Krooninen sairaus

tiivistelmä

sfingosiini-1-fosfaatti (S1P) kuljettaja Spns2 säätelee sydänlihaksen esiaste maahanmuuttoa seeprakalan ja lymfosyyttiliikennettä hiirillä. Kuitenkin sen tehtävä syöpä ei ole tutkittu. Osoitamme tässä, että kohdunulkoinen Spns2 ilmaisun aiheuttaman apoptoosin ja sen knockdown tehostetun soluvaelluksen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin. Aineenvaihdunnan Spns2 ilmaisu lisäsi solunulkoista S1P tasolla ja sen pudotus solunsisäisen. Farmakologinen esto S1P synteesin poistaneet lisätyn migraatiota välittyy Spns2 knockdovvn, mikä osoittaa, että solunsisäinen S1P on keskeinen rooli tässä prosessissa. Soluviestitykseen tutkimukset osoittivat, että Spns2 ilmaisu alentunut GSK-3β ja Stat3 välittämän pro-eloonjäämisreittejä. Toisaalta näistä reiteistä aktivoitiin Spns2 Knockdown, mikä selittää lisääntynyt solujen vaeltamiseen, sillä ne ovat myös ratkaisevia muuttoliikettä. Korjauksilla Spns2 todettiin vaikuttavan useisiin liittyviä entsyymejä S1P aineenvaihduntaan, kuten sfingosiini kinaasien, S1P fosfataasien, ja S1P lyase 1. Geneettisesti Spns2 mRNA tason todettiin vähennettävä kehittynyt keuhkosyöpä (LC) potilaille määrällisesti käyttämällä pientä mittakaavassa qPCR array. Nämä tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että Spns2 soittaa avainroolit säätelyssä solujen toimintoja NSCLC soluissa, ja että sen alassäätöä on mahdollinen riskitekijä LC.

Citation: Bradley E, Dasgupta S, Jiang X, Zhao X, Zhu G, hän Q, et al. (2014) Kriittinen rooli Spns2, sfingosiiniin-1-fosfaatti Transporter, Lung Cancer Cell Survival ja Migration. PLoS ONE 9 (10): e110119. doi: 10,1371 /journal.pone.0110119

Editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 08 syyskuu 2014; Julkaistu: 20 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Bradley et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot ovat kehossa ja tukeminen Kortistot paperin.

Rahoitus: Tämä projekti on tuetaan Intramural avustusta Georgia Regents yliopistosta ja SDG palkinnon American Heart Association (GW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä (LC) on johtava syy syövän liittyvän kuoleman Yhdysvalloissa ja maailmanlaajuisesti [1], [2]. Vuonna 2012 on yli 220000 uutta tapausta ja yli 160000 kuolemantapausta pelkästään Yhdysvalloissa [1], [3], [4]. LC on huomattavan heterogeeninen sairaus. Sen kaksi suurta lomakkeet ovat ei-pienisoluinen LC (NSCLC) ja pienisoluinen LC, joista NSCLC on yleisin muoto, joka vastaa noin 85% vasta diagnosoitu tapauksissa [1], [4].

geneettiset poikkeavuudet ovat yhdistäneet useita geenejä ja signalointi polkuja NSCLC, mukaan lukien kasvutekijän reseptorin (EGFR) perhe, signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (Stat3), ja fosfoinositidi 3-kinaasi

–

Akt-mTOR reittejä [ ,,,0],1], [2], [4]. Nämä löydöt ovat johtaneet yksilöllisesti kohdennettua hoitomuotojen erityisiä estäjä lääkkeet, kuten erlotinibi ja gefitinibin mutaatioita EGFR [5] tai crizotinib geenin translokaatiota tuloksena EML4-ALK onkogeeni [6]. Epigeneettiset vaihtelut liittyvät myös NSCLC [7], [8]. Vaikka sen diagnoosi ja hoito kehittyy nopeasti, mielekästä parannuksia tuloksia useimmille NSCLC potilaat ovat edelleen vaikeasti [1], [3]. Monet potilaat uusiutuminen ja muodostavat aggressiivisempi etäpesäkkeitä [9]. Näin syvempää ymmärrystä alkuperän ja molekyylitason mekanismeja etäpesäke taudin tarvitaan kiireesti parantamiseksi ehkäisyyn ja hoitoon.

Sfingosiini 1-fosfaatti (S1P) on voimakas bioaktiivinen signalointi molekyyli, joka soittaa elintärkeitä tehtäviä erilaisissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa, kuten immuniteetti ja syöpä [10], [11], [12], [13]. Se edistää syövän säätelemällä solujen lisääntymistä /selviytymistä, muuttoliike, angiogeneesi, ja imusuonten [10], [14], [15]. Yksi entsyymien, joka luo S1P, sfingosiinikinaasin 1 (SphK1) (Fig. 1A), on pidettävä onkogeenisen entsyymi, jonka aktiivisuus voidaan stimuloida erilaisia ​​agonistien, esim. hormonit ja kasvutekijät [16], [17]. Sitä vastoin pilkkovan entsyymin, S1P, S1P lyase 1 (SGPL1) (Fig. 1A), on alassäädetty eturauhassyövässä [17]. Hiljentäminen SGPL1 parantaa solujen selviytymistä; ja valvotaan SGPL1 ilmaisun herkistää solusta säteilytys tai kemoterapiaa [17]. Lisäksi monet näkökohdat S1P signaalien kulkureiteillä liittyvät läheisesti kasvaimien syntyyn (Fig. 1A) [10], [18]. Ekstrasellulaarinen S1P kykenee suurin osa sen funktion läpi viiden solun pinnan G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien S1P1-S1P5 [10]. Se stimuloi eri signaalintransduktioreitteihin eri solutyyppien, samoin kuin saman solun sisällä, riippuen reseptoreihin ilmaistuna. Esimerkiksi, S1P1 on kytketty ainoastaan ​​

kautta

Gi-proteiini aktivoi Ras, mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK), PI3K /Akt, ja fosfolipaasi C polkuja [10], [19]. Solunsisäinen S1P, toisaalta, edistää syövän etenemisen reseptori-riippumattomalla tavalla [11], [12], joko välittämällä kalsiumin vapautumista Endoplasmakalvosto tai vuorovaikutuksessa sen solunsisäisen tavoitteita, kuten HDAC ja TNF reseptori liittyvä tekijä 2 (TRAF2) [20]. Vielä tärkeämpää on, S1P korkeus on mukana niin riskitekijä LC epidemiologisen tutkimuksen [21].

(A), Kaavamainen esitys S1P aineenvaihduntaa ja toiminta, SGPP, S1P fosfataasi; SphK, sfingosiinikinaasin; SGPL, S1P lyaasi; herne, fosfoetanolamiinia. (B), Western blot-analyysi Spns2-EGFP ekspressiota detektoitiin anti-GFP-vasta-ainetta. β-aktiini (Actin) käytettiin latauskontrollina. A549-soluja transfektoitiin Spns2-EGFP ja solulysaateista kerättiin 48 tuntia myöhemmin. Molekyylipaino Spns2-GFP on noin 84 kD (58 + 26, nuoli). (C), Spns2 ilmentyminen lisäsi solunulkoista tason S1 P sfingosiini (Sph) ja dihydrosfingosiiniä (dhSph). Solut muuttuivat median kanssa lipidit on poistettu FBS 24 tuntia transfektion jälkeen. Toinen 24 tuntia myöhemmin, media otettiin talteen ja sentrifugoitiin, ja supernatantti analysoitiin lipidomics. (D), Viivästys kuvia Spns2 positiivisia soluja. A549-soluja transfektoitiin Spns2-EGFP kuten A. 12-16 tuntia myöhemmin solut saatettiin olosuhdekammiossa joka pitää 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ja Viivästys otettuja kuvia ajankohtina ilmoitettu. Mittakaava on 10 pm. (E), konfokaali laser skannata kuvia solujen immunologiseen värjätty aktiivinen (pilkkoutuu) kaspaasi 3 (Casp3). A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi, kiinnitettiin ja värjättiin vasta-aine pilkotaan Casp3. Mittakaava on 20 um.

S1P syntyy solunsisäisesti SphKs ja sen solutasolla on ylläpitää hienosäädetty tasapaino keskuudessa sukupolvi, muuntaminen, hajoamista, ja vienti (Fig. 1A). S1P viedään ulos soluista kuljettaja proteiineja (Fig. 1A). Useat ATP-sitova kasetti (ABC) perheenjäsenet, kuten ABCA1, ABCC1, ja ABCG1 on ehdotettu kuljettaa S1P perustuvat havaintoihin, että niiden Knockdown tai farmakologinen esto lasku S1P julkaisu [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Kuitenkin tämä käsite on edelleen kiistanalainen, koska S1P vientiä ei muutu, kun näitä proteiineja ulkoisesti ilmaistaan ​​soluissa tai tippuu hiirillä [18], [27], [28]. Äskettäin vanhapiika homologi 2 (Spns2), jäsen Keskeinen mahdollistaja superperheen muiden kuin ATP-riippuvaiset kuljettajat, on osoitettu kuljettamaan S1P sekä

in vitro

ja

in vivo

[27 ], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Enemmän kiinnostavaa, vaikka vähensi plasmassa, S1P-arvot kohoavat joissakin kudoksissa, kuten keuhkoissa Spns2 hiirissä [33], joka on yhdenmukainen aiemman raportin osoittaa, että Spns2 ilmentyy runsaimmin ihmisen keuhkoissa [18].

Nämä aiemmat havainnot sai meidät oletuksen, että Spns2 on mukana LC kehittämiseen. Olemme suorittaneet voitto-of-function ja menettämisestä toiminnon kokeita NSCLC soluissa. Olemme myös havainneet Spns2 n ekspressiotaso LC potilasnäytteistä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Vasta-aineita fosfo-GSK-3β (Ser 9), GSK-3β, fosfo-Stat3, Stat3, halkaistut Caspase 3, ja Surviviinispesifisiä olivat Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Vasta-aineet AIF ja β-aktiini oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aine LC3B oli peräisin Abcam (Cambridge, MA). Vasta-aine vastaan ​​SphK2 oli peräisin Exalpha Biologicals (Dublin, OH). Fluoresoiva merkitseminen estäjien kaspaasien (FLICA) sarja oli kotoisin Immunochemicalilta Technologies (Bloomington, MN). SphK estäjä Ski-1 oli peräisin BioVision (Milpitas, CA). Kaukalon kaspaasiestäjä Z-VAD oli Promega (Madison, WI). PI3K estäjä LY294002 oli Cayman (Ann Arbor, MI). Ja Jak estäjä Jaki oli Milliporesta (Billerica, MA). Ihmisen LC reaaliaikainen PCR paneelit olivat Origene (Rockville, MD).

Methods

Plasmidi kloonausta.

Ihmisen SPNS2 PCR monistettiin BAC käyttäen alukkeita hSpns2forward: AAG CTT ATG TGC CTG GAA TGC GCC TCG, ja hSPns2reverse: GGT ACC AA GAC TTT CAC AGA TGC GGG CGG; ja subkloonattiin pGEM Teasy-vektoria (Promega, Madison, WI). Fragmentti digestoitiin käyttämällä entsyymejä HindIII: lla ja KpnI: lla ja kloonattiin pEGFP-N1 -vektoriin (Clontech, Mountain View, CA), jolloin pSPNS2-EGFP rakentaa. HA tagged Spns2, aluketta, jotka sisältävät HA-tag suunniteltiin. PCR-tuote kloonattiin pCDNA3.1 (Life Tech., Carlsbad, CA, USA) samanlainen pSPNS2-EGFP.

Soluviljely ja käsittely.

Ihmisen NSCLC solulinjat A549 ja H1299 (ATCC, Manassas, VA) oli antelias lahja tri Zhonglin Hao, Cancer Center, Georgia Regents yliopisto. Ensisijainen ihmisen hartian epiteelisolujen (HBEpC) olivat ATCC (Manassas, VA). A549-soluja ja H1299-soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Cellgro, Herndon, VA, USA), joka sisälsi 10% FBS (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Austin, TX), ja Pen /Strep (Life Tech.). HBEpC pidettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektio Spns2 siRNA: iden suoritettiin joko Lipofectamine 2000 mukaan valmistajan ohjeiden (Life Tech.) Tai elektroporaatio käyttäen Nucleofactor (Lonza, Allendale, NJ).

Live solun Viivästys kuvantaminen, immunosytokemia, ja konfokaali laser mikroskoopilla.

live solukuvauksessa tehtiin seuraavat edellinen julkaistujen menetelmien [35], [36], [37], [38]. Lyhyesti, solut transfektoitiin Spns2-GFP. Kuusitoista tuntia myöhemmin, viljelmä laitettiin elävien solujen kuvantamisen kammioon ja vaihekontrasti micrographs ottaa joka 30-60 minuuttia Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY, Yhdysvallat. For immunosytokemian ja laser konfokaalimikroskopia, The Kiinnitetyt solut immunovärjättiin vasta lueteltujen otettua kuvaa ja käyttämällä Zeiss LSM510 konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi varustettu kahden fotonin argon laser 488 nm (Cy2), 543 nm (Cy3), ja 633 nm (Cy5, Alexa Fluor 647), tässä järjestyksessä . LSM 510 Meta 3,2 ohjelmistoa käytettiin kuvan hankintaan. Adobe Photoshop CS4 käytettiin taustan vähentämistä ja editointi. Kuvia saatu sekundaarinen vasta-ainetta ainoastaan ​​käytettiin negatiivisina kontrolleina edustavat taustan intensiteettiä tietyllä laser kanava. Antigeenispesifinen immunovärjäyksellä kvantifioitiin laskemalla solut, jotka osoittivat signaalien kaksi tai useampia edellä taustafluoresenssi.

RNA, RT-PCR, ja qPCR.

RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen). Ensimmäisen juosteen cDNA syntyy iScript cDNA-synteesin (BioRad, Hercules, CA, USA). Reaaliaikainen qPCR suoritettiin käyttämällä SYBR vihreä /Rox qPCR Master Mix PTC-200 Gradient Cycler varustettu chromo 4 jatkuva loisteputki ilmaisimen (BioRad). Alukkeet qPCR olivat: ihmisen hSpns2 eteenpäin: TTA CTG GCT CCA GCG TGA, hSpns2 käänteinen: TGA TCA TGC CCA GGA CAG; hPOLR2A eteenpäin: GGGTGGCATCAAATACCCAGA; hPOLR2A käänteinen: AGACAC AGCGCAAAACTTTCA; hSphK1 eteenpäin: GGC TGC TGT CAC CCA TGA A, hSphK1reverse: TCA CTC TCT AGG TCC ACA TCA G; hSphK2 eteenpäin: AGC GTG GTA GCC ACT TCA G, hSphK2 käänteinen: GAG CAG TGT ACC GAT GCC A; hSGPP1 eteenpäin: ATC ATC ATC GGG CTT CAT TTA GC, hSGPP1reverse: GTG CTC CAG GTG TCA AGA GT; hSGPP2 eteenpäin, TCA C CG CAC TCC TCA TCG T, hSGPP2 käänteinen: CCG GGT TGG GCT GTA GTA ATC; hSGPL1 eteenpäin: CCT AGC ACA GAC CTT CTG ATG T, hSGPL1 käänteinen: ACT CCA TGC AAT TAG CTG CCA; hABCA1 eteenpäin: TTA AAC GCC CTC ACC AAA GAC, hABCA1reverse: AAA AGC CGC CAT ACC TAA ACT; hABCC1 eteenpäin: TTA CTC ATT CAG CTC GTC TTG TC, hABCC1reverse: CAG GGA TTA GGG TCG TGG AT; hABCG1 eteenpäin: ACT GCA GCA TCG TGT ACT GGA, hABCG1reverse: CGT CTC GTC GAT GTC ACA GTG; hABCG2 eteenpäin: TGA GCC TAC AAC TGG CTT AGA, hABCG2 käänteinen: CCC TGC TTA GAC ATC CTT TTC AG.

Solun elinkelpoisuus ja solukuoleman määrityksissä.

leviämisen ja apoptoosin määritykset suoritettiin A549 ja H1299-solut transfektoitiin hSPNS2-EGFP tai HA-Spns2 kuten aiemmin on kuvattu [39], [40], [41]. Määrä elävien solujen mitattiin mikrolevylukijalla käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc, joka perustuu dehydrogenaasi aktiivisuutta elävien solujen). Lyhyesti, CCK8 lisättiin käsiteltyyn soluviljelmään, inkuboitiin 2-4 tunnin ajan, ja niiden absorptio aallonpituudella 450 nm luetaan mikrolevylukijalla. Absorptio 450 nm: ssä korreloi elävien solujen määrä läsnä hyvin. FLICA määritys suoritettiin Spns2-EGFP-plasmidi-transfektoitiin A549-soluihin käyttäen sulforodamiini-leimattua fluorimetyyli ketoni peptidi-inhibiittori (punainen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 48 tuntia transfektion kanssa Spns2-EGFP plasmideissa FLICA reagenssia lisättiin väliaineen ja soluja inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut pestiin kerran pesuliuoksella ja sitten kiinnitettiin 4%

p

tista fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa lisäanalyysiä mikroskopialla.

Virtaussytometrianalyysi.

Spns2 GFP transfektoidut A549-solut kerättiin, kiinteä 4% paraformaldehydi, ja immuno-leimattu Caspase 3-vasta sen jälkeen Alexa Fluor 555 sekundäärinen vasta-aine. Leimatut solut analysoitiin Becton Dickinson FACSCalibur 4-väri analysaattorit varustettu 4 lasereita (BD Biosciences, San Jose, CA).

Cell muuttoliike määrityksiä.

Solun muuttoliikettä mitattiin haavan parantava määrityksissä aiemmin julkaistu [42]. Lyhyesti, solut transfektoitiin Spns2 siRNA: t tai sekoitetun valvonta lipofektamiini 2000 Soluja kasvatettiin 72 tuntia, jona aikana ne oli tullut konfluentteja. Rako on noin 400 um tuotettiin pipetin kärki. Leveys raon mitattiin eri ajankohtina. Ski-I hoito, 10pM Ski-I täydennettiin 24 tunnin kuluttua siRNA transfektion. Soluja viljeltiin vielä 48 tuntia ja sitten määritys suoritetaan.

Sphingolipid ja S1 P mittausta.

transfektoituja soluja Spns2 tai Spns2 siRNA kasvatettiin 48 tuntia, ja sitten sekä solujen pelletit ja media kerättiin . Solupelletit pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä. Elatusaineet sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa poistaa kelluvat solut ja solujäte. S1P tasoja soluissa ja viljelyalustassa mitattiin Lipidomics Core lääketieteellisen University of South Carolina (valvonnassa Dr. Jacek Bielawski) julkaistujen menetelmien mukaisesti on ThermoFisher TSQ Quantum kolmoiskvadrupolisen massaspektrometrin, jotka toimivat Multiple Reaction Monitoring (MRM) positiivinen ionisaatiomoodi käyttäen muokattu versio [43]. Lyhyesti, solupelletteinä tai media, joka vastaa noin 2-3 x 10

6 solua, oli väkevöity sisäiset standardit (ISS: C

17 base D-erytro-sfingosiini (17CSph), C

17 sfingosiini -1-fosfaatti (17CSph-1P), N-palmitoyyli-D-erytro-C

13 sfingosiini (13C16-Cer) ja heptadekanoyyli-D-erytro-sfingosiini (C17-Cer)), ja uutettiin etyyliasetaatilla /iso-propanoli /vesi (60/30/10, tilavuus /tilavuus) liuotinjärjestelmää. Haihduttamisen jälkeen ja ne sekoitetaan 100 ui metanolia näytteitä injisoitiin HP1100 /TSQ Quantum LC /MS-järjestelmä ja gradientti eluoidaan BDS Hypersil C8, 150 x 3,2 mm, 3 um hiukkaskoko pylväs, 1,0 mM metanolisella ammoniumformiaattia /2 mmolaarista ammoniumformiaattia liikkuvan faasin järjestelmää. Vastaavien piikkien kohdeanalyyttien ja sisäisiä standardeja kerättiin ja käsiteltiin käyttäen Xcalibur ohjelmisto. Määrällinen analyysi perustui kalibrointikäyrien pisteväkevöimällä keinotekoinen matriisin kanssa tunnetut määrät kohdeanalyytin synteettisten standardien ja yhtäläinen määrä sisäisten standardien (ISS). Kohdeanalyytin /IS piikkien pinta-alojen suhteet piirrettiin analyytin pitoisuuden. Kohdeanalyytin /IS piikin pinta-alojen suhteet näytteistä valmistettiin samalla normalisoitiin niiden ISS, ja niitä verrattiin kalibrointikäyriä käyttämällä lineaarista regressiomallia. Muut sfingolipidit, kuten keramidin ja sfingosiini, tutkittiin myös.

Tilastot.

Keinot ja standardipoikkeamat laskettiin Microsoft Excel. Tilastollinen merkittävyys laskettiin yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn post hoc -testi tai toistuva toimenpide ANOVA GraphPad Prism. P 0,05 pidetään merkittävänä.

Tulokset

Ectopic Spns2 ilmaisu indusoi solukuoleman NSCLC soluissa

Tutkia Spns2 tehtävälle LC, käytimme NSCLC soluja. Ensin yrittivät luoda Spns2-EGFP vakaa ilmentäviä A549-solulinja, mutta mitään tällaista linjaa saatiin (tietoja ei ole esitetty). Niinpä olemme keskittyneet ohimenevän ilmentymisen Spns2. Western blot-analyysi käyttämällä anti-GFP-vasta-ainetta osoitti, että Spns2 ilmaistiin ~84 kD fuusioproteiinin (58 kD + 26 kD, nuoli, Fig. 1 B). Sen varmistamiseksi, että kohdunulkoinen ilmaisi Spns2 oli toiminnallinen, mittasimme onko se kuljetettu S1P. Lipidomics tiedot osoittivat, että S1P taso elatusaine kasvoi 5,6 ± 0,55 kertaiseksi (Fig. 1 C), yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [29], [31], [32], [33], [34] ja siitä, että transfektoitu Spns2 oli täysin toimiva. Mielenkiintoista, solunulkoiset tasot sfingosiiniä (Sph) ja dihydrosfingosiiniä (dhsph) nostettiin 1,5 ja 2,8 kertaiseksi (Fig. 1 C), mikä tarkoittaa, että Spns2 voisi kuljettaa nämä kaksi sfingolipidejä samoin. Eri lajien keramidin tutkittiin, mutta mikään ei osoittanut merkittävää eroa verrattuna kontrolliin (kuvio. S1A).

Seuraavaksi tutkimme solun toimintojen Spns2 A549-soluissa. Elävien solujen kuvantaminen osoitti, että Spns2 solut kävivät läpi dramaattisia morfologisia muutoksia ja irrottaa soluviljelymaljoille (nuolet kuviossa. 1D), mikä viittaa siihen, apoptoottista solukuolemaa. Niinpä me immunologiseen leimattu solujen vasta-aineen havaitsemiseksi aktivoitu (pilkkoutuu) kaspaasi 3 (Casp3) (Fig. 1 E). Kaksoissokkoutettu kvantitatiivinen analyysi osoittaa, että 34,2 ± 9% Spns2 positiiviset solut olivat Casp3 positiivisia (kuviot. 1E ja 2A). Tämä induktio Casp3 vahvistettiin Western blot -analyysillä ja virtaussytometria; ja estänyt yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD (kuviot. 2B, S1B, ja S1C). Induktio Casp3 toistettiin ilmentämällä HA-Spns2, joka on pienempi tunnisteen (ei esitetty). Mukaisesti Casp 3 aktivointi, anti-apoptoosin geenin surviviinin väheni merkittävästi (Fig. 2B) [36], [44]. Apoptoosin aiheuttaminen tekijä (AIF), ja pilkotaan LC3B mitattiin myös, mutta yksikään nostettiin Spns2 ilmentymistä (Fig. 2B), mikä viittaa siihen, että Spns2 ei indusoi kaspaasi-riippumattoman apoptoosin tai autophagy.

(A), kvantifiointi of Casp3 positiivisten solujen esitetty D. Vehicle (pEGFP) transfektoituja soluja käytettiin kontrollina (Con). N 100 solut lasketaan kolmesta erillisestä kokeesta. (B), Western blot-analyysien solukuoleman merkkejä. A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi kuten A. Solulysaatit kerättiin ja niitä blotattiin vasta-aineiden kanssa osoitti. Ajoneuvon (pEGFP) transfektoituja soluja käytettiin negatiivisena kontrollina ja Actin käytettiin latauskontrollina. (C), edustaja kuvia FLICA värjäytymisen Spns2 positiivisia soluja. Elävien A549-soluja inkuboitiin FLICA 1 tunti 48 tuntia transfektion jälkeen. Solut kiinnitettiin ja micrographic otettuja kuvia. Mittakaava on 10 pm. (D), kvantifiointi FLICA positiivisten solujen esitetty C. N 100 solua kolmesta erillisestä kokeesta laskettiin kaksinkertainen sokeasti. (E), Spns2 ilmentyminen vähentää elävien solujen numero A549-soluja. Solut transfektoitiin kuten A. 48 tuntia myöhemmin, suhteellinen elävien solujen lukumäärä mitattiin CCK-8 kit mikrolevynlukijaa käyttäen. N = 4 (F), Spns2 ilmentyminen solujen määrän väheneminen in H1299 soluissa. Live-H1299 solujen määrä mitattiin kuten I. N = 4 B, E, H, I, J, virhe pylväät edustavat SD, *, p 0,05, **, p 0,01.

lisäksi vahvistaa, että Spns2 aiheuttaman apoptoosin, suoritimme FLICA (fluoresoivasti leimattuja estäjä pan caspases) määrityksiä eläviä soluja. Kuvio 2C esittää tyypillistä micrographic kuvia määrityksen. Plasebokontrolloitu kvantifiointiin osoitti, että 70 ± 15,9% of Spns2 positiivisia soluja oli FLICA positiivisia (Fig. 2D).

lopputuloksen solukuoleman on vähennettävä suurinta elinkelpoisten solujen määrä. Puolueeton solujen laskenta käyttämällä mikrolevyn lukijaa (CCK-8) osoitti, että Spns2 ilmentyminen johti 59 ± 1,2%: n vähennys elinkelpoisia A549-solut 48 tuntia (kuvio. 2E). Nämä tulokset toistettiin toisessa NSCLC solulinjassa H1299 (Fig. 2F).

Yhteenvetona todettakoon, että edellä tiedot osoittavat, että kohdunulkoinen Spns2 ilmaisu indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoosin NSCLC soluissa.

Spns2 ilme moduloi S1P aineenvaihdunta

Osoitimme, että Spns2 ilme kuljetetaan S1P ulkopuolella solujen (Fig. 1 C). Mielenkiintoista on, että solun tasot S1P, sfingosiini, ja eri keramidin lajeja ei muuttunut merkittävästi Spns2 ilmaisu, paitsi dhSph ja pitkäketjuisten keramidin C20:1were kasvoi noin 2,0, ja 1,4-kertaisesti, vastaavasti (Fig. 3A ja ei ole esitetty).

(A), Spns2 ilmaisu ei muuttanut solunsisäinen taso S1P. A549-solut muuttuivat median kanssa lipidit on poistettu FBS 24 tuntia transfektion jälkeen. Toinen 24 tuntia myöhemmin, solut kerättiin, pestiin ja lipiditasot analysoitiin lipidomics. (B), Spns2 ilmentyminen johti akuutin lisäystä SphK1 A549-soluissa. Solut transfektoitiin, mRNA talteen, ja reaaliaikainen qRT-PCR suoritettiin mitata SphK1. (C), Spns2 ilmentyminen johti akuutin kasvua SphK2. A549-soluja käsiteltiin kuten B paitsi, että qRT-PCR suoritettiin mitata SphK2. (D), Spns2 ilmentyminen johti vähentämiseen SGPP1 A549-soluissa. Soluja käsiteltiin kuten B paitsi, että qRT-PCR suoritettiin mitata SGPP1. (E), Spns2 ilmentyminen vähentää S1P-reseptoreihin. Soluja käsiteltiin kuten B, paitsi että qRT-PCR suoritettiin mitata S1P1, S1P2, ja S1P3. N = 3. Virhepalkit edustavat SD. *, P 0,05, **, p 0,01. Data normalisoitiin GAPDH.

hahmotta- sen taustalla metabolista mekanismi, olemme analysoineet avainentsyymien sfingolipidikeramidi aineenvaihduntaa reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR). Sekä SphK1 ja SphK2 mRNA merkittävästi kohonnut 24 tunnin kuluessa Spns2 transfektion, ja palasi normaalille tasolle 48 tuntia (kuviot. 3B ja 3C). Kasvua SphK2 ilmaisun varmistettiin western blot-analyysi, paitsi että sen proteiinin taso pysyi suhteellisen korkealla tasolla jopa 48 tunnin kuluttua Spns2 transfektion (Fig. S1D). Tämä on järkevää, koska proteiinit yleensä kestää kauemmin aikaa hajota kuin mRNA. S1 P fosfataasi 1 (SGPP1), entsyymiä, joka defosforyloi S1P, väheni dramaattisesti 8,5% valvonnan 24 tunnin kuluessa, ja pysyivät alhaisina kuin 48 tuntia transfektion jälkeen (kuviot. 3D ja S1E). SGPP2 ja S1 P lyase 1 (SGPL1) ei vaikuta merkittävästi Spns2 lauseke (kuviot. S1E-S1F). Nämä tiedot osoittavat, että solut muuttavat ekspressiotasot useiden keskeisten entsyymien kompensoimiseksi S1P vientiä välittävät Spns2 ilmentyminen, mukaan lukien lisäämällä sukupolven (lisäys SphKs) sekä pysäyttää muuntaminen (väheneminen SGPP1).

Spns2 ilmaisu johtaa vähentäminen S1P-reseptorien ja useita pro-eloonjäämisreittejä

Kuten aiemmin mainittiin, S1P on yleensä pro-eloonjäämistekijä. Ymmärtää, miksi apoptoosin aiheutettiin kun solunulkoinen S1P nostettiin jälkeen Spns2 transfektion, havaitsimme tasot S1P reseptoreihin ja totesi, että mRNA-tasot reseptorien S1P1, S1P2, ja S1P3 olivat kaikki merkitsevästi alassäädetty jälkeen Spns2 lauseke (Fig. 3E ).

edelleen vahvistaa tämän havainnon, päätimme solun signalointipolkujen alavirtaan näistä S1P reseptoreihin. Spns2 ilmaus johti vähentynyt jyrkästi fosfo-GSK-3β (pGSK-3β, seriini 9) sekä A549 ja H1299 soluja (kuviot. 4A ja 4B). Validoida Tämän havainnon, me analysoitiin GSK-3β alkupään aktivaattori Akt [35], [45]. Kuviot 4A ja 4B osoittavat, että Pakt tasot alenivat Spns2 ilmaisu, joka osoittaa, että Spns2 heikentää PI3K /Akt-reitin. Jak /Stat3 reitin, toinen signaalireitin alavirran S1P reseptoreihin, on ratkaiseva rooli solujen eloonjäämistä, muuttoliike, ja immuunivastetta [46], [47]. Me määrittää, onko Spns2 vaikuttaa tämän reitin mittaamalla Stat3 aktiivisuutta. Western blot-analyysit osoittivat, että fosfo-Stat3 (pStat3) tasot huomattavasti vähentää Spns2 ilmentyminen molemmissa solulinjoissa (kuviot. 4A ja 4B). Casp3 aktivoitiin Spns2 in H1299-soluissa, joka on yhdenmukainen saatuja tietoja A549-solut (Fig. 4B). Seuraavaksi immuno-leimattua Spns2-EGFP transfektoitujen solujen vasta-aineiden pGSK-3β ja pStat3 ja totesi, että niiden fluoresenssisignaalien vähensi merkittävästi kaikkien solujen samaan kulttuuriin, onko Spns2 positiivinen tai ei, verrattuna ohjaamaan GFP-transfektoiduissa soluissa ( Con) (kuviot. 4C ja 4D). Tämä johtuu todennäköisesti solunulkoista kertymistä sfingolipidit, kuten Sph. Enemmän kiinnostavaa, fluoresoiva signaali pGSK-3β pienennettiin edelleen vuonna Spns2-GFP-solujen kuin ei-transfektoiduissa soluissa (nuolet kuvassa. 4C). Nämä tiedot vahvistavat, että nämä pro-eloonjäämisreittejä olivat vaarassa, kun Spns2 oli ektooppisesti ilmaistiin.

(A), Western blot analyysejä A549 näytteistä. A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi ja lysaatit kerättiin 24 ja 48 tuntia myöhemmin ja niitä blotattiin vasta-aineiden kanssa osoitti. pGSK, fosfo-GSK-3β; tGSK yhteensä GSK-3β; Pakt, fosfo-Akt; pStat3, fosfo-Stat3; tStat3 yhteensä Stat3; Aktiini käytettiin latauskontrollina. (B), Western blot analyysejä H1299 solujen näytteistä. H1299-soluja transfektoitiin ohimenevästi, kuten aiemmin mainittiin. Solulysaatit kerättiin 48 tuntia myöhemmin ja niitä blotattiin vasta-aineiden kanssa osoitti. (C), konfokaali laser skannata kuvia solujen värjätty pGSK-3β. A549-soluja transfektoitiin Spns2-GFP: n ja peitinlasit kerättiin 48 tunnin kuluttua. (D), konfokaali laser skannaus kuvia A549-solut värjättiin pStat3. Solut valmistettiin kuten C.

Spns2 Knockdown lisääntyy solunsisäisen S1P tasolla

Edellä mainitut tulokset osoittavat, että Spns2 säätelee S1P aineenvaihduntaa ja sen kohdunulkoinen ilmaisun johtaa apoptoosin NSCLC soluissa. Edelleen leikellä Spns2 rooli LC, me pudotti Spns2 siRNA. Kuviot 5A ja 5B osoittavat, että siRNA Spns2i-A vähensi merkittävästi Spns2 mRNA-tasolla yli 80%. Niinpä käytimme Spns2i-A meidän lisätutkimuksia. Salatut RNA (SCR) ja Spns2i-C (jäljempänä SPC), joka ei tukahduttaa Spns2 ilmaisua, käytettiin negatiivisina kontrolleina.

(A), (B), karakterisointi Spns2 siRNA: iden. 20 nM Spns2 siRNA A, B, ja C transfektoitiin yksitellen A549-soluja. 48 tuntia myöhemmin kokonais-RNA kerättiin ja RT-PCR: llä (A) ja qRT-PCR: llä (B) suoritettiin mitata Spns2. Salattu RNA (Scr) käytettiin negatiivisena kontrollina. (C), Spns2 knockdown by Spns2i-A lisäsi merkittävästi solunsisäisiä S1P tasolla. A549-soluja transfektoitiin Spns2 siRNA kuin A, 24 tuntia transfektion jälkeen, soluviljelyalustassa muutettiin median lipidit on poistettu ja FBS: ää. Toinen 24 tuntia myöhemmin, solupelletit kerättiin ja S1 P analysoitiin lipidomics. N = 3. (D), Spns2 pudotus muuttaa tasoa SGPP1, SGPP2, ja SGPL1. A549-soluja käsiteltiin kuten A, paitsi qRT-PCR suoritettiin mittaamaan SGPP1, SGPP2, ja SGPL1. N = 4. qPCR data normalisoitiin GAPDH.

luonnehtivat vaikutuksen Spns2 Knockdown on sfingolipidikeramidi aineenvaihduntaan NSCLC soluissa, määritimme tasot sfingolipidikeramidi ja niille niihin liittyvien entsyymien. Lipidomics tiedot osoittavat, että Spns2 Knockdown by Spns2i-A lisäsi merkittävästi solunsisäistä S1P tasolla, kun taas alentunut Sph tasolla A549-solut verrattuna Scr ja spc (kuviot. 5C ja S2A). Eritasoiset seramidiksi lajia ei muuta Spns2 taintumisen (Fig. S2B). Tämä vastaa aiemman raportin, joka S1P puute hiirillä johtaa lisääntyneeseen tasolle S1P keuhkoissa [33]. Selvittääkseen mekanismi lisääntynyt solujen S1P, mittasimme tasot suurten entsyymien S1P aineenvaihduntaan. Kuvio 5D esittää, että tasot useiden entsyymien muutettiin jälkeen Spns2 Knockdown by Spns2i-A: SGPP1 kasvatti merkittävästi 8-kertaiseksi; SGPP2 vähennettiin -50%; ja SGPL1 väheni yli 80%. Lisäys SGPP1 kiihtyy S1P muuntaminen vähentää solujen S1P tasolla, mikä kumota väheneminen SGPP2 ja kasvuun SGPL1. Kuitenkin SGPL1 oli paljon runsaammin ilmaistuna kuin SGPP1 vuonna A549-soluja (22-kertainen) (Fig. 5D). Tämä selittää, miksi S1P nostettiin jälkeen Spns2 knockdown. Muita entsyymejä, kuten SphKs, ei vaikuttanut merkitsevästi Spns2 taintumisen (kuviot. S2C ja S2D).

Spns2 Knockdown parantaa NSCLC-solujen maahanmuutto

Toiminnallisesti ensin tutki Spns2 Knockdown rooli solun selviytymistä /leviämisen jälkeen kohdunulkoinen Spns2 ilme aiheuttamaa apoptoosia. Elävien solujen laskenta määrityksissä todettiin, että Spns2 Knockdown kanssa Spns2i-A ei johtanut merkittävään kasvuun määrän eläviä soluja joko A549 tai H1299 soluja (ei esitetty), mikä osoittaa, että Spns2 alassäätöä ei vaikuta solujen selviytymistä tai proliferaatiota NSCLC-solut.

tutki roolin Spns2 knockdown solun muuttoliikettä koska solunsisäinen S1P on välttämätön keuhkojen solujen vaeltamiseen ja liikkuvuus [48]. Haavojen paraneminen naarmu analyysit suoritettiin sekä A549-soluja ja H1299 soluja. Neljäsataa pm aukot syntyi konfluentteja viljelmiä ja micrographic otettuja kuvia 8 ja 24 tunnin kuluttua naarmuuntumista. Kuvio 6A esittää tyypillisiä kuvia määritys A549-soluja. Double sokaissut määrälliset analyysit osoittivat, että ohjaus A549-soluja (SCR) siirtyi nopeudella 8,0 ± 1,5 um /h ja 5,4 ± 0,8 um /h varten 8 ja 24 tunnin aikana, tässä järjestyksessä (SPC soluilla on samanlainen tulos) (Fig. 6B). Kuitenkin Spns2 knockdown solut vaelsivat nopeudella 14,9 ± 3,1 um /h ja 10,0 ± 0,3 um /h samassa ajassa, mikä tarkoittaa 1,86 ja 1,85-kertainen kasvu, vastaavasti (kuvio. 6B). Tämä havainto oli toistettavissa H1299 soluissa (Kuva. 6C).