Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakon syöpä on yleisin pahanlaatuinen urologinen sairaus Kiinassa. Hydroksikamptotesiini (HCPT) on DNA-topoisomeraasi I: n estäjä, jota on hyödynnetty kemoterapiaa virtsarakon syövän lähes 40 vuotta. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että isoflavone, genisteiini, voi herkistää useita syövän solulinjat HCPT hoitoon, kuten eturauhasen ja kohdunkaulan syöpä. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko genisteiini- voi herkistää virtsarakon syövän solulinjoissa ja virtsarakon epiteelisolujen BDEC solujen HCPT hoitoa, ja tutkitaan mahdollisia taustalla molekyylitason mekanismeja. Genisteiini voisi merkittävästi ja annoksesta riippuen herkistää useita virtsarakon syövän solulinjojen ja BDEC solujen HCPT indusoiman apoptoosin sekä in vitro että in vivo. Genistein ja HCPT synergistisesti estivät virtsarakon solujen kasvua ja lisääntymistä ja indusoi G2 /M vaiheessa solukierron pysähtymisen ja apoptoosin TCCSUP virtsarakon syövän solujen ja BDEC solu. Esikäsittely genisteiini herkistyneet BDEC ja virtsarakon syövän solulinjat HCPT aiheuttaman DNA-vaurioita, joita synergistinen aktivoituminen ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) kinaasi. Genisteiini vaimensi merkittävästi kykyä HCPT aiheuttaa aktivointi anti-apoptoottisten NF-KB-reitin sekä in vitro että in vivo virtsarakon syövän ksenograftimalli, ja siten torjua anti-apoptoottisen vaikutuksen NF-KB-reitin kautta. Tämä tutkimus osoittaa, että genistein voisi toimia lupaava ei-myrkyllisen aineen parantaa tehoa HCPT virtsarakon syövän kemoterapiassa.

Citation: Wang Y, Wang H, Zhang W, Shao C, Xu P, Shi CH, et al. (2013) Genistein herkistää Virtsarakon syöpäsolujen HCPT Hoito in vitro ja in vivo kautta ATM /NF-KB /IKK Pathway indusoiman apoptoosin. PLoS ONE 8 (1): e50175. doi: 10,1371 /journal.pone.0050175

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2012; Hyväksytty 22 lokakuuta 2012 Julkaistu: 24 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30901498, No. 30100185, No. 81250036, No. 30973000, No. 30872583, nro 81072116) ja Natural Science Foundation of Shaan’xi maakunnassa Kiinassa ( 2009JQ4003). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yksi yleisimmistä maligniteetit vaikuttavat virtsateiden. Kaikkiaan 44690 miehillä (29,8 per 100000) ja 16730 naisilla (11,2 100000) diagnosoitiin vuonna 2006, ranking virtsarakon syöpä neljänneksi yleisin miesten ja yhdeksäs yleisin naisten pahanlaatuinen sairaus Yhdysvalloissa [1]. Sen sijaan, ilmaantuvuus virtsarakon syöpä Aasiassa on paljon pienempi. Vuonna 2009 Zhang et al. kertoi, että vaikka hinnat nousivat vuodesta 1988 vuoteen 2002 (8,22 per 100.000 1988-1992, 9.45 per 100000 1993-1997 ja 9,68 per 100000 vuosina 1998-2002), ilmaantuvuus virtsarakon syövän Kiinassa on edelleen pienempi kuin Yhdysvalloissa [ ,,,0],2]. Samoin Itä-Aasiassa, alhainen ilmaantuvuus virtsarakon syöpä on raportoitu Koreassa (14.39 per 100000), Japanissa ja Intiassa (noin 14 per 100000) [3] – [5]. Lisäksi 5 vuoden tautikohtaisia ​​eloonjäämisaste virtsarakon syövän potilaiden Aasiassa ovat korkeampia kuin länsimaissa [6].

kemoterapeuttista ainetta, hydroksikamptotesiinin (HCPT), käytetään ensisijaisesti hoitoon virtsarakon syöpä. HCPT indusoi apoptoosin virtsarakon syövän soluissa muodostamalla kolmen komponentin kompleksin DNA: n ja DNA-entsyymi topoisomeraasi I: n kautta vetysidoksia, mikä vakauttaa monimutkainen. Vakaa kompleksi estää DNA uudelleen ligaatiolla ja johtaa muuntaminen yksiketjuisen DNA: n murtautuu double-säikeen katkoksia aikana S-vaiheen. Tässä vaiheessa replikaatiohaarukan törmää DNA pilkkominen komplekseja, joka indusoi apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen [7].

Genisteiini, tunnettu isoflavoneja ja luonnon kasvitieteellisen estrogeeni, on osoitettu estävän syöpäsolujen kasvua, eloonjääminen, etäpesäke ja angiogeneesiä lisäämällä apoptoottisen solukuoleman kautta induktion useiden DNA: ta vaurioittavien ärsykkeiden [8] – [10]. Genisteiini on osoitettu olevan estävää vaikutusta kasvuun eturauhassyövän [11], kohdunkaulan syöpä [12], rintasyöpä [13], paksusuolen syöpä [14] ja munuaissolukarsinooma [15] soluja. Genistein voivat myös chemosensitize monia pahanlaatuisia kasvaimia vaikutuksille DNA myrkyllisiä lääkkeitä. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että esikäsittely 10-30 mikromol /l genisteiini- voi chemosensitize kohdunkaulan, munasarjojen ja normaaleja fibroblastisoluja hoitoon HCPT aiheuttamalla suuremman kasvun hidastumisen ja solujen apoptoosin [16]. Kuitenkin myös genistein voi parantaa kemoterapeuttisen vaikutuksen HCPT virtsarakon soluihin, ja sen molekyylitason vaikutusmekanismi tämän kudostyypin, jää epäselväksi. Siksi tutkimme, genisteiini- voisi chemosensitize virtsarakon syövän solujen HCPT, ja tutki mahdolliset taustalla mekanismeja tämän vaikutuksen.

Materiaalit ja menetelmät

1. Solulinjoja

J82, SCaBER, ja TCCSUP virtsarakon syövän solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), BFTC905, HT1197, T24, TSGH-8301 virtsarakon syövän solulinjat olivat peräisin China Center for Type Culture Collection (CCTCC). Ensisijainen virtsarakon epiteelisolulinja, BDEC, oli BioWhittaker (San Diego, CA, USA) ja ylläpidettiin eksponentiaalisesti kasvavista viljelmistä DMEM, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Genistein (Sigma, Shanghai, Kiina) ja HCPT (ystävällisesti Sanofi, Shanghai, Kiina) liuotettiin DMSO: hon valmistaa 10 mM kantaliuokset. Kokeissa soluja inkuboitiin 3 päivää ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman 10 uM genisteiini ja 1 uM HCPT 24 tuntia.

2. Solujen kasvun inhibitiota genisteiini ja HCPT

Solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa ja annettiin kiinnittyä yön yli. Elatusaine korvattiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi genisteiinin eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan, ja solut altistetaan sitten HCPT vielä 72 tuntia. Kunkin yksittäisen aineella, solut käsiteltiin genisteiini 96 tuntia ja HCPT 72 tuntia. Solujen kasvua tutkittiin käyttäen MTT-määritystä.

3. Virtaussytometria apoptoosin

Adherentit solut trypsinoitiin, suspendoitiin uudelleen ja käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Virtaussytometria tehtiin käyttämällä sinistä valoa argon-laser (eksitaatio aallonpituudella 488 nm; laser teho, 200 mW) ja punainen fluoresenssin PI että tarrat DNA nauhoitettiin. Kaikki testit apoptoosin tehtiin kahtena kappaleena ja tulokset esitetään edustavat ainakin kolmen kokeen.

4. Immunofluoresenssivärjäyksellä ja γ-H2AX ja ATM

γ-H2AX värjäys, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla HCPT ja genisteiini, väliaine poistettiin eri ajankohtina ja solut kiinnitettiin 1% paraformaldehydi 10 min, jota seurasi 70% etanolissa 10 minuutin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 0,1% Triton X fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 10 minuutin ajan, tehtiin läpäiseviksi 0,5% Triton PBS: ssa 10 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä 60 min. Soluja inkuboitiin anti-γ-H2AX (1:2,000, Cell Signaling, Shanghai, Kiina) tai anti-ATM (1:300, Cell Signaling, Shanghai, Kiina) 5% BSA PBS: ssä 4 ° C: ssa yön, pestiin neljä kertaa PBS: ssä, inkuboitiin pimeässä FITC-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (1:2,000 anti-γ-H2AX ja 1:300 anti-ATM) 5% BSA: ssa 1 h, pestiin 4 kertaa PBS: ssä, inkuboidaan pimeässä 1 ug /ml 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) PBS: ssa 5 minuutin ajan, ja asennetaan ja päällystettiin in Fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL , USA). Objektilasit tutkittiin Leica fluoresenssimikroskooppia (Wetzlar, Saksa), kuvat otettiin käyttäen Nikon fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse E800) ja tuodaan Nikon ACT-1 (versio 1.12) ohjelmiston. Kuvat yhdistettiin julkaisuformaattiin Adobe Photoshop CS2-ohjelmiston. Kutakin käsittelyä varten kunnossa, määrä γ-H2AX tai ATM pesäkkeitä määritettiin vähintään 50 solua. Kaikki havainnot todensi vähintään kolmen erillisen kokeen.

5. Western blotting

Virtsarakon syöpä solut hajotettiin 400 ul: ssa 1% SDS hajotuspuskuria (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 4 mM Nappi, 2 mM Na

3Vo

4) 5 minuutin ajan jäillä saada kokosoluliuotteista. Kerätä ydin- proteiinin, yksisolukerrokset pestiin kolme kertaa jääkylmässä hypotonisessa lyysipuskuria (HLB, pH 7,5, 10 mM Tris, 10 mM KCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM MgCI

2), ja solut kerättiin ja siirrettiin homogenisaattoriin (Wheaton Ltd, Millville, NJ, USA) 500 ul: HLB. Solut turvonnut HLB 15 minuuttia, homogenisoitiin ja solutumien kerättiin sentrifugoimalla ja lyysattiin RIPA-puskurissa. Avattavasta Analyysi suoritettiin immuunisakkautusta 500 ug ydin- tai soluliman uute (esikirkastettiin proteiini A /G helmiä) primaarista vasta-ainetta, ja sitten 50-100 ug kokonais tai ydinaseiden lysaattia eroteltiin 7,5-12,5% natriumdodekyylisulfaattia sulfaatti-polyakryyliamidi (SDS-PAGE) geeli, elektro-siirrettiin Hybond ECL-kalvolle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), tukossa PBS: ssä, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja 0,05% Tween-20, inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa, ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineita 1 tunti. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen Phototope-HRP Western Detection System (Cell Signaling, Beverly, MA, USA) ja Kodar kalvo (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) ja skannataan ja kvantitoitiin käyttäen ImageJ (http: //rsbweb.nih gov /ij /). Anti-ATM, anti-fosfo H2AX, anti-fosfo ATM (Ser 1981), anti-IKK, anti-fosfo IKK1 /2, anti-β-aktiini, anti-GAPDH, anti-fosfo-NEMO (NF-kappa- β olennaista modulaattori), anti-NBS1 (Nijimegen rikkoutuminen oireyhtymä 1) vasta-aine, anti-kaspaasi 3 ja 9, anti-fosfo-PARP ja anti-Lok1 vasta-aineet saatiin Cell Signaling.

6. siRNA transfektio

transfektio TCCSUP ja BDEC solut ATM siRNA (50 nmol /l; Invitrogen) suoritettiin käyttäen Oligofectamine reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan protokollaa.

7. In vivo kasvaimen Tutkimuksia

Koe hyväksyttiin eettisen komitean neljännen Military Medical University. Virtsarakon syöpä soluja esi-sekoitettu 01:01 kanssa matrigeelin (Becton Dickinson, Peking, Kiina) ja ihon alle ympättiin (5 x 10

6 solua per sivusto) kylkiin 10-viikkoisen naaras-SCID karvattomia hiiriä (Department Koe-eläinten, neljäs Military Medical University, Xi’an, Shaan’xi, Kiina). Huumehoito aloitettiin 22 päivää tuumorisoluinjektion jälkeen. Hiiret jaettiin satunnaisesti (5 hiirtä /ryhmä) viiteen ryhmään. Vertailuryhmä oli vaarantunut kasvaimia hoidettiin 0,01% DMSO. Hiiriä käsiteltiin suun kautta ruokaa, joka sisälsi genisteiinin (1 g /kg) ja /tai transperitoneal injektio 3 ug /ml HCPT. Prosentuaalinen muutos kasvaimen koon laskettiin vertailuja perusarvosta 22 päivää.

8. Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) B

Nuclear solu-uutteet saatiin kuten edellä on kuvattu, ja 10 ug tumauutetta inkuboitiin puhdistettiin

32P-leimattua NF-KB: n konsensus kaksijuosteista oligonukleotidia ja 0,25 mg /ml poly (dl-dC): 5 x sitomispuskuriin [18]. Näytteet erotettiin 8% polyakryyliamidigeeleillä, geelit kuivattiin, altistettiin röntgenfilmille yön yli -80 ° C: ssa ja kehitettiin käyttäen All-Pro 100 Plus automatisoitu röntgenfilmin prosessori (All-Pro Imaging Corporation, Hicksville, NY, USA).

9. Kvantifiointi ja tilastolliset menetelmät

Ryhmät verrattiin Studentin

t

-testi;

P

values≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. Vaikutukset HCPT ja genisteiiniä elinkelpoisuudesta virtsarakon syövän solujen

virtsarakon soluja käsiteltiin genisteiini ja 3 päivää, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Hoidettaessa erilaisia ​​virtsarakon syöpäsolulinjoista ja BDEC virtsarakon solut genisteiiniä johti annoksesta ja ajasta riippuvia inhibitio soluproliferaatiota, mikä osoitti, että genistein toistettavasti estää niiden kasvun virtsarakon syövän soluissa. Kuitenkin synergistinen vaikutus havaittiin, kun J82, T24, TSGH8301 ja TCCSUP virtsarakon syövän solujen ja BDEC virtsarakon soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla genisteiinin ja HCPT (Fig. 1A). MTT tutkimukset osoittivat, että synergistinen vaikutus genisteiinin ja HCPT oli pitoisuudesta riippuva (Fig. 1 B).

. MTT-analyysi virtsarakon syövän solulinjojen ja BDEC soluja käsiteltiin 10 uM genisteiiniä ja /tai 1 uM HCPT; Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina kontrollista soluja. B. MTT-määritystä TCCSUP ja BDEC soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla HCPT ja /tai genisteiiniä 48 tuntia. C. Cell cycle jakelu TCCSUP tai BDEC käsiteltiin 1 uM HCPT ja /tai 10 uM genisteiini 24 tuntia. D. Apoptosis mitattuna FACS vuonna TCCSUP, ja BDEC käsiteltiin 10 uM genisteiiniä ja /tai 1 uM HCPT. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta; *

P

0,05 ja **

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään. #

P

0,05 ja ##

P

0,01 verrattuna HCPT; @

P

0,05 ja @@ P 0,01 verrattuna genisteiiniksi.

2. Tehostemateriaalit solusyklin pidättäneet HCPT ja genistein

Sekä HCPT (1 m) ja genisteiiniä (10 um) on 24 tunnin aikana havaittiin tilastollisesti merkittävä kyky pidättää solusykliä (Fig. 1 C). Verrattuna ajoneuvon HCPT aiheutti solukierron pysähtymisen sekä S-vaiheen (ohjaus: 57,6%, HCPT: 46,5%, genisteiini: 57,9%, HCPT + genisteiini: 31,1% for TCCSUP solujen ohjaus: 57,2%, HCPT: 43.1 %, genisteiini: 53,6%, HCPT + genisteiini: 29,1% for BDEC soluja) ja G2-M-vaiheessa (ohjaus: 21,5%, HCPT: 30,6%, genisteiini: 22,1%, HCPT + genisteiini: 41,6% for TCCSUP solujen ohjaus : 21,7%, HCPT: 30,3%, genisteiini: 26,7%, HCPT + genisteiini: 36,3% for BDEC soluja). Vaikka genisteiini (10 pm) yksinään ei vaikuttanut solusyklin merkittävästi kontrolleihin verrattuna, lisäämällä genisteiinin että HCPT-käsitelty (1 m) soluissa merkittävästi herkistyneet solut HCPT kautta asiakkuutta G2 /M solusyklin pysähtymiseen.

3. Synergistinen apoptoosin HCPT ja genisteiiniä

käyttäminen FACS mitata apoptoosia, me havaitsimme, että 10 uM genisteiini ja 1 uM HCPT synergistisesti ja annoksesta riippuen indusoi apoptoosin virtsarakon syövän soluissa (Fig. 1 D). Apoptoosin induktio oli annoksesta riippuvainen ja suoraan korreloi solujen kasvun esto (Fig. 1 B, D).

4. NBS1 riippuva ATM aktivointi indusoidaan DNA vaurioita

tulokset kuvattu kohdassa 3.3 todettiin, että genistein voivat toimia synergistisesti HCPT apoptoosin. Kuten edellä on todettu, HCPT voivat aiheuttaa apoptoosin kautta indusoivan kahden katkeamisen (DSB) DNA. Siksi tutkimme onko tämä synergiaa apoptoosin liittyy DSB. TCCSUP-soluja käsiteltiin 1 uM HCPT ja /tai 10 uM genistein 1 tunti, ja koko proteiini kustakin ryhmästä uutettiin ja tehtiin Western-blottaus ja kromosomaalisen histoni proteiinin, γ-H2AX [19]. Western blot osoitti, että HCPT ja genistein voi synergisesti indusoimaan H2AX fosforylaatiota 1 tunnin kuluttua lääkehoitoa, joka osoitti, että nämä lääkkeet voivat aiheuttaa DSB. Lisäksi vahva H2AX fosforylaatio voitaisiin vielä nähdä yhteistyössä hoidetussa ryhmässä 24 tuntia käsittelyn jälkeen verrattuna solujen annettiin yhden huumeita vain, joka osoitti viivytetty DNA-vaurion korjauksen (Fig. 2A). Lisäksi, 1 uM HCPT ja 10 uM genistein synergistisesti aktivoituu fosforylaation ATM Ser 794 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2B). Alueellista jakautumista ATM ja γ-H2AX jälkeen lääkehoitoa määritettiin käyttäen Multipleksoituja immunofluoresenssimäärityksellä (Fig. 2C). Huomattavasti ATM ja γ-H2AX ydin- pesäkkeitä havaittiin TCCSUP soluissa, joita käsiteltiin sekä HCPT ja genisteiiniä 30 min kontrolliin verrattuna, HCPT- ja genisteiini-käsiteltyjä soluja. Lisäksi hoito molempien lääkkeiden lisäsi merkittävästi kolokalisaation ATM ja γ-H2AX solun tumassa. ATM-estäjä, Ku55933, laski merkittävästi ATM pesäkkeet muodostumista, ja siten inhiboivat γ-H2AX /ATM co-localization in HCPT- ja genisteiini-käsitellyt solut (Fig. 2C). Immunosaostuskokeesta määritys suoritettiin tutkimaan, miten ATM fosforyloituu jälkeen HCPT ja genistein hoitoa. Hoito sekä HCPT ja genistein aktivoida ATM ja indusoi vuorovaikutusta ATM /H2AX ja NBS1 /H2AX sisään TCCSUP ja BDEC soluja. NBS1 estäjä, mirin, merkittävästi heikennettyjä HCPT- ja /tai genistein aiheuttama ATM tai NBS1 ja H2AX sitova HCPT- ja genistein käsiteltyjä soluja (Fig. 2D).

. Western blot ja kvantifiointiin H2AX DNA-vaurioiden korjaus esikäsittelyn jälkeen 10 uM genisteiiniä ja /tai 10pM HCPT. HP-1α käytettiin latauskontrollina; Tulokset on ilmaistu suhteessa kontrolliryhmään 0 h. B. Western blot ja kvantifiointi ATM Ser 1981 fosforylaation jälkeen esikäsittely TCCSUP solujen 10 uM genisteiiniä ja /tai 10 uM HCPT 1 tunti. C. Edustavia kuvia ja kvantifiointiin ATM fosforylaation ja H2AX pesäkkeet muodostumiseen 30 min kuluttua hoito TCCSUP solujen 1 uM HCPT ja /tai 10pM genisteiiniä; diskreetti pesäkkeitä ATM autofosforylaation näkyvät mahdollista aluetta kaksinkertaisen säikeen katkoksia. D. tunnistaminen NBS1 riippuvan ATM /H2AX vuorovaikutusta. TCCSUP solut ja BDEC soluja käsiteltiin 1 uM HCPT ja /tai 10 uM genistein 1 tunnin ajan tai ilman NBS1 inhibiittoria, miriniä, immunosaostettiin anti-ATM tai anti-NBS1 vasta-aineita ja immunokompleksien havaittiin Western-blottauksella. ATM pesäkkeitä kasvoivat lineaarisesti annoksen jälkeen 1 h genistein ja HCPT hoitoa. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta; IP: immunosaostus, lev Western-blot. *

P

0,05 ja **

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään. #

P

0,05 ja ##

P

0,01 verrattuna HCPT; @

P

0,05 ja @@ P 0,01 verrattuna genisteiiniksi.

5. ATM esto downregulates NF-kB ja indusoi apoptoosia HCPT- ja genistein käsiteltyjä soluja

tasot aktivoitu, fosforyloidun ATM tutkittiin TCCSUP soluissa. TCCSUP soluissa, joita käsiteltiin 1 uM HCPT 1 h osoitti voimakasta konstitutiivisen ATM-fosforylaation, joka voitiin estää ATM siRNA tai pienimolekyylisiä tietyn ATM-estäjä, KU55933 (Fig. 3A). Immunopresipitaatiomäärityksiä osoittivat, että ATM siRNA vähensi ATM /NEMO sitova TCCSUP soluissa; kuitenkin, HCPT ja genisteiini voivat synergistisesti lisätä ATM /NEMO sitoutumisen (Fig. 3B), joka osoitti, että NEMO on tärkeä rooli tukahduttamiseen HCPT indusoidun NF-KB: n aktivaation. Lisäksi synergistisen lisäämisen ATM /NEMO sitova HCPT- ja genistein käsiteltyjä soluja oli mukana lisääntynyt IκBα lauseke (Fig. 3C) ja vähensi IKK1 /2 fosforylaatiota (Fig. 3d); puolestaan ​​nämä aiheuttama lisääntynyt pilkkominen kaspaasi 3, kaspaasi 9 ja PARP (Fig. 3E).

. Western blot ATM fosforylaation TCCSUP soluissa, joita käsiteltiin 1 uM HCPT 1 h transfektoitu ei-hiljentäminen ohjaus (NSC) siRNA, ATM siRNA tai käsitelty ATM-inhibiittorin, Ku55933 (10 uM, 2 h). B. Immunosaostaminen ja Western blot ATM ja NEMO TCCSUP transfektoiduissa soluissa NSC siRNA tai ATM siRNA, tai käsitelty 10pM Ku55933, 10 uM genisteiiniä ja /tai 1 uM HCPT. IP: immunosaostus, lev Western-blot. C. EMSA blot NF-KB ilmentymisen TCCSUP soluissa käsitelty 10pM genisteiiniä ja /tai 1 uM HCPT läsnäollessa NSC siRNA ja ATM siRNA. D. Western blot NF-KB: n, IKK2, IκBα ilmentyminen ja IKK1 /2-fosforylaation TCCSUP soluissa, joita käsiteltiin 10 uM genisteiiniä ja /tai 1 uM HCPT läsnä NSC siRNA ja ATM siRNA, joka osoittaa, että genisteiini ja HCPT aiheuttaa fosforylaatio of IKK1 /2 ja lisätä IκBα ilmaisun kautta ATM. E. Western blot PARP, kaspaasi 3 ja kaspaasi 9 lohkaisu kokosolulysaateista valmistettiin TCCSUP soluja käsiteltiin 10 um genisteiiniä ja /tai 1 uM HCPT läsnä ATM-siRNA tai Ku55933. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa, ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin kussakin toistossa.

6. Genistein heikennettyjä HCPT aiheuttama NF-KB-aktivaation ja siten synergistisesti aiheuttaman apoptoosin in vivo

Voit tarkistaa synergistinen inhiboiva vaikutus kasvuun genisteiiniä ja HCPT virtsarakon syövän soluissa, päätimme niiden vaikutuksia ksenograftimallia SCID hiiriä käsiteltiin TCCSUP virtsarakon syöpä-solulinjasta. Genistein ja HCPT osoitti synergistisen estävää vaikutusta kasvaimen kasvuun ksenograftin (Fig. 4A). Lisäksi käsitellyt kasvaimet HCPT osoitti NF-KB: n aktivaation, kun taas Genisteiini heikennetty tämän aktivoinnin (Fig. 4B). Vähentynyt aktivointi loppupään molekyylien IKK1 /2, lisääntynyt fosforylaatiota IκBα ja lisääntynyt pilkkominen kaspaasi 3, kaspaasi 9 ja PARP havaittiin käsitellyt kasvaimet genistein ja HCPT (Fig. 4C).

TCCSU virtsarakon syöpäsolun kasvainten annettiin perustaa varten 22 päivää, sitten eläimiin injektoitiin kasvaimen sisään 10 uM genisteiiniä ja /tai 10 uM HCPT päivänä 0 ja 7 hoidon. A. kasvukäyrä TCCSUP virtsarakon syövän ksenografteissa käsitelty genisteiiniä ja /tai HCPT; kasvaimen tilavuus on ilmaistu suhteessa kasvaimen koko alussa hoidon. B. EMSA määritys NF-KB ilmentyminen vierassiirrekokeissa tuumorikudoksissa kustakin ryhmästä. C. Western blot-analyysi fosforyloidun IKK1 /2, IKK2, IκBα ilmentymisen ksenograftin kasvaimen kudokset kustakin ryhmästä.

Keskustelu

Genisteiini on katsottu olevan mahdollisesti paras kemoterapia agentti virtsarakon syöpä, koska se on luonnollinen, turvallinen, mahdollisimman vähän sivuvaikutuksia ja suhteellisen alhaiset kustannukset [20]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että soija isoflavone, joka on läsnä suuria määriä soija tuotteita, voi olla tärkeä rooli esto kasvaimen [21]. On myös osoitettu indusoivan apoptoosin kautta ekspression vähentämiseen 32 kDa: n kaspaasi 3 edeltäjän ja lisäämällä tasot pilkkoa aktiivisen muodon tämän kaspaasin [22]. Zhou et al. raportoitu, että soija isoflavonien ja soija phytochemical tiivisteisiin voi estää kasvua hiiren ja ihmisen virtsarakon solulinjoja in vitro ja in vivo annoksesta riippuvalla tavalla [23]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että synergistinen inhiboiva vaikutus genisteiinin ja kamptotekiinin kohdunkaulan syövän, munasarjasyövän ja hiiren fibroblastisoluja seurausta niiden NF-KB: n translokaatio ja induktio G2 /M-solu- kierron pysähtymisen ja apoptoosin [16].

Onko genisteiini- voi herkistää rakon soluissa kamptotesiiniin hoitoon ei ole tutkittu aikaisemmin. Tässä tutkimuksessa, genisteiini ja HCPT havaittiin estävän kasvua useiden virtsarakon syövän solulinjat ja ensisijaisen BDEC virtsarakon epiteelin solulinja (Fig. 1A). Genisteiini ja HCPT synergistisesti ja annoksesta riippuen esti solujen eloonjäämistä (Fig. 1 B), indusoi G2 /M-solusyklin pysähtymisen (Fig. 1 C) ja apoptoosin (Fig. 1 D) on TCCSUP virtsarakon syövän solulinja, ja BDEC virtsarakon epiteelisoluissa. Mitä tulee taustalla olevan mekanismin, induktio annoksesta riippuvaista synergistinen DNA vaurioita genistein ja HCPT ja niiden estävä vaikutus DNA-vaurion korjaus prosessi havaittiin jopa 24 tuntia, verrattuna genisteiiniä tai HCPT hoito yksinään (Fig. 2A) . Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, molemmat HCPT [24] ja genistein [25] voisi suoraan estää DNA topoisomeraasi I. Hypoteesimme että induktio DNA vaurioita HCPT ja genisteiiniä johtuu niiden esto DNA topoisomeraasi ja siten niiden vaikutukset muodostumiseen replikointi haarukka, joka vaatii lisätutkimuksia.

Sitten tutkimme loppupään signalointi vaikutuksia genistein- ja HCPT aiheuttaman DNA-vaurion selvittää, miten synergistinen induktio ATM fosforylaation liittyy niiden pro-apoptoottinen vaikutus. ATM-kinaasi on keskeinen säädin, joka on aktivoitu DNA-vaurioita [26]. Sen on raportoitu olevan korreloi läheisesti solun apoptoosin useita syöpäsoluja. Zuco et ai. raportoitu, että kamptotesiinijohdannaisen, ST1968, voi indusoida apoptoosia aktivaation kautta ATM [27]. Kawakami et ai. kertoi, että doksorubisiini voi aiheuttaa apoptoosin A549 keuhkoadenokarsinooma soluja ATM aktivointi [28]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yhdistetty hoito genisteiini ja HCPT indusoida synergistisesti ATM Ser 1981 fosforylaatiota (Fig. 2B) paikoissa DNA-vaurioita. Käsitellyissä soluissa genisteiini ja HCPT, inhibition ATM sen spesifinen estäjä, Ku55933, inhiboi fosforylaatiota ATM ja H2AX, ja näin ollen esti niiden co-localization (Fig. 2C).

NBS1 on osoitettu olla avaintekijä MRE11 /RAD50 /NBS1 kompleksi, joka muodostaa heti sen jälkeen, kun DNA: n DSB muodoissa rekrytoida liittyviä proteiineja korjata vaurioitunut DNA sivustoja [29]. ATM ja NBS1 molemmat sitoutuvat H2AX tukirakenne proteiinia kohtiin DNA-vaurioita. Kuten aiemmin on kuvattu [30], huomasimme, että kyky genisteiinin ja HCPT synergistisesti aiheuttaa DNA-vaurioita virtsarakon syövän soluihin ATM aktivointi riippuu NBS1, koska NBS1 estäjä miriniä nimenomaan kumotaan HCPT- ja genistein aiheuttama ATM /H2AX sitova ja NBS1 /H2AX sitova (Fig. 2D). Nämä havainnot osoittivat, että synergistinen DNA vahingollista vaikutusta näiden lääkkeiden johtui niiden estämällä ATM, joka on NBS1 riippuvaista. Fosforylaatio ATM voi aktivoida NF-KB-reitin kautta, NEMO [31], joka johtaa aktivointi ja ilmaus erilaisia ​​pro-proliferatiivisia ja anti-apoptoottiset geenit, mikä suojaa syöpäsolujen apoptoosia. NEMO on ajateltu olevan polyubiquitin sitova alayksikkö, joka rekrytoi IKK on lineaarinen tai K63-sidottu polyubiquitin tukirunkoja, jotka muodostavat seurauksena reseptori-aloitetaan signalointi tapahtumat [32]. Näin ollen hoidon jälkeen DNA myrkyllisiä lääkkeitä, kuten HCPT, DSB indusoi ATM aktivointi, ja alavirran NF-KB-reitin aktivoidaan NEMO (Fig. 3B). Kuitenkin, NF-KB-reitin on osoitettu suojaavan soluja apoptoosia, mikä voi osittain lieventää myrkyllisiä vaikutuksia HCPT. Tutkimuksessamme, genisteiini hoito voisi inaktivoida NF-KB-reitin virtsarakon syövän ja epiteelisolujen. Yhteenvetona, kun HCPT hoito, DNA-vaurio voi aiheuttaa ATM-fosforylaation, joka aktivoi NF-KB-reitin suojaamiseksi soluja apoptoosin. Kuitenkin useita proteaasi kyky genisteiinin auttaa kumota HCPT-indusoidun NF-KB: n aktivaation [33]. Knockdown ATM täysin tukossa kyky HCPT ja genistein sen aktivoituvat NEMO /IKK (Fig. 3d) ja esti lohkaisu kaspaasi 3, kaspaasi 9 ja PARP (Fig. 3E). Tämä osoitti, että ATM on keskeinen rooli HCPT- ja genistein aiheuttama apoptoosin.

Vahvista synergiavaikutuksen HCPT ja genisteiinin, suoritimme in vivo vierassiirrekokeissa. Vuonna ksenografteissa of TCCSUP soluja kasvatettiin SCID-hiirissä, yhdistettynä hoidon HCTP ja genistein synergistisesti inhiboi kasvaimen kasvua (Fig. 4A). Tämä solunsisäinen molekyyli tapahtuma on sopusoinnussa aiemmin löydetty havainnot rakon soluissa. HCPT on osoitettu aktivoivan NF-KB: n, joka on torjua genisteiiniä SCID-hiirissä (Fig. 4B). Samanaikainen käyttö näiden kahden lääkkeen synergistisesti aktivoida ATM ja esti IκBα (Fig. 4C).

Tämä tutkimus osoittaa, että isoflavone, genisteiini, voi merkittävästi vahvistaa vaikutuksia virtsarakon syövän kemoterapia agentti, HCPT sekä vivo ja in vivo. Synergistinen proapoptootti- vaikutuksia näiden kahden lääkkeiden houkuttele DSB ja hidastaa DNA-vaurion korjaus prosessi aktivoimalla ATM /NBS1 /NEMO /IKK-reitin. Kuitenkin joitakin tämän mekanismin vielä selvittämättä. Ensinnäkin, se on edelleen tuntematon, onko synergistinen DSB indusoivasta vaikutuksesta HCPT ja genisteiinin kautta tapahtuvaa häiriötä replikaatiohaarukan ja toposoimerase I. Toiseksi on vielä epäselvää, miten DSB korjausprosessi on viivästynyt, onko tämä on kautta estämällä homologisen rekombinaatio, tai esto ei-homologisen lopussa liittymällä. Kolmanneksi rooli synergistinen inhibitio NBS-1 aktivaatio HCPT ja genisteiiniä epämuodostuma MRN monimutkainen vaatii tutkia edelleen. Lopulta, genisteiini on tunnettu botanic estrogeenin, ja estrogeeni on osoitettu ilmaistaan ​​virtsarakon välimuotoisen epiteelin syöpä, ja se korreloi negatiivisesti kasvaimen [34]. Onko estrogeeni vaikutus genisteiinin korreloi synergistinen kasvua estävä vaikutus on vielä tutkittava tulevaisuudessa.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että genistein voi herkistää virtsarakon syövän solulinjat HCTP, johtaa synergistiseen annoksen -riippuvaisella lisäkasvun estäminen ja solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Genistein ja HCTP aiheuttaa kaksijuosteisen DNA taukoja, joka johtaa synergistiseen aktivointi ATM, heikentää NEMO /NF-KB /IKK /kaspaasi signaalitransduktion, ja siten indusoi apoptoosia sekä in vitro että in vivo. Genisteiini voisi myös kumota HCPT-indusoidun NF-KB-reitin aktivaation, ja siten vaimentaa anti-apoptoottisen vaikutuksen NF-KB-reitin, kuten esitetty kuviossa. 5. Nämä havainnot osoittavat, että vaikka taustalla olevien mekanismien vaativat lisätutkimusta, yhdistetty anto HCTP ja genisteiinin saattaisi olla lupaava lähestymistapa hoitoon ihmisen virtsarakon syöpään.

ATM fosforyloituu sivustoja kaksijuosteisen DNA taukoja NBS1 läsnäollessa H2AX fosforylaation. Aktivoitu ATM kuljetetaan sytoplasmaan, ja aktivoi NEMO, joka fosforyloi IKK1 /2. IKK1 /2 aktivoi ja ubiquitinizes IκBα, mikä IκBα hajoamista. Tämä stimuloi vapautumista ja kuljetusta NF-KB tumaan, jossa se sitoutuu DNA, aktivoi kaspaasi pilkkominen ja käynnistää apoptoosin.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Claudia Buehnemann ( Oxfordin yliopisto, UK) hänen erinomaisesta teknisestä avusta.