Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain kehitys edellyttää angiogeneesiä ja angiogeneesiä vastaan ​​hoitojen on otettu käyttöön syövän hoidossa. Tässä yhteydessä heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPGs) esiin kiinnostaviin tavoitteita, koska niiden toiminta kuin koreseptorit suurten, pro-angiogeenisten tekijöiden. Näin ollen aiemmat tutkimukset ovat viitanneet siihen, antituumorivaikutuksia hepariinin,

so.

Yli-sulfatoitu HS, ja erilaiset hepariinia jäljittelijät; kuitenkin merkittävä haitta on niiden epäspesifinen toimintamekanismia ja mahdollisesti vakavia sivuvaikutuksia, jotka liittyvät heidän antikoagulantti ominaisuuksia. Täällä olemme tutkineet käyttö ihmisen ScFv anti-HS-vasta-aineita (αHS) kuin järkevämpi lähestymistapa kohdistaa HSPG toiminto endoteelisolujen (EC). αHS valittiin alun perin niiden tunnustamista HS epitooppien lokalisoitu valikoivasti verisuonistoon potilaan glioblastoma kasvaimet,

ts.

erittäin angiogeenisen aivokasvaimia. Yllättäen huomasimme, että nämä αHS näytteillä voimakas angiogeneesiä vaikutuksia ensisijainen ihmisen EC: issä. αHS oli osoitettu stimuloivan EY erilaistumista, joka oli yhteydessä lisääntyneeseen EY putken muodostumiseen ja lisääntymistä. Lisäksi αHS tuetaan EY selviytymisen hypoksiaolosuhteissa ja nälkään,

ts.

Tyypillisissä kasvaimen microenvironment. Tärkeää on, αHS välittämä proliferaation tehokkaasti vasta- toiminut hepariinin ja oli poissa HSPG puutteesta mutanttisoluja, vahvistaa HS-konkreettisia vaikutuksia. On mekanistinen tasolla sitoutuminen αHS on HSPGs ECS sekä glioblastoomasolut havaittiin laukaisevan p38 MAPK-riippuvainen signalointi johtaa lisääntyneeseen leviämisen. Voimme päätellä, että useita αHS jotka tunnistavat HS epitooppeja runsaasti kasvaimen verisuonistossa voi saada aikaan angiogeneesiä vasteen, mikä vaikuttaa kehityksen vasta-pohjainen kohdistaminen HSPGs syövän.

Citation: Christianson HC, van Kuppevelt TH, Belting M (2012) ScFv Anti-heparaanisulfaatin Vasta Yllättäen Aktivoi endoteelisolujen ja syöpäsolujen kautta p38 MAPK: vaikutukset Vasta-Based kohdentaminen heparaanisulfaattiproteoglykaanit in Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49092. doi: 10,1371 /journal.pone.0049092

Editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 elokuu 2012; Hyväksytty: 08 lokakuu 2012; Julkaistu: 09 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Christianson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ruotsin Cancer Fund; Ruotsin Research Council; Ruotsin Society of Medicine; physiographic Society, Lund; Gunnar Nilsson, Lundgren ja Kamprad säätiöt; Skånen yliopistollisen sairaalan lahjoitusvaroin; ja valtionrahoituksessa kliinisen tutkimuksen puitteissa kansanterveyslaitosten (ALF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etenemistä pahanlaatuisiksi osaksi ilmeisen kasvaimen kehitys vaatii rekrytointi verisuonten,

eli

angiogeenisen kytkin [1], [2]. Angiogeneesi on monivaiheinen prosessi riippuu endoteelin (EY) lisääntymisen, migraation ympäröivään kudokseen ja lopulta erilaistumista uuden aluksen. Sitovat useiden angiogeenisten tekijöiden,

esim

VEGF-A, FGF, ja HB-EGF heparaanisulfaatti (HS) polysakkaridiketjuja korostaa HS proteoglykaanien (PG) EY: biology [3] – [5] . HSPGs toimivat yhteistyössä reseptoreita, että esillä olevan kasvutekijöiden niiden korkean affiniteetin tyrosiinikinaasin signaloinnin reseptoreita solun pinnalla [6], [7]. Laajat postsynthetic muutoksia lineaarisen HS ketjuja, joka koostuu toistuvien N-asetyyliglukosamiinin ja glukuronihapon disakkaridiyksiköistä, ovat sulfaatio eri kohdissa pitkin ketjua, mikä johtaa negatiivisesti varautuneita aloilla, jotka tarjoavat sitoutumiskohdat erilaisia ​​kasvutekijöitä, proteaasit ja sytokiinit osallistuvat kasvainten kehittymiseen [3] – [7]. Vastaavasti hiiren alkioiden muokattu ilmentämään VEGF-A puuttuu HS-sitoutuva sekvenssi osoitti laskua kapillaarisen haaran muodostumiseen [8], ja siirtogeenisen hiiren mallia joko homotsygoottinen deleetio HS-sitovan motiivin PDGF-BB tai pienentää HS sulfation, näytetään vialliset pericyte rekrytointi ja peitettynä mikrovaskulaarisen anatomia [9], [10]. Altered säätelevien entsyymien mukana muokkaamassa hienorakennetta HS ketjut ovat sekaantuneet syöpä,

esim

geeni hypermetylaation välittämän geenien 3-O sulfotransferaasien ja HSulf-1 löydettiin useita syöpiä [11], ja HSulf-2 yli ilmentyminen korreloi lisääntynyt angiogeneesiä ja kasvutekijää sitova kapasiteetti rintasyövässä [12]. Edelleen, HS-halventavaan heparanaasin on liittynyt taudin etenemiseen ja köyhien potilaiden hoitotuloksiin läpi remontin kasvaimen microenvironment [13]. HSPGs on siten osallisena useita näkökohtia kasvaimen kehitystä ja angiogeneesi; kuitenkin, rooli HSPG tavoitteeksi anti-angiogeneesin käsittely on määriteltävä. Itse asiassa, useita strategioita on tutkittu, jotta tämän tarkoituksen saavuttamiseksi, mikä tärkeintä HS jäljittelevät hepariini ja sen johdannaiset [14] – [18]. Suurimmat haitat nämä yhdisteet ovat niiden suhteelliset epäspesifistä muodot kohdentamista, ja merkittäviä riskejä vuotokomplikaatioiden liittyvien antikoagulanttihoidolle toimintaan. Muita mahdollisia HS-kohdennettuja hoitoja syövän hoitoon liittyy proteiineja tai peptidejä, joilla on positiivisesti varautuneita aminohappotähteitä, jotka toimivat kilpailevina inhibiittoreina kasvutekijää sitova HS ketjuja [19].

Vasta-aineisiin perustuvia hoito on yksi nopeimmin kasvavia terapia-alueilla lääketieteellisessä onkologian ja vasta kohdistaminen VEGF, epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 (HER-2), EGF-reseptorin tai CD20 on hyväksytty hoidossa

esim

metastaattisen rintasyövän ja paksusuolen ja peräsuolen syövän ja aggressiivinen B- solulymfooma [20]. Pienemmät rekombinanttivasta-aineita, kuten single-ketjun vaihtelevan fragmentti (scFv) vasta-aineet ovat mielenkiintoisia vaihtoehtoja parani kohdistaminen johtuen niiden suotuisan farmakokinetiikkaa [21] – [23]. Mielenkiintoista on, että van Kuppevelt ja työtoverit ovat aiemmin kuvattu kehittäminen ja karakterisointi useita epitooppispesifisten, phage display johdettu, ScFv αHS koetin rakenteellista monimuotoisuutta HS ketjujen eri kudoksissa [24], [25]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme yrittäneet identifioida ScFv αHS jotka tunnistavat HS epitooppeja ilmaistuna verisuoniston potilaan glioblastooma kasvaimia, ja edelleen tutkittiin niiden käyttöä αHS putatiivisena strategia estää eri näkökohtia EY-toiminto.

tulokset

tunnistaminen αHS kloonit, jotka tunnistavat HS epitoopit kasvaimen verisuonistossa

aluksi pyrittiin määrittämään αHS klooneja, joiden tiedetään epitoopin erityispiirteet (taulukko 1) [26], jotka voivat tunnistaa verisuonten kapealla potilaan glioblastooma kasvaimia. Tämä kasvaintyyppi valittiin perustuu sen tunnettu ilmiasun hypoksian indusoiman angiogeneesin ilmenee syvällinen EY liikakasvu [27]. Kuten on esitetty kuviossa. 1A-D, kolme erillistä αHS klooneja (AO4B08, EV3C3, ja HS4E4) edullisesti värjättiin HS-epitooppien lokalisoitu kasvaimen verisuonistoon,

eli

αHS osoitti vahvaa kolokalisaation EY: n kanssa markkereita von Willebrand -tekijä (vWF) ja integriini avp3, joista jälkimmäinen on tunnettu merkkiaine aktivoidun endoteelin [28]. HS tunnistamia epitooppeja samoja αHS aineiden havaittiin ilmaistaan ​​myös ensisijaisen ihmisen EC (HUVEC) (Kuva. S1A-C). Spesifisyys αHS HS

in vitro

osoitettiin merkittävästi alentunut sitoutumalla hankittua hoidon jälkeen heparanaasin lyase että entsymaattisesti huonontaa HS (Fig. S1D). Spesifisyys αHS HS päti myös

in vivo

glioblastoma ksenografti- kasvainleikkeissä, kuten heparanaasin hoito johti täydellinen menetys αHS värjäyksen (kuvio. 1 E, oikea yläpaneeli). Me seuraavaksi suoritetaan värjäykset vasta-aineen kanssa (3G10), joka on tunnettu tunnistamaan spesifisesti HSPG-ydinproteiinia, joiden jäljellä oleva HS tynkä hoidon jälkeen heparanaasin, mutta joka ei tunnista joko vapaana HS ketjut tai ehjä HSPG [29]. Hoitamaton tuumorisektioiden osoittaneet mitään värjäytymistä 3G10 (Fig. 1 E, alempi vasen paneeli), kun taas tuumorisektioiden käsitelty heparanaasin näkyvissä merkittävää positiivisuus varten 3G10 epitoopin pääasiassa lokalisoitu aluksen kaltaisia ​​rakenteita, jotka läheisesti muistutti αHS värjäyksen malli (vrt. 1E, oikea alapaneeli ja ylempi vasen paneeli). Yhdessä nämä tutkimukset tunnistaa useita αHS klooneja, jotka tunnistavat HS epitooppeja liittyvät ehjät HSPGs runsaasti verisuonten kapealla glioblastooma kasvaimia.

, Patient glioblastoma tuumorisektioiden värjättiin HS käyttäen αHS vasta AO4B08 (A ja D) , EV3C3 (B) tai HS4E4 (C) (vihreä) ja vWF (A-C, endoteelimerkkiaineelle, punainen) tai integriini avp3 (D, markkeri aktivoitu endoteelin, punainen), ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla. Vahva yhteistyö yhdistyksen välillä HS epitoopit ja verisuonien osoitetaan sulautunut kuvia (A-D, oikea paneelit, keltainen). Kuvissa edustavat kolmea eri kasvaimia ja vähintään viiteen osaan per kasvain, ja saatiin 20-kertainen suurennus. Mittakaava, 50 uM. E, Ylä paneelit: spesifisyys αHS arvioitiin AO4B08 värjäämällä U-87 MG glioblastoma ksenografti tuumorisektioiden seuraavat joko ei käsittelyä (Ctrl) tai esikäsittely heparinaasilla III lyase (HS lyase) sulattaa HS. Alempi paneelit: 3G10-vasta-ainetta käytettiin tunnistamaan HS stubs of HSPGs jälkeen jäljellä HS lyase ruuansulatusta. Expecedly, 3G10 värjäytyminen ei ollut havaittavissa käsittelemättömän kasvainleikkeissä ehjät HS (Ctrl, vasen paneeli); kuitenkin, 3G10 värjäys HS lyase käsiteltyjen näytteiden (oikea kuva) esittää aluksen kuviona että pitkälti muistuttaa AO4B08 värjäytymistä (ylempi vasen paneeli). Mittakaava, 20 uM.

toiminnallinen vaikutukset αHS in Primary Human EC

Perustuen olettamukseen, että HSPGs ovat sopivia kohteita anti-angiogeenisen hoidon [3] – [10], [13] – [18] seuraavan kerran suoritetaan joukon toiminnallisia tutkimuksia ensisijaisesti ihmisen hankittua. Yhdenmukainen roolin HSPGs EY: n toiminto, HS jäljittelevää hepariinin lyhensi EY proliferaatiota annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2A). Sama päti että hepariini yhdistettä tintsapariininatrium (Fig. 2B), joka on laajalti käytetty antikoagulantti, ja se on tällä hetkellä tutkittavana sen kasvaimen estäviä vaikutuksia in keuhkosyöpäpotilaita (https://clinicaltrials.gov/ct2/näytä /NCT00475098? aikavälin = tinzaparincancer sijoitus = 7).

, HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ilmoitettujen pitoisuuksien joko hepariinia (A) tai pienimolekyylisen hepariinin, tintsapariininatrium (B ). Solujen proliferaatio määritettiin mittaamalla sisällytetty [

3H] tymidiinin yli 48 tunnin jakson ajan. C, HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ilman (Ctrl) tai läsnä AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) 72 tuntia. Solujen morfologia visualisoitiin kristalliviolettia värjäys, ja jää käyttäen käänteisvalomikroskoopilla varustettu digitaalikameralla. Vasen ja puolivälissä paneelit esittävät edustaja kuvaa pitkänomaisen EY fenotyypin αHS saaneilla verrattuna kontrolli soluihin. Oikea paneeli esittää kvantitatiivisen analyysin siitä, kuinka kauan yksittäiset solut kolme erillistä mikroskooppikentäs- kuoppaa kohti (n = 4), käyttäen Image J ohjelmisto. D, HUVEC viljeltiin matrigeeliä,

eli

kasvaimeen johdettu soluväliaineen, seerumivapaassa väliaineessa ilman (Ctrl) tai läsnä AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) ja niiden annettiin muodostaa putkia noin 20 tuntia. Vasen ja puolivälissä paneelit esittävät edustavia kuvia lisääntyneestä putken muodostumista αHS saaneilla verrattuna kontrolli soluja vähintään kolmen erillisen kokeen. Oikea paneeli esittää määrällinen analyysi lukumäärän ennallaan putkia kolmesta mikroskooppikentäs- kuoppaa kohti (n = 4) käyttäen Image J ohjelmisto. E ja F, αHS stimuloi EY proliferaatiota: HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa läsnä ollessa tai ilman AO4B08 (αHS) ilmoitettuina pitoisuuksina ja arvioitiin lisääntymistä [

3H] -tymidiinin ajan 3 tuntia. F, HUVEC alistettiin solusyklin vaihe analyysi 6 tunnin jälkeen ilman (Ctrl) tai AO4B08 (αHS) käsittely. Fraktio soluja vastaavassa solusyklin vaihe määritettiin virtaussytometrialla seuraavasti ydin- propidiumjodidilla. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. * Tilastollisesti eroaa käsittelemättömästä Ctrl, P 0,05.

Merkittävä haittapuoli hepariinin on niiden epäspesifinen toimintamekanismia ja mahdollisesti vakavia haittavaikutuksia. Olemme näin ollen päättänyt tutkia mahdollisuutta vasta-aineisiin perustuvassa kohdentamista HS kuin tarkempi ja järkevä antiangiogeenisiä strategia, aluksi tutkimalla yhtä aiemmin valitun αHS,

ts.

AO4B08, EY: n funktio. AO4B08 käsiteltiin hankittua näkyy pitkänomainen morfologia, jossa on noin 75% lisäys Keskimääräinen solu pituus verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 2C). EY venymä tiedetään liittyvän putken muotoilu ja itäneet EY fenotyyppi [30]. Niinpä AO4B08 todettiin edistää putken muodostumiseen 2-kertainen verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 2D). Lisäksi αHS havaittiin merkittävästi lisäämään EY proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla maksimaalinen stimulaatio on noin 3,5-kertainen verrattuna kontrolli (Fig. 2E). Erityisesti AO4B08 välitteistä stimulaatiota EY leviämisen osoitettiin jo 3 tuntia hoidon, mikä viittaa suhteellisen nopean toiminnan. Vaikutus AO4B08 EY: n leviämisen säilyi 24 h AO4B08 hoidon (Fig. S2). Stimulointi EY lisääntymisen AO4B08 tuki lisäksi lisääntynyt osa solujen S-vaiheen ja vastaavan alennuksen G1-vaiheen AO4B08 käsitelty verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 2F).

αHS Suojaa ensisijainen Ihmisen EC päässä hypoksia ja Starvation Associated Cell-kuolema

koska hypoksia ja ravinteiden puute ovat tunnusomaisia ​​piirteitä kasvaimen microenvironment [31], ja kuten hypoksia on osoitettu moduloida solun pinnan HS koostumus hankittua osaksi lisääntynyt kasvutekijää sitova kapasiteetti [32], päättelimme, että vasta-aine-välitteinen lukkiutuvat HS voi herkistää hankittua yhteydessä hypoksian ja nälkään. Tätä varten hankittua viljeltiin hypoksian (1% O

2) läsnä ollessa tai poissa ollessa AO4B08, ja arvioitiin apoptoosin analyysillä katkaistun kaspaasien. Seerumistarvaatio hypoksisten hankittua aiheuttama kaspaasi 3 ja 7 aktivoinnin hankittua ja kiinnostavaa, kaspaasi katkaisu tehokkaasti vasta- toiminut by AO4B08 hoito (Fig. 3A). Edelleen näiden tietojen perusteella, AO4B08 osoitettiin lisäävän merkittävästi elinvoimaisten hankittua on hypoksinen ja seerumin-puutostiloja (Fig. 3B). Kaikkiaan edellä tiedot viittaavat, että αHS osoitettu tunnistavan verisuonien asuva HS rakenteet voivat käyttää angiogeneesiä vaikutuksia hankittua.

, HUVEC kasvatettiin 72 tunnin kokonaan väliaineessa (10% FBS), seerumin väliaineessa, tai seerumivapaassa väliaineessa, jota oli täydennetty AO4B08 (αHS, 3 ug /ml), kuten on osoitettu, hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2). Solulysaatit analysoitiin yhteensä ja pilkotaan kaspaasi-3 ja 7 sekä α-tubuliinin immunoblottauksella. Ylähavas esitetään edustavat immunobloteilla kolmesta itsenäisestä kokeesta. Alempi paneeli osoittaa määrällisesti pilkkoa kaspaasin /yhteensä kaspaasi suhteet edustavasta kokeesta. B, HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ilman (Ctrl) tai läsnä AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) hypoksisissa olosuhteissa 72 tuntia, ja sitten värjättiin kristallivioletilla. Vasen paneeli näyttää edustavat kuvat värjättyjen solujen. Oikea paneeli näyttää määrällinen analyysi eläviä soluja. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. * Tilastollisesti eroaa käsittelemättömästä Ctrl, P 0,05.

αHS Mediated solustimulointi on ominaista HS mutta ei ole HS Epitooppi tai Cell Erityiset

tutkimme seuraavaksi spesifisyyden toiminnallisen vaikutukset αHS. AO4B08 stimulaatio EY leviämisen ilmestyi riippuvat tiukasti HS sitova kuten on osoitettu tehokkaasti kääntyminen hepariinilla annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4A). Jo alhaisin hepariinia käytetty pitoisuus (10 ug /ml), noin 75% AO4B08-riippuvaisen proliferaation estyi, ja 100 ug /ml vaikutus oli täysin kumottu (Fig. 4A). Tärkeintä, lisäksi havaittu, että ylimääräinen αHS kloonit osoitettu tunnistavan glioblastoma kasvaimen verisuoniston, HS4E4 ja EV3C3 (Fig. 1), joka myös stimuloi EY proliferaatiota, ja että tämä vaikutus oli tehokkaasti vasta-toimi hepariinia (Fig. 4C). On syytä huomata, että leviäminen kokeita kuviossa. 2A, soluja käsiteltiin hepariinilla 48 tuntia, kun taas αHS kääntyminen kokeissa soluja inkuboitiin hepariinin vain 3 h (Fig. 4A ja C). Tärkeää on, eri variantit CS,

ts.

Glykosaminoglykaanin läheisesti hepariini, ei pystynyt kääntämään stimuloivaa vaikutusta αHS (Fig. 4B). Lisäksi näissä olosuhteissa, hepariinia (10 ug /ml) tehokkaasti inhiboi αHS solupintasitomis- (Fig. S3B). Vaikka nämä tulokset osoittavat, että αHS-välittyvät vaikutukset EY: n proliferaatioon ovat HS, mutta jotka eivät rajoitu tiettyyn HS epitoopin, stimuloivan vaikutuksen näkyi voimakkaimmin EV3C3 seuraa AO4B08 ja HS4E4 (Fig. 4C). Nämä tulokset näyttivät korreloivan solun pinnalla runsaasti vastaavien αHS epitooppi,

ts.

Hankittua sitoudu ensisijaisesti αHS järjestyksessä EV3C3 AO4B08 HS4E4 (Fig. S3A). Edelleen vaikutus eri αHS klooneja ei näyttänyt olevan suoraan yhteydessä solujen jakautumista niiden epitoopin, kuten AO4B08 ja HS4E4 värjäykset näkyvät samanlaista mallia pitkin kennon kehää, kun taas EV3C3 osoitti hajanaisemman värjäys lisääntynyt tiheys kohti perinuclear alue (Fig. S1A-C).

A, HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ilman (valkoiset pylväät) tai kun läsnä on AO4B08 (mustat palkit; 1,25 ug /ml) ja osoitettujen pitoisuus hepariinia 3 h ja arvioitu solujen lisääntymistä, jonka [

3H] tymidiininsisällytysmääritys. * Tilastollisesti eroaa käsittelemätön kontrolli, P 0,05; # Tilastollisesti eroaa AO4B08 saaneista, P 0,05. Ohjaus soluja inkuboitiin ilman vasta-ainetta. B, HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ilman (valkoiset pylväät) tai kun läsnä on AO4B08 (mustat palkit; 1,25 ug /ml) ilman (Ctrl) tai CS-6, CS4, tai CS-0 (10 ug /ml), kuten on osoitettu. Solujen proliferaatio määritettiin [

3H] tymidiinin määritystä. * Tilastollisesti eroaa käsittelemätön kontrolli, P 0,05. C, HUVEC kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ilman (valkoiset pylväät) tai hepariinin läsnä ollessa (mustat palkit; 10 ug /ml) kanssa tai ilman eri αHS vasta-ainetta klooneista (1,25 ug /ml), kuten on osoitettu. Solujen proliferaatio määritettiin [

3H] tymidiinin määritystä. * Tilastollisesti eroaa käsittelemätön kontrolli, P 0,05; # Tilastollisesti eroaa αHS saaneista, P 0,05. D, Villityypin (CHO-K1-solut) ja PG puutteellinen (PgsA-745) CHO-soluja kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa poissa tai läsnä ollessa eri αHS vasta-ainetta klooneista (1,25 ug /ml), kuten on osoitettu. Solujen proliferaatio määritettiin [

3H] tymidiinin määritystä. * Tilastollisesti eroaa käsittelemätön kontrolli, P 0,05; # Tilastollisesti eroaa αHS saaneista CHO-K1-soluissa, P 0,05. E ja F, Human napavaltimon EC (HUAECs, E) ja U-87 MG glioblastoomasolut (F) kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa, kun läsnä on AO4B08 (αHS) ilmoitettuina pitoisuuksina ja lisääntymistä määritettiin [

3H] tymidiinin määritystä. * Tilastollisesti eroaa käsittelemätön kontrolli, P 0,05.

spesifisyys αHS ja riippuvuus HSPG niiden stimuloivia vaikutuksia olivat seuraavaksi tutkittiin käyttäen villityypin (CHO-K1) ja mutantti (pgsA- 745) CHO-soluja, geneettisesti puutteellinen ksylosyylitransferaasin (XT). XT katalysoi ensimmäinen askel HSPG kokoonpano,

so

. sidoksen ksyloosin tiettyihin seriinitähteiksi PG ydinproteiinia. PgsA solut ilmentävät noin 5% HSPG verrattuna villityypin soluihin [33]. Treatment of CHO-K1-solujen AO4B08, EV3C3 sekä HS4E4 johti lähes 2-kertainen proliferaation, joka osoittaa, että stimuloiva vaikutus αHS ei rajoitu HUVEC-soluja (Fig. 4D). Tämä käsite vahvisti se havainto, että αHS indusoi leviämisen ihmisen napavaltimon EC (HUAEC),

eli

toinen lähde ensisijainen ihmisen EC, sekä ihmisen glioblastoomasolulinjan-line U-87 MG on annoksesta riippuvaisella tavalla ja samassa määrin kuin HUVEC (Fig. 4E ja F). Tärkeää on, HSPG-puutteelliset mutanttisolut oli reagoimatta kaikki tutkittu αHS (Fig. 4D), joka tarjoaa geneettistä näyttöä siitä, että αHS aktivaatio soluproliferaation edellyttää häiriöttömät HS-toiminto.

αHS Dependent proliferaation johon liittyy p38- MAPK Signaling aktivointi

vieressä halusimme selventää, onko αHS indusoi soluproliferaatiota mukana tiettyyn signalointireitin. Käyttämällä fosforylaatio-spesifinen reseptori tyrosiinikinaasin array, olemme huomanneet, että αHS hoito ei aktivoida reseptorit tunnettuja HS sitovat kasvutekijät,

eli

FGF, PDGF, ja VEGFs, verrattuna käsittelemättömiin EC (Fig. 5A ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että mekanismi αHS välittämää stimulaatio hankittua ei johdu suoraan jäljitteleviä vaikutus HS-sitojaligandit. Mielenkiintoista on, käyttäen fosforylaation-spesifisiä kinaasin array, αHS hoidon todettiin olevan huomattavasti aiheuttaa fosforylaatio p38 MAPK (noin 2,5-kertainen) verrattuna käsittelemättömiin EC (kuvio. 5B). Array tiedot vahvistettiin western blottauksella, mikä osoittaa, ajasta riippuvainen ja ohimenevää induktion p-p38 MAPK by αHS (Fig. 5C). Lisäksi, fosforylaatio CREB, tunnettu alavirran kohde p38 MAPK [34], näytti lisätä, kun αHS hoitoon (noin 35% verrattuna kontrolli) (Fig. 5B). Kuitenkin, fosforylaatio toinen MAPK laajasti osallisena leviämisen signalointi, solunulkoisen signaalin säännelty kinaasin 1/2 (ERK1 /2), ei ollut vaikutusta αHS hoitoa (kuvio. 5B). Vaikutus αHS on p38 MAPK aktivaatiota näytti olevan hieman yleisempi ilmiö, koska samanlainen vaste havaittiin mikrovaskulaarisen hankittua eristetty hiiren keuhkoissa (Fig. 5D) [35] sekä U-87 MG glioblastooma-soluissa (kuvio . S4A).

HUVEC inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa tai ilman αHS (AO4B08; 1,5 ug /ml) ja 5, 15, 45, ja 60 min, ja fosforyloitu reseptori tyrosiinikinaasi-proteiinit määritettiin yhdistetyistä solulysaateista ihmisen anti-fosfo-reseptorin tyrosiinikinaasin vasta-erilaisia ​​analyysi kuten kohdassa

Methods

. Esitetyt tulokset edustavat immunobloteilla kahdesta itsenäisestä kokeesta. Merkityillä alueilla osoittavat FGFR, sarake 1: FGFR1; 2: FGFR2; 3: FGFR3; 4: FGFR4. PDGFR, sarake 1: PDGFRα; 2: PDGFRβ; 3: SCFR; 4: Flt3. VEGFR, sarake 1: VEGFR1; 2: VEGFR2; 3: VEGFR3. B, HUVEC inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa tai ilman αHS (EV3C3; 1,5 ug /ml) ja 5, 15, 45, ja 60 min, ja fosforyloitu kinaasiproteiinien määritettiin yhdistetyistä solulysaateista ihmisen anti-fosfo-kinaasi-vasta-array analyysi kuten kohdassa

Methods

. Vasen paneeli näyttää edustavan immunobloteilla kolmesta itsenäisestä kokeesta. Oikea paneeli näyttää kvantifiointiin p-p38 MAPK, p-CREB, ja p-ERK1 /2 tasoa eri olosuhteissa, esitetään suhteelliset intensiteetit

vs.

Array viittaus (punainen laatikko). C, HUVEC olivat joko käsittelemättömiä (Ctrl) tai inkuboitiin αHS (AO4B08, 1,25 ug /ml) osoitetun ajanjaksojen seurasi immunoblottaus ja fosfo-p38 MAPK, yhteensä p38 MAPK ja α-tubuliinin. Vasen paneeli näyttää edustavan immunobloteista kolmen erillisen kokeen. Oikea paneeli esittää määrällisesti suhteellisen fosfo-p38 MAPK tasojen (P-p38 /α-tubuliinin) edustavasta kokeesta. D, Sama koe kuin (C) suoritettiin hiiren keuhkon mikrovaskulaarisen hankittua, joissa näkyi vertailukelpoinen induktio p38 MAPK fosforylaation αHS kuten HUVEC. E-F, αHS aiheuttama proliferaatio on riippuvainen p38 MAPK. Proliferaatio määritettiin [

3H] tymidiinin hiiren EC (E) ja U-87 MG glioblastoomasolut (F) käsittelyn jälkeen p38-MAPK-inhibiittori SB203580 (1 uM) ja /tai αHS (AO4B08; 1,25 ug /ml) 3 tuntia, kuten on osoitettu. Tyvisolusyöpä lisääntymistä ei merkittävästi vaikuttanut p38 MAPK esto taas αHS aiheuttama proliferaatio oli lähes täysin päinvastainen. * Tilastollisesti eroaa käsittelemätön kontrolli, P 0,05; # Tilastollisesti eroaa αHS-käsitelty, P 0,05.

Useat kasvutekijät, ehkä kaikkein tärkeintä pro-angiogeenisten FGF, VEGF, ja PDGF on havaittu käynnistävän p38 MAPK aktivaation tietyissä solutyypeissä [ ,,,0],36]. Meillä on siis suoritettu useita angiogeneesin ja tyrosiinikinaasi-reseptorin fosforylaation vasta-aineen array kokeita selvittämään, onko solu stimuloivia vaikutuksia ja p38 MAPK aktivaatio αHS voi olla toissijainen spesifisten kasvutekijöiden ja niiden signaloinnin reseptoreihin. Emme kuitenkaan löytäneet merkittäviä induktio αHS jompikumpi näistä kasvutekijöiden tai niiden reseptorien (tuloksia ei ole esitetty). Suoraan tutkia toiminnallisen merkityksen p38 MAPK signaloinnin αHS välittämän leviämisen, käytimme vakiintunut p38 MAPK estäjä SB203580 [34], [37]. Odotetusti, inhibiittori tehokkaasti vasta-toimi p38 MAPK-aktivaation HUVEC-soluja (kuvio. S4b), ja see- sekä αHS-välitteisen p38 MAPK alavirran kohde CREB (Fig. S4C). SB203580 on osoitettu estävän pohjapinta p-CREB (Fig. S4C) ja proliferaation ei-stimuloiduissa HUVEC-soluja (tietoja ei esitetty), mutta ei hiiren EC: issä, ja U-87 MG glioblastooma-soluissa (kuvio. 5E ja F),

eli

lisätutkimuksia tehtiin jälkimmäisessä solutyypeissä. Mielenkiintoista, αHS-indusoitua proliferaatiota hiiren EC (Fig. 5E) sekä glioblastoomasolut (Fig. 5F) on vaimentaa tehokkaasti p38 MAPK inhibition. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sitoutuminen αHS solun pinnan HSPGs ECS sekä glioblastoomasolut laukaisee p38 MAPK-riippuvaisen signalointireitin johtaa lisääntyneeseen proliferaatioon.

Keskustelu

Vasta perustuu kasvaimen verisuonten kohdistaminen syövän hoitoon perustuu siihen, että kasvaimet vaativat angiogeneesiä jotta laajentaa ja etäispesäkkeitä, ja että EC kohtaavat ontelon verisuonten ja siten ovat suhteellisen saatavilla systeemistä hoitoa. Ajatuksena on HSPG-suunnatun kasvainhoitojen on mahdollisuus monen samanaikaisen kohdistaminen joidenkin keskeisten pro-angiogeenisten proteiinien, tärkeintä VEGF-A, FGF, HB-EGF, PDGF ja IL-8, joka voi edistää tuumorin angiogeneesiä on osittain tarpeeton tavalla vaikuttaa hoitoon vastus. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet useita αHS klooneja, jotka tunnistavat HS epitooppeja ilmentyy runsaana verisuoniston pahanlaatuisten gliooman kasvaimia. Yllättäen olemme huomanneet, että nämä αHS stimuloivat useiden kohtien EY toiminnon

ts.

Erilaistuminen, putken muodostumiseen, leviämisen ja kestävyys hypoksia ja nälkään riippuvaisten solu- kuolema. Tulosten mukaan nämä vaikutukset ovat erityisen riippuvaisia ​​αHS sitovia, ja jotka eivät liity epäspesifiset vuorovaikutukset. Tärkeää on, että stimuloiva vaikutus näytti mukana useita HS epitooppeja, kuten AO4B08, EV3C3 sekä HS4E4 kaikki näkyvissä on stimuloiva vaikutus, joka näytti olevan suoraan korreloi niiden solupinnan runsautta hankittua. Lisäksi αHS aiheuttama stimulaatio havaittiin kolme erilaista ensisijaista hankittua,

eli

HUVEC, HUAECs, ja hiiren keuhkon mikrovaskulaarisia hankittua, sekä transformoituja CHO-soluissa ja ihmisen U-87 MG glioblastoomasoluista, mikä viittaa siihen, että havainnot on yleisempi merkitys.

Aikaisemmissa tutkimuksissa antaa tukensa käsitteen HSPG oleellisena kohteena syöpähoidon [7] – [18]. Nämä strategiat on pääosin keskittynyt hepariini, sen johdannaiset ja muut polyanioninen yhdisteitä, kuten suramiini [18]. Muita keinoja puuttua HSPG toiminto sisältää vääriä substraatteja HS biosynteesin,

ts.

Xylosides [38], esto HS hajottavien entsyymien [39], ja geneettinen manipulointi HS biosynteettisissä koneet [40]. On osoitettu olevan estävää vaikutusta näiden yhdisteiden selittyy pääasiassa suoraan kilpailukykyinen tukos ligandi-HSPG vuorovaikutukset ja siten vaimentaa alavirtaan reseptorin aktivaatiota (polyanionisten yhdisteet), tai moduloimalla biologista saatavuutta HSPGs ligandin sitoutumisen (xylosides, entsyymit, geneettinen strategiat). Mielenkiintoista on, että tietomme osoittavat, että hallitseva vaikutus vasta-aineen sitoutumisen solujen HSPGs on suoraan edistää solujen aktivoitumista, mieluummin kuin estää HS ligandista riippuvan soluaktivaation. On mekanistinen tasolla sitoutuminen αHS on HSPGs ECS sekä glioblastoomasolut havaittiin laukaisevan p38 MAPK-riippuvainen signalointi, ja häiriöttömät p38 MAPK toiminto vaadittiin αHS välittämiä solun stimulaatiota. Tässä yhteydessä on huomattava, että muut HS-sitojaligandit on osoitettu stimuloivan hankittua kautta p38 MAPK-reitin [41]. Tämä solunsisäinen kinaasi alunperin havaittu olevan merkittävä proinflammatoristen välittäjänä ja myöhemmin todettu olevan osallisena useiden solun prosessien ja sairauksia kuten syöpää [36]. Itse p38 MAPK on mukana niin vaimennin pahanlaatuisten prosessien,

esim.

Onkogeeni välittämiä solun vanhenemista ja yhteystiedot esto. Muut tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, pro-muuttavien ja invasiivisia vaikutukset p38 MAPK aktivaation syöpäsoluissa ja stroomasolujen [36]. Kuten muutkin MAPK, toiminnot p38 ovat riippuvaisia ​​sen alavirtaan kinaasien, kuten seriini /treoniinikinaaseja kuten p38-säänneltyjen /aktivoitu kinaasi (PRAK) ja MAPK-aktivoitu kinaasi-2, ja monia erilaisia ​​up-stream kinaasien, kuten kuten MKK3 /6, MKK4 sekä MAPKK erillisestä signaalista. Soluspesifinen sekä solunosasijaintia erityisiä vaikutuksia lisää monimutkaisuutta p38-toiminto. Yhteydessä tuumoriangiogeneesin se on erityisen kiinnostava, että p38 hiljattain osoitettu aktivoivan kasvain hankittua kautta PRAK [42]. Jatkotutkimuksissa on selvittää, onko PRAK ja mitä vaihtoehtoisia p38 alavirtaan viestinvälitystekniikoita osallistuvat αHS välittämää angiogeneesiä vaikutuksia. Lisäksi tutkimuksemme rajoittuvat kinaasien havaitaan vasta array,

eli

muiden kinaasien eivät sisälly taulukon voitaisiin aktivoida αHS lisäksi p38.

hallitseva solun pinnan