Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä koostuu erittävien solujen ja populaation kypsymättömiä soluja. Toiminta kypsymättömiä soluja ja niiden keskinäinen suhde erityssoluihin tunnetaan edelleen huonosti. Kypsymättömiä soluja joko hierarkkinen nähden erityssoluille (kantasolujen malli) tai edustavat indusoituvan väestö syntymässä asianmukaisista stimulaation erilaistuneita soluja. Hepatosyyttikasvutekijää (HGF) -reseptorin c-MET on nimenomaan ilmaistu epäkypsiä eturauhasen soluissa. Tavoitteena on määrittää roolin epäkypsien solujen eturauhassyövän analyysi HGF /c-MET-reitin.

Gene-ilmentymisen profilointi DU145 eturauhassyövän solut stimuloidaan HGF paljasti induktion molekyyli allekirjoituksen liittyy kantasolut, tunnettu säätely ylöspäin CD49b, CD49f, CD44 ja SOX9 ja alas-säätely CD24 ( ”varsi kaltaiset allekirjoitus”). Olemme vahvistaneet hankinta varsi kaltaisen fenotyypin kvantitatiivisen PCR, FACS-analyysi ja Western blotting. Edelleen, HGF johti aktivointi kantasolujen liittyvät Notch-reitin säätely ylöspäin sen ligandien Jagged-1 ja Delta-kaltaiset 4. Pienet molekyylit SU11274 ja PHA665752 kohdistaminen c-MET aktiivisuus olivat molemmat voi estää molekyyli- ja biologisia vaikutuksia HGF. Knock-down c-MET by shRNA infektio johti merkittävään vähentämiseen ja viiveellä potilaalle tehdä kasvaimen muodostumisen uros NMRI. Immunohistokemiallista analyysiä in prostatectomies paljasti merkittävän rikastamisen c-MET positiiviset solut leviämisrintamassa, ja osoittivat koekspressoimalla c-MET varren kaltainen merkkiaineita CD49b ja CD49f.

Yhteenvetona aktivointi c-MET eturauhassyöpäsoluissa indusoi varren kaltainen fenotyyppi, joka osoittaa dynaamisen suhde eriytettyä ja kantasolujen kaltaisia ​​soluja tässä maligniteetti. Sen sovittelu tehokkaiden kasvainten muodostumisen

in vivo

ja hallitseva reseptorin ilmentymisen leviämisrintamassa syytöstä, että c-MET säätelee kasvaimen tunkeutuminen ympäröiviin kudoksiin oletetusti hankkimalla varren kaltainen fenotyyppi.

Citation: van Leenders GJLH, Sookhlall R, Teubel WJ, de Ridder CMA, Reneman S, Sacchetti A, et al. (2011) Activation c-MET indusoi Stem-Like Fenotyyppikuvaus Human eturauhassyöpä. PLoS ONE 6 (11): e26753. doi: 10,1371 /journal.pone.0026753

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 tammikuu 2011; Hyväksytty: 03 lokakuu 2011; Julkaistu: 14 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 van Leenders et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Alankomaat Organisaatio terveyden tutkimus ja kehitys (ZonMW, myöntää 907-00-138, henkilökohtaisen apurahan Dr. van Leenders, https://www.zonmw.nl/); Foundation for Scientific Urological Research (SUWO); Foundation Adessium; Foundation Zabawas, Alankomaat. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sisällä eturauhasen epiteelin kudosten homeostaasin välittyy kantasoluja asuvat pohjapinta rauhasepiteeliin [1]. Jälkeen epäsymmetrinen jako kantasoluja johtaa kauttakulku-vahvistamiseksi soluihin, jotka ovat läsnä sekä perus- ja luminaalisen epiteelin, ja joka lopulta erilaistua luminaaliseen erittävien solujen. Eri kalvomainen markkereita ilmentyvät differentiaalisesti varsi ja erilaistuneet solut hyvänlaatuisia jyrsijän ja ihmisen eturauhasen epiteelissä myös Sca-1

+, α

6-integriini /CD49f

+, α

2-integriini /CD49b

+, CD133

+, CD117

+, CD44

+ ja CD24

– [2] – [9]. Näiden merkkiaineiden saattaa edelleen delimitate varsi, kauttakulku-vahvistin- ja terminaalisesti erilaistuneita soluja normaaliepiteelissä. Esimerkiksi kantasolut oletettavasti ilmaista α

2β

1-integriini

+ /CD133

+, kauttakulku-monistamalla solut ovat a

2β

1-integriini

+ /CD133

-, ja terminaalisesti erilaistuneita soluja ovat a

2β

1-integriini

– /CD133

– [3], [7].

Solupopulaatiot biologisten piirteitä, jotka muistuttavat hyvänlaatuinen kantasoluja on myös tunnistettu pahanlaatuinen kasvain [10] – [13]. Eturauhassyövän, α

2β

1-integriini

+ /CD133

+ soluilla voimakkuus itseuudistumiseen ja monisuuntainen eriyttäminen

in vitro

[8], [ ,,,0],14]. Lisäksi CD44

+ /CD24

– soluja eristettiin eturauhassyöpäsolulinjoissa osoittavat suurta kasvain muodostavien mahdollisten

in vivo

[4]. Huolimatta näennäisestä vaihtelua klonogeeniset ja kasvaimen aloittamista potentiaali, keskinäinen suhde epäkypsiä ja erilaistuneet solut on edelleen huonosti. Vastaten niiden suhde normaaleissa kudoksissa, tiukka hierarkkinen suhde niin kutsutun syövän kantasoluja (CSC: n) ja erilaistuneita soluja on oletettu, [12] – [14]. Tämän mallin mukaan, CSC: n suoria ja peruuttamattomia esiasteita erilaistuneita soluja. Viime aikoina on kuitenkin osoitettiin, että erilaistuneita soluja voidaan hankkia CSC ominaisuuksia rintarauhasen ja paksusuolen syöpä [15], [16]. Erityisesti fenotyyppiset ja biologiset ominaisuudet vaikuttivat kantasoluja voidaan saavuttaa, kun enemmän erilaistuneet solut käyvät läpi epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon (EMT) joko pakko masennus E-kadheriinin tai erittämät tekijät mikro-ympäristössä, kuten hepatosyyttikasvutekijä (HGF ) [15], [16]. Koska sen täsmällinen luonne ja suhteessa muihin solutyyppejä ovat edelleen kiistanalaisia, puhumme solupopulaatio näyttämällä kantasolujen ominaisuuksia kuten kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

HGF ja sen tyrosiinikinaasireseptori c-MET ovat tärkeitä välittäjäaineita organogeneesin , kudosten uudistumista ja haavojen paranemista [17]. Normaalin eturauhasen epiteelin, c-MET on nimenomaan ilmaistu tyvi- ja atrofisen onteloerityssolut, jossa se oletettavasti välittää elvyttämiseen vaurioitunut erittävien rauhasten [18], [19]. Eturauhassyövän, c-MET on läsnä alhaisilla tasoilla, vähemmistö soluilla proteiinipitoista ilmaisun [18], [20], [21]. Aiemmin muita ja olemme osoittaneet, että c-MET ja pohjapinta solumarkkerigeenien Keratiini 5 ovat koekspressoi- samassa solussa väestön eturauhassyövän [14], [18]. Koska HGF /c-MET polku on sääntelytehtävä maahanmuutto- ja invaasion

in vitro

olemme ehdottaneet, että tämä solupopulaatio on nimenomaan altis tunkeutuminen ympäröiviin kudoksiin [18], [22].

tiedetään vähän rooli c-MET suhteessa varsi kaltaisia ​​soluja eturauhasen syöpä ja miten

in vitro

tutkimukset kantasolujen kaltaisia ​​soluja kääntää todellinen syöpää potilailla. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että aktivointi c-MET johtaa induktioon varsi kaltainen fenotyyppi eturauhassyövässä. Knock-down c-MET edelleen voimakkaasti alentunut kasvaimen muodostumista nude-hiirissä. Lopuksi osoitamme, että c-MET ilmentyy ensisijaisesti kehällä ihmisen eturauhasen yksilöitä ja on yhteistyössä paikallistaa sen alavirtaan tavoitteet α

2-integriinin ja α

6-integriiniä. Nämä tulokset osoittavat, että kantasolujen kaltaisia ​​soluja välittävät kasvain laajeneminen leviämisrintamassa eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksymä kansallinen Animal Experiment komitean (DEC, 102-08-01, EUR1396). Kaikki potilaan näytteitä anonyymisti käytettiin jälkeen asianmukaisen kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja hyväksyntänumerolla ihmisen etiikan Institutional Review Board (METC; MEC02.0957).

Solut ja materiaalien

DU145 eturauhassyöpäsolulinja ja ihmisalkion munuaisen (HEK) 293T-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). DU145 pidettiin 37 ° C: ssa /5% CO

2 RPMI 1640, joka sisälsi 5% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (P /S) (Lonza, Verviers, Belgia). Sillä stimulaatio kokeita DU145 soluja ympättiin yli yön RPMI /FCS. Jälkeen 1 päivä, alusta korvattiin 5% Dextran Charcoal (DCC) käsiteltiin RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA). Jälkeen sopeutuminen yön yli, HGF (25 ng /ml; Sigma) lisättiin elatusaineeseen ja solut kerättiin inkuboimalla 2 mM EDTA: ta (Sigma) 20 minuutin ajan. Pienet molekyylit SU11274 (1,0 uM, Sigma) ja PHA665752 (0,1 uM; Calbiochem, Nottingham, UK) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) käytettiin c-MET inhibition.

Microarray-analyysi

DU145-soluja stimuloitiin 2, 8 ja 24 tuntia HGF tai ajoneuvon, ja RNA eristettiin käyttäen RNAzol B-reagenssia (Tel-test Inc., Friendswood, USA). Sen jälkeen kun RNA: n eristys kloroformilla, isopropanoli ja etanoli, DNA digestoitiin käyttämällä DNA-sarjaa (Ambion, Huntingdon, Iso-Britannia). RNA laatu ja määrä mitattiin käyttäen RNA 6000 Nano Kit 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Näytteet, joissa RNA koskemattomuutta numerot 8,5 valittiin. 5 ug kokonais-RNA stimuloiduista ja kontrollinäytteiden valmistamiseen käytettiin antisense-biotinyloitu-RNA mukainen valmistajan yhden syklin protokollan (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Hybridisoimalla Affymetrix Human U133plus2.0 GeneChips (54614 koetinsarjojen, joka edustaa noin 47.000 selostukset), värjäys, pesu, ja skannaus suoritettiin, kuten on kuvannut Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), ja suorittaa Erasmus MC Center for Biomics. Microarray tiedot käsiteltiin ja normalisoitu käyttämällä Affymetrix Microarray Suite -ohjelmistoa. RMA quantile normalisointi suoritettiin ja ilmaisun arvot (EV) välillä paneelit normalisoitiin asettamalla keskiarvon kunkin 6 matriisia 150; arvot 30 asetettiin 30. kunakin ajankohtana

2log suhdelukua HGF ja ajoneuvon käsitellyt solut laskettiin. Array tietoa MIAME yhteensopiva ja on toimitettu GEO (GSE16659). Yhteyksiä muihin tietokantoihin suoritettiin käyttäen SRS7; Puunäkymäikkuna ohjelmaa käytetään tuottaa heatmap kuvat [23], [24].

Quantitative real-time PCR

Quantitative reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin käyttäen Taqman Rxn PCR Core Reagents lukien MQ, Taq Buffer, MgCl

2, dNTP, Amplitaqia G (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Seuraavia koettimia käytettiin: Hs02379687_s1 (CD24); Hs00174139_m1 (CD44); Hs01041017_m1 (CD49f); Hs00165814_m1 (SOX9); Hs00158148_m1 (CD49b). Määrä kohdegeenin normalisoitiin GAPDH (Hs99999905_m1).

analyysi c-MET-inhibiittorit on CD49b, kokonais-RNA eristettiin RNAzol B-reagenssia (Tel-Test) mukaisesti valmistajan protokollaa. RT-reaktio suoritettiin oligo (dT) 12-18-aluketta (Invitrogen, La Jolla, CA). Kun oli lisätty ensimmäisen juosteen puskuria, dithithreitol, dNTP: t ja RNAsin, RT reaktiot aloitettiin MMLV-RT (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen SYBR-vihreällä Mastermix (Applied Biosystems). CD49b eteenpäin 5′-CAG GCA CAC CAA AGA ATT GA-3 ’, käänteinen 5′-GAA GAA GCC GAG CTT CCA TA-3′, GAPDH eteenpäin 5’-ACT GTG GTC ATG AGT CCT TC-3 ’, reverse 5’ -CAT GTT CGT CAT GGG TG-3 ’, ja PBGD eteenpäin 5′-CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3′ ja reverse 5’-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3 ’. Signaalit analysoitiin ABI Prism 7700 järjestelmä (Applied Biosystems). Määrä kohdegeenien määritettiin käyttäen standardia käyrät sarjalaimennoksia. Määrittämiseksi Notch-reseptorien ja ligandien, RT-PCR suoritettiin käyttäen alukesarjoja ja cycli kuten on esitetty taulukossa S1 klo hehkutus lämpötilassa 60 ° C.

Virtaussytometria ja Western blotting

analysoimiseksi membranous proteiinien 0,5 × 10

6 DU145 soluja inkuboitiin anti-CD49b (1:500; Chemicon, Hampshire, UK), anti-CD49f (1:10,000; Abcam, Cambridge, UK), anti- CD44-FITC (1:200, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-CD24-PE (01:10, BD) ja anti-CD133-PE: tä (klooni AC133, 1:100, Miltenyibiotec, Bergisch Gladbach, Saksa ), 50 ul PBS /2% FCS: ssa 30 min. jäällä. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineilla leimattu Alexa Fluor 488 (1:500) 15 minuutin ajan. Suspension jälkeen 300 ui: aan PBS /2% FCS Hoechst 33258 (2 ug /ml) valitsemiseksi elävien solujen, proteiinin ekspressio mitattiin käyttämällä FACSAria virtaussytometriä (BD) on varustettu kolme laseria (407, 488 ja 633 nm).

analyysi SOX9 ja c-MET-proteiinia, stimuloi ja valvonta solut lyysattiin RIPA-puskuriin (10 mM tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton x 100, 1% deoksikolaatti, 0,1% SDS, 5 mM EDTA), joka sisälsi proteinaasi-inhibiittoreita (Complete, Roche, Basel, Sveitsi). Proteiini mitattiin käyttämällä Biorad-proteiinin reagensseja (Biorad Laboratories, Munich, Saksa). 40 ug kokonais-proteiinia ladattiin 10% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin nitroselluloosapaperille (Protan, Schleicher ja Schuell, Dassel, Saksa). Kun oli salvattu 5% NFDM /TBST (Protifar, Nutricia, Zoetermeer, Alankomaat) 1 tunnin ajan, blotteja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 0,2 ug /ml anti-SOX9 (klooni AF3075; R Santa Cruz). Pesun jälkeen blotteja inkuboitiin 1:1,000 anti-vuohi-HRP tai anti-kani-HRP: tä (Dako, Glostrup, Tanska) 1 tunnin ajan, käsitellään käyttäen BM Chemiluminescence Blotting Substraatti (Roche) ja kvantifioidaan ImageJ ohjelman.

MTT ja soluadheesioanalyyseissä

5.0 x 10

3 DU145 soluja stimuloitiin 96-kuoppaisille levyille 25 ng /ml HGF 0, 3 ja 6 päivää. Viljelmiä inkuboitiin tiatsolyyli blue liumbromidi (MTT 5 mg /ml; Applichem, Darmstadt, Saksa) 4 tuntia, jonka jälkeen metabolisen tuote suspendoitiin 100 ul puskuroitua DMSO: ta ja mitattiin 570 nm: ssä BIO-RAD 550 mikrolevynlukijaa (Biorad). Kvantitoimiseksi soluadheesion, 3,0 x 10

5 stimuloitujen DU145-solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille päällystettiin kollageeni I (Becton Dickinson Labware, Bedford, UK). Tarttumisen jälkeen 15 min., Levyt pestiin, inkuboitiin 1 ml: lla DCC alustalla, joka sisälsi 5 mg /ml MTT: n, ja optinen tiheys määritettiin.

Lentivirusvektorikonstruktit infektion

HEK 293T-solut ympättiin pulloja päällystetty 0,1% gelatiinia /PBS ja kasvatettiin 50-60% konfluenssiin. Lentivirus- partikkeleita tuotettiin transfektion jälkeen HEK 293T-solujen kanssa 20 ug vektori-DNA (pLKO.1 shRNA, ID167, klooni NM_000245.x-502s1c1; Sigma) yhdessä 15 ug pPAX

2 ja 6 ug PMD

2G käyttämällä capo

4 sademäärä, jonka jälkeen dH

2O, 2,5 M CaCl

2 ja HEPES puskuroitua suolaliuosta (pH 7,05) lisättiin. Transfek- Seos jätettiin inkuboitua 20-30 minuuttia. huoneenlämpötilassa ennen kuin se lisättiin HEK 293T-soluihin. ShRNA lentivirus sisältävä soluviljelmän supernatantit kerättiin 24 ja 48 tuntia transfektion jälkeen, ja läpi 0,45 um: n suodattimen. Määrittämään transfektiotehokkuutta HEK 293T-solut samanaikaisesti transfektoitu vihreä fluoresoiva proteiini (GFP). Salattu shRNA (Sigma) käytettiin kontrollina. DU145 sitten infektoitiin kerätty virus (1:01) yön yli ja tartunnan kloonit valittiin laimenemishyponatremiaa kloonaukseen.

Orthotopic injektio

1,0 x 10

5 DU145-soluja injektoitiin dorsolateral lohko mies nu /nu Naval Medical Research Institute (NMRI) hiiriä yhdessä 1,0 × 10

6 kyseistä luottoa eturauhasen fibroblastit 20 pl RPMI /DCC alustassa, joka sisälsi ihmisen HGF (25 ng /ml) [25]. Injektiot suoritettiin 30G microlance neula (Becton Dickinson, Alphen a /d Rijn, Alankomaat) on Luer kärki mikrolitran 700 ruisku (Hamilton, Bonaduz,-Sveitsin) vatsan viilto anestesiassa. Kasvaimen tilavuus (TV) seurattiin viikoittain transrektaalisella ultraäänikuvauksella (Endosonics Europe BV, Rijswijk, Alankomaat). Hiiret lopetettiin TV 1000 mm

3 tai 3-4 kuukautta. Eturauhasen oli histologisesti analysoitiin yhdessä vatsan imusolmukkeiden ja keuhkojen.

immunohistokemia

immunohistokemiaallisesti c-MET suoritettiin 94 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut radikaali prostatectomies (HE). Jaksot 4 um poistettiin vaha ja rehydratoitiin käyttäen ksyleeniä ja etanolia. Endogeenisen peroksidaasin sammutettiin ja antigeeni haku suoritettiin 15 minuutin aikana. mikroaaltosäteilytyksen (700 W) Tris-EDTA: ta (pH = 9). Laseja inkuboitiin kanin anti-ihmis-c-MET (1:100, C12, Santa Cruz), yön yli 4 ° C: ssa ja visualisoitiin käyttäen EnVision järjestelmän (DAKO). Kvantitoimiseksi c-MET, läsnä ollessa voimakkaasti positiivinen solujen teki kehällä, mielivaltaisesti määritelty ulompi 2 mm kasvain ja verrattuna keskelle.

co-localization tutkimukset, 6 nestemäinen N

2 jäädytetty RP liukuu oli asetoni-kiinteä ja inkuboitiin anti-c-MET (1:100) ja hiiren anti-humaani-CD49b (1:100, HAS-3, Abcam) tai rotan anti-ihmis-CD49f (1 :100; Abcam) yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen objektilasit inkuboitiin sian anti-kani-biogenin (1:150; DAKO) yhdistettynä anti-hiiren tai anti-rotta-vasta-aine on leimattu Alexa 488 (1:100) 30 min., Jonka jälkeen avidiini-Cy3 (1 :100) kompleksin muodostumisen 30 min. huoneenlämmössä.

Tilastot

kasvu vaikutuksia HGF ja c-MET-inhibiittorit arvioitiin Studentin

t

-testi. Immunohistokemiallinen ilmentyminen c-MET RP analysoitiin Pearson χ

2 testiä. Kasvaimen muodostuminen hiirillä arvioitiin käyttäen molemmissa kokeissa, kaikki SPSS versio 15,0 (SPSS Inc., IL, USA). Kaksipuolinen p-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Discovery HGF /c-MET geenien

Edellinen RT-PCR ja Northern blot-analyysi osoitti että c-MET on ilmaistu androgeeni-riippumaton eturauhassyöpäsolulinjoissa DU145 ja PC3, mutta ei androgeeniriippuvaisissa LNCaP [18], [20]. Stimulointi DU145 HGF johti solujen sironnan ja muuttoliike 2D-kulttuuri (kuvio 1A), kun taas stellate ituja muodostua 3D Matrigel matriiseja (kuvio 1 B). Aikana sironta, DU145-solut saadaan karan muodossa vastakohtana normaaliin epithelioid muoto, kun taas solujen kasvu inhiboitui merkittävästi 21%, kun 3 päivää (p 0,003) ja 10% sen jälkeen, kun 6 päivää (p = 0,024) (kuvio 1C). Vaikka PC3 hallussaan c-MET proteiini, HGF stimulaatio ei aiheuttanut morfologisia muutoksia (julkaisemattomat havainnot) oletettavasti johtuen sen puute toiminnallinen α-kateniinin /E-kadheriinin kompleksi [26].

, HGF aiheuttama muodonmuutos epithelioid soluklusterien kohti yhden sukkulasolut 2-ulotteinen kulttuuri.

B

, In 3-ulotteinen matrigeeliä ituja peräisin solukumista kyhmyt jälkeen HGF stimulaation.

C

, Solulisääntyminen estyy 21% (p 0,003) 3 päivän jälkeen ja 10% (p = 0,024) 6 päivän jälkeen HGF stimulaation (ohjaus

mustat palkit

-; HGF

harmaat pylväät

+).

,

B

Alkuperäinen suurennus 40 x.

tutkia molekyylitason reittejä merkitystä c-MET toiminto eturauhassyövässä, suoritimme microarray ilmaisun analyysi DU145 stimuloitu HGF. Geenit valittiin perustuu kahden taittaa tai alassäätöä vähintään yhdellä koetin asetetaan 24 tunnin aikapisteessä ja keskimääräinen ilmaisutapoja 1,41 kertainen ero. Kaikkiaan 371 geenit täytti nämä kriteerit, joista 238 oli ylä- ja 133 alassäädetty HGF (taulukko S2); top 20 ylä- ja alas geenien on kuvattu kuviossa 2A.

, Top 20 ylös- ja alas-geenien jälkeen HGF stimulaation 24 tunnin yhdistettynä vastaavien geenituotteiden -ilmaisu profiilit stimulaation jälkeen 2 ja 8 tuntia.

B

, vaikutus HGF geeneistä liittyy eturauhasen kantasolujen fenotyyppiä.

Huomasimme, että eri membranous markkereita käytetään kantasolun valinta tehostettiin 24 tunnin jälkeen: α

2-integriini /CD49b, α

6-integriini /CD49f ja CD44, kun taas CD24 oli säädeltiin (kuvio 2B). Transkriptiotekijän SOX9 indusoitui myös HGF. SOX9 tarvitaan varhaista erilaistumista eturauhasen epiteelin alkionkehityksen aikana ja on uudelleen eturauhasen syövän synnyn syytetään merkityksellinen toiminto epäkypsiä eturauhasen soluissa [27]. Expression kahden muun otaksuttu eturauhasen kantasolun merkkiaineita CD133 ja LGR5 oli alle mitattavuusrajan [14], [28].

validointi fenotyyppisten kantasolujen kaltaisia ​​solujen induktio

asetus kantasolujen liittyvien geenien HGF /c-MET koulutusjakso on validoitu kolmessa riippumattomassa DU145 kokeellisesti kvantitatiivinen PCR. Sääntelevä vaikutus HGF osoitettiin kaikkien valittujen geenien (kuva 3). 24 tunnin stimulaation CD24 (0,4-kertainen) oli alassäädetty, kun taas CD49b (2,6-kertainen), CD49f (2,0-kertaisesti), CD44 (1,8-kertainen) ja SOX9 (2,9-kertainen) olivat kaikki parannettu. Myöhemmin FACS analyysi vahvisti säätely ylöspäin kalvomainen proteiinien CD49b, CD49f, CD44, ja poistaminen CD24 (kuva 4A). Vaikutukset proteiinien ilmentyminen oli merkittävintä varten CD49b yleisellä kasvoi 240%. Kalvomainen ilmaus CD49f ja CD44 oli vain hieman kasvaa, kun HGF stimulaation (22% ja 26%, vastaavasti.). Koska SOX9 on tumassa, suoritimme Western blot-analyysi vahvistaa sen sääntelyä HGF. Kuten odotettua, ilmentyminen SOX9 proteiinin indusoituu voimakkaasti stimuloiduissa DU145-soluissa jopa 521% 24 tunnin jälkeen (kuvio 4B).

Quantitative real-time PCR vahvisti induktion CD49b, CD49f, CD44 ja SOX9 mRNA, yhdessä down-regulation of CD24.

, FACS osoitti up-regulation of CD49b (240%), CD49f (22%), CD44 (26%), yhdessä down-regulation of CD24 (-69%), kun HGF stimulaation. Ohut harmaa viiva edustaa leimaamisen sekundaarinen vasta-ainetta ainoastaan ​​(negatiivinen kontrolli), ohut musta viiva DU145 ilman HGF, ja paksu musta viiva DU145 HGF.

B

, Western blot osoitti parantamiseksi SOX9 ilmaisun yhteydessä HGF stimulaatiota 2-24 tuntia.

C

, FACS osoitti induktio kaksoisleimattua CD44

+ /CD24

– DU145 solut (kontrolli 8%

versus

HGF 26%).

sekä CD44

+ /CD24

– ja α

2β

1-integriini

+ /CD133

+ profiilit valikoida kantasolujen kaltaisia ​​soluja eturauhassyövässä [4] , [14]. Kun HGF stimulaatio, CD44

+ /CD24

– väestö rikastettiin 3,25 kertaiseksi (8%: sta 26%) yhdistettynä 0,8-kertainen pieneneminen (91%: sta 73%) kypsempi CD44

+ /CD24

+ soluissa (kuvio 4C). Valinta α

2β

1-integriinin

+ /CD133

+ solujen usein käsittelemättä ensin lyhyen aikavälin tarttumista kollageeni I matriisi, joka valitsee korkean integriinin ilmentävien solujen [3] . Voit tarkistaa, onko c-MET aktivointi parantaa osa nopeasti kiinnittämällä kypsymättömiä soluja, me määrällisesti tarttumista kollageeni I 15 min kuluttua. Tämän jakson aikana, 0,037% (keskiarvo, SD 0,006%) valvonnan kiinnittyneiden solujen kollageenin I HGF aktivoituminen DU145 solujen merkitsevästi (p 0,01) rikastettiin nopeasti kiinni soluja (keskiarvo 0,055%; SD 0,011%). FACS-analyysi, CD133 ilmentyminen DU145 oli alle herkkyys ja ei vaikuta HGF stimulaation (tuloksia ei ole esitetty).

HGF aktivoi Notch polku

Notch signalointi on tärkeä rooli eturauhassyövän kehitykseen ja on ollut mukana CSC toiminto [29] – [31]. Analyysi geenin ilmentymisen profiili osoitti yli-ilmentyminen (3,0 x) ja alas-stream Notch kohde HES-1 upon HGF stimulaatiota. Siksi tutkimme vaikutuksia HGF Notch-reseptorien ja niiden ligandien. Huomasimme, että c-MET aktivointi johti säätely ylöspäin Notch ligandien Jagged-1 ja Delta-kaltaiset (dll) 4 (kuvio 5). Ligandi Jagged-2, reseptorit Notch-2 ja Notch-3 eivät muutu, kun taas Notch-1-reseptorin alas-säädellään HGF stimulaation (tietoja ei esitetty), syytetään, että Notch aktivointi johti yli-ilmentyminen ligandien Jagged-1 ja dll-4.

HGF stimulaatio johti yli-ilmentyminen Notch ligandeja Jagged-1 ja dll-4 RNA, ja alas-stream Notch kohde HES-1.

estäjät c-MET lohkon kehittäminen kantasolujen kaltaisia ​​fenotyypin.

kirjaaminen kypsymättömiä soluja ihmisen maligniteettien aloitti kehittää erityisiä farmaseuttisten aineiden kohteekseen biologisesti tärkeiden väestöstä. Pieni molekyylit SU11274 ja PHA665752, jotka molemmat estävät c-MET entsyymiaktiivisuus täysin tukossa solu- sironnan kulttuuri ja muodostumiseen stellate ituja Matrigel (tuloksia ei ole esitetty) [32], [33]. HGF-välitteistä kasvun vähenemistä merkittävästi palautui perustasolle (p 0,001) mukaan PHA665752, mutta ei SU11274 (p = 0,186) (kuvio 6A). SU11274 (p 0,001) ja PHA665752 (p = 0,016) merkitsevästi päinvastaiseksi niin induktio CD49b (kuvio 6B) sekä esto CD24 (molemmat p 0,001) 24 tunnin kuluessa (kuvio 6C). Koska HGF vain hieman vaikuttaa CD49f ja CD44 tasolla, emme arvioida farmakologisia vaikutuksia nämä merkit.

, Solulisääntyminen estyy SU11274 molemmissa ohjaus (

mustat palkit

-) ja HGF stimuloitujen solujen (

harmaat pylväät

+), niin että se ei ole kääntänyt HGF välitteistä kasvun vähenemistä (p = 0,186). PHA665752 ei vaikuttanut solujen lisääntymisen hallinnassa soluissa, ja esti HGF aiheuttama kasvun esto (p 0,001).

B

,

C

, Sekä SU11274 ja PHA665752 tukossa HGF välittämä induktio CD49b (

B

) ja estämällä CD24 (

C

). Vakiopoikkeamat edustaa kolmen erillisen kokeen.

Expression of c- MET moduloi tehokas kasvainten muodostumista

in vivo

analysointia rooli c-MET kasvaimen -formation

in vivo

, me tartunnan DU145 soluja lentiviruksen ilmentävät shRNA kohdistaminen c-MET-reseptorin ja valitsi kolme c-MET negatiivista kloonia (kuvio 7A). C-MET negatiivinen DU145 klooneja oli samanlainen morfologia kuin vanhempien linja, kun viljellään 2D- tai 3D-kulttuuri, mutta ei reagoinut HGF sironnan tai muodostuminen stellate ituja (tuloksia ei ole esitetty). Orthotopic injektio vanhempien DU145 johti 90% (9/10) kasvaimen muodostumisen; nämä hiiret tapettiin, joissa on televisio on 1357 mm

3 (keskiarvo; alue 1016-1860 mm

3) jälkeen 42,6 päivää (keskiarvo; alue 38-52 päivää). Ohjaus DU145 infektoiduissa soluissa salattu shRNA johti kasvaimen muodostumisen 100% (5/5). Nämä hiiret olivat kaikki tapettiin johtuen suuresta TV jälkeen 59 päivää (keskiarvo; alue 52-66 päivää) (kuvio 7B). Merkittävästi vähentää kasvaimen muodostumisen tapahtunut DU145 kloonien vaiennetaan c-MET. Yhteensä 55% (11/20) klooneista (6/10 Sh167 # 14, 3/5 Sh167 # 5 ja 2/5 Sh167 # 6) aiheutti kasvainten, joista vain yksi uhrattiin johtuen suurista TV ( 1013 mm

3, 81 päivää). Viisitoista hiiret lopetettiin 119 päivää (keskiarvo; alue 109-124 päivää), joista 6 oli pieniä kasvaimia (keskiarvo TV 477 mm

3; alue 137-788 mm

3). Neljä hiiret kuolivat ennenaikainen välillä 52-102 päivää, kaikki näet pienet kasvaimet (TV tarkoittaa 225 mm

3; alue 137-304 mm

3) (kuvio 7C). Yhdessäkään hiiret metastaasien havaittiin. Yhdessä toiminnallinen c-MET välittämä tehokas kasvainten muodostumista vanhempien DU145 (p 0,02) ja johtivat merkittävästi suurempia kasvaimia ohjaus DU145 soluissa (p 0,001).

, Three DU145 klooneja (5, 6, 14), jossa alhainen negatiivinen c-MET-proteiinin ilmentymisen (Western blot) tuli vakaa shRNA infektio.

B

, Orthotopic injektio 1,0 × 10

5 DU145 funktionaalisilla c-MET johti tehokas kasvaimen muodostumista 9/10 vanhempien (

musta

) ja 5/5 ohjaus DU145 solut (

vihreä

) tartunnan salattu RNA.

C

, Orthotopic kasvainten muodostumisen väheni merkittävästi DU145 alhaisen c-MET ilme. Kaikkiaan 6/10 DU145Sh167 # 14 (

musta

), 3/5 DU145Sh167 # 5 (

vihreä

) ja 2/5 DU145Sh167 # 6 (

punainen

) injektiot johtivat kasvainten muodostumista. Vain yksi kasvain saavutti TV 1000 mm

3 tutkimuksen aikana on 52-124 päivää.

Solut ilmentävät c-MET sijaitsevat invasiivisia edessä eturauhassyöpää.

Syöpäsolut korkean c-MET ilme on nimenomaan rikastettu invasiivisia edessä peräsuolen karsinoomat, jossa ne välittävät EMT, muuttoliike ja matriisi hyökkäys [34], [35]. Määrittämään c-MET ilmentymisen leviämisrintamassa eturauhassyövässä, vertasimme ollessa suuri c-MET ilmentävien solujen ympäryksen ja keskustan hyvin kiinteä RP yksilöt (N = 94). Kaiken korkea c-MET ilmentävien solujen (kuvio 8A) havaittiin 37 tapauksessa (39,4%). Kehä sisälsi enemmän korkean c-MET ilmentävien solujen kuin kasvain keskus 27 tapauksessa (73,0%). 6 tapauksessa (16,2%) nämä solut olivat runsaammin keskustassa, kun taas 4 HE: n (10,8%), ei ollut mitään eroa ilmaisun (Pearson χ

2; p 0,001). Expression of c- MET in ennalta olemassa hyvänlaatuinen Tyvisolut sisällä koko dian toimi sisäisen valvonnan jättää kiinnitys aiheuttama värjäys esineistöä. Kaikkiaan 25 tapauksessa paljasti kasvain laajentuminen extra-eturauhasen rasvakudokseen; 10 extra-eturauhasen kasvain alueilla (40,0%) korkea c-MET ilmentäviä soluja tavattiin (kuvio 8B).

c-MET ilmentyy voimakkaasti hajallaan eturauhassyövän solut (

) , ja erityisesti invasiivisen rintamalla sisällä peri-eturauhasen rasvakudosta (

B

); arrowheads osoittavat positiivisia soluja. Alkuperäinen suurennus 100 ×.

Lopuksi koekspressoimalla tutkimukset suoritettiin RP yksilöitä validoimiseksi c-MET koekspressoimalla varren kaltainen solumerkkiaineita potilailla. Immunofluoresenssivärjäyksiä c-MET, CD49b ja CD49f osoittivat hajanainen ilmaus kaikkien merkkiaineiden tyvisolut ennalta olemassa rauhaset. Expression oli alhainen poissa useimmissa normaalien ja pahanlaatuisten onteloerityssolut. Reseptorin c-MET ilmentyi satunnaisesti korkeilla tasoilla yhden pahanlaatuisia soluja. Nämä solut koekspressoi CD49b ja CD49f, mikä osoittaa, että c-MET positiiviset solut todellakin yhteistyössä ilmaista varsi kaltainen solufenotyypin ihmisen eturauhassyövän (kuva 9).

Immunofluoresoivat kaksinkertainen merkitseminen c-MET ( Cy3; punainen) kanssa CD49b tai CD49f (Alexa 488, vihreä). Co-ilmentyminen c-MET sekä CD49b ja CD49f oli läsnä hajanaisia ​​eturauhassyövän solut (

nuolet

). Alkuperäinen suurennus 100 ×.

Keskustelu

ainakin kolme eri solupopulaatioiden voidaan erottaa ihmisen eturauhassyöpää. Vaikka eriytetty exocrine ja neuroendokriinisiksi solut edustavat hallitseva solutyyppien, näyttöä lisääntyy, että pieni populaatio kypsymättömiä soluja on ratkaisevaa biologisen käyttäytymisen eturauhassyöpää. Analoginen normaaliin rauhas eturauhasen epiteelin, Collins et al. erottaa epäkypsä varsi (α

2β

1-integriinin

+ /CD133

+) ja kauttakulku vahvistavat soluja (α

2β

1-integriini

+ /CD133

-) ihmisen eturauhassyövän näytteistä klonogeeniset, proliferatiivisia ja erottaa kapasiteetin

in vitro

[14]. Vaikka CD133 ehdotetaan yleisenä merkki kasvaimen progenitorisolujen, sen spesifisyys todellinen kasvain kantasolujen on edelleen keskustelu [10] – [12], [14], [36], [37]. Paksusuolen syöpä, esimerkiksi on ehdotettu, että CD44

+ /CD24

– /CD133

– profiili on tuumorin kantasolupopulaatiosta kun CD133

+ pikemminkin markkaa enemmän erilaisia ​​soluja [38