Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkea kasvaimeen kallikreiinin liittyviä peptidaasi 4 (KLK4) arvot liittyvät huono tulos naisille vakavien epiteelin munasarjasyöpä (EOC), jolle vatsakalvon levittämistä ja chemoresistance ovat keskeisiä tapahtumia. Määrittää roolin KLK4 näissä tapahtumissa, tutkimme KLK4-transfektoiduissa SKOV-3 ja endogeenisen KLK4 ilmentävien OVCA432 solujen 3-ulotteisen (3D) suspensioviljelmässä matkimaan askites mikroympäristö. KLK4-SKOV-3 solut muodostivat monisoluisten aggregaatteja (MCAS) katsottuna askites, samoin SKOV-3: lla käsiteltyjen solujen aktiivinen KLK4. MCA muodostuminen väheni käsittelemällä KLK4 estävää vasta-ainetta tai selektiivisen aktiivisen KLK4 auringonkukka trypsiini-inhibiittoria (SFTI-FCQR). KLK4-MCAS muodostetaan suurempia syöpäsolun pesäkkeitä mesothelial yksisoluiset kerrokset kuin muodostama vektori ja natiivi SKOV-3-soluissa, mikä viittaa KLK4-MCAS ovat erittäin invasiivisia vatsakalvon- mikroympäristössä. Korkea KLK4 ilmaistaan ​​ascitic EOC solujen verrattuna Hyväksytty primaarikasvaimen solut, jotka edelleen tukevat sen roolia askites mikroympäristössä. Mielenkiintoista, KLK4 transfektoitu SKOV-3-solut ilmensivät runsaita tasoja KLK4 alustan, urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA), erityisesti 3D-jousitus, ja korkea sekä KLK4 ja uPA havaittiin potilaalla otetaan soluja askites. Tärkeää on, että KLK4-MCAS oli paklitakselia resistenttejä joka purettiin SFTI-FCQR ja vähemmässä määrin yleinen seriiniproteaasi-inhibiittori, aprotiniini, mikä viittaa siihen, että sen lisäksi uPA, muut vielä tunnistamattomia substraatteja KLK4 on oltava mukana. Kuitenkin nämä tiedot viittaavat siihen, että KLK4 esto yhdessä paklitakselin, voi parantaa lopputulosta naisille vakavien epiteelin munasarjasyöpä ja korkeat KLK4 tasoilla niiden kasvaimia.

Citation: Dong Y, Stephens C, Walpole C, Swedberg JE, Boyle GM, Parsons PG, et al. (2013) Paklitakselia Resistance ja Monisoluista Sferoidiviljelmiä Formation aiheuta Kallikrein-Related Peptidaasistabiloidut 4 seroosit munasarjasyöpäsoluja käytettäessä Askitesta matkiminen mikroympäristön. PLoS ONE 8 (2): e57056. doi: 10,1371 /journal.pone.0057056

Editor: Georgia Sotiropoulou, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 30 elokuu 2012; Hyväksytty: 16 tammikuu 2013; Julkaistu: 25 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Dong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti tukevat National Health ja Medical Research Council (NHMRC) Australian myöntää 242220, 390123, ja 550523; Syöpä neuvoston Queenslandin ja Queensland University of Technology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

seroosit munasarjan epiteelin karsinooma (EOC) osuus 50% munasarjasyöpä [1], joka on johtava kuolinsyy gynekologisista syöpäsairauksia [2]. Noin 75% naisista, joilla EOC on diagnosoitu, kun kasvaimet ovat levinneet vatsaonteloon [3], ja -70%: lla näistä potilaista kerääntyä askites [4]. Eroavat muista kiinteitä kasvaimia, EOC etäpesäke esiintyy kasvaimen solut irtoa ensisijainen päällä ja muodostavat monisoluisten aggregaatteja (MCAS) on 3-ulotteinen (3D) -suspension askites microenvironment, ennen kiinni vatsakalvon pintaan ja perustamalla toissijaisia ​​kasvaimia taustalla soluväliaineen (ECM) [5].

Survival in askitekseen mikroympäristössä on ratkaisevan tärkeää EOC solujen menestyä vatsakalvon levittämiseen. Vaikka taustalla olevaa mekanismia ei ole selvä, on tunnettua, että askites EOC solut ovat biologisesti poikkeavat heidän kollegansa kiinteät matriisit ensisijainen ja metastaasien [6]. Esimerkiksi soluadheesiota proteiinien E-kadheriinin [7] ja α5 /av /β1 integriinien [8] ovat erittäin ilmaistaan ​​askites-johdettu munasarjasyöpäsoluja verrattuna primääri- tai metastaattinen kasvaimen sivustoja. On huomioitava, että seriiniproteaasi, urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) ja sen reseptori uPAR vuonna EOC soluja indusoidaan askites [9] ja ilmentymistä uPA liittyy chemoresistance, eteneminen ja huonon ennusteen naisilla tämä syöpä [10], [11]. Nämä tutkimukset osoittivat, että kasvain microenvironment selvästi vaikuttaa EOC etenemistä [12], [13], mutta vaikutus suspension sinänsä, mikä matkii askites microenvironment, eloonjäämiseen EOC solujen ja kemosensitiivisyys ei ole selvä. Erityisesti osallistumista muiden seriiniproteaasien edelleen suurelta osin tuntemattomia.

kallikreiinin liittyvien-peptidaasi (KLK) perhe käsittää 15 seriinin peptidaasien osoittavat niiden potentiaali biomarkkereina ihmisen syövissä [14], [15] , [16]. Nämä peptidaasien hajoavat ECM proteiinit ja aktivoi kasvutekijöitä ja muita proteaaseja, kuten uPA /uPAR akselilla [17], [18], joka on rooli ihmisen syövän etenemisessä [14], [15], [16]. Munasarjasyövän, KLK4-KLK8, KLK10 ja KLK14 on voimistunut [14], [15], [19], [20], ja meidän aiemmin raportoitu, että KLK4 ja KLK7 olivat erittäin ilmaistaan ​​kaikkein vaarallisin histotype, serous EOCs [21] , [22]. Viime aikoina olemme osoitti, että korkea

KLK7

arvot liittyvät huonoon ennusteeseen ja chemoresistance naisilla, joilla vakavien EOC ja että KLK7 indusoi MCA of SKOV-3-soluissa, todennäköisesti läpi integriiniä liittyvä mekanismi [23]. Koska korkeat KLK4 tasot ovat myös raportoitu liittyvän huonoon ennusteeseen [24] ja chemoresistance [25], tässä tutkimuksessa, pyrimme onko samanlainen, ehkä KLK-erityisiä, toimiva mekanismi oli tapahtumassa. Osoitamme tässä, että, kuten on KLK7, KLK4-over-ilmentymistä SKOV-3-solujen edistää MCA muodostumista ja paklitakselin vastustusta 3D-suspensioviljelmissä jotka matkivat askites microenvironment, mutta toisin kuin nähdään KLK7-SKOV-3-soluissa ei havaittu olevan yhdessä integriinin ilme. Kuitenkin KLK4 yliekspressoivia SKOV-3 soluilla ilmen- tymisen lisääntymisen tasoa uPA, erityisesti 3D-jousitus MCAS. Tärkeää on, KLK4 estäminen vähensi MCA tiivistyminen ja lisääntynyt paklitakselin herkkyyttä KLK4-MCAS. Nämä tiedot viittaavat siihen, että vaikka useat KLKs ovat yliekspressoitu EOC ja voi samalla liittyy EOC etenemiseen, taustalla vaikutusmekanismi, liittyvät erityiset valikoiva entsyymi spesifisyys kunkin KLK peptidaasi.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

käytetyt vasta-aineet ovat ne vastaan ​​V5 epitooppimerkitty C-terminaaliin KLK4 (Invitrogen, Mount Waverley, VIC, Australia); KLK4 katalyyttinen-domeeni-vasta-aine, KLK4 toiminnallinen esto vasta-aineella (R monoklonaalinen anti-uPA B-ketju (American Diagnostica, Stamford, CT, USA); GAPDH ja anti-hiiri-IgG (Sigma Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia). Hiiren ja kanin Alexa Fluor 488 toissijainen vasta, Alexa Fluor 568 phalloidin ja CellTracker

492 oli Invitrogen. Sukupolven aktiivisen yhdistelmä-DNA-KLK4 [26] ja selektiivinen aktiivisen KLK4 auringonkukka trypsiini-inhibiittoria (SFTI-FCQR) [27] ovat julkaistu. Kohdennettua mutageneesiä on käytetty tuottamaan katalyyttisen triadin seriinin alaniiniksi mutantti-KLK4S207A (KLK4S /A) plasmidi. Kaikki muut kemikaalit olivat Sigmalta ellei toisin mainita.

ihmisen solulinjoissa, ja potilaan seroosit EOC Biopsies ja munasarjakudoksen RNA

SKOV-3 serous EOC ja LP9 vatsakalvon mesothelial solulinjat olivat amerikkalainen Type Culture Collection ja Coriell Cell Repositories vastaavasti. OVCA432 solulinja perustettiin askite- saatu EOC potilas [28] ja on antelias lahja tri Samuel Mok (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA). Alkuperä Potilaan EOC solujen kuvattu aiemmin [21], [22]. Vakavien EOC kudos RNA-näytteet kuvattiin aiemmin [23]. Potilaan kliininen tiedot on saatu Royal Brisbane ja naisten sairaala (täydentävä taulukko S1). Eettinen hyväksyntä saatiin institutionaalisten eettisten toimikuntien (Human Tutkimusetiikka komitean Queensland University of Technology (# 0800000213) ja The Clinical and Statewide Services tutkimuskomitea (# 229)); kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

RNA uuttaminen, Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) B

Yhteensä RNA ja cDNA: n synteesi on kuvattu aiemmin [23]. Kvantitatiivinen-RT-PCR: ää suoritettiin 40 sykliä koskevasta ABI7300 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Mulgravessa, VIC, Australia) käyttämällä

KLK4

spesifisiä alukkeita (K4Ex2qS, 5′-GGCACTGGTCATGGAAAACGA-3 ’ja K4Ex3qAS, 5’ -TCAAGACTGTGCAGGCCCAGCC-3 ’) ja SYBR green kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

KLK4

ilmentyminen oli normalisoitiin

18S

(18SFor, 5’GATCCATTGGAGGGCAAGTCT-3 ’ja 18SRev, 5′-CCAAGATCCAACTACGAGCTTTTT-3’) käyttäen standardikäyrän menetelmää ja RT-PCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23].

Generation Stabiilin solulinjojen

Generation ja transfektoimalla plasmidin (pcDNA3.1 /V5-His, C-terminaali V5 tag, Invitrogen), joka ilmaisee villi tyyppinen pre-pro-KLK4 on kuvattu aiemmin [29]. Katalyyttisen kolmikon seriinin alaniiniksi mutantti-KLK4S207A (KLK4S /A) plasmidi muodostettiin kohdennetulla mutageneesillä. Stabiili monoklonaalinen KLK4-ilmentävät tai vektorisäätö solut valittiin käyttämällä G418: aa (Invitrogen), ja 3 yli-ilmentäviä klooneja, KLK4-1, KLK4-2 ja KLK4-3, valittiin satunnaisesti seuraaviin

in vitro

toiminnalliset analyysit.

in vitro toiminnalliset analyysit

in vitro muuttoliike määrityksissä.

2 x 10

5 solua RPMI-1640, joka sisälsi 0,1% BSA: ta ympättiin kudoksessa kulttuuri lisätään 8 um huokosia (BD Biosciences, Eight Mile Plains, QLD, Australia), ja annettiin siirtyä kohti 10% FCS kuten kemoatrak- alemmassa kammiossa 24 tuntia (h). Lukumäärä siirtynyt solujen määrä määritettiin käyttäen kristalliviolettia värjäystä luettiin 595 nm: ssä.

Monisoluista aggregaatti (MCA) /sferoidiviljelmiä muodostumista ja estäminen.

roikkuu pudottamalla [30] käytettiin MCA muodostumista kaikkien transfektoitujen ja natiivi-solujen kanssa 5 x 10

3 solua /kuoppa, kun läsnä oli 10% FCS RPMI-1640 (100 ui) päälle agaroosilla-päällystetyillä levyillä (60 ui 0,5% agaroosi /serum- vapaa media, w /v), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Kun yhdistelmä-DNA-aktiivinen KLK4 (rKLK4) entsyymi ja katalyyttinen aktiivinen mutantti KLK4S /A (50 ng /ml) käytettiin indusoimaan MCA muodostumisen SKOV-3-soluja, tämä suoritettiin seerumittomassa olosuhteissa. Seerumivapaassa RPMI-1640 käytettiin MCA inhibition kanssa KLK4 estävää vasta-ainetta, jonka konsentraatio (10 ug /ml) kaapata kaikki aktiiviset entsyymin kanssa hiiren IgG: tä (10 ug /ml) ohjaus. KLK4 aktiivisen auringonkukka trypsiini-inhibiittoria (SFTI-FCQR, 1 uM) [27], tai PBS: kontrollit lisättiin 10% FCS RPMI-1640. Kuvat otettiin käyttäen Nikon-Eclipse TE2000-U digitaalikamera (4 x tavoitteet) ja V ++ ohjelmisto. Kompakti MCAS määriteltiin ne, joilla on ≥30 um halkaisijaltaan. Kvantifioimiseksi solujen prosenttiosuus, jotka on muodostettu kompakti MCAS (≥30 um), kaikki näkyvissä pallosia ( 30 um, ≥30 um) laskettiin kaikissa aikapisteissä ja jaettiin useissa 4 tunnin ajankohtana valittu jotta solut asettua hyvin. Ero on yleinen sferoidiviljelmiä numeroita ja ne, joilla 30 pm halkaisijat päivänä 1, 4 ja 7 4 h laskettiin ja pidettiin prosenttiosuus kompakti MCAS muodostunut. Tämä lähestymistapa perustui aikaisempaan raporttiin Iwanicki et al [31].

In vitro mesothelial välys määritys.

LP9 mesoteelisolujen (5000) ympättiin 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin -80% konfluenssiin. MCAS pestiin PBS: ssä, inkuboitiin CellTracker

492 (4 uM), lisätään päälle mesothelial yksisolukerrosten (~4-6 pallosia /kuoppa /200 ui) ja viljeltiin 37 ° C: ssa. 4 h, 1, 2, 3 ja 7 päivää alkuperäisestä sferoidi pinnoitus, kuvat otettiin 10 x tavoite. Määrällisesti MCA välys, halkaisija fluoresoivan alueilla MCAS merkitty CellTracker

492 mitattiin käyttämällä InDesign ohjelmiston (Adobe, Adobe Systems Pty Ltd, Chatswood, NSW, Australia). Mittaukset suoritettiin 10 satunnaisesti valittua MCAS 3 eri kokeesta, että keskimääräinen halkaisija päivänä 3 verrattuna, että alkuperäisen alueen sferoidi (4 h).

Solujen eloonjääminen sisplatiinin /paklitakselihoidolla.

24 h ymppäyksen jälkeen päällystämättömän 96-kuoppalevyille (Nunc), kuten 2D-monokerrokset, soluja käsiteltiin sisplatiinin (0, 1, 5, 10, 50 uM) tai paklitakselia (0, 0,01, 0,1, 1 , 10 nM). 3D-jousitus viljelmiä, sferoidit muodostettiin kuten edellä 4 päivää ja sitten sisplatiinia tai paklitakselia lisättiin. Sillä KLK4 inhibitio in 3D-jousitus, KLK4-1 tai OVCA432 solut suspensoitiin uudelleen SFTI-FCQR (1 uM), joka sisältää median ja kylvetään, ja päivänä 4 paklitakseli (0, 0,1, 1, 10, 50, 100 nM) oli lisättiin. WST-1 määritykset suoritettiin 96 h käsittelyn jälkeen. Solujen eloonjääminen laskettiin prosenttiosuutena absorbanssi ei-käsiteltyjä soluja.

knockdovvn KLK4 Expression

knockdovvn KLK4 ilmentyminen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Lyhyesti, nisäkkään siRNA ekspressiovektori pSilencer 3,1-H1 puro (Ambion, Austin, TX, USA) käytetään vähentämään ilmentymistä KLK4. Ehdokas KLK4 siRNA kohdesekvenssejä suunniteltiin Ambion siRNA ohjelma ja sitten kohdistettu vasten ihmisen genomin tietokannasta käyttämällä BLAST-algoritmi poistaa ne, joilla on merkittävää homologiaa muiden geenien. Kahden sekvenssin valittuna olivat 5′-GATCCATCCCTGGGGCTGGTTCCTTTCAAGAGAAGGAACCAGCCCCAGGGATTTTTTTGGAAA-3 ’(psilK4Ex1) ja 5′-GATCCAACGAATTGTTCTGCTCGGTTCAAGAGACCGAGC- AGAACAATTCGTTTTTTTTGGAAA-3’ (psilK4Ex2). Oligot syntetisoitiin (Sigma) ja insertoitiin pSilencer 3,1-H1 puro-vektoriin (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. SKOV-3, jotka ilmentävät stabiilisti KLK4 (KLK4-1 klooni) solut transfektoitiin KLK4 pSilencer 3,1-H1 rakentaa tai toimitettu pSilencer 3,1-H1 negatiivinen kontrolli käyttämällä Lipofectamine (Invitrogen). 48 tunnin kuluttua, kokosolulysaatissa kerättiin transfektoiduista soluista ja ekspression KLK4 ja uPA tutkittiin Western blot -analyysillä.

Western-blottaus

Koko solulysaatteja soluja viljeltiin yksikerroksella 3päivä kerättiin puskuriin, joka sisälsi Complete proteaasiestäjäseostabletit (1 x, Roche Applied Sciences, Castle Hill, NSW, Australia), 50 mM Tris-HCI (pH 7,4), NaCl (150 mM) ja CHAPS (1%). Soluja viljeltiin 3D-kollageeni I, 3D-matrigeeliin ™ (BD Biosciences) ja 3D-jousitus 7 päivää kerättiin jääkylmään PBS seuraa menettelyn edellä. Proteiinipitoisuus määritettiin microbicinchoninic happo määritys (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, VIC, Australia). Solulysaateista (20 ug) tai väliaine (CM, 4 ug proteiinia), erotettiin SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja estetty Odyssey estopuskurilla (LI-COR® Biosciences, Lincoln, NE, USA) . Membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettuna blokkauspuskuriin yön yli 4 ° C: ssa, pestiin tris-puskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 0,05% Tween-20, ja inkuboitiin sitten toissijaiseen IRDye 680 tai 800 konjugoidut hiiren tai kanin IgG: tä (LI-COR® Biosciences) tarvittaessa. Kuvat syntyi ja tiheysmittaus analyysi suoritettiin käyttäen Odyssey järjestelmän ja ohjelmiston (LI-COR® Biosciences).

konfokaalimikroskopia

Solut kasvatettiin steriili kannen luistaa, kunnes 80% konfluentteja tai MCAS kerätty eppendorf-putkissa jälkeen 7 päivää viljelmässä kiinteä (4% w /v paraformaldehydiä /PFA PBS: ssä), permeabilisoitiin (0,5% v /v triton X-100 PBS: ssä) ja blokattiin (5% w /v naudan seerumin albumiinia /BSA PBS). Inkubointi ensisijainen vasta-aineiden KLK4 ja E-kadheriini (1/200 v /v 1% BSA PBS: ssä) oli 4 ° C: ssa yön yli. Alexa Fluor 568 phalloidin ja 4′-6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Sigma) levitettiin toissijainen Alexa Fluor 488 IgG tarvittaessa. Saadakseen kuvien MCA tila, yksikerroksista mesothelial LP9 Solut siirrostettiin 8-kammio slide (In vitro Technologies, Noble Park North, VIC, Australia), CellTracker

492 haettiin KLK4-1 pallosia ennen kylvö ja 24 tuntia myöhemmin solut kiinnitettiin kuten edellä ja sen jälkeen värjäämällä Alexa Fluor 568 phalloidin ja DAPI; MCAS Vector-1, SKOV-3 ja OVCA432 värjättiin E-kadheriinin kuten edellä. Kuvat otettiin käyttäen Leica-TCS SP5 -konfokaalimikroskoopilla (63 × ja 20 × immersioöljyobjektiivilinssillä varten yksikerrossoluissa ja MCAS vastaavasti) ja siihen liittyvän ohjelmiston. Z jakso pinoaminen kuvat luotiin käyttäen Maximum Projection ohjelmisto kuvasuhde 2.

Tilastollinen analyysi

Studentin t-testiä käytettiin toiminnallisia analyysejä, joissa

P

≤0.05 harkita olevan merkittäviä. Hengissä analyysiä, potilaat luokiteltiin kahteen ryhmään joko pieni (n = 25) tai korkea (n = 13)

KLK4

tasot käyttäen mediaani katkeamisen

KLK4

kopiomäärä, jälkeen normalisoinnin

18S,

of 0,0007 (alue 0,0000147-0,0258). Kaksi eri päätepisteitä syövän uusiutumisen ja potilaan kuoleman käytettiin laskettaessa postoperatiivisesti etenemistä elinaika (PFS) ja yleinen elinaika vastaavasti. Kaplan-Meier-analyysi määrittämiseen käytettiin yhdistys

KLK4

tasolla PFS ja kokonaiselinaika aika log rank malli. Analyysit tehtiin SPSS 18.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

KLK4 ilmentävien SKOV-3 solut ovat vähemmän vaeltavien mutta solunsalpaajaresistentti 2D Yksikerrokset

halusivat määrittää vaikutusmekanismia taustalla huonon ennusteen [24] ja chemoresistance [25] aiemmin raportoitu liittyvän korkea

KLK4

tasoilla munasarjasyövän yleisesti. Niinpä syntyy sekä vakaan ja ohimeneviä transfektantit in Skov-3-solut, jotka ilmentävät vähän endogeenista KLK4 toiminnallista analyysiä (täydennyskuvio. S1A). Western blot-analyysi vahvisti, että V5-merkitty yli-ilmentynyt KLK4 (33 kDa), solunulkoisen seriiniproteaasi, erittyy medium (CM) sekä vakaan ja ohimeneviä KLK4 transfektantteja, mutta ei vain vektorin sisältävään, mock-transfektoituja tai natiivi Skov-3-solut (Fig. 1A, yläpaneeli). Mielenkiintoista on, että 88 kDa: n proteiinijuovana nähtiin CM kahden korkean KLK4-ilmentävien kloonien (KLK4-1 ja KLK4-2) ja lyhytaikaisella transfektiolla, mutta ei CM seriinin alaniiniksi aktiivisen mutantti-KLK4S207A ( KLK4S /A) rakentaa (Fig. 1A, yläpaneeli), tai kokosolulysaatissa (WCL) villityypin KLK4 tai mutantti-KLK4S /A-transfektanttien (Fig. 1A, alapaneeli). Nämä tiedot osoittavat, että sekä villityypin KLK4 ja mutantti KLK4S /A erittyy, mutta vain villityypin KLK4 on läsnä aktiivinen entsyymi, kuten on esitetty 88 kDa: n vyöhyke, joka on todennäköisesti KLK4 kovalenttisesti sidottu tuntemattoman serpin. Tukeakseen tätä havaintoa, että KLK4 aktivoituu ja muodostaa komplekseja seerumin huomautettava proteiinien tai estäjiä, aktiivinen KLK4 (100 tai 500 nM) inkuboitiin viljelyväliaineessa (RPMI-1640), tai ilman 1% ja 5% FCS 2 ja 18 h vastaavasti. Western blot-analyysi osoittaa, että 88 kDa: n lajia esiintyy vain silloin, kun aktiivista KLK4 inkuboitiin RPMI-1640-median kanssa FCS, mutta ei silloin, kun FCS oli poissa (täydennyskuvio. S1B). Taso KLK4 ilmentymisen KLK4-3 klooni on verrattavissa endogeenisen KLK4 ilmentävien OVCA432 soluja, kun taas KLK4-1 klooni osoittaa voimakkaampaa KLK4 proteiinijuovat (Fig. 1 B). Immuunifluoresenssivasta (IF) mikroskopialla käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​V5-merkitty C-pään ja N-terminaalisen peptidin KLK4 [29] vahvistettiin edelleen proteiinin yli-ilmentymisen kunkin KLK4 kloonien, mutta vähäistä ekspressiota vektorisäätö, natiivi SKOV-3-soluja tai KLK4-1 IgG ohjaus (Fig. 1 C, täydennyskuvio. S1C).

. Western-blottauksella anti-V5-vasta-aine osoittaa KLK4 ekspressiota medium (CM) ja kokosolulysaatissa (WCL) vakaista KLK4 tranfectants (KLK4-1, KLK4-2 ja KLK-3, kaistat 1-3), vektori (Vec -1, Vec-2 ja Vec-3, kaistat 4-6) ja natiivi SKOV-3 (kaista 7) soluja, ja ohimenevästi ilmaisi villityypin KLK4, mutantti-KLK4S207A (KLK4S /A), vektorin ja mock transfektanteissa (kaistat 8- 11); GAPDH käytettiin latauskontrollina varten WCL. B. Western-blottauksella anti-KLK4-vasta-aine osoittaa suhteellisia tasoja KLK4 proteiinin WCL on KLK4-1, KLK4-3 klooneista ja OVCA432, ja 10 ng rekombinantti (r) KLK4 proteiinia. C. IF mikroskopia anti-V5 /KLK4-N terminaalista vasta-aineita (vihreä) ja phalloidin (punainen) in KLK4-1, Vec-1-kloonien, natiivi SKOV-3 tai negatiivinen kontrolli (IgG). Mittakaava, 20 um. D. TranswellTM muuttoliike testeissä, joissa KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-1, Vec-2 ja natiivi SKOV-3-solut; n = 3, keskiarvo ± SEM, * P 0,05.

Edellinen

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että KLK seriiniproteaasien pilkkovat kollageeneista I ja IV, fibronektiini, vitronektiini ja laminiini [ ,,,0],32], [33], jotka ovat komponentteja vatsakalvon kalvo [34], ja me raportoimme että KLK7 yli-ilmentyminen kasvoi tarttumista fibronektiiniin ja vitronektiiniin [23]. Tässä tutkimuksessa ei kuitenkaan emme nähneet mitään eroa KLK4-transfektoidut ja ohjaus solujen näiden vaatimusten noudattaminen ECM komponentteja tai lisääntymistä (tuloksia ei esitetty). Toisaalta, KLK4 ilmentävät kloonit osoittivat vähemmän siirtokuoppaan siirtolaisuuden vektori /native säätökennoja (* P 0,05 tai ** P 0,01, Fig. 1 D). 2D-yksikerrosviljelyissä käyttäen pitoisuuksia (sisplatiini 0-50 uM; paklitakseli 0-100 uM) alueella käytetään potilaiden hoitoon (sisplatiini 3-50 uM; paklitakseli 3-20 uM) [35], KLK4 transfektoidut SKOV- 3-solut olivat resistenttejä sisplatiinia kuin vektori /native säätökennoja (* P 0,05, täydennyskuvio. S2, vasen paneeli), vaikka vain suuntaus paklitakseli kestävyys nähtiin KLK4-transfektoiduissa soluissa (täydennyskuvio. S2, oikea paneeli ). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kaikki muutokset aiheuttama KLK4 yli-ilmentyminen oli suhteellisen joustava ja että sisplatiini sijaan paklitakseli vastus, kuten nähdään KLK7 transfektoitu SKOV-3-soluja, olisi kliinisesti merkityksellisiä fenotyypin.

KLK4 ilmentävien SKOV-3 solut muodostavat Compact MCAS että Levitä mesothelial Cell Yksikerrokset

Koska roolia homotyyppisessä soluadheesion varten EOC solujen hengissä 3D-suspension microenvironment vatsaontelones- [36] ja meidän aiempaan toteamukseen KLK7 voivat aiheuttaa sferoidi muodostumisen [23], vertasimme kyky KLK4 transfektoitujen ja kontrollisolujen muodostamiseksi MCAS /pallosia. 1, 4 ja 7 päivää ymppäämisestä, kaksi kolmesta KLK4 klooneista suuri kompakti MCAS enemmän soluja, kun taas alempi KLK4 ilmentävien KLK4-3 solut muodostivat hieman vähemmän kompakti MCAS, vektori valvontaa ja natiivi SKOV-3-soluja, jotka muodostavat pienet ja hajallaan rakeita 10% FCS, joka sisälsi media (Fig. 2A). Tämän tueksi havainnon endogeeninen KLK4 ilmentävien OVCA432 solut muodostivat kompaktimpi MCAS kuin Skov-3-solut, jotka oli vähän KLK4. Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että KLK4-ilmentävät solut muodostivat kompaktimpi MCAS kuin vektorisäädön solut päivänä 1, 4 (** P 0,01) ja 7 (*** P 0,001, Fig. 2B), samoin kuin endogeeninen KLK4 ilmentävät OVCA432 soluja verrattuna SKOV-3-soluja (* P 0,05, Fig. 2B). Kuten olemme osoittaneet, että noin aktiivinen KLK4 on sidottu tuntematon sitovia proteiineja tai serpins seerumia sisältävässä mediassa (täydennyskuvio. S1B), mikä viittaa KLK4 entsymaattinen aktiivisuus voitiin estää, kun läsnä on seerumia, käytimme seerumivapaassa olosuhteissa testata lisäämällä aktiivisen KLK4. Näissä olosuhteissa KLK4-1 solut muodostivat vähemmän kompakti MCAS (Fig. 2C) kuin se 10% FCS: ää (Fig. 2A). Lisäksi yhdistelmä-DNA-aktiivisen KLK4 (rKLK4, 50 ng /ml) indusoi natiivin SKOV-3-soluja muodostamaan MCAS enemmän samanlainen kuin havaittiin KLK4-1 kloonin taas mutantti KLK4S /A (katalyyttisesti inaktiivinen, 50 ng /ml), käsiteltiin SKOV -3 solut oli samanlainen ulkonäkö kuin SKOV-3-solujen käsitelty PBS kontrollina (P 0,05, Fig. 2C), mikä vahvistaa osallistumisen KLK4 aktiivisuuden SKOV-3 soluaggregaation. Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että aktiivinen rKLK4 käsitelty SKOV-3 solut muodostivat kompakti pallosia samalla nopeudella ja KLK4-1 soluihin, ja molemmat olivat suurempia kuin hoidettu ei-aktiivisten mutantti KLK4S /A (* P 0,01), mikä oli hieman suurempi kuin että havaitusta SKOV-3 ohjaus päivänä 4 ja 7, (** P 0,01, Fig. 2D). Nämä tiedot vahvistivat roolia KLK4 peptidaasi vuonna MCA muodostumiseen, mutta ehdotti myös mahdollisen ei-katalyyttinen toiminta KLK4 tässä prosessissa.

. MCA /sferoidi muodostuminen suoritettiin 10% FCS, joka sisälsi tiedotusvälineet 4 tunnin, päivä 1, 4 ja 7, joissa edustavat kuvat KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-1, Vec-2 klooneja, natiivi SKOV- 3 ja endogeenisen KLK4 ilmentävien OVCA432 soluja. B. kvantitatiivinen analyysi prosentteina 4 h (0 ajankohtana), joka on muodostettu kompakti MCAS (≥30 um) 1, 4 ja 7 d päässä 3 KLK4 kloonit yhdistettiin, 2 vektori kloonit yhdistettiin, natiivi SKOV-3 ja OVCA432 soluja. C. MCA muodostumiselle seerumittomassa olosuhteissa KLK4-1 klooni ja natiivi SKOV-3-soluja käsiteltiin 50 ng /ml aktiivista rekombinantti (r) KLK4or mutantti-KLK4S207A (KLK4S /A) ja PBS-kontrollin päivänä 1, 4 ja 7. D. kvantitatiivinen analyysi kompakti MCA muodostumisen KLK4-1, SKOV-3, käsiteltiin rKLK4, KLK4S /A ja PBS kontrollina yli 1, 4 ja 7d. Paneelien A ja C, mittakaava baareja, 200 m; B ja D, koe toistettiin 3 kertaa kolmen rinnakkaisen; keskiarvo ± SEM; * P 0,05; ** P 0,01; ja *** P 0,001.

tutki invasiivisuus on KLK4-MCAS kun lisätään päälle vatsakalvon mesothelial yksisoluiset kerrokset. Kirkas-kentän ja loisteputki (CellTracker

492) kuvat osoittavat, että kompakti KLK4-1 MCA kiinni live LP9 mesothelial yksikerroksisen ja vähitellen muodostunut laaja edessä leviämisen syöpäsolujen 3 päivän aikana (Fig. 3A, vasemman paneelin yläreunassa) ja jopa 7 päivää (tuloksia ei ole esitetty) vahvistetaan niiden elinkelpoisuuden ja kasvun mesothelial yksikerroksista. MCAS muodostama vektori-1 säätökennoja leviää koko mesothelial yksisolukerroksen vaikkakin vähäisemmässä määrin (Fig. 3A, ylhäällä oikealla paneeli). Koko pesäkkeitä syntyy endogeenisesti KLK4 ilmentävät OVCA432 MCAS oli samanlainen kuin transfektoiduissa KLK4-1 MCAS (Fig. 3A, alapaneeli). Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että halkaisija alojen loisteputki KLK4 MCA välys ( 6-kertainen) oli suurempi kuin Vector-1-klooni (3,5-kertainen) päivänä 3 verrattuna niiden klonaalisen valvonnan 4 h (** P 0,01, Fig. 3B). Vastaavasti, halkaisija KLK4 endogeenisesti ilmentäviä OVCA432 MCA puhdistuma päivänä 3 (7-kertaiseksi verrattuna 4 h) oli verrattavissa kuin KLK4-1 SKOV-3-klooni, kun taas natiivi SKOV-3 MCA puhdistuma (3,2-kertainen verrattuna 4 h) oli verrattavissa Vector transfektoitu SKOV-3-soluja (Fig. 3B). Konfokaaliset kuvat osoittavat, että CellTracker

492 värjätään KLK4-1, ja endogeenisesti KLK4 ilmentävät OVCA432 MCAS värjätty E-kadheriinin kasvoi mesothelial monokerrokset (Fig. 3C, ja keskijohdon paneelit), jossa on useita Z pinoaminen kuvat vahvistavat puhdistumaan mesothelial yksisolukerrokset, joita MCAS pohjaan hyvin (Fig. 3C, suurin paneelit). Vector-1 ja Skov-3 MCAS voi myös hyökätä osaksi mesothelial yksisolukerroksia mutta muodostunut pienempi tunkeutuvat pesäkkeitä johtuen vähemmän solujen määrä vastaavasti (Fig. 3C, pohja-paneelit). Nämä tiedot viittaavat siihen, että selviytymismekanismi solujen aggregaation indusoi KLK4 3D-jousitus Askites matkimalla microenvironment ja että nämä KLK4 ilmentävät palloset on lisääntynyt leviäminen kapasiteetin mesothelial kerros vatsakalvon.

. Kirkas-kentän ja fluoresenssi (CellTracker

492) kuvat osoittavat KLK4-1, Vector-1, SKOV-3 ja OVCA432 MCA (4 h ja päivä 3) puhdistumaan mesothelial yksikerroksia. Epäjatkuvasti viivat osoittavat perimeters leviämisen MCAS. B. Kvantitatiivinen analyysi osoittaa, keskimääräinen halkaisija 10 MCAS 3 erillisestä kokeesta ja edellä solulinjoissa 4 h ja päivänä 3 vastaavasti; keskiarvo ± SE, n = 3, ** P 0,01. C. IF mikroskopia kuvat osoittavat mesothelial yksikerroksista puhdistumaan MCAS muodostaman KLK4-1 merkitty CellTracker

492, Vector-1, OVCA432 ja Skov-3-solut värjättiin E-kadheriinin vasta-aine (vihreä); sekä MCAS ja mesothelial LP9 solut värjättiin falloidiinia F-aktiini (Alexa Jauhot 568, punainen) ja DAPI varten ytimet (sininen) vastaavasti; epäjatkuva viivat osoittavat sijainnit useista Z kohdat näkyvät oikealla ja alhaalla paneeleja. Paneelien A ja C, mittakaava baareja, 50 pm.

KLK4 esto Lisääntynyt Paklitakseli Herkkyys

Vaikka KLK4 transfektoidut SKOV-3-solut olivat resistenttejä sisplatiinia kuin vektori /natiivi ohjaus solut (täydennyskuvio. S2, vasen paneeli), ei ole eroa sisplatiinia reagointia välillä havaittiin KLK4 ja vektori /native ohjaus solujen 3D-suspensioon (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, vaikka vain suuntaus paklitakseli kestävyys nähtiin KLK4-transfektoituja soluja 2D-yksikerroksista (täydennyskuvio. S2, oikea paneeli), KLK4-MCAS 3D-keskeytys selvästi vastustuskykyisempiä paklitakseli kuin vektori /native soluja ( ** P 0,01, Fig. 4A). Erityisesti, tiivistys KLK4-1 MCAS pelkistettiin lisäämällä KLK4 estävää vasta-ainetta, jonka konsentraatio (10 ug /ml) ja tallentaa kaikki aktiivisen entsyymin tai selektiivisen aktiivisen KLK4 auringonkukka trypsiini-inhibiittoria (SFTI-FCQR), verrattuna niiden asianmukaiset tarkastukset (Fig. 4B, vasemmalla ja keskellä paneelit). Samoin, tiivistyminen endogeenisesti ilmentäviä OVCA432 MCAS pelkistettiin lisäämällä SFTI-FCQR (Fig. 4B, oikea paneeli). Lisäksi, vaikka 1 uM SFTI-FCQR yksinään ei leviämisen vähentämiseksi (tietoja ei esitetty), se vähentää merkittävästi KLK4-1 ja OVCA432 MCA eloonjäämisen yhdistettynä hoidon paklitakselilla (** P 0,01, Fig. 4C). Mielenkiintoista, yleinen seriiniproteaasiestäjän, aprotiniini, osittain pelkistetyt tiivistyminen MCAS muodostaman KLK4-1 ja OVCA432 soluja (Fig. 4B, alapaneeli) ja lisääntynyt herkkyys paklitakselille (* P 0,05, Fig. 4C), vaikkakin vähemmässä määrin kuin SFTI-FCQR. Nämä tiedot korosti KLK4-MCAS kestävät paklitakseli ja vähentää MCA tiivistymisen KLK4 saarto lisääntynyt herkkyys tätä lääkettä.

WST-1 määritys esittää solujen selviytymisen KLK4-1, KLK4-2, KLK4-3, Vec-1, Vec-2 klooneja ja natiivi SKOV-3 MCAS paklitakselin jälkeen (A) käsittely 3D-jousitus. B. Vasen paneeli, edustavat kuvat KLK4-1 MCAS päivänä 4 hiirellä IgG ja toiminnallinen KLK4 estävän vasta-aineen, PBS kontrollina ja KLK4 selektiivinen SFTI-FCQR (SFTI) esitetyllä tavalla. Oikea paneeli, edustavat kuvat OVCA432 MCAS päivänä 4 PBS kontrollina ja KLK4 selektiivinen SFTI-FCQR (SFTI) tai aprotiniinia kuten. Mittaviivat 200 um. C. Solujen eloonjääminen määritettiin WST-1 määrityksessä jälkeen paklitakselihoidon (Pac) 3D-jousitus viljellyt KLK4-1 klooni ja OVCA432 solujen +/- 1 uM SFTI tai 5 uM aprotiniinia (Aprot). Kokeet kentät A ja C toistettiin 3 kertaa kolmena kappaleena, pylväät edustavat Mean ± SEM. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.