Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tehostettu lysosomaalisen ihmiskauppa liittyy metastasoituneen syövän. Yrittäessään löytää syövän asiaan lysosomaaliset moottori proteiineja, vertasimme lysosomaalisen proteomeja vanhempien MCF-7 rintasyöpäsolujen tarkoin erittäin invasiivisia MCF-7-solut, jotka ilmentävät aktiivista muotoa ErbB2 (Dn-ErbB2).

Menetelmät /Principal havainnot

Massaspektrometria-analyysi tunnistaa kinesiiniin raskaan ketjun proteiinia KIF5B ainoana mikrotubuluksiin moottori liittyy lysosomeista MCF-7-solut, ja kohdunulkoinen Dn-ErbB2 parantanut lysosomaalisen -alueella. KIF5B liittyy lysosomeihin myös HeLa kohdunkaula karsinooman solut analysoituna subsellulaarifraktiointikokeet. Ehtyminen KIF5B laukaisi reuna-yhdistelmille lysosomeihin seuraa lysosomaalisen epävakautta, ja solukuolemaa HeLa-soluissa. Lysosomaalinen eksosytoosilla vastauksena solukalvon vahinkoja sekä nestefaasin endosytoosin toimivat kuitenkin normaalisti näissä soluissa. Sekä HeLa ja MCF-7-solut näyttivät ilmaisemaan saman määrän KIF5B isoformin mutta kuolema fenotyyppi oli heikompi KIF5B-köyhdytettyä MCF-7-soluissa. Yllättäen KIF5B ehtyminen esti rapamysiini-indusoidun kerääntymisen autophagosomes MCF-7-soluissa. In KIF5B vaje solujen autophagosomes muodostunut ja kerääntynyt lähelle Golgin laitteeseen, kun taas kontrolli-soluissa ne ilmestyi tasaisesti jakautuneena solulimassa.

Johtopäätökset /merkitys

data tunnistaa KIF5B syövän asiaan lysosomaalisen moottorin proteiinin ylimääräisiä toimintoja autophagosome muodostumiseen.

Citation: Cardoso CMP, Groth-Pedersen L, Høyer-Hansen M, Kirkegaard T, CORCELLE E, Andersen JS, et ai. (2009) ehtyminen kinesiinin 5B Vaikuttaa Lysosomaalinen Jakelu ja vakaus- ja indusoi Peri-Nuclear kasaantuminen Autophagosomes syöpäsoluissa. PLoS ONE 4 (2): e4424. doi: 10,1371 /journal.pone.0004424

Editor: Andreas Bergmann, UT MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 marraskuu 2008; Hyväksytty: 18 joulukuu 2008; Julkaistu: 10 helmikuu 2009

Copyright: © 2009 Cardoso et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: CMP Cardoso oli vastaanottaja avustusta Portugalin Foundation for Science and Technology (SFRH /BPD /14448/2003). Tätä työtä tukivat avustuksia Tanskan Cancer Society (MJ), Tanskan National Research Foundation (MJ), Tanskan Medical Research Council (JN ja MJ), Meyer Foundation (MJ), The M.L. JÃ? ¸rgensen ja Gunnar Hansenin Foundation (MJ), Novo Foundation (MJ ja MHH), The Vilhelm Pedersen Foundation (JN ja MJ), Tanskan Cancer Research Foundation (MJ) ja Euroopan komission FP7 APO-SYS konsortio (MJ ja JSA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lysosomeihin ovat kalvoon sitoutuneita dynaaminen soluelimiin jotka edustavat lopullinen määränpää endosyyttisiin, eritys- ja autophagic reitit [1]. Fysiologinen merkitys lysosomeihin on korostettu useita sairauksia, jotka johtuvat puutteista lysosomaalisen biogeneesissä ja toiminta [2]. Päinvastoin, parannettu synteesi, kaupan ja solun vapauttamaan lysosomaalisen proteaasien (katepsiinit), ovat tärkeitä tunnusmerkkejä maligniteetin ja yhdistää invasiivisen ja metastaattisen kapasiteetti syöpäsolujen [3], [4]. Mielenkiintoista, lysosomaalisen muutokset liittyvät kuolemattomaksi ja transformaatio syöpäsolujen myös herkistää syöpäsolut ohjelmoidun solukuoleman polkuja liittyy lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi [5], [6]. Kun laukeaa, lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi tulokset vapautumiseen katepsiinit ja muiden lysosomien hydrolaasien sytosoliin, missä ne voivat laukaista mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi, jota seuraa kaspaasi-välitteistä apoptoosia [7], [8], tai välittävät kaspaasi-riippumaton ohjelmoitu solukuolema [9]. Siten inhibitio lysosomaalisen kaupan /eksosytoosia näyttää lupaavalta kohteena syövän hoidossa. Se ei ainoastaan ​​inhiboi katepsiini välittämää invaasio, mutta myös estää yleisen kaupan ja mahdollisesti aiheuttaa kertyminen lysosomeihin tarkoitettu eritystä ja näin ollen edelleen herkistää syöpäsolut lysosomaalisiin solukuoleman polkuja. Tätä hypoteesia tukee tietoja, jotka osoittavat, että vinkristiini, joka on mikrotubulia horjuttaa syöpälääkettä, paitsi estää lysosomifuusio kaupan lisäksi myös indusoi nopeaa kasvua volyymin lysosomaalisen osaston seurasi lysosomaalisen vuoto ja katepsiini-riippuvaista solukuolemaa [10] .

Koska lääkkeitä, jotka häiritsevät mikrotubulusverkoston osoittavat yleisesti korkea myrkyllisyys, me arveltu, että tarkempi puuttumista lysosomifuusio kaupan saattaa aiheuttaa syöpälääkkeen strategioita, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia. Niinpä halusimme tunnistaa ja kuvata moottori proteiineja tärkeä lysosomifuusio liikenteen syöpäsoluissa. Moottori proteiinit hyödyntämällä solun tukirangan alustana liikkeen jaetaan myosiinin moottoreita, jotka liikkuvat pitkin aktiini microfilaments ja kinesiiniin /dynein moottorit, jotka käyttävät mikrotubuluskimppujen kautta vuorovaikutuksessa tubuliinin niiden liikkumista [11]. Motor proteiinit virtansa hydrolyysin ATP ja muuntaa kemiallista energiaa mekaaniseksi työksi, jotta ne voivat liikkua lasti (rakkulat, proteiinit ja lipidit) pitkiä matkoja. Mikrotubulusproteiinit erityinen moottorit koostuvat kahdesta perustyyppiä mikrotubulusten moottorit: plus-end moottorit ja miinus-end moottorit, riippuen suunnasta, johon ne liikkuvat pitkin filamentit solussa [12].

typistetty muoto ErbB2-reseptoria tavataan usein yli-ilmentynyt rintasyöpä ja sen ilmaisun ja aktiivisuus korreloi lisääntynyt invasiivisuus, liikkuvuuteen ja huono ennuste [13]. Niinpä kohdunulkoinen ilmaus Dn-ErbB2 MCF-7 rintasyöpäsolujen tekee niistä erittäin liikkuvaa ja invasiivisia [14] (Our julkaisematon havainto). Syynä ilmoitetaan havainto, että Dn-ErbB2 aiheuttama invasiivisen fenotyypin liittyi muuttuneeseen lysosomaalisen kaupan ja moninkertaisesti ekspression lisääntymisen ja toiminnan lysosomaalisen proteaasien, päätimme tämä mallijärjestelmä etsiä syövän asiaan lysosomaalisen moottori proteiineja. Käytimme kvantitatiivisen proteomiikka-analyysi puhdistettu lysosomeihin peräisin Dn-ErbB2 MCF-7 ja ohjaus solujen osoittaa, että jotkut moottori proteiini-tasot olivat merkitsevästi sääteli seuraavat Dn-ErbB2 induktio. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että Dn-ErbB2 lisääntynyt ilmentyminen kinesiinin 5B (KIF5B), moottorin proteiini liitetty lysosomaalisen ja mitokondrioiden liikenteen [15], [16]. Tämän mukaisesti, KIF5B mRNA on raportoitu olevan säädellään ylöspäin useiden syöpätyyppien kudoksissa, kuten virtsarakon syöpä (GDS1479 record), kehittynyt mahasyöpä (GDS1210 record), okasolusyöpä (GDS2200 record), satunnaiset pohjapinta-kuin rintojen syöpä ja BRCA1 liittyvät rintasyöpään (GDS2250 record) (saadut tiedot NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez; Gene Expression Omnibus). KIF5B on N-kinesiinin (Plus-end moottori) kuuluva Super perheen kinesiinin-1 molekyyli moottori proteiineja, jotka yhdessä soluliman dynein vastaa mikrotubulia riippuvainen rahtikuljetukset eukaryoottisoluissa [17]. Valaistaan ​​roolin KIF5B syöpäsoluissa tarkastelimme sen toiminta eri lysosomaalisen väyliä myös lysosomaalisen solukuolemareittiin, uudelleensuljettava vaste solukalvon vaurioita (eksosytoosilla) ja macroautophagy.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja hoitoja

MCF-7, HeLa ja U2OS solut ovat peräisin ihmisen rintasyöpä, kohdunkaulan syöpä ja osteosarkooma, respectivly. MCF-7-eGFP-LC3 solulinja on yhden solun klooni MCF-7-soluja, jotka ilmentävät fuusioproteiinia, joka sisältää tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (eGFP) ja rotan LC3 [18]. MCF-7-ΔNErbB2 ja MCF-7-pTRE solulinjoja ovat yhden solun klooneja MCF-7, jotka ilmentävät tetrasykliini transaktivaattoria transfektoitu pTRE-ΔNErbB2 ja pTRE, vastaavasti [14]. HeLa-LIMP1-eGFP solut ovat ilmentävien HeLa-solujen eGFP-merkinnällä lysosomifuusio kiinteä kalvo proteiini-1 (LIMP-1) [19] (ystävällisesti toimitti Dr. J. P. Luzio, University of Cambridge). Syöpäsoluja ja niiden transfektoidut muunnelmat kasvatettiin RPMI 1640 (Invitrogen), jota oli täydennetty 6% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS; Biological Industries) ja penisilliini-streptomysiiniä. Keskipitkän MCF-7-ΔNErbB2 ja MCF-7-pTRE edelleen täydennetty 5 ug /ml tetrasykliiniä. Indusoimiseksi Dn-ErbB2-ilmentyminen, tetrasykliini (5 ug /ml), poistettiin ja solut pestiin 5 kertaa PBS: ssä ennen pinnoituksen. Kaikki soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2.

Analyysi lysosomifuusio liittyvien proteiinien massaspektrometriä vakaa isotooppi leimaamisen aminohappojen soluviljelmissä (SILAC)

MCF-7-ΔNErbB2 ja MCF-7-pTRE kasvatettiin tilaustyönä syntetisoitujen RPMI 1640-alustassa joko normaali lysiiniä 12C614N2 (Lys0) tai isotooppileimattu L-lysiiniä 13C615N2 (Lys8) (Sigma-Isotec, St . Louis, MO) täydennettynä 10%: lla dialysoitua naudan sikiön seerumia (Invitrogen) vähintään 5 solunjakautumisten täysin sisällyttää leimattua aminohappoa. Lysosomeihin puhdistettiin Iron-dekstraani (FedEx) fraktiointi protokollan mukaisesti julkaistu aiemmin [20]. Lyhyesti, solut (80-90 x 10

6 yhteensä) oli esi-inkuboitu FedEx (8 h) hajotettiin mekaanisesti dounce homogenisaattorissa ja valo membraanifraktio ladattiin MiniMachs sarakkeen kiinnitetty magneetti (MACS Separator järjestelmä, Miltenyi Biotec). Lysosomeihin loukkuun pylvääseen eluoitiin sakkaroosia uuttopuskuria (250 mM sakkaroosi, 20 mM Hepes, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta ja 1 mM Pefabloc, pH 7,5) poistamalla sarakkeen magneetista ja huuhtele pois lysosomeihin jonka mäntä. Lysosomeihin liuotettiin ja proteiinit erotettiin elektroforeesilla NuPAGE-Bis-Tris 4-12% gradienttigeeleillä (Invitrogen) ja värjättiin Coomassie Blue. Geelipalat leikattiin pieniksi paloiksi ja inkuboitiin 12,5 ng /ul trypsiinillä 37 ° C: ssa yön yli. Tuloksena peptidit analysoitiin nestekromatografialla (Agilent HP1100) yhdistettynä tandemmassaspektrometrian (LC MS /MS) käyttäen lineaarista ioni-trap Fourier-muunnos ioni-syklotroni resonanssi massaspektrometriä (LTQ-FT-ICR, Thermo-Finnigan). Peak lista uutettiin käyttämällä itse kehitettyä skriptejä (DTA-ahtaa) yhdistettynä kunkin geelin dioja, ja käytetty proteiinien tietokantaan hakuja. Tiukat kriteerit tarvittiin proteiinin tunnistamiseen kansainvälisessä Protein indeksi tietokantaan käyttäen Mascot ohjelmaa (Matrix Science): ainakin kahta samanlaista peptidejä proteiinia kohti, massa tarkkuus 3 miljoonasosaa, Mascot pisteet yksittäisten peptidien parempi kuin 20, ja delta pisteet paremmin kuin 5. MS-Quant (https://msquant.sourceforge.net/), in-house kehittämä ohjelma käytettiin laskemiseen peptidi runsaussuhde ja arvioimaan varmuuden peptidin tunnistamiseen.

siRNA: t ja transfektiot

kolme siRNA: t on suunniteltu kohdistamaan KIF5B mRNA: 5′-CCAUCAUCAUACAAUGAGUCUGAAA-3 ’(KIF5B-1), 5′-CGGCGACAAGUACAUCGCCAAGUUU-3′ (KIF5B-2), ja 5’- CAUCUACCAGAAGGGAUCAAGACAA-3 ’(KIF5B-3). Kaikki siRNA: t hankittiin Invitrogen. Joka siRNA kokeilla kontrollinäyte käsitelty transfektion aineen yksinään ja /tai KIF5B epäsuhta oligo 5’-CGGAACACAUGGCUAAACCGGCUUU-3 ’(MM), otettiin mukaan. MCF-7 ja HeLa-solut transfektoitiin 25 nM siRNA soveltaa Oligofectamine (Invitrogen), kuten transfektion aineena.

mittaaminen solujen elinkelpoisuuden ja mikroskooppinen analyysi

Elävät solut mitattiin niiden kyky vähentää tetratsoliumsuolaa 3- (4,5-dimetyylitiatsoli-2-y) -2,5-diphenyltetrasodiumbromide (MTT, Sigma) formatsaaniksi väriaineen havaittavissa spektrofotometrinen on VersaMax mikrolevynlukijaa (Molecular Devices Ltd, Wokingham, Iso- -Britannia), kuten on kuvattu aiemmin [9]. Vaihekontrasti kuvat solulinjoja otettiin käännetyllä Olympus IX-70 mikroskooppia liitetty Olympus DP70 digitaalikamera. Viivästys mikroskopia suoritettiin Carl Zeiss Axiovert 200M fluoresenssimikroskooppiin avulla MetaMorph ohjelmistoa.

analyysi GFP-LC3 translokaatio

Autophagy aiheutettiin inkuboimalla MCF-7-LC3-eGFP solujen 2.5 uM rapamysiini (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 24 tuntia. Prosenttiosuus solujen eGFP-LC3 translokaatio osaksi pistettä (vähintään 100 solua /näyte) laskettiin eGFP-LC3 ilmentävät solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydiä ja 0,19% pikriinihappo (v /v) soveltamalla Zeiss Axiovert 100 M konfokaali Laser Skannaus mikroskooppi. Solut, joissa ≥5 vihreä soluliman rakkulat pidettiin positiivisina.

mittaus entsyymin toiminnan

kaspaasi-3-like (DEVD-AFC, Enxzyme System Products), kysteiini katepsiini (zFR-AFC, Enzyme System Products), hapan fosfataasi ja p-

N

asetyyli-glukosaminidaasi (NAG) aktiivisuudet määritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [6], [9]. Lyhyesti, solulimafraktio uutettiin 20-35 ug /ml digitoniinipuskuria ja solun kokonais jae 200 ug /ml digitoniinipuskuria ja määrä sopivan alustan hydrolyysi V

max mitattiin 20 minuutin aikana 30 ° C: ssa Spectramax Gemini fluorometriä (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Laktaattidehydrogenaasin (LDH) aktiivisuus sytosoliin määritettiin sytotoksisuus havaitseminen kit (Roche) käytettiin sisäisenä standardina.

immunoblot-analyysi ja immunosytokemia

Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Ensisijainen vasta-aineita vastaan ​​KIF5B (SUK4 kohteesta Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), University of Iowa) ja ab5629 (peräisin Abcam), lysosomiin kalvoproteiini-2 (LAMP-2; klooni H4B4 päässä DSHB), GRP75 (SPA825 kohteesta Stressgene ,), katepsiini B (Ab1 Oncogene), p70 S6-kinaasi 1 (p70

S6K1; # 9202) ja phospo-p70

S6K1 (# 9206) (Cell Signalling Technology) ja glyseraldehydi-3-fosfaatti (GAPDH, Biogenesis, Poole, UK) ja sen jälkeen asianmukainen peroksidaasikonjugoiduilla toissijaisen vasta-aineet DAKO A /S (Glostrup, Tanska).

immunosytokemiassa, solut peitinlaseil- vahvistettu käyttämällä jääkylmällä metanolilla 10 min tai 3,7% formaldehydiä 30 minuutin ajan 25 ° C: ssa. Solut värjättiin mainituilla primaaristen vasta-aineiden, mukaan lukien hiiren anti merisiilin KIF5B (01:20, SUK4), hiiren anti-ihmisen sytokromi

c

(klooni 556432 1: 350, BD PharMingen, San Diego, CA) , vuohen anti-ihmis-γ-tubuliinia (SC-7396, Santa Cruz Biotechnology) ja hiiren anti-ihmisen LAMP-2 (1:100). Pesun jälkeen näytteitä inkuboitiin sopivan Alexa Fluor-488- ja Alexa- Fluor-546/594 kytketty sekundääriset vasta-aineet (Molecular Probes). Konfokaaliset kuvat otettiin käyttäen Zeiss Axiovert 100 M konfokaali laserskannaus mikroskooppi varustettu LSM 510 järjestelmään (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

RNA: n uutto, cDNA-synteesi ja käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR)

RNA kerättiin soluviljelmästä kanssa RNeasy pylväät (QIAGEN) ja cDNA-synteesi tehtiin TaqMan RT Kit (Roche) käyttäen oligo- (dT)

16 alukkeita. PCR-reaktiot suoritettiin standardeissa olosuhteissa seuraavilla alukkeilla:

KIF1A-forw: GACACGCTGGTCTGAGATGA. KIF1A-rev: TGGCTTAGGCACTCCTCACT; KIF3A-forw: GACTATGCTGAGGCTGCAA. KIF3A-rev: TGTCTTTGGCCTTGCTTTC; KIF5A-forw: CAGCTTGACGACAAGGATGA. KIF5A-rev: GGTGTCCACTGACCTCCTGT; KIF5B-forw: GATGGATCGGAAGTGAGCAT. KIF5B-rev: ATCACGACCGTGTCTTCTCC; KIF5C-forw: GCAACTGGAACAGGAGAAGC.

KIF5C-rev: ACCTCACCCAAACACTCCAG. PBGD-forw: CATGTCTGGTAACGGCAATG; PBGD-rev: AGGGCATGTTCAAGCTCCTT. Porfobilinogeeni siinideaminaasi (PBGD; PubMed merkintä BC000520) käytettiin sisäisenä kontrollina yhdessä mielenkiinnon kohteena olevan geenin. PCR-tuotteet koon erotettiin 1,5% -agarose geeliä sisältävä etidiumbromidia, visualisoitiin UV-valossa, valokuvattiin käyttäen Polaroid elokuva.

Subsellulaariset

tiheysgradientti fraktiointi solut yhdistettiin jääkylmässä homogenisointipuskurissa (250 mM sakkaroosi, 20 mM Hepes, ja 1 mM EDTA, pH 7,4) ja lyysattiin dounce-homogenisaattorissa jäillä. Homogenaatteja sentrifugoitiin ja supernatantti sentrifugoitiin 3000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja pelletti heitettiin pois. Supernatantti sentrifugoitiin 17000 g: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Jodiksanoli gradientit muodostettiin lisäämällä peräkkäin 4, 10, 16 ja 24% liuoksia homogenisaatiopuskurilla 25 ° C: ssa 1 tunnin ajan, jolloin muodostui jatkuvan gradientin. Lopullinen pelletti suspendoitiin uudelleen homogenointipuskuriin, ja ladattiin jatkuvan 4-24% jodiksanoli kaltevuus ja sentrifugoitiin 20000

g

on SW41Ti roottorin (Beckman) 17 h ajan 4 ° C: ssa. Liukuvärit jaettiin yhteensä kaksikymmentä 500 ui fraktioita, kerätty pohjasta. Tiheys kutakin fraktiota määritettiin mittaamalla OD 244 nm: ssä. Katepsiini B /L,

N

-acetylglucosaminidase (NAG) ja hapanta fosfataasia toimintaa mitattiin kunkin osan lisäämisen jälkeen digitoniinin.

Analyysi eksosytoosilla toiminnan yhteydessä solukalvon haavoittaen

kalvo haavan tekemisen elektroporaatiolla suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, solut suspendoitiin Hanksin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS) (Gibco, Invitrogen), alistettiin elektroporaatiota 200 V vaihteleva taso kapasitanssi 0,2 cm elektrodin geenin kuvettiin (Bio-Rad), ja niitä inkuboitiin 1 min 37 ° C: ssa. Sitten soluja inkuboitiin anti-LAMP-1 (sc-20011, Santa Cruz Biotechnology), vasta-aine, jäillä 30 minuutin ajan, pestiin, kiinnitettiin ja värjättiin Alexa Fluor 488-vasta-aineita (Molecular Probes). Virtaussytometriaa 10000 solua per näyte suoritettiin FACS (Becton Dickinson) ja tulokset analysoitiin CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson). Mitata ionomysiini aiheuttama eksosytoosilla aktiivisuuden soluja inkuboitiin HBSS, joka sisälsi 10 uM ionomysiiniä (Sigma). Katepsiini B-spesifinen koetin, zfr-AMC (VWR International) lisättiin kuhunkin kuoppaan, jonka lopullinen pitoisuus 100 uM hetkellä 0 ja 10 min. Määrä substraatin hydrolyysin, mitattuna vapautumisen AMC (viritys aallonpituudella 400 nm; emissioaallonpituus 489 nm) 30 ° C: ssa Spectramax Gemini fluorometriä (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

tulokset

ΔNErbB2 nostaa tasoa KIF5B lysosomeihin

MCF-7 rintasyöpä soluja, jotka ilmentävät aminopäästään katkaistu konstitutiivisesti aktiivisen muodon ErbB2-reseptorin tyrosiinikinaasin (ΔNErbB2) näyttää hyvin liikkuvien fenotyyppi ominaista laaja kalvo ruffling, solukalvon ennusteet ja hajaantumista solujen (Fig. 1A). Lisäksi ΔNErbB2 ilmaisu indusoi lokalisoinnin lysosomeihin on filopodia (Fig. 1A) ja 3-4-kertaisesti säätely lysosomaalisen kysteiinin katepsiini toimintaa [6] viittaa siihen, että Dn-ErbB2 muuttaa lysosomaalisen kaupan ja sisältöä. Jotta voitaisiin tunnistaa moottorin osallistuvien proteiinien lysosomaalisen kaupan syöpäsoluissa, vertasimme proteomeja lysosomeihin eristettyjen ohjaus MCF-7 ja MCF-7-ΔNErbB2 solujen vakaa-isotooppi merkintöjä aminohappojen (Lys0 /Lys8) soluviljelmässä ( SILAC), jota seuraa massaspektrometria-analyysi [22]. Kuusi myosiinin moottorit ja yksi mikrotubulusten erityisiä kinesiiniin moottori voitiin havaita tätä lähestymistapaa lysosomifuusio liittyvien moottori proteiineja (taulukko 1 ja Dataset S1). Lysosomaalisen yhdistys kolmen tunnistettujen moottorin proteiinit (myosiinin Ib, myosiinin Ic ja kinesiiniin raskaan ketjun KIF5B) oli säädelty yli 25%, kun kohdunulkoinen Dn-ErbB2 ilmaisun MCF-7-soluissa. Luonnehtia toiminnallista merkitystä näiden kolmen moottoreiden osalta kasvua, selviytymistä ja lysosomaalisen jakelu me köyhdytettyä ne MCF-7 ja HeLa kohdunkaula syöpäsoluissa RNA-interferenssi. Vain siRNA: t, jotka ovat spesifisiä KIF5B vaikutti näihin parametreihin (Fig. 2 ja tietoja ei ole esitetty). Niinpä päätimme tutkia roolia KIF5B on lysosomaalisen toiminto tarkemmin.

(A) immunovärjäämällä lysosomifuusio erityisiä LAMP-1 vasta-Dn-ErbB2 ja ohjaus soluja. (B) RT-PCR-analyysi osoittaa mRNA ekspressiotasoja eri N-kinesiinien lukien KIF5A (349 emäsparia), KIF5B (337 emäsparia), KIF5C (320 emäsparia), KIF3A (393 emäsparia) ja KIF1A (364 emäsparia) H: HeLa, M: MCF-7 ja U: U2OS soluja. KIF vahvistus kaistoja nuolilla. Talon säilyttäminen geeni PBDG (257 bp) käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) Kevyt membraanifraktioiden HeLa-solut erotettiin jodiksanoli kaltevuus ultrasentrifugaatiolla ja proteiinin ekspressiotasot KIF5B, LAMP-2 (lysosomeihin) ja GRP75 (mitokondrioita) visualisoitiin immunoblottauksella. Entsyymiaktiivisuus tasot katepsiini B /L, hapan fosfataasi ja NAG mitattiin kaikissa murtolukuja ja palveli lysosomaalisen markkereita; lineaarisuus jodiksanoli gradientin profiili määritettiin mittaamalla OD 244 nm: ssä (alempi kaavio).

(A) Protein tasot KIF5B, 48 tuntia sen jälkeen, kun ehtyminen vaihtelevalla siRNA pitoisuuksilla (KIF5B-1 siRNA ) ja HeLa ja MCF-7; β-tubuliinia toimi sisäisen valvonnan. Oligof: säätökennoja käsitelty Oligofectamine yksin. (B) edustaja vaihekontrasti kuvia HeLa, MCF-7 ja MCF-7-Dn-ErbB2-soluja, 72 h käsittelyn jälkeen osoitetun siRNA: t. (C) HeLa solut köyhdytetty varten KIF5B tai käsitelty kontrolli MM siRNA ja metabolinen aktiivisuus määritettiin MTT-määrityksellä ja kuolema arvioitiin LDH vapautumisen määrityksellä (D). MTT ja LDH-arvot on esitetty prosentteina käsittelemättömien solujen. (E) kaspaasi-3: n kaltainen aktiivisuus ja (F) sytosolin katepsiini aktiivisuus HeLa-soluissa jälkeen KIF5B ehtymisen (72 tuntia) mitattuna DEVDase ja zFRase entsyymimäärityksillä vastaavasti. Arvot edustavat keinot kolmena mittausten ± SD. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa olennaisesti samat tulokset.

KIF5B ilmentyy suuresti eri syöpäsoluissa

Ensin tutkittiin mRNA: n ilmentymisen tasot KIF5B kolmessa syöpäsolun linjat (MCF-7, HeLa- ja U2OS osteosarkooma) ja todennut sen olevan erittäin ilmentyy kaikissa kolmessa solulinjoissa verrattuna muihin N-kinesiinien lukien KIF5A /KIF5C (kinesiiniin 1), KIF3A (kinesiinin 2) ja KIF1A (kinesiini 3) (Fig. 1 B). Havaitsimme vain vähäistä KIF3A taas sekä KIF5A ja KIF5C mRNA: t eivät olleet havaittavissa kaikissa kolmessa solulinjoissa yhteisymmärryksessä aiempien havaintojen viittaa siihen, että niiden ilmentyminen rajoittuu neuronien [23] (Fig. 1 B). Jotta haastaa lysosomaalisen lokalisoinnin KIF5B havaita proteomiikka-analyysi MCF-7-soluissa, me kohdistuu valoa kalvo osa HeLa solujen tiheysgradientin fraktiointi ja analysoidaan eri jätejakeiden immunoblottauksella ja lysosomaalisen entsyymiaktiivisuuden mittauksia. Kuten kuviossa 1C on esitetty, KIF5B oli yksinomaan läsnä fraktiot, jotka sisältävät suuria määriä lysosomaalisten LAMP-2-proteiinin ja lysosomaalisen entsyymiaktiivisuuden markkereita (kysteiini katepsiinit, hapan fosfataasi ja p-

N

asetyyli-glukosaminidaasi). On kuitenkin huomattava, että jakeet, jotka sisältävät mitokondrion GRP75 markkeriproteiinina olivat osittain päällekkäinen lysosomaalisen jakeet ja KIF5B.

ehtyminen KIF5B aiheuttaa lysosomaalisen vuoto ja solukuolemaa HeLa-soluissa

valaista roolia KIF5B solujen kasvua ja selviytymistä, HeLa ja MCF-7-solut köyhdytetty varten KIF5B RNA interferenssin (Fig. 2A). Mielenkiintoista, KIF5B-köyhdytettyä HeLa-solut hankittiin pitkänomainen solujen fenotyyppi, jota seuraa merkittävä kasvun esto ja solukuolemaa (Fig. 2B-D). KIF5B ehtyminen aiheuttama samankaltainen mutta selvästi heikompi sytostaattinen /sytotoksinen vaikutuksia MCF-7-solut ja hieman MCF-7-Dn-ErbB2 soluissa analysoituna valomikroskoopilla (Fig. 2B). Huolimatta siitä, että induktio merkittävän solukuoleman, vain hyvin pieni kaspaasi-3-kaltaisen aktiivisuuden havaittiin KIF5B-köyhdytettyä HeLa-soluissa (kuvio. 2E). Sen sijaan KIF5B köyhdytetyn soluilla merkittävää kasvua sytosolin kysteiiniä katepsiini aktiivisuus osoittaa lysosomaalisen kalvon läpäiseväksi (Fig. 2F).

ehtyminen KIF5B HeLa-soluissa indusoi perifeeristen parvia lysosomeihin HeLa-soluissa

Koska KIF5B puutteellisia hiiren extraembryonic soluissa näyttää perinuclear klusterointi mitokondrioita ja laski happo laukaisema kaupan lysosomeihin kohti solun reuna [16], me seuraavaksi tutkittiin jakelu näiden soluelimiin jälkeen KIF5B ehtyminen. Tutkiakseen lysosomaalisen jakelu, me käytti HeLa ilmentäviä eGFP-LIMP1 kuin lysosomaalisen merkki [19]. In KIF5B vaje HeLa-eGFP-LIMP1 solujen jakautumista eGFP-LIMP1-postive lysosomeihin dramaattisesti muuttunut peräisin hajanainen perinuclear kuvio suuria reuna-aggregaatteja (Fig. 3A). Nämä lysosomeihin ilmestyi klustereita ja aktiivisesti kuljetetaan ja aggregaattien havaittuna video nopeutus mikroskopia (Video S1 ja S2). Toisin kuin lysosomeihin, mitokondriaalisen jakelu eivät vaikuttaneet KIF5B ehtyminen HeLa-soluissa (kuvio. 3A).

(A) edustaja konfokaali kuvia joko HeLa-solujen tai HeLa, jotka ekspressoivat stabiilisti LIMP-1-EGFP transfektoitiin KIF5B tai MM siRNA, ja värjättiin mainituilla vasta-aineilla. (B) HeLa-solut kylvettiin peitinlaseil- (80% konfluenssi) on kalvo haavoittui veitsellä ja heti sen jälkeen värjättiin pinta LAMP-1; solut jälkeen sitoutunut eikä värjättiin KIF5B. (C) HeLa-soluja, jotka on transfektoitu ilmoitettu siRNA olivat (48 tunnin jälkeen), stimuloidaan exocytose 10 uM ionomysiinillä. Ekstrasellulaarinen eritys lysosomaalisen katepsiini mitattiin zFR-AMC entsyymianalyysiä ja arvoja (avulla kolmena kappaleena mittausten ± SD) on ilmaistu prosentteina koko solun LDH sisältöä. (D) kvantifiointi pinta LAMP-1 elektroporaatio HeLa-soluissa virtaussytometrillä. Punainen ja vihreä valo osoittaa solujen kahdessa eri portit. Solujen prosenttiosuus punainen portti käytettiin arvioida, paljonko pinta-alttiina LAMP-1 +/- elektroporaatio. FL1-H: fluoresenssi-intensiteetti. FSC-H: eteenpäin sivusironnalla.

Koska KIF5B toimii

plus

-end moottori, eli moottori, joka kuljettaa lastia sentrosomimäärän solun reuna [24], kertyminen lysosomeihin solun kehän KIF5B-köyhdytettyä soluja voisi johtua kehällä lokalisaation sentrosomin tai epäonnistuminen lysosomeihin sulake solukalvon kanssa. Jotta testata vaihtoehtoa meillä värjättiin HeLa-eGFP-LIMP1 solujen vastaisella vasta-aineella γ-tubuliinin merkitä sentrosomien. Kuitenkin lysosomaalisen klusterit eivät kerry ympärillä sentrosomien (Fig. 3A). Sen tutkimiseksi, mikäli KIF5B on välttämätöntä lysosomaalinen eksosytoosilla, haimme kolmea eri menetelmää (mekaaninen raapiminen, elektroporaatio ja ionomysiini) aiheuttaa solukalvon vaurioita, jotka laukaisevat Ca

2+ virtaa ja induktio uudelleensuljettava vasteen, johon eksosytoosia lysosomeihin [25 ]. Leikkausveitsellä käytettiin naarmu semi-konfluentti kerros HeLa-solujen mekaanisesti aiheuttaa solukalvon vaurioita, ja lysosomaalisen eksosytoosia välittömästi analysoitiin käyttämällä vasta-ainetta havaitaan luminal epitoopin lysosomaalisen LAMP-1 solun pinnalla. Pinta fluoresenssi LAMP-1 oli merkitsevästi kasvanut vahingon sivustolla osoittaa lysosomaalisen kalvon sulkea, ja lisäksi yhteistyössä lokalisointi ja kertymistä KIF5B at vahinko sivuston havaittiin viittaa siihen, että KIF5B on mukana tässä vastaus (Fig. 3B). Koska tämä menetelmä ei ole sopiva kvantitatiiviseen tutkimuksia, käytimme elektroporaatio indusoivan pieniä hydrofiilisiä huokosten solukalvon tutkia, KIF5B oli välttämätöntä liikenteen prosessissa lysosomeihin vahingon sivustoja. Menetelmä on laajalti käytetty käyttöön proteiineja ja DNA: ta soluihin ja se riippuu solujen kykyyn suljetaan niiden solukalvon elektroporaation jälkeen [26]. HeLa-solut tehtiin elektroporaatio yhä kapasitanssi ja heti kun ne värjättiin pinta LAMP-1 (Fig. 3d). Kvantitointi LAMP-1, joka on paljaana solukalvon virtaussytometrialla paljasti havaittavissa oleva määrä LAMP-1 3,3% käsittelemättömien solujen. Sitä vastoin, kun solut tehtiin elektroporaatio 125 ja 250 uF, LAMP-1 havaittiin pinnalla on 11,4 ja 21%: lla soluista vastaavasti. Solut köyhdytettyä varten KIF5B ja altistettiin 125 uF ei osoittanut mitään merkittävää muutosta pinta LAMP-1 verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa altistetaan 125 uF (Fig. 3d). Samoin ionomysiini aiheuttama lysosomaalisen eksosytoosilla Ontelonsisäisen proteaasien ei vaikuttanut KIF5B ehtymisestä (kuvio 3C). Nämä tiedot osoittavat, että KIF5B ole ratkaiseva lysosomaalisen eksosytoosilla ja solukalvon uudelleen sulkemiseen. Lisäksi otto Alexa Jauhot 488-dekstraani (10 kDa) ei vaikuttanut KIF5B ehtyminen osoittaa, että KIF5B ei tarvita nestefaasin endosytoosin (tuloksia ei ole esitetty).

ehtyminen KIF5B indusoi peri-tumakertymään of autophagosomes

Seuraavaksi tutkitaan, onko KIF5B on rooli autophagy, suuret lysosomaalisen hajoamisen kautta. Tätä tarkoitusta varten olemme käsiteltiin MCF-7-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti autophagosome liittyvä LC3 fuusioidun proteiinin parannetun vihreää fluoresoivaa proteiinia (MCF-7-LC3-eGFP) joko rapamysiiniä, joka indusoi autophagy inaktivoimalla nisäkkään rapamysiinin kohde kompleksin 1 ( mTORC1) tai concanamycin A, joka estää vakuolaarisen V-ATPaasiaktiivisuutta lysosomeihin mikä vähentää liikevaihdon autophagosomes sekä induktion autophagosome muodostumisen eston kautta mTORC1 [27]. Mielenkiintoista, ehtyminen KIF5B kolme ei-päällekkäistä siRNA merkittävästi vähentynyt kyky rapamysiinin laukaista muodostumista LC3-postive autophagic rakkulat (Fig. 4A). Tätä vaikutusta ei ole tuomat muutokset kyky rapamysiinin estää mTORC1 koska ehtyminen KIF5B ei ollut mitään vaikutusta mTORC1 toimintaa analysoituna fosforylaation tila p70 S6-kinaasi 1 (p70

S6K1) (Fig. 4B). Tutkia ilmiötä edelleen, me seurasimme autophagosome muodostumista MCF-7-LC3-eGFP käsitelty solu rapamysiiniä (ei esitetty) tai concanamycin A Viivästys video mikroskopia 45 minuuttia. Yllättäen jakelu autophagosomes oli dramaattisesti muuttaa KIF5B ehtyminen. Vuonna KIF5B köyhdytettyä soluissa autophagosomes ilmestyi ja kertynyt pääasiassa tuman ympärillä (Fig. 4C-E; Video S3), kun taas solut, joita käsiteltiin ohjaus siRNA ne jaettiin diffuusisti koko sytoplasmassa (Fig. 4C, Video S4). Perinuclear autophagosomes in KIF5B köyhdytettyä solut sijaitsevat lähellä Golgin laitteeseen, kuten visualisoitiin värjäämällä vastaisella vasta-aineella

trans

-Golgi verkon membraaniproteiini Golgin-97 (Fig. 4F ja video S5).