Krooninen sairaus

tiivistelmä

MUC1 proteiini poikkeavasti ilmentyy monet kiinteiden kasvainten syöpiä. Toisin kuin sen apikaalisella ryhmittely terveitä epiteelisolujen, se on jakautunut tasaisesti syöpäsoluja. Kuitenkin mekanistinen yhteys poikkeava ilme ja syöpä on pysynyt vaikeasti. Tässä raportoimme, että kalvoon sitoutunut MUC1 lohkomistuote, jota kutsumme MUC1 *, on vallitseva muoto proteiinin viljellyissä syöpäsoluja ja syöpäkudoksiin. Lisäksi osoitamme, että transfektio minimaalinen fragmentti MUC1, MUC1 *

1110, joka sisältää vain neljäkymmentäviisi (45) aminohappoa solunulkoisen domeenin, on riittävän antamaan onkogeenisen toimintoja, jotka olivat aiemmin johtuvan koko pituuden matkan proteiinia. Verrattaessa molekyylipainon ja toiminto, vaikuttaa siltä, ​​että MUC1 * ja MUC1 *

1110 vastaavat suurin piirtein. Todisteet esitetään, että tukee voimakkaasti mekanismi, jossa dimeroitumisesta solunulkoisen domeenin MUC1 * aktivoi MAP-kinaasin signalointiryöpyn ja stimuloi solujen kasvua. Nämä havainnot viittaavat menetelmiä manipuloida kasvun mekanismi hoitotoimenpiteiden syövän hoitoihin.

Citation: Mahanta S, Fessler SP, Park J, Bamdad C (2008) minimaalisen katkelma MUC1 sovittelee syöpäsolujen kasvua. PLoS ONE 3 (4): e2054. doi: 10,1371 /journal.pone.0002054

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 17 joulukuu 2007; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2008; Julkaistu: 30 huhtikuu 2008

Copyright: © 2008 Mahanta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä on biotekniikan yritys ja osallistua optiojärjestelmän.

Johdanto

MUC1 on Type I kalvo glykoproteiini musiinin perheen, jolla on laaja solunulkoinen domeeni, jossa on satoja tandem toistuvaa yksikköä, yksi transmembraaninen domeeni ja C-terminaalinen sytoplasminen häntä [1] – [5]. MUC1 normaalisti ilmaistiin apikaalisella rajalla terve epiteelin että linja hengitys-, lisääntymis- ja mahasuolikanavaa. Jyrkässä ristiriidassa terveen ekspressiokuvion joka rajoittaa MUC1 ontelon pinnoille, syöpäkudokset näyttää poikkeava ekspressiokuviota jossa MUC1 on tasaisesti jakautunut koko kudoksen pinta [6], [7]. Tällä hetkellä arvioidaan, että 75% kaikista ihmisen kiinteän kasvaimen syövät ilmentävät poikkeavasti MUC1-proteiinia [8].

Funktio MUC1 tervettä tilassa on edelleen epäselvä, vaikka näyttöä nopeasti kertyvät rooliaan onkoproteiinia . Käyttöönotto MUC1 osaksi aiemmin MUC1-negatiiviset solut johtaa kasvaneeseen kasvunopeus [9], mahdollistaa kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun [10] ja tekee solut vastustuskykyisiä indusoiman apoptoosin käsittelemällä tavanomaisen kemoterapian aineilla [8]. Vuorovaikutukset MUC1 ja jäsenten ErbB- perhe on raportoitu [11], [12]. MUC1 on mukana useissa solunsisäisiin signalointireitteihin. Nämä tutkimukset ovat keskittyneet MUC1 sytoplasminen häntä (MUC1-CT), joka on ehkä parhaiten karakterisoitu osan proteiini [13]. 72 aminohappo hännän kantaa tähteitä, voidaan fosforyloida ZAP70, PCKδ, GSK3p, erbb1, c-Src, Lyn, ja Lck. Lisäksi, signaalinsiirtoelementit AP-2, p53, ER-α, β-kateniinin ja Grb2 on osoitettu sitoutuvan MUC1-CT, oletettavasti funktiona sen fosforylaatiotilaa. Todellakin, -tutkimuksiin liittyy fosforylaation MUC1-CT aktivointi MAP-kinaasin signalointireitin [12]. Yhdessä tällaisessa tutkimuksessa [14], vasta-aine stimulaatio solunulkoisen domeenin kimeerisen proteiinin, joka käsittää solunulkoisen ja transmembraanisen osia CD8, mutta sytoplasmisen hännän MUC1, johti fosforylaatiota ERK 1/2. ERK aktivointi osoitettiin olevan riippuvainen fosforylaatiota MUC1-CT ja voitaisiin poistaa määräävässä asemassa negatiivinen Ras mutantti tai jonka MEK estäjä, siis väittää, että MUC1-CT välittää Grb2-SOS-Ras-MEK-ERK signalointi kaskadi, joka johtaa solujen jakautumisen.

Tutkimukset MUC1 solunulkoisen domeenin (ECD) on monimutkaista sen leikkaus koko (150-300 kDa), se seikka, että se on erittäin glykosyloitunut ja se koostuu vaihteleva määrä tandem-toistojen. Lisäksi, proteiini voidaan pilkkoa, sitten irtoa solun pinnalta. Shed MUC1, joka koostuu pääosin tandem-toistojen, voidaan havaita seerumissa vaiheen II rintasyöpäpotilaiden [15]. Vastaavasti, Western blot ja lysaatit MUC1-positiivisten viljellyt syöpäsolut esittävät kahta MUC1 lajia: korkean molekyylipainon lajit (150-300 kDa), joka reagoi vasta-aineita, jotka sitoutuvat peräkkäiset toistot, ja alhaisen moolimassan (20-35 kDa), joka reagoi vasta-aineita, jotka sitoutuvat sytoplasminen häntä. Solusupernatanteista sisältää vain korkean molekyylipainon MUC1 lajeja. Joissakin tutkimuksissa on osoitettu, että MUC1 itse pilkkoo kautta SEA toimialueen sisällä proteiini [16], [17]. Toiset ovat esittäneet todisteita siitä, että TACE (ADAM 17) ja MMP14 (MT1-MMP) katkaisevat MUC1 [18], [19]. Ensimmäiset raportit olettaisi, että kun MUC1 pilkkominen, vapautuneen, molekyylipainoltaan suuri osa uudelleen kumppaniaan kalvoon sitoutuneen pienimolekyylipainoisen fragmentti, jolloin siitä tuli ligandin kalvoon sitoutuneen reseptorin [20].

Tämä kertomus keskittyy ilmentymistä ja toimintaa alhaisen molekyylipainon MUC1 hajoamistuoteseoksesta, joka pysyy membraaniin sitoutunut jälkeen suurin osa solun ulkopuolisen domeenin on pilkottu, ja vapautuu solun pinnalla.

tulokset

karakterisointi romaani MUC1-vasta

tutkiakseen ilmentymiskuviot MUC1 ja sen hajoamistuotteesta sekä viranomaisten tehtäviä, meidän täytyi kehittää vasta-aineita, jotka voivat erottaa pienimolekyylipainoisen pilkkominen tuotteen täyspitkän proteiini ehjien solujen ja kudosnäytteiden. Vasta-aineet, jotka tunnistavat tandem-toisto-motiiveja (VU4H5, Santa Cruz) ja sytoplasminen häntä (Ab-5, LabVision) on kaupallisesti saatavilla (Fig. 1A). Kuitenkin vasta-aineita, jotka tunnistavat solunulkoisen osan membraaniin sitoutuneen lohkomistuotteen eivät ole. Mutkistaa asiat, tarkka sivusto (t), jolla MUC1 lohkeaa syöpäsoluihin on epäselvä. Useita katkaisukohdat MUC1 on havaittu tai oletettu [21], [22]. Itse asiassa, yksi entsyymejä, jotka pilkkoo MUC1, MMP14, voi hajottaa sen alustojen useisiin kohtiin [23]. Ei kuitenkaan pilkkoutumiskohta, joka on raportoitu tai ehdotettu tuottaisi kalvoon sitoutunut fragmentti, jossa on solunulkoinen domeeni lyhyempi kuin neljäkymmentäviisi (45) aminohappoa. Siksi me esiin vasta-ainetta vastaan ​​neljäkymmentäviisi (45) aminohapon peptidi (N-1110-1154-C), joka on välittömästi N-terminaalisen transmembraanidomeenin (Fig. 1 B). Me perusteltu, että tämä vasta-aine tunnistaisi membraaniin sitoutuneen tuotteiden kaikista raportoiduista tai ehdotettu pilkkoutumiskohdat. Epävarmuudesta johtuen täsmällisen aseman MUC1 pilkkominen, tässä, me yleisesti viitata kaikkiin kalvoon ankkuroitunut MUC1 pilkkoutumistuotteet kuten MUC1 *. Vastaavasti puhumme vasta-aineita vastaan ​​neljäkymmentäviisi aminohapon peptidi (N-1110-1154-C) Anti-MUC1 *. Sekä polyklonaalisia että monoklonaalisia vasta-aineita syntyy ja ne suoritettiin olennaisesti, vastaavasti.

. Täyspitkä MUC1-proteiinia muodostuu sytoplasminen häntä (CT), transmembraanidomeeni (TM), joka on itse-aggregaatiota domain (SAD), ja satoja tandem-toistojen (TR). B. Pilkkominen tuote, MUC1 *, koostuu sytoplasminen häntä, transmembraanidomeeni, ja vähintään 45 aminohappoa solunulkoisen domeenin (ECD). Vaikka tarkkaa sivusto (t) pilkkominen edelleen jossain määrin epävarmaa, tietojemme mukaan ei katkaisukohdat on raportoitu, että ne aiheuttavat vähemmän kuin 45 aminohappoa ECD. Sitoutumiskohdat vasta VUH5, Ab-5 ja Anti-MUC1 * on merkitty. C. Western-analyysi kokosolulysaateista MUC1-positiivisten viljellyt syöpäsolut, kaistat 1-6, verrataan MUC1-negatiiviset solut, kaistat 7-9. A 6% geeli (ylempi) oli blotattiin VU4H5 ja 12% geeliä (alempi) blotattiin Anti-MUC1 *. D. T47D, MUC1-positiivisten viljellyt rintasyövän soluja, immunosaostettiin joko Ab-5 tai anti-MUC1 *. Näytteitä kokosolulysaatissa (WCL), kaista 1, tai immunosaostumat, kaistat 2 ja 3, analysoitiin western-blotilla. Geelit koetettiin joko VU4H5 (ylempi) tai anti-MUC1 * (alempi). E. Western-analyysi kolmesta MUC1 rintasyöpä solulinjoissa esi- ja post deglykosylaatiotek- ja blotattiin anti-MUC1 * osoittaa, että todellinen molekyylipaino pilkkoa MUC1 on noin 16-18 kDa. F. taulukossa esitetään yhteenveto reaktiivisuuksien vasta joko täyspitkä MUC1 (Hi MW) tai lohkaistaan ​​MUC1 (Lo MW).

Anti-MUC1 * vasta-aineet tyypillistä western blot, FACS, ja immunosolukemiallinen. Kuvio 1C esittää western blot, jossa solulysaatteja paneelin MUC1-positiivisten viljellyt syöpäsolut koetettiin joko VU4H5 (ylempi geeli) tai anti-MUC1 * (alempi geeli). Kuten odotettua, VU4H5 värjättiin korkean molekyylipainon MUC1 lajien kaikkien MUC1-positiivisten solujen testattu: T47D, ZR-75-1, ZR-75-30, BT474, DU145, ja Capan 2. Anti-MUC1 * värjättiin pienimolekyylipainoinen 20-35 kDa proteiini bändi, joka näytti olevan spesifinen MUC1. MUC1-negatiivisia soluja, HCT116, 3Y1 ja HEK293, ei reagoinut joko vasta-aineella. Sen varmistamiseksi, että pienimolekyylipainoisen aineen, joka reagoi anti-MUC1 * oli todellakin MUC1, lysaatit MUC1-positiivisia kasvainsoluja immunosaostettiin joko Ab-5 (sytoplasmahännän vasta-aine) tai anti-MUC1 *, sitten analysoitiin western blot ( kuva 1D). Anti-MUC1 * sitoutuu samaan alhaisen molekyylipainon lajien, että Ab-5 tunnistaa, mikä vahvistaa, että anti-MUC1 * sitoutuu alhaisen molekyylipainon MUC1 lohkomistuote.

Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, Western blot -analyysillä, korkean molekyylipainon MUC1 lajeja vain reagoimaan vasta-aineiden kanssa tandem toistot, ja eivät reagoineet anti-MUC1 * tai Ab-5 (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin, molemmat vasta-aineet kykenevät heikosti immunosaostamiseksi korkean molekyylipainon lajit (Fig. 1 D, ylempi geelin). Näissä kokeissa, immunosaostus voi yksinkertaisesti kaataa ei-kovalenttisesti hetero-dimeeri kaksi pilkkominen fragmentteihin. Nämä tulokset voidaan myös selittää sillä, että VU4H5 sitoutuu tandem toistuva yksikkö, joka toistuu satoja kertaa reseptorin, kun taas anti-MUC1 * ja Ab-5 sitoutuvat ei-toistuvia sekvenssejä, jotka esiintyvät vain kerran reseptoriin. Vaihtoehtoisesti nämä tulokset saattavat yksinkertaisesti selittää sillä, että suuret lajit syöpäsoluihin on pilkottu muoto, MUC1 *. Taulukko Kuvion 1 esitetään yhteenveto vasta-aineen sitoutumisen tiedot.

lähemmin todellinen koko alhaisen molekyylipainon MUC1 lajien solulysaatteja deglykosyloituneen ennen western blot -analyysillä. Kuviossa 1E on esitetty, että kun deglykosylaatio, aikaisemmin laajaa 20-35 kDa: n proteiini band suppenee erillinen bändi, joka kulkee, jonka ilmeinen molekyylipaino on noin 15-17 kDa. Toteamme, että laskettu molekyylipaino on MUC1 lohkomistuote, trunacted noin neljäkymmentäviisi aminohapon solunulkoinen domeeni on noin 16 kDa.

Ekspressiokuvioiden MUC1 ja sen lohkaisu tuote, MUC1 *, on Viljellyt solut ja syöpäkudoksiin

Viljellyt syövän solut analysoitiin immuno- sytokemian ekspression määrittämiseksi kuvio MUC1 ja hajoamistuoteseoksen MUC1 *. MUC1-positiivisen rintasyövän solut kahden värjättiin VU4H5 joka sitoutuu tandem-toistojen yksiköiden suuren molekyylipainon fragmentti ja Anti-MUC1 *, joka sitoutuu alhaisen molekyylipainon, membraaniin sitoutunutta lohkomistuote, MUC1 *. Fluoresoiva kuvantamisen paljasti, että MUC1 * on hallitseva muoto proteiinin viljellyillä syöpäsoluihin ja tasaisesti jakautunut koko solun pinnalla. Sen sijaan, proteiineja, jotka värjättiin VU4H5 olivat joko ei toiminut ollenkaan tai olivat vähäisiä laji (kuvio 2A). VU4H5 värjäys voi osoittaa, että proteiinin pinnalla on täyspitkä MUC1 tai että se on ei-kovalenttisesti sitoutunut hetero-dimeeri, joka koostuu sekä katkaisu- tuotteiden. Erityisesti ekspressiokuvion täyspitkän MUC1 on ryhmitelty yhteen tai kahteen pistettä solun pinnalla, joka muistuttaa taipumus MUC1 terveitä epiteelin klusterin klo apikaalisella rajalla.

. Fluoresoiva kuvantaminen viljeltyjen rintasyöpäsolujen osoittaa, että hajoamistuotteen MUC1 * (punainen) on vallitseva laji ja on tasaisesti jakautunut koko solun pinnalla. Täyspitkä MUC1 (vihreä) on toissijainen eläinlaji ja on ryhmitelty. Solut kaksinkertainen värjättiin anti-MUC1 * (punainen), joka sitoutuu epitooppiin kalvon proksimaalinen 45 ensimmäistä aminohappoa solunulkoisen domeenin ja VU4H5 (vihreä), joka sitoutuu epitooppiin tandem-toisto domeenin täysipituisen proteiinin . OLLA. Paria vierekkäisiä osia ihmisen kudosnäytteiden hoitamattomia potilaita värjättiin joko anti-MUC1 * (vasen) tai VU4H5 (oikealla). Kuvat valokuvattiin 10 × tai 100-kertainen suurennus. B. poikkileikkaus ei-syöpä munanjohdin esittää MUC1 * pinta värjäytymisen luminaaliselle reuna (alhaalla vasemmalla). Täyspitkä MUC1 on sytoplasminen (alhaalla oikealla). C. Rintasyöpä kudosnäytteet. D. Keuhkosyöpä yksilöitä. E. Colon syöpä yksilöitä. Nuolet kaikkein mukana osia syöpäkudoksen jossa kaikki solu arkkitehtuuri on menetetty ja kudosta ei värjätty VU4H5.

vieressä katsoimme ekspressiokuviota täyspitkän MUC1 versus MUC1 * terve ja syöpä- ihmisen kudosnäytteiden hoitamattomista potilaista. Leikesarjojen ei-syöpä munanjohdin värjättiin joko anti-MUC1 * tai VU4H5. Sekä MUC1-vasta-aineita värjättiin luminaalipinnalla munanjohdin, mutta ei ympäröivään kudokseen (Fig. 2B, ylempi paneeli). 100-kertainen suurennus paljasti, että pilkottu muoto, MUC1 *, yksinomaan ilmaistaan ​​

pinta

on epiteelisolujen putken, kun täyspitkä MUC1-proteiinin näyttää rajoittuvan sytoplasmaan (Fig. 2B, alempi paneeli). Back-to-back osien syöpä rinta-, keuhko-, ja paksusuolen kudokset samalla tutkittiin kahden vasta-aineen (kuviot. 2C-E, tässä järjestyksessä). Jyrkässä ristiriidassa ekspressiokuviota MUC1 terveitä kudoksia, joka rajoittui luminaaliselle reunaan, MUC1 ilmaistaan ​​koko pinnalle syöpäkudokset. Värjäämällä anti-MUC1 * osoittaa, kuten viljellyillä syöpäsoluja, suuret muodossa MUC1 on syöpäkudoksen MUC1 *. Suurennettu kuvat osoittavat, että MUC1 * ilmentyy solun

pinta

kun täyspitkä MUC1 näyttää olevan sytoplasman (kuviot. C, D, alempi paneeli). Erityisesti, Anti-MUC1 * tuotettu raskaampia värjäytymisen kuin VU4H5 huolimatta siitä, että tandem-toisto-vasta-aine voi sitoutua satoja epitooppien per reseptorin verrattuna yhden epitoopin, johon anti-MUC1 * sitoutuu. Osa syöpäkudoksen testasimme ei värjäytynyt positiivinen joko MUC1-vasta. Yhdeksän (9) rintasyöpänäytteistä testataan, vain yksi oli MUC1-negatiivinen syöpä, joka vastaa suunnilleen julkaistut raportit, että noin 90% kaikista rintasyövistä on MUC1-positiivisia syöpiä. Toteamme, että kudosnäytteet, joiden katsottiin olevan MUC1-negatiivinen syöpiä oli normaalia apikaalisella värjäytymistä sekä MUC1 vasta ulkopuolisilla alueilla marginaalin maligniteetin (tuloksia ei esitetty) vahvistaa, että määritys suoritettu oikein mutta nämä syövät eivät tyypillistä poikkeava ilmentymä MUC1.

Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että jotkut kudosnäytteiden värjätty positiivinen läsnäolo MUC1 * mutta negatiivinen täyspitkän MUC1. Esimerkiksi paksusuolen syöpä näyte värjättiin anti-MUC1 * kanssa voimakkain värjäytyminen, joita esiintyy eniten sairaissa osia näytteen. Sen sijaan VU4H5 kevyesti värjätään lähialueilla marginaali maligniteetin mutta ei tuottanut värjäytymistä enemmän sairaat alueiden ominaista menetys matkapuhelinarkkitehtuurin (Fig. 2E). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa ajatuksen, että kaikkein syöpä yksilöitä saattaa vaikuttaa MUC1-negatiivinen, jos vasta-aineilla vastaan ​​täysipituinen proteiini yksinään. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että vallitseva MUC1 lajien syöpäkudoksen, kuin viljellyt syöpäsolut, on pilkottu laji, MUC1 *.

MUC1 * välittää solukasvun

Kun on, että suuret lajit pinnalla syöpäsolujen ja kudoksia on MUC1 * eikä täyspitkä proteiini, päätimme tutkia kasvuominaisuudet pilkotun muodon verrattuna lohkaisemattoman. MUC1-negatiivisia soluja, 3Y1 ja HCT116, transfektoitiin joko täyspitkä MUC1 tai konstrukti, MUC1 *

1110, jonka solunulkoinen domeeni lopetettiin neljäkymmentäviisi (45) aminohappoa (N-1110-1255-C ) (Fig. 1 B). Vakaa transfektantteja osoittautui riittämättömäksi tutkimukseen, koska täyspitkän transfektantit nopeasti kehittynyt väestö hallitsee pilkottu muoto, MUC1 *, joilla on vain vähän tai ei täyspitkä proteiini saatavilla solun pinnalla (tuloksia ei esitetty). Tästä syystä, yhden solun klooneja, ja käytettiin kokeissa, on kuvattu esillä olevassa tutkimuksessa. FACS, immunosytokemia ja Western blot-analyysi osoitti, että yhden solun klooneja täyspitkän MUC1 tuotti täysipituinen proteiini, mutta samalla syntyy hajoamistuotteen MUC1 * (Fig. S1).

klonogeenisten määritys suoritettiin arvioida kasvuvauhti MUC1 *

1110 versus täyspitkä MUC1, jotka oli transfektoitu rotan fibroblasti-3Y1 soluja. Solut maljattiin alhaisella tiheydellä annettiin kasvaa yhdeksän (9) päivää. Tuloksena pesäkkeet visualisoitiin värjäämällä kristallivioletilla. MUC1 *

1110 klooneja, 3Y1 MUC1 * 3 ja 3Y1 MUC1 * 44, tuottivat enemmän, isompi ja tiheämpi pesäkkeitä kuin täyspitkät kloonit, 3Y1 MUC1 8 ja 3Y1 MUC1 17 (Fig. 3A). Lopussa yhdeksän päivää, MUC1 *

1110 kloonit tuottivat viisi vaille kymmenen kertaa enemmän soluja kuin täyspitkän klooneja. Ero kasvu kvantitoitiin mittaamalla määrä, kristallivioletin, joka vapautui solujen jokaiselle levylle (Fig. 3A: pylväsdiagrammi). Kuitenkin kasvu solujen lukumäärä olisi voinut olla, koska kasvu eloonjäämisprosentti tai korottamalla kasvu. Solujen eloonjääminen tekijöitä voidaan tunnistaa niiden kyvystä tehdä solujen resistenttejä kemoterapia-indusoitua kuolema. Yhden solun klooneja MUC1 tai MUC1 *

1110, jotka oli transfektoitu MUC1-negatiiviset solut (3Y1 tai HCT116) käsiteltiin AraC, sisplatiinin tai etoposidin, määritettiin sitten mitata määrä solukuoleman. Solut transfektoitiin joko täyspitkä MUC1 tai MUC1 *

1110 tuli resistentti indusoiman apoptoosin näiden kemoterapeuttisten aineiden. Edustava koe on esitetty kuviossa 3B. Nämä tulokset esittävät, että MUC1 tai MUC1 * lisäys solujen eloonjäämistä. Sen määrittämiseksi, ovatko ne myös lisäävät solujen kasvua, solun kaarianalyysin koe suoritettiin. FACS käytettiin mittaamaan solujen määrä G2 /M-vaiheen (indikaattori solunjakautumisen) määrään verrattuna G1 vaiheessa. Suhde solut G2: G1 mitattiin HCT116-solut transfektoitiin joko täyspitkä MUC1 tai MUC1 *

1110 (Fig. 3C). Käyttöönotto joko MUC1 *

1110 tai täyspitkä MUC1 ajoi enemmän soluja G2 /M-vaiheessa kuin kontrolli- transfektio tyhjän vektorin. Kuitenkin transfektio MUC1 *

1110 lisäsi suhde G2:G1 enemmän kuin transfektio täyspitkän proetin. Muista, että vaikka transfektoidaan täyspitkä proteiini, huomattava määrä on proteolysoidun että MUC1 * muodossa.

. Klonogeenisten määritys suoritettiin yhden solun klooneja, MUC1-negatiivisten 3Y1-solujen, jotka oli transfektoitu joko tyhjällä vektorilla, täyspitkä MUC1 tai MUC1 *

1110. Valokuva, petrimaljoja, jotka sisältävät soluja maljataan 1000 solua per 100 mm: n, kasvatettiin 9 päivää, sitten värjättiin kristallivioletilla. Pylväsdiagrammi määrällisesti kasvu kunkin kloonin. Kristalliviolettia imeytyy solujen kullakin maljalla oli vapautettu ja absorbanssi 590 nm: ssä mitattiin spektrofotometrillä. Absorption mittaukset normalisoitiin määrä kristalliviolettia vapautuu tyhjän vektorin klooni. Nimikkeistön meidän yhden solun klooneja on ”vanhempi solun nimi /konstrukti /klooni #”. B. Resistance solukuolemaan aiheuttama kemoterapiaa huumeiden AraC testataan yksisoluklooneista joko tyhjän vektorin, täyspitkä MUC1 tai MUC1 * transfektoida 3Y1 soluihin. C. Solusyklianalyysiä suoritettiin joko tyhjän vektorin, täyspitkä MUC1 tai MUC1 * transfektoida MUC1-negatiivinen solulinja HCT116. Suhde solujen prosenttiosuus G2 G1 faasi funktiona seerumin konsentraation. Suhde% G2:% G1 tyhjän vektorin transfektantit on normalisoitu 1. D. kasvu MUC1-positiivisten rintasyöpäsolujen ZR-75-30, stimuloidaan lisäämällä kahdenarvoinen (bv) Anti-MUC1 * ja esti lisäämällä monovalentin (mv) Fab. Lisäämällä kahdenarvoinen vasta-aine tuottaa kellon muotoinen kasvukäyrä, joka on tunnusomainen reseptori dimerisaation. Kasvu MUC1-negatiivisten HEK 293-soluissa ei kuitenkaan vaikuttanut joko bivalenttinen tai yksiarvoinen Anti-MUC1 *. E. stimulointi kasvua lisäämällä kahdenarvoisen Anti-MUC1 * testataan käyttämällä stabiilisti transfektoitu siRNA tukahduttaa MUC1 ilmentyminen rintasyövässä T47D. Kaksivalenssinen Anti-MUC1 stimuloi kasvua transfektoiduissa soluissa ohjaus siRNA, mutta ei merkittävästi vaikuta kasvua MUC1 tukahdutetaan solujen. Western blot-analyysi (insert) osoittaa, että MUC1 siRNA tukahdutti MUC1 ilmaisun noin 90%. F. MUC1-positiivisen rintasyövän soluja, T47Ds, käsitellään joko kaksiarvoinen Anti-MUC1 * tai monvalent Fab, analysoitiin sitten Western läsnäolon fosforyloidun ERK1 /2. Blotit osoittavat induktion ERK2 fosforylaation kaksiarvoisella Anti-MUC1 * ja eston pohjapinta ERK1 /2 fosforylaation kahden päivän (2 d) käsittely monovalentin Fab.

siis pitänyt perustaa yhteys MUC1 * ja kasvua, me arveltu, että se voi toimia kasvutekijän reseptori. Ilman tunnettuun ligandiin MUC1 tai MUC1 *, olisi vaikea testata hypoteesia. Kuitenkin, luokan I kasvutekijäreseptorit laukaista solun kasvun kautta dimerointi solunulkoisen domeenin reseptorin. Meillä oli kahdenarvoinen vasta-aine MUC1 *

1110-ECD (solunulkoinen domeeni) osan, jota voitaisiin käyttää simuloimaan ligandiaan. Toiset olivat aiemmin raportoitu, että stimulaatio tämän luokan kasvutekijän reseptorien dimeroivalla Vasta-aineilla, kellomainen kasvukäyrät [24] – [26]. Tämä johtuu solun kasvua lisääntyy vasta-pitoisuus kunnes maksimaalinen kasvu saavutetaan, kun yksi vasta-dimerisoituu kahdessa reseptoreihin. Kuitenkin, kuten vasta-aineen pitoisuus menee yli, kukin vasta-aine sitoutuu yhteen reseptoriin, joten ei dimerisaatio tapahtuu, ja solujen kasvua putoaa. Suoritimme samanlaisia ​​kokeita käsittelemällä MUC1-positiivisten syöpäsolujen sekä MUC1 ja MUC1 *

1110 transfektoitujen solujen anti-MUC1 *. Negatiivisena kontrollina, käsittelimme solut yhdenarvoinen Fab Anti-MUC1 *, jotka eivät voi dimeroitua reseptoreihin. Kunkin MUC1-positiivisen tai MUC1 *

1110-solulinjan testasimme, kahdenarvoisen vasta-aine stimuloi solujen kasvua ja tuottaneet odotettua kellomainen kasvukäyrä. Täydellisenä vastakohtana yksiarvoiset Fab paitsi ei stimuloi solujen kasvua, mutta se indusoi solukuolemaa. Tulokset yhden tällaisen kokeen on esitetty kuviossa 3D, jossa kasvu MUC1-positiivisten rintasyöpäsolujen ZR-75-30s, stimuloidaan Anti-MUC1 * ja estää yksiarvoiset Fab. MUC1-negatiiviset HEK293 eivät vaikuta joko vasta-aineella. Kontrollivasta-aineita riippumatta siitä, onko kaksiarvoinen tai yksiarvoisia, ei ollut vaikutusta kasvuun MUC1-positiivisten kasvainsolujen kasvua (Fig. S2). Sen varmistamiseksi, että vasta-aine-stimulaatiota solujen kasvua erityisesti välittämä MUC1, kokeet toistettiin käyttämällä MUC1-positiivisen rintasyövän syöpäsoluja, T47Ds, jotka oli stabiilisti transfektoitu siRNA on pudotus MUC1 ilmentymisen. T47D-solujen kasvua stimuloidaan lisäämällä kahdenarvoinen Anti-MUC1 * ja ominaisuus kupumaisen kasvukäyrä on tuotettu. Kuitenkin solut, joissa MUC1 ilmentyminen on tukahdutettu vähintään 90% vasta-aine ei ole stimuloiva vaikutus (Fig. 3E). Lopuksi kokeet osoittivat, että stimulointi MUC1-positiivisten solujen kaksiarvoisella Anti-MUC1 * aiheuttama fosforylaation ERK1 /2. Sen sijaan yhdenarvoinen Fab-fragmentti Anti-MUC1 * tukahdutetaan pohjapinta tasot fosforyloitua ERK1 /2 (Fig. 3F). Fosforylaatio ERK1 /2 on keskeinen vaihe aktivointi MAP-kinaasin signalointiryöpyn. Yhdessä nämä tulokset ovat sopusoinnussa ajatuksen, että MUC1 * on kasvutekijän reseptori tai co-reseptori, joka välittää solun kasvun kautta dimerointi solunulkoisen domeenin, jolloin MAP-kinaasin signalointireitin aktivoituu.

MUC1 * aktivoivat ligandit

Jos MUC1 tai MUC1 * toimii kasvutekijän reseptori, joka aktivoituu dimerointi solunulkoisen domeenin, niin siitä seuraa, että MUC1-positiivisten syöpäsolujen voi erittävät dimeroivalla ligandi (t). Suunnittelimme nanohiukkasten kokeen seuloa syöpäsolujen lysaatit ja supernatantit läsnäolo tämän ligandin. MUC1 *

1110-ECD-peptidien (N-1110-1054-C: ks. 1B) on kiinnitetty kultananopartikkeleilla kautta C-terminaalisen histidiini-tag ja lysaattia /supernatantti näytteet lisättiin [27]. Jos dimeroivalla ligandia olivat läsnä, se olisi samanaikaisesti sitoutua ensimmäiseen peptidi ensimmäisellä nanohiukkasten ja toinen peptidi toisella nanohiukkasten, mikä aiheuttaa suurimman silloittumista nanohiukkasten ja peptidejä. Johtuen luontainen ominaisuus kultananopartikkeleilla, silloittuminen aiheuttaa värin muutos ominaisuus vaaleanpunaisesta violetti /sininen [28]. Lisäämällä lysaattia /supernatantti seoksia MUC1 *

1110-ECD: n peptidi-, joissa nanohiukkasten aiheutti liuoksen kääntää violetti /sininen. Määrä värin muutos vastaa suurin piirtein määrä MUC1, että kukin solulinja tuotettu. Ei värimuutos johti kun lysaattia /supernatantti seoksia lisättiin nanohiukkasten joissa kontrollipeptidiä (Fig. 4A).

. Lysaattia-supernatantti seoksia paneelista MUC1 rintasyöpä solut testattiin läsnäolon ligandi, joka pystyy dimeroivalla MUC1 *

1110-ECD peptidi (kalvo proksimaalisten 45 aminohappoa ekstrasellulaarisen domeenin: 1110-1155) . Lysaattia-supernatanttia seoksia inkuboitiin nanohiukkasia, joissa joko kontrollipeptidiä tai MUC1 *

1110-ECD-peptidi, histidiini-merkitty C-terminuksessa. Nanopartikkelidispersio ratkaisu värinmuutos vaaleanpunaisesta violetti /sininen tarkoittaa, että laji seoksessa on samanaikaisesti sidottu 2 tai useamman MUC1 *

1110-ECD peptidejä. B. kaksivalenssinen (bv) Anti-MUC1 * (0,77 ug) lisätään nanohiukkaset, joissa joko kontrollipeptidiä (rivi A) tai MUC1 *

1110-ecd, peptidit (rivi B). Vasta-aine sitoutumaan kahteen peptidien eri nanohiukkaset aiheuttaa nanohiukkasten aggregaatiota ja liuoksen värin muutos vaaleanpunaisesta violetti /sininen. Rivillä A, kaivot 3-5, tämä yhdistäminen estetään lisäämällä yhdenarvoista Anti-MUC1 * Fab (mv Fab). C. nm23 0.05, 0.1 tai 0.2 uM, (rivit A, B ja C vastaavasti) lisätään nanohiukkaset laakeri MUC1 *

1110-ECD peptidejä (sarakkeet 2-5). Lisätty nm23 indusoi värinmuutos, oletettavasti nm23 dimeerit sitoutuvat nanohiukkasten immobilisoituun MUC1 *

1110-ECD peptidejä. Lisääminen monovalentin Anti-MUC1 * (mv Fab), sarakkeissa 3-5, estää värin muutos. D. kasvatusaine MUC1-positiivisten rintasyövän soluja, T47Ds ja MUC1-negatiivinen rotan fibroblastien, 3Y1s, sekoitettiin helmiä laakeri MUC1 *

1110-ECD peptidi. Immunosaostettiin lajit analysoitiin sitten western, jossa geeli blotattiin anti-nm23 vasta-aine. Western blot osoittaa, että T47Ds erittävät nm23 vaikka 3Y1s eivät. E. Pintaplasmoniresonanssianalyysi (SPR) käytettiin havaitsemaan välinen suora sitoutuminen nm23 (15 nM) ja MUC1 *

1110-ECD-peptidejä. Sensogram osoittaa, että 1044 RU on nm23, pistetään 15 nM, sitoutunut pintaan laakeri MUC1 *

1110-ECD peptidejä (yhtenäinen viiva), mutta ei nm23 sitoutuneena ohjaus kilven irrelevanttia peptidin (katkoviiva). F. stimulointi T47D rintasyövän solujen kasvua nm23 riippuu MUC1 ilme. Eksogeeninen nm23 lisätään T47D rintasyövän soluja stimuloi kasvua ja tuottaa kellon muotoinen käyrä osoittaa reseptorin dimeroitumisen. Kasvu on suuresti vähentynyt soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti MUC1-spesifinen siRNA, verrattuna soluihin, jotka ilmentävät kontrollina siRNA. Western blot määrällisesti siRNA tukahduttamista MUC1.

tunnistamiseksi mikä näytti olevan MUC1 * ligandi (t), helmet laakeri MUC1 *

1110-ECD peptidejä käytettiin immunosaostamaan tuntemattoman proteiineja lysaatista /supernatantti seosten MUC1-positiivisten syöpäsolujen. Eluaatit eroteltiin SDS-PAGE: lla ja visualisoitiin hopeavärjäyksen avulla menetelmiä. Oli lähinnä vain kaksi bändejä, jotka saostettiin MUC1 *

1110-ECD peptidi eikä saostetaan kontrollipeptidiä: näkyvä 23 kDa ja himmeämpi 17 kDa: n vyöhykkeen (kuva. S3). Proteiinivyöhykkeet leikattiin geelistä ja analysoitiin käyttämällä N-terminaalista mikrosekvensointi, joka tunnistaa ne nm23, isoformit H1 ja H2 vastaavasti. Nm23 löytyy yleensä sytoplasmassa kaikkien solujen, mutta on usein erittävän syöpäsoluja [29] osoittaa, että se voisi olla ligandin solunulkoisen osan MUC1 *. Solusupernatantit immunosaostettiin MUC1 *

1110-ECD peptidien kiinnitetty helmiä, sitten analysoitiin western blot. Supernatantit MUC1-positiivisten syöpäsolujen, mutta ei kontrollisoluissa, syntyy voimakas proteiinia vyöhyke noin 23 kDa: n, joka reagoi anti-NM23H1 (Fig. 4B). Tämä vahvisti, että proteiinien syövän solusupernatanttien että immunosaostettiin MUC1 *

1110-ECD peptidejä todellakin nm23.

havaitsemiseksi suoran sitoutumisen välillä nm23 ja MUC1 *

1110-ECD peptidejä ja spesifisyyden varmistamiseksi, toinen nanohiukkasten koe suoritettiin. Rekombinantti ihmisen nm23 lisättiin MUC1 *

1110-ECD-peptidi-laakeri nanopartikkelien ja nanohiukkasten joissa kontrollipeptidiä. Lisäys nm23 nanohiukkasten laakeri MUC1 *

1110-ECD, aiheutti liuoksen värin muutos vaaleanpunaisesta violetti /sininen ja aste värin muutos oli tehtävä nm23 pitoisuus. Yksiarvoisesta Fab Anti-MUC1 * kilpailevasti inhiboivat välillä hiukkanen immobilisoimatonta MUC1 * peptidejä ja nm23 (Fig. 4C). Edelleen osoittaa spesifisyyden nanohiukkasten määrityksen itse, kaksivalenssinen Anti-MUC1 lisättiin MUC1 *

1110-ECD-peptidi-laakeri nanohiukkaset, jotka odotetusti johti vaaleanpunainen siniseen värimuutos. Tämä sitoutuminen myös inhiboi kilpailevasti monovalenteilla Fab (Fig. 4D).