Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Kromosominen epävakaus (CIN) on merkittävä voima Mikrosatelliittimarkkerien vakaa (MSS) satunnaista CRC. CIN kasvaimet on ominaista suuri määrä somaattisten kromosomaalisen kopioluvun poikkeamia (SCNA), jotka usein vaikuttavat onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Päätavoitteena Tämän työn tavoitteena oli tunnistaa uusia ehdokas CRC kuljettaja geenit vaikuttavat toistuvat ja polttovälin SCNA. Korkean resoluution genominlaajuisten vertaileva genomin hybridisaation (CGH) paneelit käytettiin vertaamaan kasvain ja normaali DNA 53 satunnaista CRC tapauksissa. Konteksti korjattu yhteinen poikkeama (COCA) analyysin ja yksilölliset algoritmit tunnistettu 64 poistot ja 32 voitot polttoväli minimaalinen yhteisiä alueita (FMCR) korkealla taajuudella ( 10%). Vertailu näiden FMCR julkaistujen genomista profiileja CRC, paljastui yhteisiä päällekkäisyys (42,2% poistoista ja 34,4% kopio voitot). Pathway analyysi osoitti, että apoptoosin ja p53 signalointireitteihin olivat yleisesti vaikutti poistettu FMCR, ja MAPK ja kaliumkanavan väylät voitot FMCR. Ehdokas tuumorisuppressorigeeneille in poistetaan FMCR mukana

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 ja NFKBIA

ja ehdokas onkogeenien saavuttanut FMCR mukana

PRDM16

,

TNS1, RPA3 ja KCNMA1

. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus vahvistaa joitakin aiemmin havaittuja poikkeamia MSS CRC ja tarjoaa

in silico

todisteiden avulla uusia Hakijan geenejä.

Citation: Burghel GJ, Lin WY, Whitehouse H, Brock I , Hammond D, Bury J, et al. (2013) tunnistaminen Hakijan geenien yhteiseen Focal kromosomimuutokset Mikrosatelliittimarkkerien Vakaa peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (12): e83859. doi: 10,1371 /journal.pone.0083859

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 08 marraskuu 2013; Julkaistu: 18 joulukuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Sheffieldin yliopisto (Lääketieteellinen tiedekunta hammaslääketieteen ja terveys) PhD stipendi, ja tutkimus ja innovaatiopalkinnon, ja Yorkshire Cancer Research PhD stipendi (S003PHD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä miehillä ja toiseksi naisilla [1]. Yli 1 miljoonaa uutta CRC tapausta diagnosoidaan vuosittain ja ~ 600000 liittyvien kuolemien arvioitiin maailmanlaajuisesti vuonna 2008, jolloin CRC 3

rd korkein syy syövän liittyvän kuoleman molempia sukupuolia [1,2]. Kromosominen epävakaus (CIN) on yleisin muoto genomista epävakautta CRC ja se liittyy 65-85% satunnaista CRC tapauksia [3-6]. Kasvaimet, jotka kehittävät läpi CIN reitin on ominaista usein numeerinen ja /tai rakenteellisia voittoja ja tappioita kromosomisegmentit tai kokonaisia ​​kromosomeja on huomattavasti lisääntynyt määrä verrattuna normaaleihin soluihin [7]. CIN kasvaimet tiedetään liittyvän

TP53

mutaatioita ja alhainen mikrosatelliitti epävakaus (MSI) [8,9]. CIN uskotaan ajaa CRC kehittämiseen kopiomäärä voitto onkogeenien kuten

MYC

ja poistamista tuumorisuppressorigeeneille kuten

Smad4

ja

TP53

[3,9 -13]. Tätä näkemystä tukee yhdistyksen välillä todetut kopiomäärä poikkeavuuksia syöpään liittyvien geenien ja niiden ekspressiotasot CRC näytteissä [14-16].

Vaikka suurin osa kromosomipoikkeavuuksien syntyy satunnaisella tavalla, jotkut toistuvat ja esiintyy yleisesti muiden syöpien ohella CRC [13,16,17]. Tihennetystä joidenkin somaattisten kopioluvun poikkeamia (SCNA) on todennäköisesti seurausta kloonivalintamenetelmää aikana kasvainten kehittymiseen. Toistuva SCNA antaa kasvaimeen, jossa on tapa kohdistaa kasvainten ja onkogeeneihin hankkia yksi tai useampi syöpää tunnusmerkkejä ja ajaa kasvaimen kehittymisen [13]. Useita yhteisiä kromosomipoikkeavuuksien on tunnistettu tavanomaisia ​​sytogeneettisen tekniikoilla, kuten metafaasissa vertaileva genomin hybridisaation (CGH) ja fluoresoiva in situ hybridisaatio (FISH) [18-20]. Näihin kromosomi viat kuuluvat voitot 8q, 13q ja 20q ja tappiot 18q, 5q, 8p, 17Q [18,20]. Kuitenkin, koska niiden suuri koko, tunnistaminen erityisen kuljettaja geenien näillä alueilla on ongelmallista [16,17,21].

käyttö array-pohjainen CGH mahdollistaa hankintaan genominlaajuisten tiedot korkealla resoluutiolla (alas muutaman kiloemästä) ja tunnistaminen polttovälin ja minimaalinen yhteisiä alueita (FMCR) [16,17]. FMCR ovat yleensä pienempiä kuin 3Mb koko ja näin ollen sisältää suhteellisen pieni määrä geenejä, joten yksinkertaistaa tunnistaminen kuljettajan geenejä [16,17]. Viime aikoina FMCR ovat johtaneet tunnistamiseen uusia syövän kuljettajan geenejä mahdollisten terapeuttisten ja ennusteen arvioinnissa useissa syöpätyypeissä lukien CRC [16,17,22-27]. Päätavoitteena Tämän työn perusteella on soveltaa analyyttisiä lähestymistapoja perustuu korkean resoluution array-pohjainen CGH tietojen joukon satunnaista microsatellite vakaa (MSS) CRC kasvaimet sekä jäljitellä havaintoja poikkeamia havaittu aiemmissa tutkimuksissa ja tunnistaa uusia ehdokas CRC kuljettaja geenejä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen tietojen ja näytteiden keräämistä ja tutkimuksen hyväksyi South Yorkshire Research eettisen komitean (UK) (09 /H1310 /54).

Tutkittavat ja DNA-näytteitä

kudosnäytteet saatavana 53 potilasta, joilla MSS Kolorektaalituumorien. Kolmekymmentäkahdeksan näistä olivat tehdään leikkaus joissa pääasiallisena peräsuolen kasvain Sheffieldin Royal Hallamshire ja Sheffield Northern General sairaaloissa (maaliskuu 2001 – kesäkuu 2005). Viisitoista asian kudosnäytteet Sheffield Royal Hallamshire Hospital kudospankkia (HTA License 12182). Ennen sisällyttämistä tutkimukseen, kasvain tila kaikkien näytteiden varmistettiin patologi (JB). Kaikki kasvain kudosnäytteet mikro-leikeltiin ennen DNA: n eristämiseksi, niin että uutettu materiaali sisälsi vähintään 80% syöpäsoluja. DNA-näytteet ääreisverenkierron tai normaali paksusuoli kudoksissa olivat saatavilla myös kaikilta palvelukseen potilaista. Muita tietoja, kuten; sukupuoli, kasvaimen sijainti, erottelua vaiheessa ja ikä diagnoosin oli saatavilla patologian kirjaa (Materiaalit ja menetelmät S1). Genomi-DNA uutettiin kasvain, normaali kudos ja ääreisverenkierron näytteitä käyttäen QIAamp DNA Minikit, (Qiagen, Hilden, Saksa).

MSI tila

MSI tilan kaikki kasvaimen DNA näytteiden määritettiin käyttäen MSI Analysis System kit, v1.2 (Promega, Madison, USA), joka perustuu mononukleotidi mikrosatelliittimarkkerin BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 ja MONO-27. PCR-tuotteet erotettiin kapillaarielektroforeesilla käyttäen ABI PRISM

TM 3730 DNA Analyzer ja analysoitiin käyttäen genemapper ohjelmisto v4.0 (Applied Biosystems, Warrington, UK). Näytteet ilman epävakaa markkereita luokiteltiin MSS [28]. MSI analyysi Sarja sisältää myös 2 erittäin polymorfista penta-nukleotidin markkereita, joita käytetään tarkistamaan näytteen identiteettiä.

Yhdistelmät ja mutaation analyysi

mutaation analyysi

BRAF

eksoni 15

KRAS

eksonin 2,

APC

mutaatio cluster region (MCR),

TP53

eksonit 4-9 ja

PIK3CA

eksonit 9 ja 12 vastaavat eksonit amplifioitiin PCR-menetelmällä (Alukesekvenssit luetellaan materiaalit ja menetelmät S1), ja sekvensoitiin käyttämällä PRISM

TM BigDye Terminator v3.1 standardin prototcol (Applied Biosystems). Sekvenssi analysoitiin käyttämällä ohjelmistoa Staden [29] ja mutaatiot varmistettiin vertaamalla NCBI referenssijaksoa. Liittyminen numerot annetaan Materiaalit ja menetelmät S1.

aCGH profilointi

Agilent koko genomin CGH paneelit 4x44K (Design ID 014950) ja 4x180K (Design ID 022060) levitettiin 6 ja 47 näytettä vastaavasti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Taulukot sisälsivät 60-mer oligonukleotidikoettimia varten 42494 (44K) ja 170334 (180K) erilliset kromosomipaikoissa mediaani koetin väli 43KB (44K) ja 13KB (180K). Analyysit suoritettiin Agilent oligonukleotidiin array-pohjainen CGH protokolla v6.0. Laadun arviointi paneelit perustui johdannainen log suhde leviäminen (DLRS), signaalin intensiteettiä ja toistettavuus, taustamelu, array grid sijoitus ja harha koettimet esittämät Agilent piirreirrotuksen ohjelmisto (v 10.5.1.1) kuin 11 hyvin määritelty QC mittarit ( microarray tietojen käytön tiedot: GSE 418413).

Array CGH tietojen analysointi

aCGH analyysi suoritettiin käyttäen Agilent genomista työpöytään ohjelmisto (v 5.0.14). SCNA todettiin käyttäen laatu painotettu aikaväli pisteet algoritmi, jota kutsutaan myös poikkeavuus havaitsemismenetelmä 2 (ADM2) algoritmia (Threshold: 6,0), jossa oletuksena keskittäminen ja sumea nolla korjaus. Default ominaisuus ja poikkeama suodattimia levitettiin ja sisäisen array koetin rinnakkaista yhdistettiin. Kasvaimen näytteitä pidettiin kromosomiin epävakaa, jos yksi tai useampi merkittävä poikkeavuuksia havaittu [8]. Toistuva SCNA tunnistettiin käyttämällä yhteydessä korjattu yhteisen poikkeaman (COCA) algoritmi kromosomaalista laajuus, p-arvo 0,05 ja päällekkäisyyttä kynnys 9.0.

FMCR määriteltiin alueet, jotka ovat alle 3 Mb kooltaan ja määritelty vähintään 2 riippumaton yhteyspiste tai päällekkäisiä SCNA (pitää koko määritetään tapahtumien (SDE)). Vähimmäistarkastustiheydeksi 10% tapauksista ja COCA pisteet ~ 2,0 (p-arvo = 0,01) oli myös tarpeen.

Tekninen validointi

Jotta validoimiseksi aCGH tuloksia, 2 päällekkäisiä kokeita käyttäen 44K ja 180K taulukot tehtiin. Lisäksi 3 FMCR (2 poistetaan ja 1 monistettiin) vahvistettiin käyttäen kopiomäärä kvantitatiivinen PCR.

TP53

LOH-analyysi perustuu sekvensointi tulosten käytettiin varmistamaan 17p poistot.

Tulokset

CIN, MSI ja mutaatiostatus

53 valitut näytteet sillä tässä tutkimuksessa olivat MSS. Analyysi

APC, TP53

,

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

mutaatioita osoitti, että taajuus ja kuvio näistä mutaatioista yhtyä aiemmin julkaistu tiedot MSS satunnaista CRC [30-33] ja (https://www-p53.iarc.fr/index.html). Niistä 53 CRC tapauksissa onnistuneesti analysoida array CGH, 5 ei ollut merkittävää poikkeavuuksien katsottiin kromosomiin vakaana. ADM2 algoritmi ei soittaa poikkeavuuksien 2 näytteitä ja toisen näytteen epäonnistunut 4 QC mittareita. Yhteenveto molekyyli- piirteitä 53 näytettä on esitetty taulukossa S1 File S1.

Jakelu Yhteinen SCNA

Yhteensä 3097 SCNA tunnistettiin 45 kromosomiin epävakaa tapauksissa. Lukumäärä SCNA näytettä kohti vaihteli 1-411, jossa mediaani on 43 näytettä kohti. SCNA vaihteli kooltaan 0.014Mb-147.48Mb (mediaani: 2.29Mb). Yleiskatsaus rakenteessa ja taajuudet näiden SCNA on esitetty kuviossa 1. Yleisin voitot olivat kromosomissa alueiden 20q (73,3%, n = 33), 13 (57,8%, n = 26), 8q (53,3%, n = 24), 7 (51,1%, n = 23) ja X (51,1%, n = 23), ja yleisimmät tehtiin poistoja kromosomissa alueet 18 (55,6%, n = 25), 8p (51,1%, n = 23) ja 17-beeta (51,1%, n = 23). Jotkin näistä alueista sisältää keskeiset CRC kuljettaja geenejä, kuten

MYC

at 8q,

Smad4

at 18q ja

TP53

klo 17p. Yhteenveto SCNA jokaisesta näytteestä on esitetty taulukossa S1 File S1 ja Kuva 2.

Data päässä 180K muodossa array näkyvät. Punainen edustaa voitot ja vihreä edustaa poistot. Y-akseli vastaa taajuutta.

edustus kaikista CNA tunnistettu 40 kromosomiin epävakaa tapauksissa analysoitiin 180K alustalla. Punainen edustaa vahvistusta ja vihreä edustaa poisto. Pisteviivat merkitsevät sentromeerien. Molekyyli- ja kliinisten piirteiden järjestyksessä ylhäältä;

PIK3CA

,

APC

, TP53, KRAS ja BRAF mutaatiostatus (sininen ja valkoinen edustaa mutantti ja WT vastaavasti), CIMP (punainen, oranssi ja vihreä ovat CIMP-H, CIMP-L ja CIMP-n tässä järjestyksessä), potilaan sukupuoli (vaaleanpunainen ja harmaa edustaa naisen ja miehen vastaavasti) ja kasvaimen sijainti (keltainen ja syaani ovat proksimaalisen ja distaalisen vastaavasti).

yhteinen poikkeavuus analyysi ja FMCR

Out of 3097 SCNA yksilöity 45 kromosomiin epävakaa näytteitä, 1689 poikkeamia olivat polttoväli ( 3.0Mb) kooltaan 0.014Mb jopa 3.00Mb (mediaani: 0.71Mb). Keskipiste poikkeamia koostui 746 kopion voittoja, joiden kokoluokassa 0.014Mb-2.99Mb (mediaani: 0.92Mb) ja 943 poistot, joiden koko valikoima 0.025Mb-3,00 Mb (mediaani: 0.58Mb). Tunnistaa FMCR, COCA analyysi yhdistettynä määritelmien kuvattu Menetelmät levitettiin ADM-2 ulostulo ja tämä analyysi johti tunnistamiseen 64 poistot ja 32 voitot täyttävät FMCR kriteerit. 64 poistetut FMCR vaihteli kooltaan 0.03-2.64Mb (mediaani: 0.42Mb) ja sisälsi yhteensä 714 tunnettuja geenejä joiden valikoima 0-69 deletoitu alueittain (mediaani: 4 geenejä) (taulukko S2 File S1) . 32 sai FMCR vaihteli 0.03-1.96Mb koko (mediaani: 0.83Mb) ja sisälsi yhteensä 288 tunnettuja geenejä joiden valikoima 0-34 geenien sai alueittain (mediaani: 3 geenejä) (taulukko S3 File S1) .

tunnistaminen tunnettujen syövän geenien FMCR

tunnettujen syövän geenien sisällä poistetaan ja sai FMCR The FMCR geeni luettelot verrattiin sekä täydellinen geeni listan syöpää geenistä väestönlaskennan projekti ( https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census/, pääsee kesäkuuta 2013), sekä CRC ja rintasyöpä kuljettajan geenejä tunnistettiin äskettäin suurikapasiteettisten uudelleenjärjestely-tutkimuksessa [34]. Tämä analyysi osoitti, että läsnä 27 ”syöpä geenit” sijaitsevat poistetun FMCR (~ 3,8% kokonaismäärästä poistetut geenit, taulukko S2 File S1) ja 11 ”syöpä geenit” sisällä saavutti FMCR (~ 3,8% kokonaismäärä sai geenien; taulukko S3 File S1).

esiintyminen syövän geenin sisällä FMCR ei välttämättä tarkoita, että se toimii kuljettajana geeni. Joitakin ”syöpä geenit”, tyyppi FMCR (poistettu tai ulkoiset) ei vastannut tunnettujen geenien toiminnan, esimerkkinä olkoon poistamista tunnetun onkogeenin

sääntelyviranomaisten

. Kuitenkin geenien toiminnan ja tyypin FMCR olivat usein yhdenmukaisia ​​odotuksia, esimerkkejä kuten deleetiot

MAP2K4

ja

CDKN2C

(taulukko S2 File S1) ja voitto

FGFR1

(taulukko S3 File S1). Ehkä tärkeintä, klassisen

Smad4

tuumorisuppressoriproteiinia poisto ja onkogeenisten

MYC

voitto molemmat havaita poistettu ja sai FMCR vastaavasti. Taajuus Molempien

Smad4

poistot ja

MYC

voittoja 45 kromosomiin epävakaa tapauksia oli korkea ~ 53% (taulukot S2 S3 File S1).

vertailu julkaistu SCNA tietojen

jotta rajat vahvistaa tuloksemme julkaistujen tietojen kanssa, vertasimme FMCR yhteisiin kromosomimuutokset alle 3Mb tunnistettu neljässä viime CRC tutkimuksissa [13,16,22,35] . Yhteenlaskettu polttovälin poikkeamia havainneet näissä tutkimuksissa oli 187 voitot ja 189 poistot. Välillä 4 julkaistuja tutkimuksia, oli vain 10 päällekkäisiä polttoväli poistot (5,3%) ja 29 päällekkäisten polttoväli voitot (15,5%). Suurempi osuus FMCR tutkimuksessamme päällekkäin julkaistu alueilla. Kaikkiaan 27 meidän 64 Poistetaan FMCR (42,2%) ja 11 meidän 32 sai FMCR (34,4%) päällekkäin polttovälin poistot ja voittoja 4 julkaistuissa tutkimuksissa.

suuri SCNA tutkimus äskettäin suoritettiin 26 eri syöpätyyppejä, mukaan lukien CRC [17]. Tutkimuksessa havaittiin luettelon 20 yleisimmistä somaattisten poistot ja voitot poikki analysoitiin syöpätyyppeihin. Lisäksi Hakijan geeni valittiin myös kunkin yhteisen SCNA. Vertailu meidän FMCR ja yleisimmät alueista Beroukhim et al tutkimus paljasti päällekkäisyys 5 poistamisesta alueilla (25% kokonaismäärästä) ja 3 vahvistusalueilla (15% kokonaismäärästä). Kaikki kandidaattigeeneihin tunnistaa Beroukhim ja kollegoiden tutkimuksessaan olivat sisällä päällekkäiset alueet meidän FMCR.

Pathway analyysi

Jotta etsiä mitään erityisiä kuvioita tai reittejä vaikuttaa geenien sisällä poistettu tai saadut FMCR, Database for Annotation, visualisointi, ja Integrated Discovery (DAVID) v6.7 käytettiin (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [36]. DAVID suorittaa rikastus analyysi (perustuen biologisiin merkintöjä varten kohdegeeneissä) tunnistaa kaikki biologiset polkuja, jotka ovat tilastollisesti merkitsevästi yliedustettuina analysoidun geenin luettelosta [36]. Sillä poistetaan FMCR, kaikkein rikastettu syöpään liittyvien polku oli Apoptosis (P = 0,014) (Kuva S1), jossa 10 apoptoottisten geenien ilmenevät poistettu FMCR. Seitsemän näistä geeneistä (

CASP3

,

CASP8

,

CASP10

,

NFKBIA

,

CAPN1

,

BAD

,

TNF

ja

TNFRSF1A

) on proapoptoottisten roolit ja 3 (

PIK3R5, PIK3R2 ja CFLAR

) ovat anti-apoptoottisia. Lisäksi p53-signalointireitin on rikastettu poistetaan alueilla (P = 0,079), 5 vaikuttaa geenien (kuvio S2);

CCNB1

,

GADD45G

,

SERPINE1

,

SESN2

ja

SFN

, jotka kaikki ovat raportoineet anti-selviytymisen toimintoja.

Toisaalta, onkogeeninen MAPK signalointireitin oli kaikkein yliedustettuna väylän saatu FMCR (P = 0,032) ja 9 vaikuttavat geenien (kuvio S3). Seitsemän näistä geeneistä (

CACNA1H

,

FGF23

,

FGF6

,

FGFR1

,

MAPKAPK2

,

ELK4

ja

MYC

) tiedetään olevan kasvua edistäviä ja selviytymistä toimintoja, kun taas muut 2 (

DUSP8 ja DUSP2

) on anti-selviytymisen toimintoja.

Gene Ihmissuhteet joukossa Alustavat Loci (Grail) analyysi suoritettiin myös (https://www.broadinstitute.org/mpg/grail/) [37] etsimään toimivia ihmissuhteita joukossa genomialuetta. Termit apoptoosin, apoptoottiset ja kaspaasi olivat merkittävimmin rikastettu keskuudessa poistettu FMCR. Saat voitot, kalium konduktanssi kanavat ja siilin reitit olivat merkittävimmin rikastettu ehdoin.

tunnistaminen Hakijan geenien ehdokas FMCR

Jotta tunnistaa uusia ehdokas CRC kuljettaja geenien FMCR kriteerit tiukennettu. Ehdokas FMCR valittiin jos ne on määritelty 4 SDE, esiintyy ≥20% tapauksista ja on enintään 12 geenien 3.0Mb koosta. Nämä tiukemmat FMCR määritelmiä tunnistettu 11 poistoja (taulukko 1) ja 8 voitot (taulukko 2). Niistä 28 geenit sisällä poistetut alueet, 10 (35,7%) tunnistettiin Hakijan geenejä, joiden tiedetään tai mahdollisten tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja ja ulos 31 geenien sisällä sai alueiden, 6 (19,4%) oli ehdokkaita, joiden tiedetään tai mahdollisten onkogeeniset toiminto (taulukot 1 ja 2, katso keskustelu). Ehdokas tuumorisuppressorigeeneille in poistetaan FMCR mukana

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2 ja NFKBIA

, ja ehdokas onkogeenien saavuttanut FMCR mukana

PRDM16, TNS1, RPA3

ja

KCNMA1

. Tärkeää on, että kopioluvun asema 2 näiden uusien Hakijan geenejä,

NFKBIA

ja

KCNMA1

, vahvistettiin erityisiä määrällisiä RT-PCR-määrityksissä.

Kromosomaalinen sijainti

Start

End

Koko (Mb) B toistuminen (%) B SDE

Genes

Candidate genes

*

3p14.357521404576526910.1324.44433p14.260078018611958231.1231.1171

FHIT

4q22.191340468926745441.3333.3382

TMSL3

6q261623571251630498540.6922.2271

PARK2

11p15.4917244993636100.1922.225312q14.263277389633681090.0920.0041

RASSF3

14q13.234108596349503390.8428.8959

NFKBIA

16p13.3-p13.2613253670182750.8924.4471

A2PB1

17p13.1-p1210957541124009681.4448.8953

MAP2K4

20p12.114376202160711351.6937.78101

MACROD2

21q22.1133554005336512050.1028.8973

IFNAR1, IFNAR2

Taulukko 1. Hakijan geenien poistetaan FMCR.

* kandidaattigeenit pohjalta määritellyistä syövän kannalta oleellisia toimintoja. CSV Lataa CSV kromosomikohdassa

Start

End

Koko (Mb) B toistuminen (%) B SDE

Genes

Candidate genes

*

1p36.32241214436300361.2226.67711

PRDM16

1p34.336881028375358910.6520.00512q352183542272185560810.2020.0051

TNS1

7p22.1-p21.3703316278298870.8048.8954

RPA3

8q23.31138277911145474540.7251.1140NA10q22.378238542790846560.8520.0041

KCNMA1

12p13.32-p13.31428242953649991.0840.00412

FGF23, FGF6

22q11.2118517833186863130.1720.0041Table 2. Hakijan geenien sai FMCR.

* kandidaattigeenit pohjalta määritellyistä syövän kannalta oleellisia toimintoja. CSV Lataa CSV

Keskustelu

tunnistaminen FMCR ja vaikutti polkuja

taajuus ja malli mutaatioiden

APC, TP53

,

KRAS

,

BRAF

ja

PIK3CA

olivat tyypillisiä MSS /CIN kasvaimia, mikä viittaa siihen, että analysoitu näyte tässä on tyypillinen tämän kasvaimen tyypistä. FMCR alun perin määriteltiin poikkeava alueilla pienempi kuin 3Mb kooltaan, esiintyy yli 10%: ssa tapauksista, joissa on vähintään 2 SDE ja COCA pisteet ~ ≥2 (p-arvo = 0,01). Kaiken kaikkiaan 64 poistetaan ja 32 sai FMCR tunnistettiin mukaan nämä kriteerit. Aiemmin julkaistut tutkimukset osoittivat melko alhainen päällekkäisyys poikkeamia niiden välillä (5,3% polttovälin poistot ja 15,5% Fokaalisten voitot) [13,16,22,35]. Tämä ei ehkä ole yllättävää, koska käytön eri alustoilla, analyysimenetelmät ja näytejoukoilla johtaa tunnistamiseen eri kuormittajat poikkeavuuksia. Tutkimuksemme osoitti suurempaa päällekkäisyyttä aiemmin julkaistujen tietojen (42,2% poistetaan FMCR ja 34,4% on saanut FMCR), mikä viittaa puuttuminen merkittävä määrä puolueellisuudesta näytteenotossa ja menetelmät.

Pathway analyysi osoitti, että suurin osa merkittävästi rikastettu syöpään liittyvien reittien joukossa poistetaan FMCR olivat apoptoosin ja p53 signalointireitteihin. Kymmenen apoptoottista geenit olivat yleisesti poistettu meidän näytteitä, joista 7 ovat tienneet proapoptoottisten toiminnot ja 3 (

PIK3R2

,

PIK3R5

ja

CFLAR

) on anti-apoptoottinen roolit. Kuitenkin,

CFLAR

tapahtuu samassa FMCR kuin pro-apoptoottisten geenien

CASP8

ja

CASP10

. Vastaavasti,

PIK3R5

sijaitsee 1.2Mb alavirtaan

TP53

, ja 81% (n = 17) deleetiot ovat yhteisiä välillä 2 geenejä. Siksi näyttää todennäköiseltä, että se on poistetaan pro-apoptoottisten geenien sisällä FMCR joka toimii kuljettajan tapauksessa anti-apoptoottiset geenit on co-Poistetaan matkustajia. P53 signalointireitin, kaikki poistetut geenit (n = 5), joiden tiedetään olevan anti-kasvaimia toimintaa. On huomattava, että

TP53

itsessään myös poistettu 37,8% (n = 17) tapauksista, mutta sitä ei ole tunnistettu sisällä FMCR. Nämä tulokset viittaavat siihen, että poistetut FMCR voisi olla tärkeä rooli tuumorisolun selviytymisen kautta invaliditeettiin apoptoosin ja /tai p53 signalointireitille. Lisäksi rikastaminen apoptoottisten geenien poistetun FMCR tukee tunnettua korrelaatiota genomin epästabiilisuuden ja vialliset apoptoosin [38].

merkittävimmin rikastettu koulutusjakson sai FMCR geenit oli onkogeenisel- MAPK-reitin, jossa on 9-geenien tavanomaisesti vaikuttaa. Seitsemän näistä geeneistä tiedetään tai ennustetaan olevan onkogeenisen aloilla edistämällä kasvaimen kasvua ja selviytymistä. Vaikka 2-geenit on anti-selviytymisen rooleja, yksi näistä (

DUSP8

), tapahtui samassa FMCR kuin onkogeeninen kasvua edistävää geenin

IGF2

. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset vahvistavat, että polttoväli poistot ja kopioluvun voitot kohdegeenien sisällä tuumorisuppressoriproteiinia ja onkogeenista polkuja vastaavasti.

Candidate syöpä kuljettajan geenejä

Kaikkiaan tunnistettu FMCR sisälsi ~ 1000 geenejä. Jotta voitaisiin tunnistaa joukko Hakijan geenien FMCR olivat edelleen etusijalle käyttämällä tiukempia FMCR määritelmä. Raadin ehdokas FMCR olivat 11 poistot ja 8 voitot, jotka sisältävät yhteensä 59 vaikuttaa geenien.

Kymmenen 28 geenien (35,7%) on 11 ehdokasta poistetaan FMCR ovat syöpään liittyvien joilla tiedetään tai mahdollisten tuumorisuppressoriproteiinia toiminto. Kuusi näistä geeneistä (

FHIT

,

TMSL3

,

PARK2

,

A2BP1

,

MACROD2

ja

MAP2K4

) on johdonmukaisesti raportoitu poistetuiksi CRC ja muiden syöpien [17,22,26,35]. Toisaalta,

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2

ja

NFKBIA

eivät aikaisemmin ilmoitettu vaikuttavan CRC.

RASSF3

on aiemmin osoitettu estävän solujen lisääntymisen rintasyövän solulinjoissa [39]. Proteiini tasojen interferonireseptorit geenien (

IFNAR1 ja 2

) osoitettiin olevan alassäädetty virtsarakon syöpään, ja liittyy pitkälle ja kestävyys kemoterapiaa [40]. Inaktivoivat mutaatiot on

NFKBIA

on löydetty Hodgkinin lymfooma, ja heterotsygoottinen

NFKBIA

deleetioita raportoitu ~ 25%: GBM tapauksista [23,41] .. Perustuen niiden toiminnot, kirjallisuudessa ja niiden tapahtumaksi ehdokas poistetaan FMCR ehdotamme

RASSF3

,

IFNAR1

,

IFNAR2

ja

NFKBIA

uusina ehdokas CRC tuumorisuppressorigeeneille.

Kuusi 31-geenien (19,4%) on 8 ehdokas sai FMCR ovat syöpään liittyvät ennustetun onkogeeninen toiminnot (

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

,

KCNMA1, FGF23

ja

FGF6

).

FGF23

ja

FGF6

on raportoitu saadut CRC ja muiden syöpätyyppeihin [15,17]. Kuitenkin

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

ja

KCNMA1

ei ole aikaisemmin raportoitu CRC. PR verkkotunnuksen sisältäviä 16-geenin (

PRDM16

) on tunnettu onkogeeni sekaantunut akuutti myelooinen leukemia (AML) ja osteosarkooma [42,43] Tensin 1-geeni (

TNS1

) on ainoa geeni läsnä asiaa FMCR, ja

TNS1

yliekspressio

in vitro

aiemmin osoitettu merkitsevästi edistää solujen vaeltamiseen fibroblasteissa [44]. Replikointi proteiini A3 geeni (

RPA3

) Hiljattain osoitettiin voiteta etäispesäkemelanoomassa (sisällä FMCR) ja olla keskeinen rooli kasvaimen invaasio [45]. Suuri konduktanssi kalsium-aktivoitujen kaliumkanavan alfa-alayksikön geeni (

KCNMA1

), ainoa geeni sen FMCR, on osoitettu voiteta eturauhassyövässä tapauksissa ja yli-ilmentyy metastaattisen rintasyövän [46,47]. Perustuen niiden toiminnot, kirjallisuudessa ja tapahtumana ehdokas sai FMCR ehdotamme

PRDM16

,

TNS1

,

RPA3

ja

KCNMA1

kuin novel ehdokas CRC onkogeenien.

Yhteenvetona tuloksemme, jotka perustuvat analyysiin keskipiste minimaalinen yhteisiä alueita, vahvistavat aiemmin raportoitu CRC loci ja tukevat oletusta, että toistuvan polttoväli poikkeavuuksia kohdistaa syöpään liittyvien geenien ja polkuja. Lisäksi polttoväli poistot ja tiomonistukset osoitettu vaikuttavan tunnettujen kasvainten ja onkogeeneihin vastaavasti. Ehdotamme tässä useita uusia ehdokas CRC kuljettajan geenejä. Lisävalidointia ja toiminnallisia tutkimuksia edellytetään määrittää niiden mahdollisen roolin CRC tuumorigeneesiä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Apoptotic geenit poistetussa FMCR (DAVID output). DAVID lähtö osoittaa apoptoosin signalointireitin kanssa poistetut geenit merkitty punaisella tähdellä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0083859.s001

(TIF) B Kuva S2.

P53 signalointireitin poistetussa FMCR (DAVID output). DAVID lähtö osoittaa P53 signalointireitin, jossa poistetut geenit merkitty punaisella tähdellä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0083859.s002

(TIF) B Kuva S3.

MAPK väylän sai FMCR (DAVID output). DAVID lähtö osoittaa MAPK -signalointireitistä kanssa monistettujen geenien merkitty punaisella tähdellä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0083859.s003

(TIF) B Materiaalit ja menetelmät S1.

Yhteenveto potilaiden ja kasvainten ominaisuuksiin, alukkeita sekvenssit ja hehkutuslämpötiloja ja NCBI-geenin liittymisen numeroita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083859.s004

(DOC)

Tiedosto S1.

taulukot S1-S3. Taulukko S1: Yhteenveto molekyyli- ominaisuudet 53 kasvaimen näytteitä. Taulukko S2: Yhteenveto 64 Poistetaan FMCR. Taulukko S3: Yhteenveto 32 sai FMCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0083859.s005

(XLS) B

Kiitokset

Haluamme kiittää kaikkia tutkimukseen osallistuneista, Helen Cramp ja Dan Connley potilaiden rekrytointi ja tiedonhallinnan, Paul Heath avusta kanssa aCGH ja ydin sekvensointi laitokseen Sheffieldin yliopistossa suorittamiseksi DNA-sekvensoinnilla.