Krooninen sairaus

tiivistelmä

Advances aloilla syövän aloittamista solujen ja suuren suorituskyvyn

in vivo

shRNA näytöt ovat korostaneet tarvetta tarkkailla kasvainsolujen kasvun syövän mallien klonaalisen tasolla . Vaikka

in vivo

syöpäsolujen kasvua heterogeenisyys ksenografteissa on kuvattu, se on vielä mitata. Tässä testasimme lähestymistapa määrällisesti kloonikasvuun heterogeenisuus syöpäsolujen ihonalaisen ksenograftin hiiri malleja. Käyttämällä suurikapasiteettisten sekvensointi menetelmä, seurasimme kohtalo

in vitro

ja

vuonna viv

o kymmenentuhannen HCT-116-solut erikseen koodattu ainutlaatuinen viivakoodi toimittama lentivirus transduktion. Vaikka kasvu

in vitro

oli vähemmän homogeeninen odotettua, olemme edelleen löytää, että 95% lopullisesta peräisin olevien solujen 80% alkuperäisestä soluja. Vuonna ksenografteja kuitenkin 95% noudetun viivakoodilla solut ovat peräisin vain 6% alussa pistetään solujen vaikutusta me termi ”klonaalinen määräävä asema”. Havaitsimme tämän klonaalinen valta-asema kaksi ylimääräistä ksenograftimalleissa (MDA-MB-468 ja A2780

cis) ja kahdessa eri isäntäkantoina (NSG ja Nude). By tarkasti ja toistettavasti määrällisesti klonaalinen syöpäsolujen kasvua

in vivo

, huomaamme, että pieni joukko kloonien osuus valtaosa jälkeläisen solujen, vaikka HCT-116, solulinja raportoitu puuttuvan kasvain -initiating osastoon. Stokastinen

in vivo

valintaprosessissa kuvaamme on merkittäviä vaikutuksia aloilla

in vivo

shRNA seulonta ja kasvaimen aloittamista soluja.

Citation: Nolan-Stevaux O, Tedesco D, Ragan S, Makhanov M, Chenchik A, Ruefli-Brasse A, et al. (2013) mittaus Cancer Cell Growth heterogeenisyys läpi Lentivirusvektorikonstruktit Barcoding Osoittaa Clonal Dominance ominaisuutena

In vivo

Kasvain siirteen. PLoS ONE 8 (6): e67316. doi: 10,1371 /journal.pone.0067316

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 helmikuu 2013; Hyväksytty: 16 toukokuu 2013; Julkaistu: 26 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Nolan-Stevaux et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Cellecta, Inc. oli toimittaja lentiviruksen shRNA kirjastojen tätä tutkimusta varten ja on työnantajan Donato Tedesco, Mikhail Makhanov ja Alex Chenchik. Olivier Nolan-Stevaux, Seamus Ragan, Astrid Ruefli-Brasse, Kim Quon ja Paul D. Kassner työskentelee Amgen. Tämä Tutkimuksen rahoittivat Amgen Inc. ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Viime vuosina ksenografti- hiirimalleissa syöpä on käytetty koetin peruskysymyksiin kasvaindiagnostiikassa yhtä monipuolinen kuin olemassaolo syövän aloittamista solujen tai toteutettavuutta identifioida uusia syövän kohdegeenien käyttämällä

in vivo

shRNA drop-out seulonnan lähestymistavat. Molemmissa kentät kuitenkin suhteellisen huono ymmärtämistä kasvun dynaamisen ksenograftimalleissa aiheuttanut sekaannusta.

Ensinnäkin tulokset sarjalaimennuksen kokeissa, joissa hyvin vähän syövän solut injektoidaan ihon alle hiiriin on käytetty tukea [1], [2], tai kumota [3] on olemassa harvinaisia ​​syövän aloittamista solujen sisällä heterogeeninen altaat syöpäsolujen kiinteitä kasvaimia [4]. Kuitenkin syöpäsoluja kasvaimet eivät ole itsestään, vaan ympäröi muita syöpäsoluja. Niinpä jos muutama syöpäsolut injektoidaan hiiren ja epäonnistua kasvaa, se voi heijastaa niiden puute syövän aloittamista mahdollisten; tai enemmän prosaically, että ne eivät olleet optimaalisessa ympäristössä, jota ympäröi muiden syöpäsolujen (kasvain alku- tai ei). Seuranta käyttäytymistä oletetun syövän aloittamista solujen ympärillä otaksuttu syöpäsolujen aloittamista solujen antaisi kipeästi kaivattua selkeyttä.

Toiseksi menetelmiä hyödyntämällä yhdistettyjä kirjastoja lentivirusvektorien koodaavat satoja shRNA laukaisee on edelläkävijä tunnistamaan mahdollisia uusia syöpää edistävät geenit

in vivo

[5], [6]. Vaikka

in vitro

yhdistettiin shRNA drop-out näytöt (viimeaikaisena katso esimerkiksi [7]), ja

in vivo

yhdistettiin shRNA rikastamiseen näytöt pyritään tunnistamaan kasvaimeen vaimentimet tai kasvuun estävä mekanismit ovat onnistuneet [8], [9],

in vivo

shRNA drop-out näytöt eivät ole laajasti jäljitellä. Tässäkin ymmärtää paremmin kasvun heterogeenisyys ksenograftimalleissa auttaisi tulkitsemaan ja ennustamaan tuloksia tällaisista seulonnan lähestymistavat. Merkillistä, kun taas spatiaalinen fenotyyppinen heterogeenisyys on dokumentoitu vierassiirrekokeissa syövän malleissa [10], [11], klonaalinen syöpäsolun kasvua heterogeenisyys ksenograftimalleissa ole koskaan mitattu.

Tässä olemme käyttäneet menetelmää lentiviruksesta viivakoodi koodaus tarkasti ja samanaikaisesti mitata kasvuominaisuudet tuhansia yksittäisiä syöpäsolujen sisällä altaan korvamerkittöminä syöpäsolujen kasvanut

in vitro

tai ihon alle

in vivo

vakavasti immuno-hiirillä. Tuloksemme osoittavat huomattavan heterogeeninen syöpäsolujen kasvua useissa ksenograftimalleissa, jolloin pieniä määriä yksittäisten syöpäsolun klooneja ottaa alunperin tasaisesti jakautunut ja heterogeeninen solupopulaatio, vaikutusta olemme kutsutaan ”klonaalinen määräävä asema”. Seurauksena havaintomme, ehdotamme uuden kloonisolulinjojen seurantatapasi kiertää häiriövaikutukset klonaalisen määräävän aseman yhteydessä yhdistettyjen

in vivo

shRNA drop-out näytöt. Suosittelemme myös käyttää tätä menetelmää mitata panos oletettujen syövän aloittamista solujen alaryhmistä, ei yksinään, mutta sisällä heterogeeninen syöpäsolun väestöstä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics ohjausjärjestelmästä ja hiiri Strain

Hiiret hoidettiin mukaisesti kuin

opas hoito ja käyttö Laboratory Animals, 8

th

Edition National Institute of Health. Eläimiä pidettiin laitoksessa kansainvälisesti akkreditoitu Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC), tuuletetuissa mikro-eristäjä kotelo. Eläimet oli

mielinmäärin

päästävä syömään ja veden välityksellä automaattinen kastelujärjestelmä. Eläimet pidettiin 12 tunnin: 12 hr valo: pimeä sykli, tiloissa 22 ° C: ssa ja 45%: n kosteudessa. Tutkimuksemme protokolla ja eläinsuojina suunnitelma oli hyväksynyt Amgen South San Francisco Institutional Animal Care ja Käytä komitea (Amgen South San Francisco IACUC, Protocol # 2011-01108). Kahdeksan viikon ikäiset naaras NOD /SCID IL2rg hiiriä (NSG) (Jackson Laboratories kanta # 5557) ja kymmenen viikon ikäiset naaras Kateenkorvattomia Nude hiiriä (Charles River kanta # 490) käytettiin tässä tutkimuksessa.

Lentivirusvektorikonstruktit Library tiitteri määritys FACS

tiitteri yhdistettiin lentiviruksen kirjaston määritettiin suoraan HCT-116-solujen FACS-mittaus prosenttiosuus mCherry positiivisia soluja sarjalaimennokselle lentiviruksen allas. Lyhyesti, titrauksilla lentiviruksen altaan lisättiin 1,5 x 10

5 HCT-116-solujen kasvatusväliaineessa (McCoyn 5A, 10% FBS: ää), joka sisälsi DEAE-dekstraani (MP Biomedicals, Catalog # 195133), 10 ug /ml. Solut altistettiin viruksen 16 tuntia ja infektion imettiin pois ja korvattiin täydellisen kasvualustan ilman DEAE-dekstraania. Solut pysyivät kulttuuriin vielä 48-72 tuntia ja käsiteltiin trypsiinillä, pestiin Dulbecon PBS, ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä ratkaisu. Kiinnitetyt solut analysoitiin prosenttiosuus mCherry positiivisten solujen FACS (Becton Dickinson LSRII). Infektiokerrointa (MOI) ja tiitteri, ilmoitetaan transdusoivaa yksikköä per ml (TU /ml), määritettiin prosenttiosuutena transdusoidut solut ja tilavuus lentiviruksen varastossa käyttää. MOI ensin määritettiin käyttämällä yhtälöä% transdusoidut soluista = 100 * (1- e

– (MOI)) ja tiitteri määritettiin käyttämällä yhtälöä Titer = [MOI × # solujen infektio] /vol (ml virus) = TU /ml [12] – [15]. Tämän viruksen allas, 10 ui virus aiheutti 12,9% mCherry positiivisia soluja ja lasketun tiitteri 2 x 10

6 TU /ml käytettiin määrittämään sopivan tilavuuden viruksen myöhempää kokeissa valitun MOI: n.

Laskelmat transduktiotehon ja lukumäärä Lentivirusvektorikonstruktit lisäosien Per Cell

Virus hiukkasia odotetaan jakaa satunnaisesti yksittäisiin soluihin ja prosenttiosuus tartunnan saaneiden solujen tietyllä MOI (jossa MOI = muutinlait- yksikköä /solu) voi arvioidaan, jonka Poisson-jakauma, jossa prosenttia infektoitujen solujen on yhtä suuri kuin 100 * (1-e

– (MOI)) (taulukko 1). Todennäköisyys minkä tahansa määrän viruspartikkeleita tietyssä solussa, siten, annetaan Poisson yhtälön p (v) = (M

ve

v) /v !, jossa M = MOI, ja v on numero mätön tarttuu solun. Nämä kaavat voidaan laskea tiitterin virus altaan tietyssä solulinjassa ja arvioida solujen prosenttiosuus tartunnan tahansa määrän mätön (taulukko 2).

Lentivirusvektorikonstruktit Infektio Menettely KE-U6-TET Library in HCT-116

HCT-116-solut (koolonisyöpäsolulinja – ATCC # CCL-247), jossa on kaksinkertaistaa aikaa 21 tuntia. viljeltiin täydellisessä kasvualustassa [McCoyn 5A-alustassa (Life Technologies # 16600-082), 10% Tet System Hyväksytty FBS (Clontech # 631101), 0,1 mg /ml Normocin (Invivogen # ant-nr-1)]. KE-U6-TET, joka on lentivirus- kirjasto, joka sisälsi 27500 yksittäisten Tet-indusoituvan viivakoodilla shRNA sekvenssit jonka tiitteri 2 x 10

6 TRANSDUKTIO yksikköä (TU) /ml käytettiin yhdessä 10 ug /ml DEAE dekstraania (MP Biomedicals # 195133), jotta päästäisiin (MOI) 0,1, jonka todennäköisyys infektoimaan solun useamman kuin yhden lentiviruksesta hiukkanen on laskettu olevan alle 5% (taulukko 2) [15]. Lyhyesti, 3 x 10

6 HCT-116-solut suspendoitiin uudelleen 8,5 ml: aan täydellistä kasvualustaa, johon oli lisätty DEAE-dekstraania (10 ug /ml) ja transdusoidaan 150 ui KE-U6-TET-kirjasto, ja inkuboitiin 16 tuntia, jolloin solupopulaation 3 x 10

6 solua sisältävä ~ 3 x 10

5 infektoimia soluja yhdellä lentivirus kuljettavia yksittäisen viivakoodi.

Lentivirusvektorikonstruktit Infektio Menettely Luciferase kirjasto HCT-116, MDA-MB-468 ja A2870

cis

lentiviraalinen kirjasto, joka sisälsi 27 neutraalia Renillaa

Luciferase

shRNAs sekvenssit liittyvät 2%: n viivakoodien läsnä kirjastossa oli käytetyt MOI 0,18, 0,17 ja 0,15, vastaavasti HCT-116, MDA-MB-468 (Breast Cancer Cell Line – ATCC # HTB-132) ja A2780

cis

(sisplatiini Resistant Munasarjojen Cancer Cell Line – Sigma-Aldrich # 93112517) soluja. Ennustetaan prosenttiosuus infektoitujen solujen, joissa on enemmän kuin yksi lentiviruksen hiukkanen on laskettu olevan alle 10% näissä MÕIS (taulukko 2). Lyhyesti, 3 x 10

6 solua suspendoitiin uudelleen 8,5 ml: aan kasvualustaa, jota oli täydennetty polybreenin (5 ug /ml), transdusoitu lentiviruksen kirjasto, ja inkuboitiin 16 tunnin ajan, jolloin solupopulaatio 3 x 10

6 solua sisältävä ~ 5 x 10

5 transdusoidut solut, ~ 90%, joiden ennustetaan saaneen yhdellä lentivirus ja kuljettaa yhden viivakoodi (taulukko 2).

In vitro

kokeessa

16 tuntia transduktion jälkeen kanssa KE-U6-TET kirjasto, näytteitä 10

5 HCT-116 solut, jotka sisältävät -10

4 erikseen merkitty soluja ympättiin kolmena kappaleena T175 soluviljelypullot ja jatkuvasti kasvanut 8 päivää täydellisessä kasvualustassa, jossa media täydennystä 2-3 päivän välein. Jokaista

in vitro

jäljitellä, kaikki solut kustakin T175 pulloon käytettiin heti korjuun päivänä 8 genomista DNA eristämistä.

NSG Vieraslajisiirteen Experiment

16 tuntia post transduktio kanssa KE-U6-TET kirjasto, näytteitä 10

5 HCT-116 solut, jotka sisältävät -10

4 erikseen merkitty soluja sekoitettiin 3 x 10

6 transdusoimattomien HCT-116-solut ja resuspendoitiin 200 ui 1:01 PBS: Matrigel-liuosta (BD Bioscience # 356235) kanssa ennen ihonalaista injektiota 8-viikkoa vanhoja naaraspuolisia NSG hiiriä (varastossa # 005557, Jackson Laboratories). Kukin -ksenografti annettiin kasvaa 12 päivää, kunnes saatu ihonalainen kasvain saavutti koko ~500 mm

3. Tässä vaiheessa kasvaimet kerättiin genominen DNA eristämistä.

Nude vierassiirrekokeissa

16 h transduktion jälkeen lusiferaasin kanssa kirjasto, 3 x 10

6 solua (HCT-116, MDA-MB-468 tai A2780

cis) resuspendoitiin 200 ul 1:01 PBS: matrigeelin ratkaisu (BD Bioscience # 356235) ennen ihon alle 10 viikon ikäisiä naaras Nude-hiiriä (varastossa # 490, Charles River Laboratories). HCT-116 ja A2780

cis-ksenografti annettiin kasvaa 14 päivää, ja MDA-MB-468 ja 24 päivää, kunnes saatu ihonalainen kasvain saavutti koko ~500 mm

3. Tässä vaiheessa kasvaimet kerättiin genominen DNA eristämistä.

Tet tukahduttaminen shRNA Expression puuttuessa Doksisykliini ja Induktio Doksisykliinillä

tehokkuus TET-repressori elementti vektorin arvioitiin yli 15 päivää kokeilu. Kolme riippumatonta infektiot 9 x 10

7 HCT116-soluja kasvatusväliaineessa (McCoyn 5A, 10% FBS: ää), joka sisälsi DEAE-dekstraani (MP Biomedicals, luettelo # 195133), 10 ug /ml suoritettiin 27,5 k shRNA kirjasto klo MOI = 0,3 Corning Cell pino 10 alusta (luettelo # 3271). Maksimoida esitys kirjaston kukin shRNA otettiin käyttöön ~1000 riippumaton soluissa. 24 tunnin kuluttua, infektio imettiin pois ja korvattiin täydellisen kasvualustaa 2 ug /ml puromysiiniä (InvivoGen, luettelo # ant-pr-5) aloittaa valinnan infektoituneita soluja. 72 tuntia transduktion jälkeen, solupelletti ja ~ 9 x 10

7-solut kerättiin viite kunkin infektion kolmena kappaleena (päivä 0 näyte). 9 x 10

7 solua uudelleen kylvetään ja ylläpidetään viljelmässä täydellinen media 2 ug /ml puromysiiniä. Solut siirrostettiin 3 päivän välein ulos 15 päivää, kylvöä 9 x 10

7-soluihin ja ylläpitää valikoivia paine puromysiinin ajaksi kokeen. Cell pellettejä triplikaattinäytteet päivästä 0 ja 15 jätettiin sekvensointiin DNA viivakoodit korkean suoritustehon sekvensoinnin. Solut, joissa shRNA ilmentyminen indusoitiin hoidettiin jälkeen uudelleen kylvö 9 x 10

7-solut päivänä 0 kanssa Doksisykliini (Sigma-Aldrich, luettelo # D-9891) 0,5 ug /ml 15 päivää.

Recovery ja kvantifiointi viivakoodit

Koettimet valmistettiin suurikapasiteettisten sekvensointi Illumina HiSeq2000 seuraaviin Cellecta protokollan (https://www.cellecta.com/resources/protocols). Joukko viivakoodeja käytetään rakentamiseen kirjaston koostui 27500 18-nukleotidin yksilön pitkän viivakoodeja, täydellisesti tasapainossa vuonna AT /GC ja puriini- /pyrimidiiniä, suunniteltu käyttäen patentoitua Cellecta algoritmia. Pienin Hamming etäisyys viivakoodeja sarja on 4, niin jopa 3 mutaatioita 18-nukleotidisekvenssi voidaan havaita ja vioittuneet viivakoodit hylätään, joka tarjoaa asianmukaisen suojelun tason nykyisen tarkkuuden Illumina sekvensointitekniikan. Viivakoodi ID numerot olivat koodattu viivakoodiin sekvenssin käyttämällä kvaternääristä numeerinen (A-0, T-1, G-2, C-3), niin mukauttamismenetelmiä viivakoodin dekonvoluutio ei tarvittu. Käyttämällä Cellecta n muunnosalgoritmi, viivakoodi tunnistenumerot poimittiin kustakin oikea viivakoodin ja runsaasti kunkin viivakoodi sekvensoitu näytteestä mitattiin. Tällä menettelyllä, monimutkaisuus laskenta ei riipu monimutkaisuuden kirjaston. Monimutkaisuus on O (n) oli n on määrä lukee Sekvensoidun antureista. FASTQ ja qseq tiedostoja Illumina HiSeq2000 konetta käytettiin analyysissä.

Clone Koko arviointi

Kunkin näytteen määrä viivakoodin määrä vastaa yhden transdusoitujen solujen laskettiin yhteensä määrä viivakoodi laskee näytteessä ja kokonaismäärä transdusoidut solut näytteessä (jälkimmäinen mukaisesti arvioidusta genomista DNA elpymistä ja transduktion MOI, ja varmistettiin PCR koetin saanto). Arvioida koko kunkin klooni transdusoituun solupopulaation (solujen lukumäärä, joilla on samat viivakoodi), viivakoodi laskee olivat sitten normalisoidaan lasketun yksisoluiset viivakoodi määrä.

Tulokset

Measuring Clone Takaisinsaantinopeus

in vivo

jotta jäljittää kloonien peräisin yksittäisten solujen sisällä syöpäsolu väestö, me tartunnan HCT-116 peräsuolen syövän solut lentiviraalinen kirjasto, joka sisältää 27,500 riippumaton indusoituvia shRNA sekvenssit, kukin liittyy yksittäisen 18 nukleotidin viivakoodi. Olemme tartunnan 3 x 10

6 HCT-116-solujen infektiokertoimella (MOI) 0,1. Näissä infektio olosuhteissa, Poisson-jakauma-analyysi ennustaa vähäinen määrä dual-infektion tapahtumia (alle 5% transdusoitujen solujen) [15] (taulukko 2). Muuntosarja tuotti ~ 3 x 10

5 yksilöllisesti Barcoded soluja (taulukko 1). Kolme sarjaa 10

4 HCT-116 viivakoodilla soluja (10

5 solua yhteensä annettiin MOI 0,1) kasvatettiin viljelmässä

in vitro

8 päivää tai noin 9 populaation kaksinkertaistumista. Genomi-DNA kolmesta allasta kasvatettujen solujen

in vitro

alistettiin viivakoodi suurikapasiteettisten sekvensointi ja kokoa (solujen määrä) kunkin havaittu klooni Transdusoiduissa väestöstä laskettiin kuinka monta kertaa kukin bar -koodi on haettu (Fig. 1).

lentiviruksen kirjasto, joka sisälsi 27500 ainutlaatuinen viivakoodeja käytettiin transdusoimaan HCT-116-solujen MOI-arvolla 0,1. Altaat 10

5 solut, vastaten 10

4 erikseen merkitty soluja joko sekoitettiin 3 x 10

6 solua ja istutettiin ihonalaisesti NSG hiiriin tai kasvattaa viljelmässä

in vitro

. Solut kerättiin talteen sen jälkeen, kun 9 päivää ja kasvainten poistettiin 12 päivää, ja kokonais-DNA valmisteet soluista tai kasvaimia tehtiin viivakoodin hakuproseduuri.

Samalla, kolme sarjaa 10

4 viivakoodilla HCT-116-solut (10

5 solua yhteensä annettiin MOI 0,1) samasta alkuperäisestä virustransduktio tapahtuma kerättiin 16 tuntia transduktion jälkeen ja erikseen sekoitetaan 3 x 10

6 infektoimattomia HCT-116-soluissa ja laimennetaan 50% Matrigel, ennen ihon alle kylkeen kolmen vakavasti immuuni puutteesta naisten NSG hiirillä. Kukin -ksenografti annettiin kasvaa 12 päivää, kunnes saatu ihonalainen kasvain saavutti koko ~500 mm

3. Genomi-DNA kolmesta ksenograftikasvaimissa alistettiin samaan viivakoodi elpymistä ja klooni koko estimointimenettelyt kuin

in vitro

näytteissä (kuvio. 1).

in vivo

klooni haku laskettiin suhteena keskimääräinen lukumäärä viivakoodilla klooneja tunnistettiin kolmessa ksenograftikasvaimissa ja keskimääräinen lukumäärä Barcoded-kloonien tunnistettu kolmessa solupopulaatioiden kasvanut

in vitro

riippumatta kloonin koko (Fig. 1). Kuten esitetään taulukossa 3, havaittuun klooni haku oli lähes 60% ja määrä klooneja yksilöityjen

in vitro

ympäristössä kussakin toistossa oli hyvin lähellä ennustettua arvoa 10

4 klooneja. Huomattavaa on, että kun solususpensio sisältävä matrigeelin pistetään ihon alle, pieni määrä (~ 10%) injisoidusta neste tihkuu ulos injektiokohdassa, mikä vastaa osa menetetty viivakoodeja

in vivo

asetus.

in vivo

”Clonal Dominance” Inside HCT-116 ksenoqraftit

arvioida ja verrata miten viivakoodilla solut jakautuvat

in vitro

ja

in vivo

, olemme analysoineet jakelun niiden viivakoodit mukaan, miten usein ne noutaa HTS. Täydellinen tietojen joukko klooneja ja viivakoodi laskee on saatavilla (taulukko S1).

Ensimmäisessä kaaviossa, olemme analysoineet klonaalisia jakelu kasvatettujen solujen

in vitro

: me piirretty useita riippumattomia klooneja (Fig. 2A – siniset palkit) tai koko yhteenlaskettu määrä soluja (Fig. 2A – oranssi palkit) kunkin kloonin kokoluokkaan poikki X-akselilla. Esimerkiksi

in vitro

oli 2649 itsenäistä kloonia, joiden koko vaihtelee välillä 512-1023 solujen, mikä osoittaa, että nämä kloonit, että ”512-1023” solujen luokkaan on täytynyt keskimäärin 8 populaation kaksinkertaistumista ( Fig. 2A – sininen palkki arvo ’512-1023’ X-akseli luokka). Nämä 2649 kloonit osaltaan yhteensä 1.017.216 jälkeläinen Barcoded solujen upon

in vitro

kulttuurin 8 päivää (Fig. 2A – oranssi palkki arvo ’512-1023’ X-akseli luokka). Todisteena että

in vitro

kloonikasvuun on enimmäkseen homogeeninen, 95% jälkeläinen Barcoded soluja löytyy 8 päivän kuluttua on

in vitro

kulttuuri olivat peräisin 80% alussa tagged kloonit ja olivat sisällä klooni luokat ”128-4095”, joka osoittaa vähintään 7 väestöstä rajapinnoilla.

kunkin kaavion määrä itsenäistä kloonia (siniset palkit) tai koko yhteenlaskettu määrä soluja (oranssi palkit) on piirretty jokaisen klooni kokoluokkaan poikki X-akselilla. (A) Distribution of HCT-116-viivakoodit

in vitro

: 80% viivakoodit (kloonit) tunnistettiin luokkiin ”128-255” ja ”2048-4095”, mikä osoittaa, että 80% soluista jaettuna välillä 7 ja 12 kertaa; 95% soluista tunnistettiin luokkaan ”128-255” ja ”2048-4095”, joka osoittaa, että 95% soluista kuuluvat kloonit, jotka ovat peräisin 80% alun perin transdusoidut solut, jotka jaetaan 7 ja 12 kertaa. Asteikko Solujen lukumäärä säädettiin 500 kertaiseksi, jotta vierekkäin vertailuja kloonausnumerot ja solujen määrä. (B) jakauma HCT-116-viivakoodit

vivo

: 75% viivakoodeja löytyy luokkiin ”puuttuva” ja ”2-3”, mikä osoittaa, että ne joko eivät hengissä ollenkaan, ei jakaa tai jakaa enintään kerran ja edusti vain 1% noudetun tagged soluja. Kuitenkin vain 6% viivakoodit sijaitsivat luokkiin ”64-127” ja ”16384-32767”, osoittaa, että ne jaetaan 6 ja 14 kertaa; 95% soluista kertynyt luokkiin ”64-127” ja ”16384-32767”, mikä osoittaa, että 95% merkityn solut ovat peräisin 6% alussa Barcoded klooneista, jotka jaetaan eniten. Asteikko Solujen lukumäärä säädettiin 25-kertaisesti, jotta vierekkäin vertailuja kloonausnumerot ja solujen määrä.

Toisessa kaaviossa, olemme analysoineet klonaalisia jakelu kasvatettujen solujen

in vivo

: me taas piirretty useita itsenäisiä klooneja (Fig. 2B – siniset palkit) tai koko yhteenlaskettu määrä soluja (Kuva. 2B – oranssi palkit) kunkin kloonin kokoluokkaan poikki X-akselilla.

in vivo

jakaumien näyttää dramaattisesti erilainen kuin

in vitro

jakaumat.

In vivo

, 75% klooneista ryhmittyneet ”Missing-3 ’luokkia, mikä osoittaa, että 75% soluista aluksi pistetään

in vivo

tehtiin vähemmän kuin kaksi solunjakautuminen (Fig. 2B – siniset palkit – ”Puuttuva” tai ”1” tai ”2-3” luokat). Vahvistetaan, että nämä kloonit eivät kasvaneet

in vivo

, näiden kloonien osuus oli vain 1% koko yhteenlaskettu määrä solujen merkityn solupopulaation tunnistaa HTS tuloksena kasvaimen. Toisaalta, 6% injektoidusta solut pystyvät jakamaan enemmän kuin viisi kertaa tuottaa klooneja, joissa on vähintään 64-solut (Fig. 2B – siniset palkit on merkitty 6%). Merkillistä, nämä kloonit osuus oli 95% koko yhteenlaskettu määrä solujen tagged solupopulaation (Fig. 2B – oranssi baareja merkitty 95%), mikä osoittaa erittäin merkittävää kasvua heterogeenisyys

in vivo

, jossa kaksi eniten runsaasti talteen kloonit yksin (pois arviolta 10000) koki 14 populaation kaksinkertaistumista ja tuotti hämmästyttävän 7,5% koko solun tunnisteet talteen HTS ksenografteissa (Fig. 2B – klooneja ja solujen ”16384-32767” luokka).

termi tämä ilmiö ”klonaalinen määräävä asema”, jolloin pieni osa soluista istutettu

in vivo

jakaa paljon enemmän kuin valtaosa muista klooneista ja edistää ylivoimaisesti jälkeläinen solupopulaatio. Huomaa, että ennen tutkimuksia päätellä, että HCT-116-solulinja ei sisällä kantasoluja tai kasvaimeen aloittamista väestöryhmästä (katso keskustelu).

Lukuun ottamatta vaikutus koodatun shRNA

in vitro

ja

in vivo

shRNA koodattu lentiviruksien kloonataan alavirtaan U6-TET-promoottori ja säätelee Tet-repressorin koodattu lentivirus varmistamaan tukahduttaminen shRNA hiusneula ilmentymisen puuttuessa Doksisykliini. Näin ollen Tässä kokeessa sisältö lentivirusvektoreita on puhtaasti käytettiin baari-koodausjärjestelmän infektoituneiden solujen ja sen ei ennusteta häiritse solujen kasvua. Sen varmistamiseksi, että koodatut shRNA ei vaikuttamatta solujen kasvuun, me kasvoi solujen alustassa, joka sisältää Tet-hyväksytty järjestelmä FBS, suunniteltu minimoimaan de-tukahduttamisen promoottorien puuttuessa Doksisykliini. Kuitenkin vahvistaa kokeellisesti, että odottamattomia shRNA induktio ei vaikuttanut viivakoodin jakeluun ilman doxycycline, vertasimme myös jakeluun viivakoodit sisältämän KE-U6-TET kirjasto seuraavat HCT-116 transduktio päivänä 0 ja päivänä 15 infektion. Tässä kokeilussa, me transdusoidut HCT-116-solujen kanssa KE-U6-TET lentiviraalinen kirjasto MOI 0,3 ja kerättiin solut oikealle tartunnan jälkeen (päivä 0) tai sen jälkeen 15 päivän

in vitro

kasvun Koska Doksisykliini (päivä 15) (Fig. 3A). Havaitsimme hyvin tiukka korrelaatio (R = 0,99) lukumäärän välinen lukee saatiin kultakin shRNA viivakoodin päivänä 0 ja päivänä 15 (Fig. 3B). Sitten arvioitiin, jos kaksi shRNA jakaumat päivänä 0 (Kuva. S1A), ja päivä 15 (Fig. S1B) olivat merkittävästi erilaisia ​​toisiinsa käyttämällä ei-parametrista Kruskal-Wallis Rank Sum Test ja saatu P-arvo on 0,972, mikä osoittaa tilastollista eroa paremmuusjärjestyksen eri shRNA että shRNA väestön päivänä 0 ja päivänä 15 (Kuva. S1D). Myöskään ei ollut muuttaa koko jakautuminen shRNA kahden aika-pistettä, joka on perustettu t-testi p-arvo 0,99 (Fig. S1D). Nämä tulokset osoittavat, että ilman Doksisykliini, U6-TET-ajettu shRNA pinnit eivät kasvuun vaikuttavat ja jakaumat viivakoodeja transdusoitujen HCT-116 solupopulaatio

in vitro

, ja olivat siten todennäköisesti vaikuta niiden jakautuminen ksenografteissa, edellyttäen että hiusneulat pysyi indusoimattomaan

in vivo

.

(A) lentiviraalinen kirjasto, joka sisälsi 27500 ainutlaatuinen viivakoodeja käytettiin transdusoimaan HCT-116-solujen MOI 0,3 . 72 tunnin jälkeen, ja puromysiiniselektion solut jatkuvasti siirrostettiin 15 päivää ilman Doksisykliini. Päivänä 0 ja päivänä 15 solueriä saatiin ja kokonais-DNA sekä ajankohtina alistettiin viivakoodi korkean suoritustehon sekvensoinnin hakuproseduuri. (B) Korrelaatio kuvaaja Päivä 15 mittaukseen päivänä 0. shRNA viivakoodin lukee kaikki näytteet kaikista ajankohtina normalisoitiin ensin 2 x 10

7 lukee. Arvot triplikaattinäytteet otettiin keskiarvo. Päivänä 15, vahva tukahduttaminen shRNA ilmaisun puuttuessa Doksisykliinistä ilmeistä korrelaatiota kanssa Päivä 0 viittaus. Tontti log10 tarkoittaa normalisoitua lukee Day 0 vastaan ​​päivänä 15 (Pearson korrelaatio: R = 0,99).

mallintaa mitä tapahtuisi, jos hiusneulat de-tukahdutettu syöpäsolu väestö, myös vertasi shRNA viivakoodin jakelu transdusoiduissa HCT-116-solut päivänä 0 ja päivänä 15 seuraavia

in vitro

kasvun läsnäollessa Doksisykliini (päivä 15 – Dox – Fig. S1C). Näissä olosuhteissa, kun taas yleinen shRNA populaatiojakauman ei vaikuttanut merkittävästi (p-arvo t-testi kahden populaatiot oli 0,99), sijoitus-tilauksen eri shRNA viivakoodeja oli syvästi vaikuttanut (p-arvo ei -parametric Kruskal-Wallisin rank-order testi oli 1,75 x 10

-8 – Fig. S1D). Sitten analysoimme jakautuminen viivakoodit runsaimmin tunnistettu kolme

in vivo

ksenograftin näytteitä (tunnistettu osa ylhäältä 6% klooneja edistää 95% noudetun tunnisteet – katso kuva. 2) hälventää kaksi mahdollista mutta triviaalia selityksiä klonaalisen ylivoima havaitsimme: (i) että ensimmäinen viivakoodi edustus bias ja (ii) mahdollinen vaikutus vuotavien pinnit jotka olisi hyötynyt joitakin klooneja toisten

in vivo

. Ensinnäkin, emme tarkkailla viivakoodin jakelu bias, joka olisi suosinut kloonit, jotka haettiin

in vivo

. 4109 runsain shRNA viivakoodeja talteen kolmessa

in vivo

rinnakkaista jaettiin koko shRNA väestön jakautuminen ja ei voi selittää klonaalisen ylivoima vaikutus vietämme (Fig. 4A). Toiseksi, jos vuotava ilmentyminen shRNA pinnit

in vivo

oli tekijä klonaalisen asemaan, odotamme, että kloonit, jotka on valittu

in vivo

olisi koodata shRNA pinnit, jotka suosivat HCT-116 kasvua, tai ainakin, eivät ole myrkyllisiä HCT-116. Tämä ei kuitenkaan ollut: suuri määrä runsaimmin viivakoodit, jotka haettiin

in vivo

(värjätty punaisella kuvassa 4B) koodaavat oikeastaan ​​shRNA pinnit, jotka ovat myrkyllisiä HCT-116

in vitro

, koska ne itse asiassa klusterin vasemmalla puolella shRNA käyrä, joka osoittaa kasvua estävä vaikutus, kun

in vitro

induktion Doksisykliini ja 15 päivää (Fig. 4B), mikä viittaa vahvasti siihen, että nämä shRNA hiusneulat ei poisteta tukahdutettu aikana kasvun Siirto tehty kasvain. Jos nämä myrkylliset shRNA hiuspinnejä ollut vuotavat tai de-tukahdutettu, ne olisivat estäneet kasvua kloonien koodaama heitä ja heidän viivakoodi todennäköisesti ei ollut joukossa runsain shRNA viivakoodeja haetaan

in vivo

.

(A) jakautuminen 4109 ainutlaatuinen viivakoodit noudetaan runsaimmin kolmesta ksenograftikasvaimissa (merkitty punaisella pystyviivat) koko shRNA väestön jakautuminen shRNA kirjastossa. (B) havaitseminen suuri osa runsaimmin viivakoodit kolmesta ksenograftikasvaimissa (merkitty punaisella) on shRNA väestön eniten myrkyllistä HCT-116 upon Doksisykliini induktion

in vitro

15 päivää (mitattuna negatiivinen loki2 suhde keskimääräisen lukea laskee yksittäisten shRNA päivänä 15 seuraava Doksisykliini tarkoittavan lukea laskee päivänä 0).

Clonal Dominance on havaittu muissa ksenograftimalleissa ja toinen hiiri Host

edelleen vahvistaa havaintomme ylimääräisiä solulinjojen ja eri isäntäkanta, me transdusoitu 3 x 10

6 HCT-116, MDA-MB-468 ja A2780

cis solut kahtena MOI-arvolla