Krooninen sairaus

tiivistelmä

Differential redox homeostaasin normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen viittaa siihen, että pro-hapetin aiheuttama säätelyä solujen reaktiivisten happiradikaalien (ROS) olisi valikoivasti tavoite syöpäsolujen vaarantamatta elinkelpoisuutta transformoimattomien soluja. Niinpä esihapetinta poikkeama hyvin siedetty pahanlaatuisten solujen saattavat nopeasti saavuttaa solukuolemaa kynnysarvon pahanlaatuisten solujen jo korkealla ohjearvo konstitutiivisen oksidatiivisen stressin. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme käytti valitun määrän amiini-pyridiini-pohjainen Fe (II) komplekseja, jotka toimivat tehokkaan ja vankan hapetuskatalysaattorit orgaanisten substraattien reaktiota peroksidien kanssa. Viisi näistä Fe (II) olevat virukset ja vastaavat aminopyridiini ligandit valittiin arvioida niiden syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Huomasimme, että rauta kompleksit eivät näytä mitään kyseisen toiminnan, kun vastaava ligandit osoittivat merkittävää antiproliferatiivista aktiivisuutta. Niistä ligandit, joista yksikään ei ollut hemolyyttinen, yhdisteet 1, 2 ja 5 olivat sytotoksisia alhaisen mikromolaarisella alueella vasten paneelin molekulaarisesti erilaisia ​​ihmisen syöpäsolulinjoja. Tärkeää on, että sytotoksinen aktiivisuus profiilin joidenkin yhdisteiden säilynyt muuttumattomana epiteeli–to-mesenkymaalista (EMT) aiheuttama pysyviä populaatioita syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka hankittu resistenssi tunnettuja ROS indusoijan doksorubisiini. Yhdisteet 1, 2 ja 5 esti kyky muodostaa klooneja syöpäsolujen ja indusoi apoptoottista solukuolemaa mukana kaspaasi 3/7 aktivointi. Virtaussytometria analyysit osoittivat, että ligandit olivat vahvoja indusoijia oksidatiivisen stressin, mikä johtaa 7-kertainen solunsisäisten ROS tasoilla. ROS induktio liittyi niiden kykyä sitoutua solunsisäiseen raudan ja tuottaa aktiivisen koordinoinnin kompleksit sisällä soluja. Sitä vastoin solunulkoiset kompleksointi rauta inhiboi ligandien. Iron kompleksit osoitti korkeaa taitoa lohkaista DNA läpi oksidatiivisen-riippuvainen mekanismeja, mikä viittaa todennäköisesti sytotoksisuusmekanismin. Yhteenvetona, me raportoimme, että kun kelatointi solunsisäisen rauta, pro-hapetin aktiivisuus amiini-pyrimidiini-pohjainen rauta kompleksit tehokkaasti tappaa syövän ja syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, mikä tarjoaa toiminnallisia näyttöä tehokas perheen redox-suunnattu anti- syöpä metallodrugs.

Citation: González-Bártulos M, Aceves-Luquero C, Qualai J, Cussó O, Martínez MA, Fernández de Mattos S, et ai. (2015) Pro-Oxidant aktiivisuus Amine-Pyridiini-Based Iron Complexes Tehokkaasti osumalla ja syövän Varsi kaltaisia ​​soluja. PLoS ONE 10 (9): e0137800. doi: 10,1371 /journal.pone.0137800

Editor: Sujit Kumar Bhutia, National Institute of teknologian Rourkela, Intia

vastaanotettu: 05 toukokuu 2015; Hyväksytty: 21 elokuu 2015; Julkaistu: 14 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 González-Bártulos et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksin Espanjan Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), CONSOLIDER-INGENIO 2010 CSD2010-00065, ja Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) , SAF2012-38914, Plan Nacional de I + D + I.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut metabolisesti mukautuksia ylläpitämään niiden hallitsematon kasvu ja leviämistä. Monipuolinen sisäiseen ja ulkoiseen molekyylitason mekanismeja osallistumaan tähän aineenvaihdunnan uudelleenohjelmointi toimittaa syöpäsolujen riittävästi energiaa ja biosynteettisen kapasiteetin kasvain ympäristössä [1,2]. Muuttunut metabolismi yhdessä aktivoidun onkogeenisia signalointi ja vapautuminen mitokondrioiden toimintaa johtaa tyypillisesti lisääntymiseen sukupolven reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) syöpäsoluissa [3,4]. Kiinnostavaa kyllä, tämä ilmiö johtaa ero redox homeostaasin normaaleissa ja pahanlaatuisia soluja, jotka on nousemassa lupaava kohde suunnittelusta valikoivampi ja tehokkaita syöpälääkkeiden [5-8].

Erittäin reaktiivista ROS tuotetaan soluissa epätäydellinen väheneminen molekulaarisen hapen veden aikana aerobista aineenvaihduntaa. ROS yleensä säätelee solujen puolustava antioksidantteja [9,10] ja osallistua useisiin solun toimintoja, kuten signaalitransduktion, entsyymi aktivoinnin, geenien ilmentyminen ja proteiinin translaation jälkeiset modifikaatiot [11]. Kun syntyy liikaa tai kun tehokkuutta solujen antioksidantti järjestelmä on submaksimaalinen, ROS kerääntyä ja aiheuttaa peruuttamattomia soluvaurioita hapettumisreaktiotuotteen läpi biomolekyylien, kuten lipidi- kalvoja, entsyymien tai DNA, joka yleensä johtaa solun kuolemaan [12]. ROS voi myös edistää syövän taudin alkamisen ja etenemisen indusoimalla DNA mutaatioita ja pro-onkogeenisen signalointireittien [13,14].

Lisääntynyt ROS syöpäsoluissa ylössäätelee antioksidantti vaste, jolloin uusi redox tasapaino, joka mahdollistaa näiden solujen on mahdollista säilyttää korkeammat ROS tasoilla kuin normaalit solut. Näin ollen, syöpäsolut ilmentävät pysyviä oksidatiivista stressiä, joka edistää solujen lisääntymistä, mutta on riittämätön aiheuttamaan solukuoleman [4,13]. Tämä muuttunut homeostaasiin tekee syöpäsolujen alttiita ulkoisille hapettimet, jotka tuottavat ylimääräistä ROS, jotka ovat omiaan lisäämään oksidatiivista stressiä yläpuolella sytotoksinen kynnyksen. Tämä herkkyys on korkeampi rajoitettu kapasiteetti syöpäsolujen vahvistaa antioksidantti vastaus neutraloimaan oksidatiivisen loukkaus [15]. Sen sijaan normaalit solut voivat sietää korkeampia eksogeenisia ROS stressiä, koska niillä pienempi konstitutiivista ROS tasoilla yhdessä ylivoimainen reagointikykyä antioksidantti järjestelmiä. Itse asiassa, se on hyvin kuvattu, että sen lisäksi, että niiden suorat vaikutukset DNA: n ja solujen jakautumisen, vaikutusmekanismi monien kemoterapeuttisten aineiden, kuten 5-fluorourasiili, bleomysiini, sisplatiini, doksorubisiini tai paklitakselia liittyy myös ROS-välitteisen apoptoosin [13 , 16-19].

Vaikka biologisia vaikutuksia ROS ja sääntelymekanismeissa ROS tasot ovat vakiintuneita syöpäsoluissa, tiedetään vähän roolista ROS syövän kantasolujen (CSC) alaryhmässä, joka näyttää suuri kapasiteetti itseuudistumiseen ja erilaistumista ja myös mahdollisuus saada kasvaimia, joissa on voimakas kemo- /radio vastus [20,21]. CSCS sisältävät alempia ROS kuin ei-CSCS, todennäköisesti seurauksena parannettu vapaan radikaaleja järjestelmät [22]. Alhainen ROS tasot voivat liittyä etuoikeutettu asema tämän solualaryhmän, säilyttäen DNA eheys ja proteiinien toimintaa, joka on kriittinen säilyttää mahdollisuudet itseuudistumisen ja stemness [23,24]. Siten eksogeeninen ROS korkeus voisi olla tapa tappaa CSC alapopulaatio, joka on normaalisti rikastettu jälkeen tavanomaisen kemoterapian. Todellakin, niclosamide ja arseenitrioksidi (AS

2O

3), jotka ovat tehokkaita ROS induktorit, on osoitettu edistävän CSC kuoleman [25].

Useat syöpälääkkeiden, jotka kohdistuvat solujen redox tasapaino ovat eri vaiheissa prekliinisen ja kliinisen kehityksen [5,6]. Mekanistisesti nämä aineet joko estävät solujen antioksidantti puolustusmekanismeja [27-29] tai tuottavat ROS [30-32]. Lisäksi nämä aineet, siirtymämetalli-yhdisteet voivat olla lupaavia ehdokkaita pro-hapetin hoitoja. Kun kertyneet soluissa, metalleja kuten rautaa, mangaania ja kuparia, läpikäyvät pyöräily redox reaktioita, jotka tuottavat korkeita ROS, pääasiassa erittäin vahingoittavien hydroksyyliradikaalin lajien kautta Fenton reaktion. Tämä metalli-välitteisen muoto oksidatiivisen stressin on tunnettu aiheuttaa solukuoleman [33], ja siten, yhä useammat tutkimukset tutkivat mahdollisuuksia metallodrugs redox-pohjainen syöpähoitoihin [34-37].

Transition metal komplekseja aminopyridiinillä sisältävien orgaanisten tukirunkoja ovat nousseet voimakkaita katalyyttejä hapettuminen orgaanisten substraattien. Nämä kompleksit pidetään myös bioinspired katalyytteinä, koska ne toistavat rakenne- ja reaktiivisuus ominaisuuksia oksidatiivisen entsyymejä. Keskeinen osa niiden toiminta on niiden vahva sitoutuminen rauta ja mangaani-ioneja, tuottaa voimakkaita hapettimia ensin reagoida peroksidien [38-43]. Nämä hapetin yhdisteet toimivat katalyytteinä edistää hapettumista inertissä molekyylien, kuten alkaanit, alkeenit ja jopa haastava vesimolekyylin. Vaikutusmekanismi käsittää rauta-peroksidilajeista, kemiallisesti muistuttavat aktivoituun bleomysiini. Lisäksi nämä yhdisteet ovat erittäin resistenttejä self-hapettumista. Tätä taustaa vasten me tässä arvioi antiproliferatiivinen ja sytotoksinen aktiivisuus profiilit viiden amino-pyridiini-pohjainen Fe (II) kompleksien, jotka on aiemmin osoitettu olevan erityisen aktiivisia peroksidin Aktivointireaktiot [38-43], ja vastaava metal- vapaa ligandit, vastaan ​​paneelin ihmisen erilaisiin solulinjojen epiteelin-to mesenkyymisoluyhteisviljelmissä (EMT) aiheuttama pysyviä populaatioita syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja ja ei-pahanlaatuisia soluja. Aktiivisimpia yhdisteitä analysoitiin edelleen niiden kyky inhiboida kyky muodostaa klooneja syöpäsolujen, moduloida solusyklin ja aiheuttavat solukuoleman. Kapasiteetti Amiinin-pyrimidiini-pohjainen rauta kompleksit tuottaa ROS ja aiheuttaa DNA-vaurioita arvioitiin yhdessä vaikutuksen kelatoitumiseen solunsisäisten raudan niiden sytotoksiseen profiilin. Perustuen tappava häiriöitä redox tasapainossa aiheuttamat nämä kompleksit syövän ja ROS vastustuskykyisten syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja, tarjoamme vahvaa toiminnallista näyttöä tehokkaan perheen redox-suunnatun syöpälääkkeen metallodrugs.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), dimetyylisulfoksidi (DMSO), propidiumjodidia (PI) , deferoxaminemesylate suola (DFO), N-asetyyli-L-kysteiini (NAC), kalseiini-acetoxymethylester (kalseiini-AM), kakodylaattipuskurissa, Tris-EDTA: ta (eteeni-diamino tetraetikkahappoa), Tiron, natriumatsidia, metyyli vihreä, Hoechst etidiumbromidia, bromifenolisinistä, ksyleenisyanolia, glyseroli ja RNaasi A: ta olivat Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Metyleenisininen, vetyperoksidi 35% (w /v) ja etanoli olivat Panreac (Barcelona, ​​Espanja). HEPES oli ICN (Madrid, Espanja). Triton-X100 oli peräisin PlusOne (Amersham Bioscience, Uppsala, Ruotsi). 2 ’, 7’-Dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H

2DCFDA) oli Molecular Probes (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Agaroosi oli peräisin ECOGEN (Barcelona, ​​Espanja). Sisplatiini (Pharmacia, Pfizer Inc, Kalamazoo, MI, USA) toimitti ystävällisesti apteekissa Katalonian syöpäinstituutti (ICO, sairaala Dr. Josep Trueta, Girona, Espanja). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), RPMI-1640-väliaine, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä-streptomysiiniä ja trypsiini saatiin GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA). DMEM /F12, hevosen seerumia ja insuliinin olivat Invitrogen. Hydrokortisoni, koleratoksiini ja epidermaalista kasvutekijää olivat Sigma-Aldrich. Rintaepiteelisolulinja Cell Growth Medium (MEGM) oli Lonza (Berkshire, UK). PUC18-plasmidi oli Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Yhdisteet, valittiin tähän tutkimukseen (1, 1-Fe, 2, 2-Fe, 3, 3-Fe, 4, 4-Fe, 5 ja 5-Fe) syntetisoitiin seuraavasti raportoitiin menettelyt [38-41].

Solulinjat

Ihmisen MCF-7-rintasyöpäsolulinja, CAPAN-1 haimasyöpä solulinja, PC-3 eturauhasen syövän solulinja, Z-138, Jeko-1, Granta ja SP53 non-Hodgkin- lymfoomåsolulinjojen, Jurkat-T-solujen akuutti lymfaattinen leukemia-solut, LN229 ja U87MG glioomasolulinjoja ja MCF 10A kuolemattomaksi rintaepiteelisolulinja solulinja saatiin the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). CCD-18Co ihmisen paksusuolen fibroblastisolulinjassa saatiin EucellBank (University of Barcelona, ​​Barcelona, ​​Espanja). 1BR3G transformoitu ihmisen ihon fibroblasteja saatiin European Collection of Cell Cultures (ECACC, Porton, UK). MCF-7, CAPAN-1, PC-3, LN229 ja U87MG pidettiin DMEM. Hematologiset solulinjoja ylläpidettiin RPMI-1640. Kaikki alustat täydennettiin 10% FBS: ää ja 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä. Medium for JURKAT, Jeko-1 ja Z-138-solujen täydennettiin 25 mmol /l HEPES. MCF 10A-soluja ylläpidettiin DMEM /F12, johon oli lisätty 5% hevosen seerumia, 500 ng /ml hydrokortisonia, 100 ng /ml koleratoksiinia, 10 ug /ml insuliinia ja 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää. HMLE-soluja (kuolemattomiksi ihmisen rintarauhasen epiteelisolut), HMLER solut (HMLE solut yli-ilmentävät hTERT, SV40: n T /t ja H-RasV12) ja HMLERshEcad syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (HMLER transformoitujen solujen lyhyillä hiusneula-RNA estää ilmentymisen CDH1 geenin, joka koodaa E-kadheriinin) [44], pidettiin 1: 1-seosta HMLE (DMEM /F-12 + 5% hevosen seerumia, penisilliini-streptomysiiniä-glutamiinia (PSG), 10 ug /ml insuliinia, 10 ng /ml epidermaalista kasvutekijää ja 0,5 g /ml hydrokortisonia) ja MEGM. Kaikkia solulinjoja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2

sytotoksisuusmääritykset

sytotoksinen aktiivisuus yhdisteiden määritettiin MTT väheneminen määrityksessä, kuten on kuvattu [ ,,,0],45]. Yhdisteet laimennettiin Milli-Q-vettä, jolloin saadaan 1 mmol /L kantaliuoksia. Asianmukainen alikvootit näistä laimennettiin vastaavalla soluviljelyalustaa saadaan lopullinen toimi pitoisuudet. Alikvootit 5000 1BR3G solujen, 6000 MCF-7, 6000 PC-3-solut, 10 000 CAPAN-1-solut, 4000 MCF 10A soluja, 4000 HMLE soluja tai 4000 CCD-18Co-soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille, 24 tuntia ennen hoitoja. Hematologiset solulinjoja siirrostettiin 400 000 solua /ml. Soluja käsiteltiin vastaavan yhdisteen konsentraatioissa 0-100 umol /l: ssa 48 tuntia. Kolme rinnakkaista kunkin yhdisteen käytettiin. IC

50 määritettiin kunkin yhdisteen tavanomaisilla epälineaarinen regressio ja käyränsovituksella GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).

Hemolyyttinen määritys

hemolyyttinen aktiivisuus yhdisteiden 100 umol /l arvioitiin määrittämällä hemoglobiinin vapautuminen punasolujen suspensioiden tuoreen ihmisveren (5% tilavuus /tilavuus) kuten on kuvattu [46].

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

MCF-7-solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin sisplatiinin, yhdiste 1, 2 tai 5 10 umol /l, tai pelkästä kontrollina, 3 ja 24 tuntia 37 ° C: ssa. Lisäksi, solut altistettiin yhdisteeseen 1 3, 6, 12 ja 24 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin PBS: llä, kerättiin trypsiinillä ja alhaisella tiheydellä (3000 solua 360 mm: n levy). Solujen annettiin jakaa ja muotoon pesäkkeitä 7-10 päivän ajan; jonka jälkeen, pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin 2% metyleenisineä 50% etanolia. Pesäkkeiden lukumäärä kuhunkin maljaan määritettiin käyttäen Alpha Innotech Imaging järjestelmän (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

kaspaasiaktiivisuus analyysi

Entsymaattinen kaspaasiaktiivisuus määritettiin jälkeen solut altistetaan yhdiste 1, 2 ja 5 10 umol /l: ssa 48 tuntia. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin luminometrisellä kaspaasi-Glo 3 /7assay (Promega, Madison, WI, USA) käyttämällä Synergy HT monen havaitseminen mikrolevylukijalla (Bio-Tek).

Solusyklianalyysiä

Cell cycle profiilit analysoitiin virtaussytometrialla PI-värjättyjen solujen. Lyhyesti, solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa 70% etanolia. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, DNA värjättiin 50 ug /ml PI: n läsnä ollessa 50 ug /ml RNaasi A värjätyt solut käsitellään sitten FACScan-virtaussytometrillä (Coulter Epics XL-MSL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) ja winMDI ohjelmiston.

ROS mesurement

Cellular ROS-pitoisuus määritettiin käyttämällä 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti koetin (H

2DCFDA). Solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille (50 000 solua /kuoppa) fenolipunaista DMEM 24 h ennen hoitoja. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla yhdistettä 1, 2 ja 5 (2,5, 5 tai 10 umol /l) tai vehikkeliä yksinään kontrollina, 5 tai 24 tuntia 37 ° C: ssa. Joissakin kokeissa soluja yhteistyössä käsiteltiin yhdisteillä plus 5 mmol /l NAC. Käsittelyjen jälkeen solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 1 umol /l H

2DCF-DA PBS: ssä 30 minuutin ajan pimeässä. Pesun jälkeen solut kerättiin trypsiinillä ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS-Calibur virtaussytometrillä (Becton-Dickinson®, Immunofluorometry Systems, Mountain View, CA, USA). Geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetin ollessa 10 000 solua määritettiin käyttäen CellQuestTM ohjelmistoa (Becton Dickinson). Fluoresenssin taitettava kasvu verrattuna käsittelemättömiin soluihin määritettiin kullekin hoitoon.

määritys cellular labiilin rautaa altaan

Matkapuhelinverkko labiili rauta allas määritettiin kalseiini-AM. CAPAN-1-soluja (125 000 solua /kuoppa) ympättiin 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin 24 h 10 umol /l yhdistettä 1, 2 tai 5 37 ° C: ssa. Joissakin kokeissa soluja inkuboitiin 2 tuntia 100 umol /l DFO tai 100 umol /l FeCI

2. Solut altistuvat ajoneuvon yksin käytettiin kontrollina. Käsittelyjen jälkeen solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin kalseiini-AM: n (0,25 umol /l) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Sen jälkeen solut pestiin ja kerättiin trypsiinillä ja geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetin ollessa 10 000 solua määritettiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu.

Cellular DNA-vaurioita analyysi

DNA-vaurioita arvioitiin tarkkailemalla intensiteetti p-H2A.X fluoresenssi virtaussytometriaa käyttämällä. Lyhyesti, solut kerättiin trypsiinillä, pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä 15 minuutin ajan jäissä. Sitten solut permeabilised 0,2% v /v Triton-X100: ssa 10 minuuttia ja inkuboitiin 1: 400 kanin anti-p- (S139) -H2A.X vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ja 30 minuutin ajan jäissä. Pesun jälkeen 0,1% Triton-X100 PBS: ssä, soluja inkuboitiin 1: 400 anti-kani-Alexa 555-konjugoitu vasta-aine (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) 20 minuutin ajan jään päällä. Analyysi suoritettiin FACScan-virtaussytometrillä, jossa virtaava ohjelmiston.

DNA cleavage analyysi

DNA katkaisun seurattiin agaroosigeelielektroforeesilla. Kantaliuos pUC18-DNA valmistettiin tuoreeltaan Milli-Q-vettä pitoisuutena 0,5 ug /ml (1512 umol /L nukleotidia, 756 umol /l bp). Reaktiot suoritettiin sekoittamalla 0,5 ui pUC18 asianmukaiset erillä yhdisteiden ja 1 ui aktivoivan aineen liuosta (35% paino /tilavuus H

2O

2 H

2O). Kakodylaattipuskurissa (0,1 M, pH 6,0) lisättiin seokseen, jolloin saatiin lopullinen tilavuus on 20 ui. Lopullinen pitoisuus pUC18-DNA oli 37,8 umol /l nukleotidin (18,9 umol /l bp). Näytteitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa; reaktiot pysäytettiin lisäämällä 6 ui puskuriliuosta, joka koostuu bromifenolisini (0,25%), ksyleenisyanolia (0,25%), ja glyserolia (30%). Sen jälkeen näytteet tehtiin elektroforeesi 0,8% agaroosigeelissä 0,5 x TBE-puskurissa (0,045 mol /l Tris, 0,045 mol /l boorihappoa, ja 1 mmol /l EDTA: a), 100 V: ssa 1 h ja 40 min. Geelit värjättiin etidiumbromidilla (10 mg /ml TBE) 15 minuutin ajan ja visualisoitiin UV-läpivalaisulla. DNA nauhat otettiin käyttäen PROGRES CapturePro 2.7 järjestelmä ja intensiteetti kunkin kaistan kvantifioitiin kanssa GelQuant version 2.7 ohjelmisto (DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) käyttäen korjauskerrointa 1,31 kompensoimaan alennetun etidiumbromidilla ottoa superkierteistä plasmidi-pUC18-DNA [47]. Osuus eri plasmidi-DNA määritettiin kunkin hoidon. Testataan osallistuminen ROS säikeen katkeamisen ja mahdollisen monimutkainen-DNA vuorovaikutus sivustoja, eri ROS scavengers ja ura sideaineita lisättiin reaktioseoksiin. Scavengers käytettiin Tiron (10 mmol /L), natriumatsidia (0,4 mol /l), ja dimetyylisulfoksidi (DMSO, 3 ui). Uran sideaineita käytettiin metyyli vihreä (20 mmol /l) ja Hoechst (40 mikromol /l).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS tilasto-ohjelmalla for Windows (versio 15.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitatiiviset muuttujat ilmaistiin keskiarvon ja keskihajonnan (SD) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Normaalisuus tietojen testattiin käyttämällä Shapiro-Wilk testi. Erot tietoja normaalijakaumaa ja homogeeninen varianssit analysoitiin käyttämällä muuttujien Studentin t-testiä. Arvoa p 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Valinta yhdisteiden

Iron koordinaatiokomplekseihin 1-Fe, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe ja 5-Fe valittiin määrittämään niiden antituumoriaktiivisuus ihmisen eri solulinjojen, joka perustuu niiden kykyyn muodostaa erittäin hapettavia kanssa reagoidessaan peroksidien [38-43]. Neljä Fe (II) -pohjaisen komplekseja 1-Fe, 2-Fe, 3-Fe ja 4-Fe sisältävät neljähampainen aminopyridiiniä ligandeja ja ne ovat tunnettuja niiden erinomaisen aktiivisuuden hapetuskatalyysissä [38-40,42,43]. Complex 5-Fe sisältää viisihampainen ligandi ja on tunnettu vakauttaa korkea hapetustilojen rautaa [41]. Lisäksi rauta-orgaanisista yhdisteistä 1, 2, 3, 4 ja 5 testattiin vaikutuksen arvioimiseksi metalli ligaatiolla niiden sytotoksisen aktiivisuuden (kuvio 1).

yhdisteet 1, 2 ja 5 ovat erittäin sytotoksinen ja syövän kantasoluja kaltaisten solujen

antiproliferatiivinen raudan kompleksien (1-Fe, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe ja 5-Fe) ja vastaava rauta-free ligandeja (1, 2, 3, 4 ja 5), ​​oli alun perin testattiin kaksi kasvaimen syöpäsoluja linjat, MCF-7 ja CAPAN-1. Yhdisteet testattiin eri konsentraatioissa, jotka vaihtelivat 0-100 umol /l pitoisuuden määrittämiseksi, joka tarvitaan inhiboimaan solujen kasvua 50%: lla (IC

50). Yhdisteet, joilla on IC

50-arvot yli 100 mikromol /l katsottiin olevan aktiivinen. Vain kolme viidestä raudan kompleksit (1-Fe, 3-Fe, 4-Fe) osoitti mitattavissa antiproliferatiivista vaikutusta MCF-7-soluissa, kun taas yksikään raudan kompleksit olivat aktiivisia vastaan ​​CAPAN-1-soluissa (taulukko 1). Antiproliferatiivinen 3-Fe ja 4-Fe on varsin vaatimaton (IC

50 = 73,5 ± 0,7 umol /l ja 63,5 ± 2,1 umol /l, tässä järjestyksessä). Sen sijaan kaikki rauta-free ligandit olivat sytotoksisia molemmissa solulinjoissa analysoidaan IC

50 arvot vaihtelevat välillä 3,7 ± 0,4-88,5 ± 0,7 umol /l MCF-7-solut ja 6,0 ± 0,7-32,0 ± 10,4 umol /L CAPAN-1-soluissa. Nämä arvot ovat alueella vakiintunut syöpälääkkeiden kuten sisplatiinin testattiin samoissa olosuhteissa (taulukko 1). Heikon antiproliferatiivinen aktiivisuus raudan kompleksit, olemme keskittyneet metalli-orgaanisista yhdisteistä ja arvioitiin niiden sytotoksisuus valikoima kasvain (PC-3, Z-138 ja JURKAT) ja ei-pahanlaatuiset (HMLE, MCF 10A, 1BR3G ja CCD-18Co) solulinjoja (taulukko 2). Yhdiste 2 oli aktiivisin ligandin kasvainsoluja vastaan, IC

50 arvot vaihtelevat välillä 3,8 ± 0,2-7,2 ± 1,9 umol /l. Yhdisteet 1 ja 5 myös osoittautunut alhaiseksi IC

50-arvot (4,8 ± 1,2-15,1 ± 3,1 umol /l ja 2,9 ± 0,4-7,7 ± 0,3 umol /l, tässä järjestyksessä), kun taas maltillisempaa antituumorivaikutus saatiin ligandit 3 ja 4. Vain normaalissa paksusuolen CCD-18Co solulinja aktiivisuus yhdisteiden oli pienempi kuin tuumorisolulinjoja. Tärkeää on, yksikään ligandit olivat hemolyyttinen, jopa 100 umol /L (taulukko 2). Antitumor ominaisuudet ligandien arvioitiin edelleen paneelissa solulinjojen, mukaan lukien ihmisen leukemia, lymfooma ja gliooma syöpäsolujen, analysoimalla niiden sytotoksisten vaikutusten 10 umol /l. Kuten odotettua, yhdisteet 1, 2 ja 5 näytetään myös korkea antiproliferatiivinen aktiivisuus näitä solulinjoja (kuvio 2A), mikä osoittaa niiden kykyä olla laajalti aktiivisia kasvaimia estävinä aineina.

(A) Sytotoksisuus yhdisteiden 1, 2, ja 5 vastaan ​​syöpäsoluja. Ilmoitetun solulinjoja käsiteltiin 48 h ligandien kanssa (10 umol /l) ja solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Data edustaa elävien solujen prosenttimäärän suhteessa käsittelemättömiin soluihin (kontrolli). (B) Sytotoksisuus doksorubisiinin ja yhdisteet 1, 2 ja 5 vastaan ​​CS kaltaisia ​​soluja. CS-like HMLER-shEcad solujen ja ei-CS-like HMLER isogeenisestä vanhempien soluja käsiteltiin 48 h arvostellaan pitoisuudet doksorubisiinia, 1, 2 ja 5. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Kunkin käsittelyn elinkelpoisten solujen prosentuaalinen suhteessa käsittelemättömiin soluihin on ilmoitettu. Data edustaa keskiarvoa ± SD 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

perehtyä sytotoksista tehoa ligandien 1, 2 ja 5, niiden antiproliferatiivinen aktiivisuus arvioitiin vakaa rintasyöpä varsi (CS) kaltainen solulinja (HMLER-shEcad). Tämä solulinja perustettiin alun perin triple onkogeenisistä transformoitu ja kuolemattomiksi ihmisen rintarauhasen epiteelisolut (HMLER), jolloin pudotus E-kadheriinin laukaisi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka johti solujen tunnusmerkillisiä piirteitä CSCS [44,48]. Kuten odotettua, CS-like HMLER-shECad solut olivat enemmän resistenttejä tunnettu kemoterapian doksorubisiinia kuin ei-CS-like HMLER isogeenisestä ohjaus soluihin [48] (IC

50 = 0,3 ± 0,02 umol /l vs 0,10 ± 0,02 umol /l, vastaavasti, jotka edustavat ~ 3-kertainen nousu IC

50) (kuvio 2B). Sitä vastoin sytotoksinen profiilia ligandien 1 ja 2 pysyi suurelta osin muuttumattomana CS-like HMLER-shECad solujen (IC

50 = 5,3 ± 0,7 umol /l ja 6,8 ± 0,1 umol /l, tässä järjestyksessä) suhteessa HMLER soluja ( IC

50 = 6,5 ± 0,4 umol /l ja 6,6 ± 0,3 umol /l, tässä järjestyksessä) (kuvio 2B), mikä osoittaa, että nämä ligandit indusoivat solukuoleman mekanismilla, voi eikä jota alustassa solunsalpaajaresistentti-CS-kaltainen fenotyyppi. Lisäksi yhdiste 1 näkyy joidenkin selektiivisten sytotoksisuus kohti HMLER-shECad soluissa. Sen sijaan HMLER-shECad osoittivat jonkin verran vastustuskykyä ligandi 5-indusoidun sytotoksisuuden (IC

50 = 8,6 ± 0,5 umol /l ja 5,1 ± 0,1 umol /L HMLER soluissa) (kuvio 2B).

pitkän aikavälin aktiivisuus ligandien määritettiin mittaamalla niiden kyky estää klonogeenisten mahdollisuuksia syöpäsolujen. Näin ollen, MCF-7-soluja käsiteltiin 3 tai 24 h 10 umol /l-ligandi 1, 2 tai 5, tai sisplatiinin positiivisena kontrollina, ja sen jälkeen pinnoittamalla alhaisella tiheydellä. Analyysi pesäkemäärät jälkeen 10 päivää paljasti huomattavaa estävää vaikutusta yhdisteen 2 pesäkkeenmuodostus ja pesäkkeiden lukumäärä oli merkittävästi vähentynyt 39% verrattuna kontrollisoluihin 3 tunnin jälkeen altistumisen ligandi (kuvio 3A). Lisäksi kyky muodostaa klooneja MCF-7-soluissa oli lähes poistettiin 24 tunnin kuluttua altistuksen yhdisteeksi 2, paljastaen suurempi inhiboiva aktiivisuus kuin sisplatiinin. Tällä hetkellä vaiheessa, yhdisteet 1 ja 5 myös vähentänyt merkittävästi pesäkemäärät 57% ja 53%: lla, vaikka niiden aktiivisuus oli pienempi kuin yhdiste 2, joka on yhtä mieltä antiproliferatiivinen ligandien (taulukko 2). Toisin kuin sisplatiinihoitoon, solujen kasvun esto ligandeilla on ajasta riippuva. Altistuminen MCF-7-solut ligandin 1 3, 5, 12 ja 24 h vähentänyt pesäkkeiden 0%, 18,7%, 40,5% ja 56,6%, vastaavasti (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että ligandit laukaisevat viivästynyt solukuoleman mekanismin, joka vaatii useita tunteja tapahtuu.

(A) Pesäkkeenmuodostusta MCF-7-solujen altistuksen jälkeen yhdisteille 1, 2 ja 5 (10 umol /l ) 3 tai 24 tuntia. Sisplatiini sisällytettiin positiivisena kontrollina. (B) Pesäkkeenmuodostusta altistumisen jälkeen yhdisteeseen 1 (10 umol /l) 3, 5, 12 ja 24 h. Pylväskaaviot osoittavat prosenttiosuus laskettiin pesäkkeiden suhteessa kontrolliin käsittelemättömiin soluihin ja ne edustavat keskiarvoja ± SD 3 riippumattoman kokeen. * P 0,05 vs. kontrolli soluja.

yhdisteiden 1, 2 ja 5 edistää solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin

onko ligandit indusoivat solukuolemaa aktivoinnin avulla ohjelmoidun solukuoleman (apoptoosin) , aktivointi executioner kaspaasien, kaspaasi-3 ja -7, analysoitiin käyttäen luminometrisellä määritystä paneelin ihmisen syöpäsolulinjoja. Soluja käsiteltiin ligandien 10 umol /l, ja kaspaasi aktiivisuutta tarkkailtiin 48 tunnin jälkeen. Kaikki kolme ligandit aktivoitu kaspaasi 3/7 jonkin verran (kuvio 4). Yhdiste 2 hoito selvästi lisääntynyt kaspaasi 3/7 aktiivisuutta kaikissa solulinjoissa verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Mielenkiintoista on, käsittely yhdisteellä 1 johtanut merkittäviin kaspaasi 3/7 aktivaation lymfooma (Z-138, Jeko-1, Granta ja SP-53), mutta ei leukemia (JURKAT) tai gliooma (LN229 ja U87MG) solulinjat. Yhdiste 5 indusoi laaja pro-apoptoottisen vaikutuksen, aktivoimalla kaspaasi 3/7 useimmissa solulinjoissa lukuun ottamatta PC-3-soluja, ja se oli kaikkein tehokkain yhdiste vastaan ​​Jurkat-soluja (kuvio 4). Mikä tärkeintä, nämä tulokset korreloivat vahvasti profiilia sytotoksisten vaikutusten aiheuttamaa yhdisteiden 1, 2 ja 5 (kuvio 2A), ja viittaavat siihen, että yhdisteet 2 ja 5 edistää solujen kuoleman etupäässä indusoimalla apoptoosia. Nämä tulokset vahvistettiin analysoimalla vaikutus kaspaasi estoa sytotoksista aktiivisuutta yhdisteiden. Kuten on esitetty kuviossa 4B, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä QVD-OPh merkittävästi palautui sytotoksisuus yhdisteiden 1 ja 5 MCF-7 ja CAPAN-1-soluja indusoivan lisäys solujen elinkelpoisuuden vaihtelevat 2,5-4 kertaiseksi. Huomionarvoista yhteisymmärryksessä aiempien havaintojen, yhdiste 2 näkyy hyvin korkea sytotoksinen aktiivisuus, mikä voi selittää puute reversion läsnä ollessa kaspaasiestäjä näissä koeolosuhteissa. Nämä havainnot tukevat, että sytotoksinen aktiivisuus näiden yhdisteiden liittyy kaspaasi-riippuvaista apoptoosia.

(A) Ilmoitettu solulinjoja käsiteltiin 48 h yhdisteiden 1, 2 ja 5 (10 umol /l) ja kaspaasi 3 /7-aktiivisuus mitattiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Pylväskaaviot osoittavat kertainen nousu kaspaasiaktiivisuus suhteessa ole hoidettu (kontrolli) ja edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. (B) MCF-7 ja CAPAN-1-soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan kanssa ligandien (10 uM) puuttuessa (-) tai läsnä ollessa (+) ja yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä QVD-OPH (20 uM) ja solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Tiedot on esitetty elinkelpoisten solujen prosentuaalinen suhteessa käsittelemättömiin soluihin (kontrolli). Data edustaa keskiarvoja ± SD 3 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. Erot poissa ja läsnä ollessa QVD-OPh hoito oli tilastollisesti merkittävä * p 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001.

tutkia vaikutuksen ligandien solun solusyklin etenemisen, solusyklin jakautumisen MCF-7 ja LN229 solut tutkittiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun 24 ja 48 tunnin yhdisteille altistamisen 1, 2 ja 5 (10 umol /l). 0,05.