Krooninen sairaus

tiivistelmä

interleukiini (IL) -20 on tulehdusta edistävä sytokiini IL-10 perheen. IL-20 liittyy kasvaimen edistämisen patogeneesissä suun kautta, virtsarakon, ja rintasyöpä. Kuitenkin vähän tiedetään rooli IL-20 eturauhassyövässä. Oletamme, että IL-20 edistää kasvua eturauhasen syöpäsoluja. Immunohistokemiallinen värjäys osoitti, että IL-20 ja sen reseptorit ilmennettiin ihmisen PC-3 ja LNCaP eturauhassyövän solulinjoissa ja eturauhasen tuumorikudosta 40 potilasta.

In vitro

, IL-20 voimistunut N-kadheriinin, STAT3, vimentiinistä, fibronektiini, RANKL, katepsiini G, ja katepsiini K ja lisäsi maahanmuutto ja pesäkkeen muodostumista eturauhasen syöpäsolujen kautta aktivoida p38, ERK1 /2 , AKT, ja NF-KB signaaleja PC-3-solut. Tutkimme vaikutukset anti-IL-20 monoklonaalinen vasta-aine 7E eturauhasen kasvaimen kasvua

in vivo

käyttäen SCID hiiren ihonalainen ja sääriluunsisäinen ksenografti- kasvainmuodoista.

In vivo

, 7E vähensi kasvainten kasvua, esti tuumorin välittämä osteolyysiä, ja suojattu luun mineraalitiheys jälkeen sääriluunsisäinen injektion eturauhasen syöpäsoluja. Voimme päätellä, että IL-20 on mukana solujen vaeltamiseen, pesäkkeiden muodostumisen ja kasvainten aiheuttamaa osteolyysiä eturauhassyöpää. Siksi IL-20 voi olla uusi kohde eturauhassyövän hoitamiseksi.

Citation: Hsu YH, Wu CY, Hsing CH, Lai WT, Wu LW, Chang MS (2015) Anti-IL-20 monoklonaalinen vasta-aine estää Eturauhassyöpä Growth and Bone osteolyysiä hiirimalleissa. PLoS ONE 10 (10): e0139871. doi: 10,1371 /journal.pone.0139871

Editor: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, RANSKA

vastaanotettu: toukokuu 12, 2015; Hyväksytty: 16 syyskuu 2015; Julkaistu: 06 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Hsu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia tiede ja teknologia Taiwan (MOST 103-2311-B-006-002 ja MOST 104-2311-B-006-007 -MY2).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin tapaus syöpä ja kuudes syy syövän kuoleman miehillä maailmanlaajuisesti [1]. Suurin osa miehistä, joilla on edennyt eturauhassyöpä on skleroottiset luuetäpesäkkeistä, joka aiheuttaa kovaa kipua ja patologisten luunmurtumien [2, 3]. Invasion of luun osaston syöpäsolujen aiheuttaa epätasapainon osteoklastien ja osteoblastien toimintaa, joka puolestaan ​​katkaisee luun homeostaasin [4]. Nämä syövän aiheuttama luu vasteita suosia selviytymisen ja syöpäsolujen kasvua uudessa ympäristössä. Vaikka eturauhassyövän luuetäpesäkkeistä ovat pääasiassa osteoblastic luonteeltaan, on yhä enemmän todisteita siitä, että osteoklastien välittämää osteolyysiä vaikuttaa myös luun sairastuvuuteen eturauhassyöpäpotilailla luuetäpesäkkeistä [5, 6].

Muut raportoivat, että rinta- ja eturauhassyövän syövät indusoivat osteoklastien aktivaatiota vapauttamalla liukoisia tekijöitä, kuten IL-1, IL-6, ja makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (M-CSF). Useimmat näistä välittäjäaineiden toimia osteoblasteihin ja stroomasolujen, ja edistää osteolyyttisiä vaurioita säätelemällä reseptorin aktivaattori NF-KB-ligandin (RANKL), joka on mahdollinen mekanismi selittää lisääntyneen luun resorption luumetastaasipotilailla [6, 7]. RANKL sitoutuu sen reseptoriin (RANK) on solukalvon osteoklastien, mikä johtaa erilaistumiseen ja kypsymiseen osteoklastien [8]. Katepsiini K, kysteiiniproteaasi erittää osteoklastien ja eturauhasen syöpäsolujen, hajoaa soluväliaineen aikana luun resorptiota [9]. Katepsiini G, kemoattraktantti osteoklastien esiasteiden, joka pystyy käsittelemään RANKL: in liukoista muotoa (sRANKL), joka edistää osteoklastien aktivoitumisen [10, 11]. Esto katepsiini G: n ja katepsiini K vähentää merkittävästi kasvainten aiheuttamaa osteolyysiä, mikä viittaa siihen, että katepsiini K ja katepsiini G ovat ratkaisevia mikroympäristössä syövän aiheuttaman osteolyyttisiä vaurioita [10, 12].

Tulehdus on kriittisesti liittyvä kasvain etenemistä. Se vaikuttaa kasvaimen kehittymisen molekyylitasolla säätelemällä kasvain mikroympäristön ja säätelevät tasapainoa sytokiinien, kemokiinien ja transkriptiotekijöitä [13, 14]. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on kriittinen syövän etäpesäkkeiden. EMT muuttaa käyttäytymistä syöpäsolujen ja saa ne hyökätä ympäröivään strooman, johtaa niiden intravasation, levittäminen ja kolonisaatio kaukaisiin kohtiin [15, 16]. Aikana EMT, kasvainsolut, jotka ovat epiteelin kaltaisia ​​soluja, hankkia mesenkymaaliset ominaisuudet, ja menetys epiteelin markkerin E-kadheriinin johtaa kasvuun mesenkymaaliset merkkiaineiden N-kadheriinin, fibronektiiniä, ja vimentiinin [17]. Useita EMT indusoijat, kuten Snail ja Twist, ovat transkriptiotekijöitä, jotka tukahduttavat E-kadheriinin ilmentymisen [16, 18]. Muut tutkimukset [19, 20] ovat raportoineet, että syöpäsolut edistää EMT aktivoimalla STAT3-signalointireitin.

IL-20 on jäsen IL-10 perheen, joka sisältää IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 ja IL-26 [21, 22]. Se ilmaisee kahden tyyppisiä heterodimeerin reseptorikompleksin: IL-20R1 /IL-20R2 ja IL-22R1 /IL-20R2 [23]. IL-20 on mukana useissa tulehdussairaudet, kuten nivelreuma [24], ateroskleroosi [25], psoriaasi [26, 27], osteoporoosi [28], suusyöpä [29], ja rintasyövän [30].

Eturauhassyöpä on monimutkainen sairaus, jossa etäpesäkkeitä luuhun on syy sairastuvuutta ja voi edeltää etäpesäkkeitä muita elintärkeitä elimiä. Olemme aiemmin [28, 30] osoitti, että IL-20 edistää paitsi rintasyöpäkohteisiin proliferaatio ja migraatio, mutta myös moduloi osteoklastien säätelemällä RANKL ja RANK. Anti-IL-20 monoklonaalista vasta-ainetta (mAb) 7E laski osteolyyttiset leesiot hiirimalleissa rintasyövän ja suojattujen poistettu munasarjat hiiriä osteoporoottisten luukatoa, jotka molemmat tukevat käsitystä, että IL-20 on kriittinen, jotka säätelevät kasvaimen-välitteisen osteolyysiä. Oletamme, että IL-20 edistää kasvua eturauhasen syöpäsoluja. Siksi tutkimme IL-20 ja sen biologisen funktion syöpäsolujen ja arvioidaan terapeuttista potentiaalia 7E vierassiirrekokeissa eturauhassyövän hiiri malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Immunohistokemia

Parafiini upotettujen kudosleikkeiden 40 ihmisen eturauhassyövän näytteet saatiin kaupalliselta eturauhassyöpäkudoksen array (SuperBioChips Laboratories, Seoul, Korea), ja niitä käytettiin immunohistokemiallista (IHC) värjäämällä anti-IL-20 (7E ), anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, tai anti-IL-22R1 mAb (R R 200) tai korkea-ilmentymisen (H ≥ 200). Immunosytokemiallinen värjäys IL-20 ja sen reseptorien PC-3-soluissa tehtiin käyttämällä samaa protokollaa kuin edellä on kuvattu.

Soluviljely

Eturauhassyöpä solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC-3 ja LNCaP, pidettiin RPMI-1640, jossa on 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Life Technologies, Rockville, MD), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä . Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Soluproliferaatiomääritys

PC-3-soluja (3 x 10

4) viljeltiin yön yli ja sitten altistetaan ihmisen (h) IL-20 (200 ng /ml) 72 tunnin ajan väliaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää. Vahvistaa spesifinen aktiivisuus IL-20, 7E (2 ug /ml) lisättiin viljelmään järjestelmän, joko yksin tai yhdessä IL-20 on 10: 1 (7E: IL-20) pitoisuus suhde. Sitten soluja inkuboitiin 1 mg /ml metyylitiatsol tetratsolium (MTT) (Sigma-Aldrich), 3 tunnin ajan, ja MTT-formatsaanikiteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma-Aldrich). Absorbanssi mitattiin 550 nm: ssä.

Cell migraatiokokeessa

Solun muuttoliikettä analysoitiin käyttämällä modifioitua Boyden kammio polykarbonaatti suodatin 8 um huokosia (Nucleopore, Cabin John, MD). Ylempi Kuopat ladattu PC-3-solut (5 x 10

4). Alakammioissa täytettiin hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG RPMI-1640, joka sisälsi 1 % FBS: ää. RPMI-1640 ja 1% FBS: ää, käytettiin negatiivisena kontrollina. Solujen annettiin kulkeutua 8 tuntia, ja sitten ne värjättiin ja laskettiin. Koe tehtiin kolme kertaa käyttäen neljänä kaivoihin.

Reaaliaikainen migraatiokokeessa

PC-3-solut ympättiin 5 x 10

4 solua /ml 6-kuopan astioihin ja annettiin kiinnittyä 18 tunnin ajan. Sitten solut altistettiin alustassa, joka sisälsi hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG. Solumigraation kinetiikan rekisteröitiin käyttäen fluoresoivaa solua analysaattori (heinäkuu Smart; Montreal Biotechnologies Inc. (MBI), Dorval, Montreal, Kanada) 18 tuntia ja sitten analysoitiin ImageJ Software (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Soft agar pesäkkeitä muodostavien määrityksessä

Solut näytteille eksponentiaalinen kasvu suspendoitiin täydelliseen kasvualustaan, joka sisälsi 0,35% Bacto-agar (A-6013 Type 1 Low EEO, Sigma-Aldrich) ja päällekkäin 0,5% agaroosigeelissä 30-mm astiat (1 x 10

4 solua /malja). Alustassa, joka sisälsi IL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG päällystettiin päälle agar. Astiat pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa (5% CO

2, 95% O

2) kolmen viikon ajan. Tänä aikana, väliaine vaihdettiin joka 2. päivä. Näkyvissä olevien pesäkkeiden ( 50 pm) laskettiin mikroskoopilla. Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) B

analysoimiseksi IL-20 ja sen reseptorit, kokonais-RNA: PC-3 ja LNCaP-soluja uutettiin käyttäen reagenssia (Trizol; Invitrogen, Carlsbad, CA), ja sitten kokonais-RNA tehtiin käänteistranskriptio (Clontech, Palo Alto, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Monistettu malli havaittiin käyttämällä SYBR Green, jossa on reaaliaikainen PCR-järjestelmää (StepOnePlus; Applied Biosystems), jossa geeni-alukkeita. Glyseraldehydi fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina. Ekspression tutkimiseksi E-kadheriinin, N-kadheriinin, STAT3, vimentiinin, fibronektiini, RANKL, katepsiini G, ja katepsiini K, PC-3-soluja inkuboitiin hIL-20 (200 ng /ml) 2-6 tunnin ajan. Ilmentymistasojen Näiden geenien analysoitiin käyttämällä SYBR Green (Applied Biosystems), kuten vuorovaikutus aineena. Kvantifiointi analyysi mRNA normalisoitui ihmisen GAPDH kuin taloudenhoito geeni. Suhteellinen kerrannaisina muutoksen mRNA ilmentyminen määritettiin laskemalla 2

-ΔΔCt.

Western blotting

PC-3-solut (2 x 10

5) stimuloitiin hIL- 20 (200 ng /ml) (R Sigma-Aldrich) käytettiin estämään proteaasiaktiivisuutta katepsiini G. PC-3-soluja esi-inkuboitiin 1 uM TPCK 1 tunnin ajan ja sitten se käsiteltiin jossa hIL-20 vielä 72 tuntia. TPCK liuotettiin 100% etanolia (EtOH), ja sitten laimennettiin elatusaineeseen. Vehikkelikontrolli oli 0,0175% EtOH viljelyväliaineessa. Taso sRANKL lopullisessa viljelty väliaine analysoitiin ELISA.

Eturauhassyöpä PC-3-laakeri kasvainmuoto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin protokollien mukaisesti perustuu Taiwan National Institutes of Health (Taipei, Taiwan) vaatimukset ja ohjeet hoitoon ja käyttöön koe-eläimillä. Tutkimuksen menettelyjä hyväksynyt eläinten eettisen komitean National Cheng Kung yliopisto. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimystä ja vähentää käytettyjen eläinten määrää. Kahdeksan viikon ikäisiä urospuolisia severe combined immuunivajavaisiin (SCID) hiiriä käytettiin kaikissa kokeissa. Lyhyesti, hiiret nukutettiin käyttämällä intraperitoneaalisesti (i.p.) pentobarbitaalia (50 mg /kg) ja sitten injektoitiin buprenorfiinia (2 mg /kg, i.p.) kirurgiseen kivunlievitystä. Vasemman utarerasvaa tyynyn kuhunkin hiireen injektoidaan subkutaanisesti PC-3-soluja (1 x 10

6). Onnistumisprosentti ihonalainen (s.c.) kasvaimen istutuksen oli 100%. Sitten hiiret satunnaistettiin 3 ryhmään (n = 4 kussakin ryhmässä), ja käsiteltiin fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), 7E (10 mg /kg, sc), tai hiiren immunoglobuliini G (mIgG; 10 mg /kg ; sc) kolme kertaa viikossa ajaksi hoito-ohjelman. Vasta-aine injektoitiin (s.c.) kehään kasvavan kasvaimen tuumoria kantavissa SCID-hiirissä. Terveet verrokit injektoitu kasvainsoluja. Tuumorin koko mitattiin paksuus kolmessa kohtisuorassa mitat ja lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa: tuumorin koko = 0,5 x (pituus x leveys x syvyys). Neljäkymmentä päivää sen jälkeen, kun kasvainsoluja oli injektoitu, hiiret tapettiin käyttämällä CO

2, ja kasvainkudoksen kerättiin ja punnittiin. Analysoida ekspressiotasojen IL-20 ja katepsiini G, kasvainkudos eristettiin 4 hiirtä kussakin ryhmässä kerättiin, ja kokonais-RNA uutettiin lisäanalyysiä varten.

sääriluunsisäinen injektio PC-3 SCID-hiiriin

Kahdeksan viikon ikäisiä urospuolisia SCID-hiiret nukutettiin käyttämällä injektion pentobarbitaalilla (50 mg /kg) ja sen jälkeen buprenorfiinia (2 mg /kg, ip) kirurgiseen kivunlievitystä. Jokainen sai mediaalinen parapatellaarisella viilto ja neula sijoitettiin ydinkanava sääriluun. PC-3-solut, pitoisuudella 2 x 10

5/100 ui, olivat hitaasti ruiskutetaan sääriluu ja viilto suljettiin 5-0 kromihapon ompeleita. Leikkauksen jälkeisen analgesian, buprenorfiinia (2 mg /kg, i.p.) injektoitiin kerran päivässä 3 päivää leikkauksen jälkeen. Onnistumisprosentti sääriluunsisäinen kasvaimen istutuksen oli 100%. Sitten hiiret satunnaistettiin kolmeen ryhmään (n = 5 kussakin ryhmässä) ja injektoitiin vehikkeliä (PBS, ip), mIgG (10 mg /kg, ip) tai 7E (10 mg /kg, ip) kolme kertaa viikossa viikko. Seitsemän viikon kuluttua hoitojen alkoi, hiiret tapettiin käyttämällä CO

2, ja niiden sääriluumetafyysien analysoitiin

in vivo

mikro-tietokonetomografiaa (mikro-CT), jossa on korkean resoluution, pieniannoksisen X-ray skanneri. Luun mineraalitiheys (BMD) analysoitiin 50 peräkkäisen viipaleiksi. Tulokset laskettiin prosenttiosuutena verrattuna arvoja terveen ohjaus.

Tilastollinen

Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) nonparametric Kruskal-Wallisin testiä käytettiin vertaamaan tietoja ryhmien välillä. Post hoc vertailut tehtiin käyttäen Dunnin monivertailukoetta. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskihajonta (SD). Merkitys asetettiin

P

0.05.

Tulokset

IL-20 ja sen reseptorit potilailla, joilla on eturauhasen syöpä

Neljäkymmentä eturauhasen adenokarsinooma kudosnäytteistä (vaihe II, n = 8; vaiheessa III, n = 32) oli IHC värjättiin anti-IL-20 mAb: itä. Värjäytymisvoimakkuus oli korkea-ilmentyminen 22 näytteissä (kuvio 1A) ja matala-ilmentymisen 18 näytettä. Sen tutkimiseksi, eturauhassyövän solu on kohdesolun IL-20, käytimme IHC värjäys analysoida ekspressiotasoja IL-20: n reseptorien (IL-20R1, IL-20R2, ja IL-22R1) eturauhasen adenokarsinooma kudosnäytteitä 40 potilailla. Eturauhasen syöpä solut kaikki positiivisesti värjättiin anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, ja anti-IL-22R1 mAb: itä (kuvio 1B, 1C ja 1D). Intensiteetti IHC värjäytymisen eturauhassyövän kudosten oli heterogeeninen (kuvio 1F). Anti-IL-20 ja anti-IL-20R1-mAb: t ovat erittäin värjättiin kasvainsoluja, mutta anti-IL-20R2 ja anti-IL-22R1 mAb: t eivät ole (kuvio 1A, 1B, 1C ja 1D, nuolet) edustavilla karsinooma kudoksiin. Ekspression IL-20R1, IL-20R2, ja IL-22R1 oli suuri 37, 7, ja 10 näytettä, vastaavasti.

(AE) Kirurgisesti koepala eturauhasen adenokarsinooma kudosnäytteistä (vaihe II, n = 8 , vaiheessa III, n = 32), 40 potilasta saada kaupallisesta eturauhassyöpäkudoksen array. IHC värjäys anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, ja anti-IL-22R1 mAb: t osoittivat, että IL-20 ja sen reseptorit (IL-20R1, IL-20R2, ja IL-22R1) värjättiin. Hiiren IgG1 (mlgG1) isotyyppi oli negatiivinen kontrolli. Nuolet osoittavat eturauhasen syöpäsoluja. Suurennus: 200 x. Tiedot edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta samoin tuloksin. (F) kvantitointi värjäytymisen intensiteetti anti-IL-20, anti-IL-20R1, anti-IL-20R2, ja anti-IL-22R1 mAb: t 40 ihmisen eturauhassyövän yksilöitä. IHC, immunohistokemiallinen värjäys; mAb, monoklonaalinen vasta-aine; mIgG, hiiri immunoglobuliinikirjastoista.

Solujen lisääntyminen estyi 7E saaneilla PC-3-solujen

selkeyttämiseksi roolia IL-20 patogeneesissä eturauhassyövän, ensin tutkittu onko IL-20 ja sen reseptorit (IL-20R1, IL-20R2, ja IL-22R1) ilmennettiin eturauhassyövän solulinjoissa. RT-qPCR ja IHC värjäys osoitti, että IL-20 ja sen reseptorit kaikki ilmaistuna PC-3-soluissa (kuvio 2A ja 2B), ja LNCaP-soluissa (kuvio 2A). Ensimmäinen vaihe syövän etenemistä on ajateltu olevan seurausta geneettinen muutos, joka johtaa epänormaalin proliferaation yhden solun. Sen määrittämiseksi, onko IL-20 edistää PC-3-solujen proliferaatiota, käytimme MTT-määritys, joka osoitti, että IL-20 ei merkittävästi edistää soluproliferaatiota PC-3-soluja, mutta että solujen lisääntymistä annoksesta riippuvalla inhiboitui 7E saaneilla PC-3-soluissa (kuvio 2C ja 2D). Syövän etenemistä mukana solujen vaeltamiseen ja etäpesäkkeiden kaukaisiin elimiin. Reaaliaikainen migraatiokokeessa osoitti, että solujen vaeltamiseen lisääntyi IL-20-käsitelty PC-3-solujen verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin, jonka aktiivisuus oli heikennetty 7E (kuvio 3A ja 3B). Lisäksi Boyden kammio testi osoitti samanlaisia ​​tuloksia (kuvio 3C ja 3D).

(A) RT-qPCR osoitti, että IL-20 ja sen reseptorit ilmaistiin eturauhassyöpä PC-3 ja LNCaP. Tiedot edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta samoin tuloksin. (B) IHC osoitti, että IL-20 ja sen reseptorit ilmaistiin eturauhassyöpä PC-3-solut. Tiedot edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta samoin tuloksin. (C) MTT-määritys osoitti, että solujen lisääntyminen estyi 7E-käsitelty PC-3-soluja. Pelkästään väliainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. 7E on käytetty inhiboimaan hIL-20. * P 0,05 versus käsittelemättömien kontrollien, #p 0,05 vs. hIL-20 ryhmä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) MTT-määritys osoitti, että solujen lisääntymistä annoksesta riippuvalla inhiboitui 7E-käsitelty PC-3-soluja. * P 0,05, ** p 0,01 vs. mIgG valvontaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. RT-qPCR, reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio; MTT, metyylitiatsol tetratsoliumilla; 7E, anti-IL-20 monoklonaalista vasta-ainetta; hIL-20, ihmisen interleukiini-20.

(A-B) Cell muuttoliike arvioitiin käyttäen reaaliaikaista migraatiokokeessa. PC-3-soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG. Solumigraation kinetiikan tallennettiin käyttämällä Smart fluoresoivaa solua analysaattori 18 tuntia. (A) edustaja nopeutus kuvien seuranta liikkeen matkan PC-3-solut esitetään kullekin ryhmälle. Liikkeen etäisyys jokainen solu on esitetty eri väreillä (count = 7 solua). (B) kvantisointi liikkeen etäisyys (pm) PC-3-solut (count = 7 solua). Hiiren IgG oli negatiivinen valvonta 7E. * P 0,05 versus käsittelemättömien kontrollien, #p 0,05 vs. hIL-20 ryhmä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, jokainen tehdään neljänä kappaleena. (C-D) Cell muuttoliike tutkittiin myös käyttämällä modifioitua Boyden kammion määritystä. Ylempi Kuopat ladattu 5 x 10

4 PC-3-solut. Alakammioissa täytettiin hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG RPMI-1640, joka sisälsi 1 % FBS: ää. RPMI-1640 ja 1% FBS: ää, käytettiin negatiivisena kontrollina. Solujen annettiin kulkeutua 8 tuntia. (C) edustaja Giemsa-värjäys kuvat näkyvät kullekin ryhmälle. (D) kvantitointi siirtynyt solua kuoppaa kohti. ** P 0,01 versus käsittelemättömien kontrollien. ## P 0,01 vs. hIL-20 ryhmä. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kussakin tehdään neljänä kappaleena.

Pesäkkeenmuodostusta edistettiin IL-20-käsitelty PC-3-solujen

Ensimmäinen vaihe paikallinen invaasio eturauhasen syöpä on kasvu pesäkkeiden muodostumista syöpäsoluja. Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen testi osoitti, että kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumisen oli merkitsevästi korkeampi IL-20-käsitelty PC-3-solujen kuin käsittelemättömien kontrollien, jonka aktiivisuus oli heikennetty 7E (kuvio 4A ja 4B).

PC-3-soluja (1 x 10

4 /kuoppa) inkuboitiin hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG varten 3 viikkoa. Viljelyväliaine vaihdettiin joka 2 päivä. (A) edustaja kuvat näkyvät kullekin ryhmälle. (B) Pesäkkeenmuodostusta oli merkitsevästi korkeampi IL-20-käsitelty PC-3-soluja. 7E (2 ug /ml) käytettiin inhiboimaan IL-20. * P 0,05, ** p 0,01 versus käsittelemättömien kontrollien, ## p 0,01 vs. hIL-20 ryhmä. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, jokainen tehdään kolmena kappaleena.

Signaalitransduktiota aiheutettiin IL-20-käsitelty PC-3-solujen

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon ( EMT) on keskeistä kasvainprogression ja etäpesäkkeitä. Sen tutkimiseksi, IL-20 on mukana eturauhasen tuumorimetastaasissa kautta EMT, RT-qPCR käytettiin ekspression analysoimiseksi epiteelin merkki E-kadheriinin, N-kadheriinin, STAT3, vimentiinistä ja mesenkymaaliset merkki fibronektiinin PC-3-solujen inkuboitiin IL-20. Se osoitti, että E-kadheriinin oli vaimentua (kuvio 5A), ja N-kadheriinin, STAT3, vimentiinin, ja fibronektiini oli merkittävästi voimistunut (kuvio 5B, 5C, 5D ja 5E), kun taas 7E-käsitellyissä soluissa, tämä säätelyä oli heikennettyjä. Täsmennetään mahdollinen mekanismi välillä IL-20 ja syövän etenemiseen, signaali molekyylit ERK1 /2, AKT, NF-KB, ja p38 arvioitiin ja havaittiin fosforyloitua IL-20-käsitelty PC-3-solut (kuvio 5F) .

(AE) PC-3-soluja käsiteltiin hIL-20 (200 ng /ml) ja osoitetut ajat, ja ekspressiotasot E-kadheriinin, N-kadheriinin, STAT3, vimentiinin, ja fibronektiini analysoitiin RT-qPCR kanssa alukkeita. * P 0,05, ** p 0,01 versus 0 tunnin valvonta. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta, joista kukin tehdään kolmena kappaleena. (F) PC-3-soluja (2 x 10

5) inkuboitiin hIL-20 (200 ng /ml) osoitetun ajanjaksoja, ja sen jälkeen solun lysaatit kerättiin ja analysoitiin käyttäen immunoblottaus, joilla on erityisiä vasta-aineita fosfo- p38, fosfori-ERK1 /2, fosfori-AKT, ja fosfori-NF-KB. p-aktiini-vasta-ainetta käytettiin sisäisenä kontrollina. Kvantifiointi bändejä tehtiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. * P 0,05 versus 0-min valvontaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

RANKL, katepsiini G, ja katepsiini K selostukset ja sRANKL proteiinin tuotanto indusoitiin IL-20-käsitelty PC-3-solujen

Sen testaamiseksi, onko IL-20 säätelee katepsiinit ja RANKL eturauhassyövän, PC-3-soluja käsiteltiin IL-20: ssa 6 tuntia. RT-qPCR Geenitranskriptikuvion analyysi osoitti voimistunut RANKL, katepsiini G ja katepsiini K ilmaisun IL-20-käsitelty PC-3-solut, joiden aktiivisuus neutraloitiin 7E (kuvio 6A, 6B ja 6C). Lisäksi ELISA-määritystä osoittivat merkittävää (p 0,05) kasvu sRANKL ilmentymisen IL-20-käsitelty PC-3-soluissa (kuvio 6D). Siksi me hypoteesi, että IL-20-käsitelty PC-3-solut tuottavat katepsiini G: n ja sen jälkeen hajota RANKL tuottaa sRANKL, mikä edelleen edistää osteoklastien aktivoitumisen luun mikroympäristössä. Sen varmistamiseksi, että lohkaisu RANKL oli katepsiini G:-riippuvainen, käytimme tietyn katepsiini G: n estäjä (TPCK, 1 uM) ja estää proteaasiaktiivisuutta katepsiini G, joka on vahvistettu hypoteesia (kuvio 6E).

(AC) PC-3-soluja käsiteltiin hIL-20 (200 ng /ml), 7E (2 ug /ml), mIgG (2 ug /ml), hIL-20 plus 7E, tai hIL-20 plus mIgG varten 6 tuntia, ja ekspressiotasot RANKL, katepsiini G, ja katepsiini K: analysoitiin RT-qPCR erityisiä alukkeita. * P 0,05, ** p 0,01 vs. käsittelemätön kontrolli, #p 0,05 vs. hIL-20 ryhmä. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta, joista kukin tehdään kolmena kappaleena. (D) PC-3-soluja inkuboitiin hIL-20 (100, 200, tai 400 ng /ml) 48 tunnin ajan, elatusaine kerättiin ja sitten pitoisuus sRANKL määritettiin käyttäen ELISA: lla. * P 0,05 versus käsittelemättömien kontrollien. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta, joista kukin tehdään kolmena kappaleena. (E) PC-3-soluja esi-inkuboitiin 1 uM katepsiini G-spesifinen estäjä (TPCK) 1 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten hIL-20 (400 ng /ml) 72 tunnin ajan. Vehikkelikontrolli oli 0,0175% EtOH viljelyväliaineessa. Pitoisuus sRANKL määritettiin käyttäen ELISA: lla. * P 0,05 versus käsittelemättömien kontrollien, #p 0,05 vs. hIL-20 plus EtOH vehikkelikontrollit. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, kussakin tehdään kolmena kappaleena. RT-qPCR, reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio; sRANKL, liukoisen RANKL; EtOH, etanoli.

Kasvaimen kasvu estyi 7E saaneilla PC-3 eturauhassyöpävieraslajisiirteissä

Koska meillä

in vitro

tuloksiin, me lisätutkimuksia vaikutukset 7E eturauhasen kasvaimen kasvua

in vivo

meidän hiiren ksenograftimallissa. PC-3-solua injektoitiin (sc) SCID-hiiret, joita käsiteltiin sitten PBS: llä, mIgG (10 mg /kg, sc) tai 7E (10 mg /kg, sc) injektion 3 kertaa viikossa, ja kasvaimen kasvu oli mitattuna 40 päivää. Oli vähemmän kasvua 7E-käsitellyssä ryhmässä kuin mIgG- ja PBS-käsiteltyjen kontrolliryhmiin (kuvio 7A). 40 päivän jälkeen hiiret tapettiin ja niiden kasvaimet punnittiin. Kasvaimia 7E hoidetussa ryhmässä punnitaan vähemmän kuin mIgG- ja PBS-käsiteltyjen ryhmien (kuvio 7B). Kasvainkudoksen kustakin ryhmästä eristettiin sitten purkaa RNA. RT-qPCR osoitti, että IL-20 ilmentyminen 7E-käsitellyssä ryhmässä oli merkitsevästi alempi kuin mIgG- ja PBS-käsiteltyjen kontrolliryhmiin (kuvio 7C). Lisäksi, katepsiini G: n ilmentymistä vaimentua siinä 7E-käsitellyssä ryhmässä (kuvio 7D).

(A-D) PC-3-solua injektoitiin (s.c.) osaksi utarerasvaa SCID-hiirillä. Yksi päivä myöhemmin hiiriin injektoitiin (s.c.) PBS: llä, 7E (10 mg /kg), tai mIgG (10 mg /kg; n = 4 ryhmää kohti) kolme kertaa viikossa. (A) Kasvaimen koko mitattiin käyttäen paksuus. (B) Hiiret tapettiin 40 päivää sen jälkeen, kun ne oli injektoitu PC-3-soluja, ja niiden kasvaimet kerättiin ja punnittiin. (C-D) Kasvaimen kudosnäytteitä kustakin ryhmästä (n = 4) eristettiin lopussa kokeen. Ilmaisu IL-20 ja katepsiini G: kasvainkudoksessa analysoitiin RT-qPCR kanssa alukkeita. * P 0,05, ** p 0,01 vs. mIgG valvontaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta samoin tuloksin. (E-F) 7E käsittely suojattu luukato ja vähentynyt luun tiheys laskumäärä sääriluunsisäinen PC-3-pistetään osteolyyttinen hiirillä. PC-3-soluja (2 x 10

5/100 ui) injektoitiin hitaasti luuytimeen ontelon sääriluun. -Hiiriin ruiskutettiin i.p. PBS: llä, 7E (10 mg /kg), tai mIgG (10 mg /kg) (n = 5 kussakin ryhmässä) kolme kertaa viikossa. Terveet verrokit injektoitu syöpäsoluja. (E) Tibiaalinen metaphysis otettiin terveiltä ohjaus hiirillä ja hiiriä PC-3 luukadossa. Edustavia mikro-CT tarkistuksia on esitetty kullekin ryhmälle. (F) sääriluun BMD mitattiin ja tulokset esitetään prosentteina suhteessa terveisiin arvoihin. * P 0,05 vs. mIgG valvontaa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta samoin tuloksin. BMD, luun mineraalitiheys; mikro-CT, mikro-tietokonetomografia.

7E inhiboi kasvaimen aiheuttamaa osteolyysiä PC-3 eturauhassyöpävieraslajisiirteissä

etenemisen eturauhasen syöpä, monet potilaat lopulta kehittää luumetastaasipotilailla . Perustuu

in vitro

data, me arveltu, että IL-20 voisi edistää osteoklastigeneesin säätelemällä sRANKL ja katepsiini G: ilmaus eturauhassyöpäsoluissa. Siksi me pohti estämällä IL-20 vähentäisi eturauhassyövän aiheuttamaa osteolyysiä

in vivo

. PC-3-solut injisoitiin luuytimen ontelon koipiluut SCID-hiirissä, jotka sitten injektoitiin (i.p.) PBS: llä, mIgG tai 7E kolme kertaa viikossa seuraavien 7 viikkoa. Mikro-TT, käytettiin tutkittaessa vaikutusta 7E eturauhassyövän luukadossa, osoittivat, että PC-3 syövän luukadossa estyi että 7E-käsitellyn ryhmän verrattuna mIgG- ja PBS-käsiteltyjen ryhmien (kuvio 7E) . BMD oli merkitsevästi pienempi mIgG- ja PBS-käsiteltyjen kontrolliryhmien kuin terveet kontrolliryhmän;