Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on yleisin gynecologic maligniteetti. Tunnistaa mikro-ribonukleiinihapoista (miRNA) ilmentyminen profiili EOC kudoksissa, jotka voivat toimia uusien diagnostisten biomarkkeri EOC havaitsemiseen, ilmaus 1722 miRNA 15 normaalista munasarjan kudosnäytteitä ja 48 munasarjasyöpä Näytteiden profiloitu käyttämällä kvantitatiivista todellinen -aika polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) -määritys. Kymmenen microRNA allekirjoitus (HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-574-3p, HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-asennuspalveli- 15b-5p, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-141-5p, HSA-miR-130b-5p, ja HSA-miR-135b-3p) tunnistettiin pystyä erottamaan ihmisen munasarjasyöpä kudosten normaaleista kudosten kanssa 97% herkkyys ja 92% tarkkuus. Kaksi miRNA klustereita miR183-96-183 (miR-96-5p, ja miR-182, miR183) ja miR200 (miR-141-5p, miR200a, b, c ja miR429) ovat huomattavasti säädellään ylöspäin munasarjasyövän kudosnäytteistä verrattuna normaalin kudoksen näytteissä, mikä viittaa siihen, opinnäytteet miRNA voi olla osallisena munasarjasyövän kehittämiseen.

Citation: Wang L, Zhu MJ, Ren AM, Wu HF, Han WM, Tan RY, et ai. (2014) kymmenen MicroRNA Signature tunnistettiin genominlaajuisten MicroRNA Expression Profilointi Human epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (5): e96472. doi: 10,1371 /journal.pone.0096472

Editor: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, Kiina

vastaanotettu: 02 marraskuu 2013; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2014; Julkaistu: 09 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Miao-Jun Zhu, Hong-Fei Wu, Wu-Mei Han, ja Ruo-Ying Tan ovat tämänhetkisiä työntekijöitä Biovue. Mikään kirjoittajat mitään taloudellisia etuja. Kaikki tiedot ja materiaalit Tämän tutkimuksen ovat avoinna käyttää. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

munasarjasyöpä (OC), yksi kolmesta gynecologic pahanlaatuisia on seitsemäs yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti [1]. Periytyminen korkean penetraation syöpää alttiusgeenit kuten mutatoitunut BRCA1 tai BRCA2 ja /tai Lynch oireyhtymä liittyviä mutaatioita kasvanut riski sairastua OC [2]. Epiteelin munasarjasyöpä (EOC) osuus on noin 80-90% OC [3]. EOC on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti länsimaissa [4]. Yhdysvalloissa (USA), EOC aiheutti lähes 15500 kuolemantapausta vuonna 2012 [5]. On olemassa vain muutamia tehokkaita biomarkkereita ja hoitoja EOC [6] – [8], ja EOC: n varhainen havaitseminen on edelleen haaste onkologit. 5 vuoden pysyvyys on yli 70%: lla potilaista myöhäisvaiheen EOC on vain 35% [5]. Ei tehokas seulontamenetelmä havaitsemiseksi alkuvaiheen OC korkea spesifisyys ja herkkyys on tällä hetkellä saatavilla, ja syövän antigeeni-125 yhdessä transvaginal ultraäänitutkimus voi havaita vain 30-45% potilaista, joilla Taudin alkuvaiheessa [9]. Vaikkakin deoksiribonukleiinihappo (DNA) metylaatio biomarkkerit olla lupaava rooli havaitsemisessa EOC, on edelleen valtava tarve tunnistaa mahdolliset biomarkkerit korkea spesifisyys ja herkkyys. Analyyseissä on myös standardoida parantamiseksi havaitsemista, hoidon optimoimiseksi ja saavuttaa toivottava hoitotuloksia [10].

rooli mikro-ribonukleiinihapoista (miRNA) OC on saanut viime aikoina huomiota, koska ne tarjoavat uusia strategioita ennaltaehkäisyä, varhaista toteamista, diagnosointia ja hoitoa. Niillä on tärkeä tehtävä olennaisia ​​prosesseja, kuten solujen erilaistumista, kasvua ja apoptoosin [11], [12]. Poikkeava ilmaisu tai mutaatio miRNA syövät ilmaisseet mahdollisen toimia uutena luokan onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille perustuu niiden tavoitteita [13]. Koska miRNA voitaisiin eristää ja havaita kudosten ja verinäytteistä, perifeerisestä verestä johdettuja miRNA käytettiin uusina kiertävän biomarkkereita OC [14]. Useimmissa julkaistuissa tutkimuksissa, miRNA ilmentyminen profiloidaan miRNA microarray ja vahvistanut määrälliset polymeraasiketjureaktio (qPCR).

Tämä tutkimus toteutettiin genominlaajuisten kudos miRNA ilmentymisen profilointi kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-reaktion. Profiilia 10 kudoksen miRNA todettiin, jotka voivat toimia biomarkkerina EOC ja edistää paremmin ymmärtämään mekanismin munasarjakasvain synty ja kehitys.

Materiaalit ja menetelmät

kokoelma OC kudosnäytteet

Normal munasarjan epiteelin kudosnäytteistä (N näytettä) (n = 15) ja pahanlaatuinen epiteelin munasarjojen kudosnäytteistä (C näytettä) (n = 48) kerättiin Zhongshan sairaalan Fudanin yliopiston, Shanghai, Kiina. 48 pahanlaatuisia munasarjojen epiteelin kudosnäytteistä (C näytteet) sisältyy 41 munasarjan epiteelin karsinoomanäytteistä (CE näytettä) ja 7 epiteelin munasarjasyöpä rajatapaus kudosnäytteistä (CB näytettä). 48 pahanlaatuisia munasarjojen epiteelin kudosnäytteet erilaisia ​​solutyyppejä: 29 seroosinen, 6 sekoitettu epiteelin, 6 endomet-, 1 adenokarsinooma (ei ole mainittu muualla), 4 selkeä soluja, ja 2 mucinous karsinoomat. Kaikki kudosnäytteet jäädytettiin välittömästi nestetypessä sen jälkeen, kun on poistettu kehosta, ja säilytettiin -80 ° C: ssa pitkäaikaisessa varastoinnissa. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikissa aineissa, ja tutkimussuunnitelman hyväksyi eettisen komitean Zhongshan sairaala. Väestörakenne ja kliinisiä piirteitä potilaista ja normaalit kontrollit on lueteltu taulukossa 1.

miRNA eristäminen

Yhteensä-RNA eristettiin 50 mg jäädytetyn kudoksen miRNeasy Mini Kit (

Qiagen, USA

) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Laatu eristetyn RNA havaittiin agaroosigeelielektroforeesilla, ja määrä analysoitiin ultraviolettivalolla spektrofotometrisellä menetelmällä käyttäen Biomate3 (

Thermo Scientific, USA

). Yhteenlaskettu RNA: t, joissa on teräviä bändejä 18S rRNA ja 28S rRNA ei voida katsoa huonontuneen ja käytetään miRNA profilointiin.

lisäys Poly (A) hännät ja käänteistranskriptio

Puhdistettu kokonais-RNA ( mukaan lukien pienet RNA) laimennettiin 125 ng /ul, jossa 0,1 x RNA varastoinnin puskuriin (Ambion, USA), joka sisälsi 0,1% Tween-20 (

Sigma

). miRNA lisättiin poly (A) hännän ja reverse litteroitiin cDNA käyttäen Sharpvue miRNA First Strand Kit (

Biovue, Shanghai, Kiina

) ohjeiden mukaisesti sarjasta. Konsentraatio kokonais-RNA reaktiossa lisäksi poly (A) hännät ja käänteistranskriptio on 50 ng /ul.

Reaaliaikainen PCR

syntetisoitiin miRNA cDNA sekoitettiin Sharpvue 2x Universal qPCR Master Mix (

Biovue, Shanghai, Kiina

) ja nukleaasitonta vettä. Sharpvue Human miRNA Primer Array-A-E v1.0 384-hyvin (

Biovue, Shanghai, Kiina

) käytettiin, ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin kohti ohjeita Sharpvue miRNA qPCR Kit. Kukin näyte havaittiin 1757 miRNA alukkeilla lukien 35 ohjaa viiden 384-kuoppalevyille. Jokainen levy sisältää kolme endogeenisen ohjaimet (HSA-7SL-scRNA, HSA-RNU6B, ja HSA-RNU48) kahtena kappaleena ja yhdessä ilman mallia valvontaa. miRNA ilmaisu kvantitoitiin käyttäen ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System (

Applied Biosystems, USA

). Reaaliaikaisen PCR-reaktioseosta inkuboitiin 95 ° C: ssa 2 minuutin ajan, jota seurasi 3 kertaa 96 ° C: ssa 5 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti, 37 sykliä 96 ° C 5 sekuntia ja 60 ° C: ssa 30 sekuntia, ja käynnissä sulamiskäyräanalyysillä lopussa. EVA-Green väriaine ja Rox väriainetta käytettiin toimittaja ja viite vastaavasti. Tiedot miRNA havaitseminen on esitetty kuvassa S1 tiedostoon S1.

Tilastollinen

Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen R ja Bioconductor paketteja. Ja 1722 miRNA määrityksissä ja 2 endogeenisen vertailukokeineen (HSA-RNU6B, ja HSA-RNU48), 1696 miRNA oli Ct-arvo alle Ct = 32 (havaitsemiskynnys) joukosta vähintään 10%: n havaittu 63 näytettä. Loput 28 määritykset poistettiin lisäanalyysiä. Jotta voitaisiin poistaa erot näytteessä RNA panos, rikvantiilin-mediaani menetelmää käytettiin käsittelemään raaka Ct mittaukset [15]. Näytteet, jotka osoittivat merkittäviä eroja profiileja (keskiarvo absoluuttinen ero, Bioconductor paketti ”arrayQualityMetrics”) on pidetty harha ja poistettiin loppupään analyysi. Tämä menettely poistaa kolme OC kudoksissa (kaksi epiteelikarsinooma kudosnäytteistä ja yksi munasarjan epiteelin syövän raja kudosnäyte) ja yksi tavallinen munasarjan epiteelin kudosnäytteessä.

Differential ilmentymisen analyysi suoritettiin jäljellä 59 näytettä käyttäen t-testiä ( R paketti ”Limma”). miRNA tuottaa vääriä löytö määrä (FDR) -adjusted p-arvot alle 0,1 ja taita muutos yli 2 kutsuttiin ilmentyvät eri.

Jotta kehittää ennustusalgoritmi OC diagnoosin populaatiosta sisältävien näytteiden 39 munasarjan epiteelin kohdunkaulan kudosten yhdessä 6 epiteelin munasarjasyöpä rajatapaus kudosten ja 14 normaalin munasarjan epiteelin kudoksia, kolme luokittelun menetelmiä testattiin: tukivektorikone (SVM, Bioconductor paketti ”E1071”), K-lähimmän naapurin (Bioconductor paketti ”luokka”), ja diagonaalinen lineaarinen erotteluanalyysi (Bioconductor paketti ”sfsmisc”). Suorituskyky algoritmien alun perin arvioitiin käyttäen jätettävissä one-out cross validointimenettely eri määrä ennustajan markkereita. Kunkin sarjan opetusnäytteitä, miRNA rankattiin perustuu niiden t-testi, p-arvo syntyy verrattaessa syövän kudoksissa normaaleja kudoksia. Top n miRNA (jossa n sallitaan vaihdella välillä 2 ja 50) käytettiin rakentamaan ennustemallista tietojen perusteella koulutukseen näytteitä ja levitetään loput testinäytteen. Prediction luokan ja todennäköisyys rekisteröitiin jokaisesta näytteestä ja luokitus algoritmi. Vakaus miRNA ennustajan luettelot käyttää harjoitusnäytteille arvioitiin prosenttia päällekkäisyys alkuun n miRNA näiden luetteloiden. Koska rajallinen määrä näytteitä saatavilla tämän tutkimuksen yhteinen miRNA näiden luetteloiden valittiin lopullisen luettelon ennustavia (valittuna markkereita). Merkittäviä eroja määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä ja pidetään merkittävinä, jos P-arvo 0,05. Analyysissä, herkkyys määritellään prosenttiosuutena syövän kudoksia, jotka on tunnistettu oikein olevan tässä tilassa, kun spesifisyys määritellään prosenttiosuutena normaaleissa kudoksissa, jotka on tunnistettu oikein normaalisti.

Tulokset

kliiniset ja patologiset löydökset

kliiniset piirteet 45 potilaalla on OC ja 14 normaalia valvontaa käytetään tutkimuksessamme on koottu taulukkoon 1. iät potilaalla on OC vaihteli 20-81 vuotta (mediaani, 57 vuotta), kun taas terveillä vaihteli 21 ja 75 vuotta (mediaani, 56). Kaikki nämä näytteet diagnosoitu sairaus ja oli makroskooppinen kuvaus. Per 2012 Soft Tissue OC suuntaviivat National Kattava Cancer Network, eri kasvain eriyttäminen laadut potilaita tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: 8 tapausta arvosanalla I (16,7%), 11 tapausta arvosanalla II (23%), 18 tapauksissa asteen III (37,5%), ja 11 tapausta, joissa määrittelemätön (23%); ja kasvaimen vaiheet olivat 14 tapauksessa, jossa vaihe I (29,2%), 5 tapauksessa vaiheen II (10,4%), 27 tapauksissa vaiheen III (56,3%), ja 2 tapauksissa, joissa vaihe IV (4,2%) syöpiä.

miRNA ilmaisun vertailun

jotta voitaisiin poistaa erot RNA tuloa käytetään profiloida 63 munasarjojen kudosnäytteet tässä tutkimuksessa rikvantiilin-mediaani menetelmä [16] käytettiin käsittelemään raaka Ct mittauksia. Kaiken kaikkiaan tiedot 59 munasarjakudoksen analysoitiin Mirna ilmaisua.

tutkimiseksi kyky tunnistaa miRNA ilmaus allekirjoitus OC kudosnäytteistä, miRNA ilmentyminen profiilit 59 munasarjakudoksen RNA-näytteet kerättiin 39 epiteelin syöpä kudosnäytteet, 6 munasarjan epiteelin syövän rajatapaus kudosnäytteitä, ja 14 normaalin munasarjan epiteelin kudosta analysoitiin käyttäen 1696 miRNA määrityksissä havaitaan (Ct 32) on vähintään 10% näytteistä tässä tutkimuksessa. 45 OC kudokset verrattiin 14 normaalin munasarjan kudoksissa käyttäen t-testiä. 305 miRNA todettiin FDR-oikaistu p-arvo on alle 0,1 ja taita muutos edellä 2. Yhteenveto näistä tulokset esitetään kuviossa 1. Differentially-ilmaisi miRNA kesti laaja valikoima Ct-arvojen ja kertamuutoksia.

) juoni miRNA määrityksiä käytetään profiloida verrattuna näytteet: kertainen muutos (y-akseli) vastaan ​​normalisoitua Ct mittauksia. B) Volcano käyrä tuloksena p-arvot t-testiä (y-akseli) välinen C ja N ryhmään. 305 miRNA näyttää FDR-oikaistu p-arvot alle 0,1 ja taita muutos yli 2 (näkyy punaisena). C) Hierarkkinen klusterointi (R paketti pvclust) 45 munasarjasyöpä kudosten ja 14 munasarjojen normaaleissa kudoksissa perustuvat top 50 eniten muuttuva miRNA määrityksissä. Kunkin klusterin hierarkkisessa klusterointi, määrät nimeltään

p

-arvot (noin puolueeton

p

-arvo (punainen) ja Bootstrap Todennäköisyys p-arvo (vihreä)) lasketaan kautta multi-asteikko bootstrap rs.

P

-arvo klusterin on arvo välillä 0 ja 1, joka osoittaa kuinka vahva klusterin tukevat tiedot. D) 17%: n varianssi havaittu Ct mittauksissa top 50 eniten muuttuva miRNA määritykset kaikissa näytteissä selittyvät näytteen patologian tila (C tai N). Loput covariates katsoi here (lähde = sairaala lähde, selviytyminen, kasvainhistologiaa, FIGO vaiheessa kasvaimen, uusiutuminen, ja vaihe) selittävät 24% varianssista.

Vertailu miRNA ilmaisun erityyppisten of EOC kudosnäytteiden

miRNA ilmentymistä 59 kudosnäytteiden että verrattiin mukana 45 näytettä, joka sisältää C-ryhmän [lukien 39 epiteelin munasarjasyöpä kudosnäytteistä (CE ryhmä) ja 6 epiteelin munasarjasyöpä rajatapaus kudosnäytteistä (CB ryhmä)] ja 14 normaalin munasarjan epiteelin kudosnäytteistä (N-ryhmä).

hierarkkinen klusterointi miRNA osoitettiin FDR-oikaistu p-arvot alle 0,1 ja taita-muutos yli 2 (punainen piste). Vertailujen 335 differentiaalisesti ilmaisi miRNA CE ja N ryhmään näkyvät kuvassa S2 tiedostoon S1. Sen sijaan yksikään ehdokas miRNA havaittiin, kun CB ryhmä verrattiin N-ryhmän (kuva S3 tiedosto S1) ja kun CE ryhmää verrattiin CB ryhmä (kuva S4 tiedosto S1). Pienentynyt määrä syövän rajatapaus kudosten saatavilla tämän tutkimuksen voisi rajoittaa tehoa havaita merkittäviä muutoksia ja selittää puute havaittujen muutosten näissä vertailuissa.

biomarkkereiden valinta

tarkkuus kolmen hyviksi eri määrä ennustaja markkereita väliltä 2 50 on esitetty kuviossa 2. Prediction tarkkuus oli melko samankaltainen käytetyt menetelmät, ja paremman suorituskyvyn luokittelun malleissa perustui pienempään määrään miRNA markkereita (kuvio 2A). Vakaus (y-akseli) mitattuna prosenttia päällekkäisyyttä luettelot miRNA markkereita käytetään luokituksen (59 Tässä analyysissä, yksi kutakin käytetyn näytteen testaus) on esitetty kuvassa 2B funktiona useita markkereita käytetään (x-akseli ). Kuten odotettua, päällekkäisyys valitun luettelot miRNA ennustavat nousi noin 90% kun ennuste perustui 11 tai enemmän markkereita, mikä viittaa pienempi vaikutus merkki valinnassa vaiheessa yksittäisistä näytteistä.

A) Virheiden määrä tuotettua eri luokittelu algoritmeja funktiona lukumäärän ennustuksen merkeillä. Jätä-one-out ristivalidointi menetelmää käytettiin arvioimaan tuloksena virhemääriä. B) Prosenttia päällekkäisyys ennustajan miRNA valitaan eri koulutus näytesarjaa käytetty. C) Jätä-one-out cross vahvistustulokset: kukin näyte luokan todennäköisyys (y-akseli) on arvioitu perustuu SVM malli oppinut kaikista muista näytteistä. Kudokset (syöpä musta, normaali punainen) edustaa luokittelu todennäköisyys olla syöpä. D) ROC-käyrän perustuu loman-one-out cross vahvistustulokset avulla SVM menetelmää.

miRNA seulonta ja testaus välillä munasarjasyöpä ja normaaliryhmää

10 yhteinen miRNA poikki luettelot käytettyjen merkkiaineita perustuvia ennusteita 11 miRNA valittiin lopullinen luettelo biomarkkereita OC diagnoosia. Joitakin ominaisuuksia näistä miRNA, mukaan lukien kertainen muutos syövän ja normaaleissa kudoksissa yhdessä t-testi, p-arvoja ja FDR-säädettiin p-arvot, esitetään taulukossa 2. 10 miRNA sisältyvät miR-1271-5p ja miR-574 -3p, joka oli huomattavasti pienempi ilmentyminen (P-arvot on esitetty taulukossa 2) tasoilla munasarjasyöpä ryhmä (C-ryhmä) kuin normaalissa ryhmässä. Sen sijaan muissa miRNA kuten miR-182-5p, miR-183-5p, miR-96-5p, miR-15b-5p, miR-182-3p, miR-141-5p, miR-130b-5p, ja miR-135b-3p oli huomattavasti korkeampi ekspressiotaso munasarjasyövän kudosnäytteestä ryhmä (C ryhmä) kuin normaalissa ryhmässä (P-arvot on esitetty taulukossa 2).

luokittelu suorituskykyä valittu 10 miRNA varten SVM algoritmin käytön jälkeen loman-one-out ristivalidointi menettely on esitetty kuvassa 3. Koska luettelon valituista miRNA käyttää kaikki näytteet, suorituskyky esitetään tässä saattaa olla liian suureksi todellisen yhden. Tämä näkyi parantuneen tarkkuuden ennustuksen suorituskyky kun merkki valinta askel oli riippumaton testauksesta näytesarja (kuva 3). Havaittu tarkkuus oli 86%, kun taas havaittu tarkkuus valituille markkereita oli 96%. Herkkyys havaita OC perustuu valittuun markkereita oli 97%, kun taas spesifisyys oli 92%, jossa ala käyrän alla (AUC) saatua vastaanotin toimii (ROC) käyrä 0,978. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu eri puolilla tärkeimmistä kliiniset tekijät kerätään näytteet testattiin tässä tutkimuksessa (kuvio 3D).

A) Prediction todennäköisyydet (munasarjasyöpä) jokaisesta näytteestä käytettiin tässä tutkimuksessa (C = Cancer; N = Normal). B) ROC-käyrän. C) Prediction virheen eri kudosten ryhmiin: normaali kudos (N), epiteelin karsinoomien kudoksissa (CE) ja rajatapaus kudoksissa (CB). D) Prediction virheiden kasvaimen ryhmissä [Lisääntynyt virhe alempiin asteen näytteitä (mutta ei merkitsevä)].

Keskustelu

Jotta löytää tiettyjä profiileja kudosta johdettu miRNA of EOC, vertaileva tutkimus suoritettiin käyttäen qRT-PCR array alustan välillä 45 epiteelisolujen kudosnäytteitä potilaalla on EOC ja 14 epiteelisolujen normaalin kudosnäytteitä terveiden verrokkien. Tutkimus osoitti, että 10 säädeltyyn miRNA allekirjoitus joista HSA-miR-1271-5p ja HSA-miR-574-3p olivat alassäädetty; ja HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-141-5p, HSA-miR-15b-5p, HSA -miR-130b-5p, ja HSA-miR-135b-3p oli yliekspressoitiin munasarjasyövän kudoksissa. Nämä havainnot voivat tehokkaasti erottaa OC kudoksia munasarjojen normaaleista kudoksista, mikä läsnäolo erityisiä miRNA in EOC. 10-miRNA allekirjoitus tunnistettu tutkimuksessa voi edistää paremmin ymmärtämään mekanismi EOC kasvaimen kehittymisen ja kehittämisen sekä myös auttaa diagnostiikassa EOC.

miRNA ilmaisua järjestelmää käytetään tutkimuksessa oli seuraavat merkittävät edut: (1) suurin kokoelma validoituja määrityksiä (1722 ihmisen miRNA in miRBase v 20,0), (2) yksi suurimmista Herkkyysalue (enintään 6 kertaluokkaa), (3) herkin tunnistus (alas yksi kopio numero), (4) korkein spesifisyys ( 3% ristireaktiivisuutta keskuudessa 8 jäsentä anna-7 perhe). Kolme erilaista luokitusta menetelmiä käytetään jätettävää one-out cross validointimenettely virheiden minimoimiseksi. Parhaan tietomme mukaan tämä on suurin laajuus miRNA (1722) lauseke profilointi tutkimus käyttäen qRT-PCR toistaiseksi.

Olimme analysoineet varianssi hajoaminen syövän ja normaalin kudosnäytteitä ja osoitti tuloksen kuvassa 1D. Huomasimme, että ei ole korrelaatiota sairaalan lähde, säilyminen, kasvainhistologiaa, taudin vaiheessa kasvaimen ja jopa uusiutuminen, paitsi näytteet (normaali kudosnäytteitä vs. pahanlaatuinen kudosnäytteitä). Vielä tärkeämpää on, 10 miRNA syrjittyjen EOC ryhmä normaalista ryhmästä korkea herkkyys ja spesifisyys, mikä viittaa niiden mahdollinen arvo varhaiseen havaitsemiseen OC. He osoittivat, että luokittelu C ryhmä N-ryhmän voidaan olettaa olevan 97% herkkyys ja 92% tarkkuus.

10-miRNA allekirjoitus tunnistettu tutkimus osoitti näkyvästi erottelu EOC normaalista valvontaa. Näistä miRNA, miR-96, miR-182 ja miR-183 ovat ryhmittyneet yhteen lokukseen kromosomissa 7 [17] ja miR-141-5p kuuluu miR-200 perhe, joka on ryhmitelty kromosomeissa 12. Ei vain miR-141, olemme edelleen havainneet, että muut jäsenet (200a /b /c) ja miR200 perheen yli-ilmentyy myös EOC verrattaessa normaaliin (taulukko 3). Molemmat kaksi miRNA klusterit ovat tunnettuja onkogeenisiä miRNA klustereita, jotka on laajasti raportoitu ottamaan kasvaimen synnyssä monenlaisissa kasvaimissa [18] – [20]. MIR-200 perheenjäsenet raportoitu kohdistaa ZEB1 ja ZEB2, ZEB transkriptiotekijät ovat ratkaisevia repressors BMP signalointi, ja Peart ym raportoitu, että BMP signalointi säätelee pahanlaatuistumisriskin askiteksen johdetun ihmisen epiteelin munasarjasyöpä pallosia kautta AKT kinaasiaktivaatiota [ ,,,0],21]. Jäsenet (miR200b ja miR429) sekä miR200 perheen raportoitiin olevan merkitsevästi yhteydessä munasarjasyöpään uusiutuminen ja eloonjäämiseen [18]. Sillä miR183-96-182 klusteri, Xu kertoi, että yli-ilmentynyt miR-182 ja miR-96 kohdistaminen haarukka perälaatikon O3 on merkittävä rooli pro-leviämisen vaikutusta leptiinin on munasarjasyöpäsoluja [22]. miR-182 ilmoitettiin suoraan ja säätelee negatiivisesti tärkeä tuumorisuppressoriproteiinia, ohjelmoitua solukuolemaa 4 (PDCD4) OC [23]. miR-183 on vahvistettu olevan kielteisiä sääntelyn vaikutuksia Tiam1 ilmaisun, joka myötävaikuttaa invasiivisia, muuttavien ja elinkelpoisuus ominaisuudet OC solujen [24]. Tuore tutkimus sekvensoimalla pieniä RNA: iden isogeenisiin p21 + /+ ja p21 – /- solut osoittivat, että useat miRNA klustereita, miR-200b-200a-429, miR-200c-141 ja miR-183-96-182 oli alassäädetty in p21-vajaiden solujen, jos lisäämällä antagonisoivaa miR-200 ja miR-183-96-182 klusteri miRNA in p21 + /+ soluja, se lisäsi invaasion ja kohonneita tasoja

VIM

,

ZEB1

ja

SLUG

mRNA: ita, jotka ovat yhteisiä tavoitteita miR-183 ja miR-96. Tutkimuksessa lisäksi havaittu, että p21 muodostaa kompleksin ZEB1 klo miR-183-96-182 klusterin promoottori estävän transkription tukahduttaminen tämän klusterin ZEB1 ehdottamalla vastavuoroinen silmukka [25]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-200 perheenjäsenet säädellään ylöspäin serous epiteelin munasarjasyövän solulinja sekä seerumin sairastavien potilaiden vakavien epiteelin munasarjasyöpä [26], [27].

Nämä tulokset viittaavat siihen, että klustereiden miR-183-96-182 ja miR200 on erittäin tärkeä rooli EOC ja niitä voidaan käyttää potentiaalisina diagnostisia biomarkkereita EOC havaitsemiseksi sekä terapeuttista potentiaalia tukahduttaminen munasarjasyöpä leviämisen ja invaasion .

SVM käytettiin lisäksi kanssa profilointitiedot tuotetaan epiteelisolujen näytteitä harjoitustiedot testata epiteelin munasarjasyöpä rajatapaus kudosnäytteitä. Kuusi ulos 7 OC näytteet ennustettu OC, joka osoitti, että tunnistetut allekirjoitus voisi myös olla hyödyllistä havaita OC rajatapauksista kudosnäytteistä (tuloksia ei ole esitetty). Tämä saattaa kuitenkin tarvita suuremman otoskoko vahvistusta. Ei kuitenkaan ole merkittäviä miRNA voinut erottaa CB N ryhmään, tai CB päässä CE ryhmästä. Tämä voi johtua alennetulla teholla havaitsemaan eroja 39 epiteelin munasarjasyöpä näytettä (CE) ja 6 epiteelin munasarjasyöpä rajatapaus kudosnäytteistä (CB). Lisätutkimukset suurempien otoskoko tarvitaan vahvistamaan tämän selityksen.

Joitakin tärkeitä eroja miRNA havaittiin myös erottaminen epiteelin munasarjasyöpä näytettä (ilman epiteelin munasarjasyöpä raja kudosnäytteitä) normaalista näytteistä. Seitsemän säädeltyyn miRNA mukaan lukien HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-182-3p, HSA-miR-1468 -5p, ja HSA-miR-135b-3p (taulukko S1 tiedosto S1) vahvistettiin AUC ROC-käyrän (AUC = 0,965), jossa 97% herkkyys ja 85% tarkkuus (kuva S5 tiedostossa S1). 6 Näistä 7 miRNA (HSA-miR-182-5p, HSA-miR-183-5p, HSA-miR-96-5p, HSA-miR-1271-5p, HSA-miR-182-3p, ja hsa- miR-135b-3p) ovat 10-miRNA allekirjoitus. 10 Ainutlaatuinen miRNA profiileja erottaa epiteelin munasarjojen kasvain kudosnäytteitä myös epiteelin munasarjasyöpä kudosnäytteitä ja epiteelin munasarjasyöpä sidottu linja kudosnäytteitä normaalista munasarjan epiteelin kudosnäytteiden kanssa 97% herkkyys ja 92% tarkkuus. Ilmaisu profiilia 7 miRNA allekirjoitus oli myös osaa luokitella epiteelin munasarjasyöpä kudosnäytteitä ja normaalin munasarjan epiteelin kudoksia. Nämä havainnot voivat tarjota perustan tuleville tutkimuksia kliinistä arvoa kasvaimen miRNA ennustaa terapeuttista tehoa, säilyttäen valvonta ja ennustaminen ennustetta ja auttaa ymmärtämään paremmin mekanismi epiteelin munasarjakasvain synty ja kehitys.

tukeminen tiedot

Tiedosto S1.

Tukevaa tietoa lukuja. Kuva S1, Katsaus koesuunnitelmasta. Kuva S2, vertailu munasarjojen epiteelin karsinoomien kudoksen (CE ryhmä) ja normaalin kudoksen (N-ryhmä). A) MA käyrä määrityksiä käytetään profiili verrattuna näytteitä. B) Volcano käyrä tuloksena p-arvot t-testin välillä CE ja N ryhmään. 335 miRNA osoittaa säädetty p-arvot (FDR) alle 0,1 ja taita-muutokset yli 2 (näkyy punaisena). C) Hierarkkinen klusterointi CE ja N ryhmään perustuvat top 50 eniten muuttuva miRNA määrityksissä. Kuva S3, vertailu munasarjojen rajatapaus kudoksen (CB ryhmä) ja normaalin kudoksen (N-ryhmä). A) MA käyrä määrityksiä käytetään profiili verrattuna näytteitä. B) Volcano käyrä tuloksena p-arvot t-testin välillä CB ja N ryhmään. Ei miRNA esittää oikaistu p-arvot (FDR) alle 0,1 ja taita-muutokset yli 2 (näkyy punaisena). C) Hierarkkinen klusterointi CB ja N-ryhmän perustuvat top 50 eniten muuttuva miRNA määrityksissä. Kuva S4, vertailu munasarjojen epiteelin karsinoomien kudoksen (CE ryhmä) ja munasarjojen rajatapaus kudoksen (CB ryhmä). A) MA käyrä määrityksiä käytetään profiili verrattuna näytteitä. B) Volcano juoni tuloksena p-arvot t-testin välillä CE ja CB ryhmiä. Ei miRNA osoittaa säädetty p-arvot (FDR) alle 0,1 ja taita-muutokset yli 2 (näkyy punaisena). C) Hierarkkinen klusterointi CE ja CB ryhmät perustuvat top 50 eniten muuttuva miRNA määrityksissä. Kuva S5, Seven valittu miRNA vertaamalla CE ryhmän normaali ryhmä. A) Prediction todennäköisyys SVM, 53 näytettä, joiden virheitä = 3 (0,06 0,05). B) AUC-arvo (AUC = 0,965) osalta arviointiin microRNA paneelin CE ryhmässä normaalista ryhmästä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0096472.s001

(DOC) B