Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime vuosina merkittävää huomiota on kiinnitetty käytön luonnollisia aineita kuten syöpälääkkeiden. Luonnollinen antioksidantti dipeptidi L-karnosiini kuuluu tähän luokkaan molekyylien koska se on osoittautunut olevan merkittävää syövän vastaista aktiivisuutta sekä in vitro että in vivo. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että L-karnosiini estää proliferaatiota ihmisen kolorektaalisen syöpäsoluissa, jotka vaikuttavat ATP: n ja reaktiivisten happiradikaalien (ROS) tuotanto. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet Hypoksia indusoituvat Factor 1α (HIF-1α) mahdollisena kohteena L-karnosiinin HCT-116-solulinja. HIF-1α proteiini on yliekspressoitu erilaatuisia ihmisen syövän ja on merkittävä syy lääkeresistenssi ja säteilyn kiinteitä kasvaimia. Erityisen kiinnostavia ovat kokeelliset tiedot tukevat käsitystä, että sukupolven ROS tarjoaa redox signaalin HIF-1α induktio, ja tiedetään, että jotkut antioksidantit voivat tukahduttaa kasvaimien syntyyn estämällä HIF-1α. Nykyisessä tutkimuksessa havaittiin, että L-karnosiini vähentää HIF-1α-proteiinin tason vaikuttavat vakauden ja vähentää HIF-1 transkriptionaalista aktiivisuutta. Lisäksi olemme osoittaneet, että L-karnosiini on mukana ubikitiinistä proteasomin järjestelmä edistää HIF-1α hajoamista. Lopuksi vertasimme antioksidantti on L-karnosiinin kanssa, kahden synteettisen antioksidantin bis-diaminotriazoles (eli 1 ja 2, vastaavasti). Huolimatta näistä kolmesta yhdisteillä on sama kyky vähentää solunsisäisiä ROS, 1 ja 2 ovat tehokkaampia scavengers ja ei ole vaikutusta HIF-1α ilmaisun ja syöpäsolujen lisääntymistä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että analyysi L-karnosiinin antioksidantti reitti selventää taustalla oleva mekanismi antiproliferatiivisia vaikutuksia tämän dipeptidin paksusuolen syöpäsoluissa. Vaikka molekyylitason mekanismi, jonka L-karnosiini alas säätelee tai estää HIF-1α aktiivisuutta ei ole vielä selvitetty, tämä kyky voi olla lupaava hoidettaessa hypoksia liittyviä sairauksia.

Citation: Iovine B, Oliviero G, Garofalo M, Orefice M, Nocella F, Borbone N, et al. (2014) antiproliferatiivista vaikutus L-karnosiini korreloi Vähentynyt ilmentyminen hypoksian indusoima tekijä 1 alfa ihmisen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 9 (5): e96755. doi: 10,1371 /journal.pone.0096755

Editor: Sabato D’Auria, CNR, Italia

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2014; Julkaistu: 7. 2014

Copyright: © 2014 Iovine et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat ”finanziamento per l’Avvio di Ricerche Originali”, Università degli Studi di Napoli Federico II, GO. ”Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale” apurahan 2009 Italian Ministero dell’Università e della Ricerca, GO NB GP. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

L-karnosiini (β-Ala-His) on luonnollisesti esiintyvä histidiini dipeptidi, endogeenisesti syntetisoidun ja yleisesti todettu aivoissa, lihaksessa, munuaisessa, vatsassa, ja suuria määriä, luustolihaksessa. Tämä dipeptidi on osoittautunut suorittaa useita biologisia toimintoja, kuten antioksidantti aktiivisuus, kyky kelatoida metalli-ioneja, proteiinikinaasien glykosylaation, anti-inflammatorisia ja anti-vanhenemista ominaisuudet [1]. Toinen näkökohta vaikutuksen L-karnosiinin koskee sen anti-proliferatiivisen vaikutuksen ihmisen solulinjoissa. Viime aikoina olemme osoittaneet, että L-karnosiini estää proliferaatiota ihmisen kolorektaalisyöpää HCT-116-solujen vaikuttamalla ATP ja ROS tuotanto ja indusoimalla solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa [2]. Lisäksi jotkut kirjoittajat, joiden proteomic lähestymistapaa, tukevat sitä mahdollisuutta, että tämä dipeptidi vaikuttaa kasvainsolujen kasvua ihmisen gliooma soluja ja hidastaa kasvaimen kasvua in vivo NIH3T3-HER2 /neu hiirimallissa läpi puuttumista proteiinilaskostumisen /jalostus ja HIF-1α signalointi [3] – [4]. Oikeastaan ​​huomattavia ponnisteluja on suunnattu löytö kemiallisen tai luonnollisia molekyylejä, jotka kohdistuvat HIF-1α-proteiinia ja säännellä HIF-1α signalointireitin monin molekyylitason mekanismeja, kuten kopioinnin säätely, stabilointi, hajoamisen ja transaktivaa-. Erityisen kiinnostavaa on tehtävä ROS ja antioksidantit molekyylien HIF-1α sääntelyä. Itse asiassa, useita yhdisteitä, kuten rapamicin ja resveratrolin on osoitettu olevan inhibiittoreita HIF-1α [5] – [6]. HIF-1α on osa HIF-1 kompleksin, jolla on keskeinen rooli O

2 homeostaasiin ja itse asiassa pidetään keskeisenä säätelijänä mukauttamista vastausten syöpäsolujen hypoksia [7]. HIF-1 kompleksi on heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka koostuu O

2-säännelty HIF-1α ja konstitutiivisesti HIF-1β alayksiköistä. Alle happiolosuhteissa isoformivyöhykkeet propyylihydroksylaasia PHD2 hydroksyloi HIF-1α kahdella toiminnallisesti riippumatonta proliinitähteet, Pro

402 ja Pro

564, sisällä ODD (hapen vaikutuksesta hajoaminen) domain [8] – [9]. Hydroksyloidut Pro tähteet edistävät rekrytointia HIF-1α Von Hippel-Lindaun tuumorisuppressoriproteiinia (VHL), tunnustamista moduuli E3-ubikitiinipromoottori ligaasilla, joka vastaa sen ubikinaation ja myöhempien proteasomin-välitteisen hajoaminen [10]. Hypoksisissa olosuhteissa HIF-1α proteiini pakenee proteolyysin määrä lisääntyy, ja muodostaa heterodimeerin HIF-1β in HIF-1 kompleksin. HIF-1 kompleksi tunnistaa ja sitoutuu hypoksia reagoivan elementin (HRE) on hypoksia-indusoituva geenit, mukaan lukien geenit, jotka vaikuttavat angiogeneesiä, rauta aineenvaihduntaa, modulaatio glukoosiaineenvaihdunnan, solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, ja invaasio, aktivoiden niiden transkriptio [ ,,,0],11]. Viime vuosina, HIF-1 on tullut lupaava kohde syövän hoito. Itse asiassa, HIF-1α yli-ilmentyminen on yleinen piirre ihmisen syövissä, joissa se välittää sopeutumista hypoksinen kasvaimen mikroympäristössä. Mukaisesti näiden huomautusten tarkoituksena oli tutkia HCT-116 solulinja vaikutukset L-karnosiinin ilmentymistä HIF-1α ja HIF-1α-riippuvainen geeneistä. Lisäksi viime vuosina erityisen mielenkiintoinen se on ollut rooli ROS ja antioksidantit molekyylien HIF-1α sääntelyä [12]. Siten ymmärtää mekanismeja vastuussa L-karnosiinin vaikutusta olemme tutkineet myös miten tämä dipeptidi vaikuttaa ROS solunsisäisiä tasoja verrattuna kahteen uuteen antioksidantti bis-diaminotriazole yhdisteiden (eli 1 ja 2 vastaavasti) saatavilla myös laboratorioiden ja joiden antioksidantti aktiivisuus on julkaisematon. Vaikka nämä kolme yhdisteillä on sama kyky vähentää solunsisäisiä ROS, olemme havainneet, että 1 ja 2 ei ole vaikutusta HIF-1α ilmentymisen ja syövän solujen proliferaatiota. Oletetaan, että antioksidantti on L-karnosiinin toimii eri mekanismilla kuin yhdisteet 1 ja 2. Näin ollen päättelemme, että analyysi L-karnosiinin antioksidantti reitti selventää taustalla oleva mekanismi vaikutuksia tämän dipeptidin paksusuolen syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

HCT-116 ihmisen kolorektaalikarsinoomasolulinjaa hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) USA. Solulinjaa viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 DMEM: ssä (Dulbeccon Modified Eagle Medium) hankittiin BioWhittaker Classic Cell Culture Media, Lonza – VWR International srl, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ( Gibco Laboratories, North Andover, Massachusetts) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Gibco Laboratories).

Chemical bis-triatsolin yhdisteet 1 ja 2

kaksi yhdisteet valmistettiin reaktiolla vastaavan hapon (trans-trans-mukonihapon ja fumaarihappo, vastaavasti), diaminoguanidine monohydrokloridia polyfosforihappoa, kuten kuivausaineen, noudattamalla jo kuvattua [13]. Chlorohydrates 1 ja 2 valmistettiin seuraavasti. Kukin bis-diaminotriazole suspendoitiin veteen. Laimennettu suolahappoa (10 ml väk. 100 ml: ssa vettä) lisättiin, kuumennettiin ebullition, kunnes kiinteä aine oli täysin liuennut. Kun oli jäähdytetty huoneenlämpötilaan, 2 saatiin ruskeana prismaattisia kiteinä. Kun kyseessä on 1 kloorihydraatti (vaalean ruskea prismaattisia kiteitä) saatiin, kun etanolin lisääminen vesiliuokseen ja jäähdyttämällä huoneenlämpöön. Rakenne chlorohydrates ja protonaatio N-2 atomin renkaan, sen sijaan, amino- ryhmät, vahvistettiin yksittäisen kiteen analyysin (työ valmisteilla), ja on johdonmukainen samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu [13].

Hoidot

L-karnosiini, toimittaja Sigma-Aldrich Canada, liuotettiin DMEM ilman fenolipunaista (Sigma-Aldrich). HCT-116-solut maljattiin konsentraatiossa 3,0 x 10

6 solua 100 mm: n maljoille. Kun oli inkuboitu yksi päivä 37 ° C: ssa 5% CO

2, L-karnosiini, lisättiin 0,5-100 mM; soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ja kerättiin 24 tunnin kuluttua. Käsittely bis-diaminotriazole yhdisteet (1 ja 2) suoritettiin samoissa olosuhteissa käyttäen pitoisuuksia 0,05-0,5 mM. Sillä CoCl

2 käsittely 100 mM CoCl

2 lisättiin HCT-116 6 tuntia. MG132, toimittanut Calbiochem USA liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja lisättiin viljelyalustaan. HCT-116-soluja inkuboitiin 1 h ennen L-karnosiini hoitoon [14]. 24 h kuluttua L-karnosiini hoidon solut kerättiin proteiinin immunosaostus.

fluoresenssimikroskopialla

HCT116-soluja kasvatettiin dioja 24 h ja käsiteltiin 100 mM L-karnosiinin. 24 tunnin kuluttua solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin kylmällä 4% paraformaldehydillä PBS: ssä huoneen lämpötilassa 10 minuuttia ja sitten tehtiin läpäiseviksi 0,4% Triton X100 PBS: ssä 1X. 10 minuutin kuluttua solut pestiin kahdesti PBS: llä 1X /0,4% naudan seerumin albumiinia (BSA), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solut käsiteltiin ensin HIF-1α-vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) PBS 1X /0,4% BSA: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja tämän jälkeen Alexa 568 (Molecular Probes ”Alexa Fluor 568) toissijaisen vasta PBS 1X /0,4% BSA: ta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. PBS-pesun jälkeen solut värjättiin asennus väliaineen fluoresenssin DAPI (Vector laboratories). Tuloksia tutkittiin fluoresenssimikroskopialla Zeiss Axiophot 40X resoluutio.

Antioksidantit aktiivisuuden mittaus, jonka DPPH Method

DPPH (1,1-difenyyli-2-pikryylihydratsyylin) sammutusta menetelmää käytettiin varten arviointi antioksidantti 1, 2 ja L-karnosiini [15]. Kyky Näytteiden kaivella DPPH radikaali mitattiin käyttäen Brand-Williams menetelmä [16]. Alikvootit (60 ui) ja 1 mM liuosta, jossa oli 1, 2 ja L-karnosiini lisättiin 3 ml DPPH liuosta (6 x 10

-4 M) ja absorbanssi määritettiin 515 nm: ssä (Philips PU 8620-sarja UV /näkyvä spektrofotometri) 5 minuutin välein, kunnes vakaa tila. Jokaista antioksidantti määritystä varten Trolox alikvootti käytettiin kehittämään 50-500 mM standardikäyrä. Kaikki tiedot olivat ilmaistiin Trolox Samanarvoisuudet (mmol TE /l).

Solujen elinkelpoisuuden analyysi

MTT-määritys suoritettiin protokollan aiemmin raportoitu [17]. HCT-116-solut maljattiin tiheyteen 1 x 10

5-soluissa 96-kuoppaisilla levyillä. Sen jälkeen bis-diaminotriazole yhdisteet (1 ja 2) määritettiin käyttäen pitoisuuksia 0,05-0,5 mM. 24 tunnin inkubaation, 10 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (Sigma Aldrich) (0,05 mg /ml) lisättiin elatusaineeseen. 4 tunnin kuluttua 37 ° C: ssa elatusaine poistettiin ja 200 ui DMSO: ta lisättiin liuottamaan suoloja formatsaanin. Absorbanssi mitattiin 96-kuoppaiseen levyyn spektrofotometrillä aallonpituudella 570 nm. Kokeet itsenäisesti suoritettava kolme kertaa ja kukin koe sisälsi kolminkertainen rinnakkaista. Kontrollinäytteitä, jotka sisältävät täydellisen viljelyalustassa puuttuu soluja tai kontrollisoluja ilman L-karnosiini myös mukana kussakin kokeessa.

klonogeeninen määritys

HCT116-solut maljattiin tiheydellä 500 solua /kuoppa 12-kuoppaisille levyille 500 ul: aan tuoretta viljelyalustaa, jossa on täydelliset DMEM, jossa 20-50-100 mM L-karnosiinin tai bis-diaminotriazole yhdisteet (1 ja 2) (+0,05-+0,5 mM). Jälkeen 7 päivää, solut pestiin kahdesti PBS: llä 1X ja värjättiin liuoksella, jossa oli 0,2% kristalliviolettia, 50% metanolia ja 10% etikkahappoa H

2O 30 min huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen solut pestiin deionisoidulla H

2O ja valokuvattiin.

mittaus reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) B

muodostumista ROS arvioitiin avulla 2,7-dikloorifluoreskiiniliuoksella -diasetaattia koetin (H2DCF-DA) (ostettu Sigma-Aldrich). HCT-116-solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille 100 ul: aan tuoretta viljelyalustaa, joka sisälsi DMEM ilman fenolipunaista. Solujen annettiin kasvaa 24 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2, niin L-karnosiini (0,5-100 mM) tai yhdisteiden 1 ja 2 (0,05-0,5 mM) lisättiin viljelyalustaan . ROS Toimenpide suoritettiin protokollan aiemmin raportoitu [18]. Fluoresenssia seurattiin käyttäen LS 55 fluoresenssi spektrometri (Perkin-Elmer Ltd., Beaconsfield, Englanti). Kussakin kokeessa fluoresenssia kasvu mitattiin kolme viljelmään kussakin käsittelyssä.

transfektioanalyysissä ja Luciferase Reporter Assay

Solut transfektoitiin hypoksia-vaste-elementin (HRE) -luciferase reportteri plasmidi tai vektori, joka sisältää hapen vaikutuksesta hajoamista (pariton) domeenin HIF-1α, käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Darmstadt, Saksa) on seerumitonta OptiMEM-1-alustassa (Lonza, Verviers, Belgia), mukaan valmistajan ohjeiden. Viljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 24-48 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuudeksi arvioi Dual-Luciferase Reporter koejärjestelmässä (Promega, Madison WI, USA) ja jossa on Promega GloMax 20/20 Luminometer mukaan valmistajan ohjeiden.

valmistaminen Total, Nuclear ja sytosoliproteiiniin uutteet

Yhteensä uutteet HCT-116 valmistettiin 24 h hoidon jälkeen L-karnosiini 0,5-100 mM tai 1 tai 2 0,05-,5 mM. Näytteet pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä 1X ja sentrifugoitiin 240 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletti suspendoitiin uudelleen kylmään hajotuspuskuriin, joka sisälsi 1% Triton X100, 0,1% SDS, 0,1% NaN

3, 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,1 mM Na

3Vo

4, 10 mM Nappi, 0,5 mM PMSF ja 10 ug /ml aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiini 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan jään päällä. Solulysaatit sentrifugoitiin 20000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sillä soluliman ja tumauutteet HCT116-solut kerättiin, pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä 1X ja sentrifugoitiin 240 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan jääkylmää hypotonisessa lyysipuskuria (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 1 mM PMSF, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Na-

3Vo

4, 10 ug /ml kutakin aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiini), ja inkuboitiin ravistellen 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Seuraavaksi solut hajotettiin lisäämällä 5% NP40. Solu-uute sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 500 x g: ssä ja supernatantti, joka sisältää sytosolisen fraktion jälkeen saatu sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 20,000 x g.

ydin- pelletti suspendoitiin uudelleen suuren suolapitoisuuden uuttopuskuria ( 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,4 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT: tä, 10 ug /ml kutakin aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiini), ja inkuboitiin ravistellen 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan . Tumauutteen sentrifugoitiin sitten 15 minuutin ajan 20,000 x g, ja supernatantti jaettiin eriin ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit (Bio-Rad Laboratories). Länsi blot analyysit, proteiinit saadut altistettiin vasta-aineita HIF-1α (kanin polyklonaalinen vasta-aine Santa Cruz Biotechnology), aldolaasi A (ABNOVA), aldolaasient- C (kanin polyklonaalinen vasta-aine Santa Cruz Biotechnology) ja β-aktiini (hiiri monoklonaalinen Santa Cruz Biotechnology). Signaalit havaittiin käyttämällä ECL kit (GE Healthcare).

immunosaostus

HCT-116-solut lyysattiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 250 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaattia, 5 mM EDTA, ja 1 mM DTT), jota oli täydennetty proteaasi- inhibiittoreilla. Näytteet (800 ug) oli esikirkastettiin 30 ui Protein A /G Plus-agaroosi (Santa Cruz Biotechnology), 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Anti-HIF-1α-vasta-ainetta (kanin polyklonaalinen vasta-aine, Santa Cruz Biotechnology) lisättiin lysaatissa ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa ja sen jälkeen 30 ui Protein A /G Plus-agaroosi lisättiin lysaattia. 1 tunnin kuluttua 4 ° C: ssa proteiinit otettiin talteen Laemmli-puskuriin, eroteltiin 8% denaturoivalla geelillä ja sen jälkeen niille immunoblottaus.

Reaaliaikainen PCR-määritys

Yhteensä RNA valmistettiin HCT -116 solut käyttämällä RNeasy mini -kittiä (Qiagen) ja se käytettiin syntetisoimaan cDNA ta satunnaisheksanukleotidialukkeilla ja MultiScribe käänteistranskriptaasia (Invitrogen) 48 ° C: ssa 1 h. CDNA monistettiin sitten käytettäessä iCycler iQ reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä (Bio-Rad Laboratories) käyttäen IQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Real-Time PCR-reaktiot ja suhteellisen kvantifioinnin geenin ilmentyminen suoritettiin, kuten on raportoitu [19]. Suhdelukua 2

-ΔΔ

CT

ennen hoidon L-karnosiini ja ne lasketaan näytteitä inkuboitiin L-karnosiini 5-100 mM ilmaistaan ​​kertaiseksi muutoksia.

tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SDS (keskihajonnat) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä ANOVA ja P-arvo, joka monivertailutestillä. Taso tilastollinen merkittävyys määritettiin ** p 0,001, *** p 0,0001 [2]. Analyysit tehtiin käyttämällä GraphPad PRISM (versio 3.0, GraphPad Software, Inc .: La Jolla, CA, USA, 2002) on Windows-alustalla.

Tulokset

L-karnosiini Vähentää HIF -1α proteiini tasot vaikuttavat sen Pysyvyys HCT-116 solut

jotta voidaan vahvistaa vaikutuksen dipeptidin L-karnosiini on ilmaus HIF-1α transkriptiotekijä, ihmisen koolonkarsinoomasoluja (HCT-116) käsiteltiin eri pitoisuuksia L-karnosiinin (0,5-100 mM). Erityisesti RT-PCR-analyysi, 24 h sen jälkeen, kun L-karnosiinin Lisäksi kävi ilmi, vakaan tilan HIF-1α-mRNA: iden tasot, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja (kuvio 1A). Seuraavaksi arvioidaan vaikutukset L-karnosiinin HIF-1α-proteiinin ilmentymisen HCT-116-solujen Western blot -analyysillä. Proteiinin tasot arvioitiin sekä hypoksia ja normoksia, sekä läsnäollessa (0,5-100 mM) ja ilman L-karnosiinin. Vuonna HCT-116 normoxic soluja, 50-100 mM L-karnosiinin vähentää ilmentymistä HIF-1α verrattuna kontrollinäytteeseen ei ole käsitelty L-karnosiini (kuvio 1 B). Havaitsimme myös, että hypoksian indusoima (by CoCl

2) ilmentymistä HIF-1α väheni hoidon jälkeen 50 tai 100 mM L-karnosiini (kuvio 1 C). Täplät uudelleen tuotettu vasta-aineilla vastaan ​​β-aktiini vahvistaa proteiinin kuorma vastaavuutta. Vahvista vähentäminen HIF-1α teimme immuunisaostustesti. Olemme havainneet, että HIF-1α-vasta-aineen immuunisaostumassa sisälsi merkittäviä määriä HIF-1α-proteiinin vasta kontrollinäytteessä (kuvio 2A). Lisäksi olemme tutkineet vaikutus L-karnosiinin upon HIF-1α proteiinisynteesiä soluissa käsitelty sykloheksimi- (CHX). Analyysi HIF-1α proteiinin vakauden CHX-käsitellyissä soluissa osoitti, että taso HIF-1α väheni L-karnosiini käsitellyt solut (50-100 mm), mikä viittaa siihen, että L-karnosiini vaikuttaa HIF-1α proteiinin stabiilisuuteen (Fig. 2B). Lisäksi tutkimme jos tämä dipeptidi voi olla mukana proteasomista hajoamista HIF-1α. Siksi arvioimme Western blot -analyysillä vaikutus proteasomin inhibiittoria MG132 on HIF-1α-proteiinin tasot hoidon jälkeen 50-100 mM L-karnosiinin. Kuten kuviossa 2C on esitetty, hoito 1 mM MG132 ja L-karnosiini 24 h lisäsi HIF-1α-proteiinin tason käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin tai soluihin, käsitelty MG132 yksin. Toinen osoitus osallistumisesta L-karnosiinin in HIF-1α proteasomin hajoamista saatiin transfektoimalla sisältävän vektorin ODD domeenin HIF-1α. Kuten kuviossa 2D on esitetty, lusiferaasin aktiivisuus vähenee huomattavasti 24 tuntia hoidon jälkeen L-karnosiini (100 mM).

(A) HIF-1α-mRNA: t mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä kokonais-RNA-valmisteen HCT -116 solut 24 tunnin kuluttua L-karnosiinin hoitoa. Valkoiset palkit osoittavat kertaiseksi muutoksia mRNA suhteessa määrään HIF-1α mRNA käsittelemättömissä soluissa ilmoitetaan arvo 1; (B) Western blot analyysi yhteensä uutteissa HCT-116-solut 24 tuntia sen jälkeen, kun L-karnosiini ja (C) L-karnosiini ja CoCl

2 hoito tutkittiin HIF-1α ja β-aktiini-vasta-aineita. Liittyvät histogrammit raportoivat densitometristä arvot HIF-1α /β-aktiini-suhde. Densitometrinen arvot edustavat keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Erot katsottiin merkitsevä ** p 0,001, *** p 0,0001.

(A) Western blotting-analyysi tutkittiin anti-HIF-1α-vasta immuunisaostettujen proteiinien HCT-116; (B) western blotting-analyysi koko proteiiniextraktien HCT-116-solut 24 tuntia sen jälkeen L-karnosiini (100 mM) tai L-karnosiini (100 mM) plus 10 mM sykloheksimidin (CHX) käsittely koetettiin HIF-1α ja β-aktiini vasta-aineita. Liittyvät histogrammit raportoivat densitometristä arvot HIF-1α /β-aktiini-suhde; (C) western blotting-analyysi koko proteiiniextraktien HCT-116-solut 24 tuntia sen jälkeen L-karnosiini (100 mM) tai L-karnosiini (100 mM) ja 1 mM MG132 hoito koetettiin HIF-1α ja β-aktiini vasta-aineita. Densitometrinen arvot edustavat keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Erot katsottiin merkitsevä ** p 0,001, *** p 0,0001; (D) Kaaviokuva ODD-LUC toimittaja vektori. ODD-LUC vektori sisältää hapen vaikutuksesta hajoamista (ODD) verkkotunnus HIF-1α kloonattu ylävirtaan lusiferaasigeenin. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja se edustaa keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Arvot on ilmoitettu prosentteina lusiferaasin aktiivisuus verrattuna 100%: iin käsittelemättömien solujen.

L-karnosiini Influence HIF-1α tumaansiirtymiseen vähentäminen transkriptionaalista aktiivisuutta Hypoksia reagoivan elementin (HRE) ja Expression sen alavirrassa Genes

Vakavoitu HIF-1α proteiini translokoituu sytoplasmasta tumaan, jossa se dimerisoituu kanssa HIF-1β muodostavien kopioinnin suhteen aktiivisia HIF-1 kompleksin. Siksi tumalokalisaatio HIF-1α on välttämätöntä transkriptionaalista aktiivisuutta HIF-1α. Vaikutus L-karnosiinin solunsisäinen lokalisaatio HIF-1α analysoitiin ensimmäisessä vaiheessa western-blottauksella määrityksessä käytetään soluliman ja ydinvoiman proteiinifraktiot sittemmin immunofluoresenssianalyysillä. Kuten on esitetty kuvioissa 3A ja 3B, L-karnosiini vaikuttaa translokaatio HIF-1α sytoplasmasta tumaan. Itse asiassa, kun HCT-116-soluja käsiteltiin L-karnosiini ydin- proteiinin tasot HIF-1α vähentynyt huomattavasti, kun taas sytosolin tasolle ei ollut vaikutusta. Myös immunofluoresenssianalyysillä (kuvio 3C) HIF-1α-signaalin L-karnosiini käsitellyissä soluissa oli heikosti havaittavissa käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin tai CoCl

2-käsitellyissä soluissa. Syöpäsoluissa, aktivoinnin HIF-1 kompleksi merkitsee sen yhdessä HRE motiivi säätelyalueita kohde- geenien glykolyyttisessä prosessissa. Tästä syystä, HCT-116-solut transfektoitiin väliaikaisesti HRE-lusiferaasireportteriplasmidi. Kuten on esitetty kuviossa 3D, käsittely 100 mM L-karnosiini aiheutti merkittävää lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen (24 h käsittelyn jälkeen). Tämän jälkeen arvioimme mRNA: t noin HIF-1α-riippuvaisia ​​geenejä. Me mitataan RT-PCR-analyysi vaikutuksia eri pitoisuuksia L-karnosiinin (0,5, 5, 50 ja 100 mM), mRNA: n tasot aldolaasi A: n ja PDK-1. Kuten on esitetty kuviossa 4B, aldolaasi A: n ja PDK-1-mRNA: t laskivat hoidon jälkeen L-karnosiini, erityisesti välillä 50 ja 100 mM. Western blot-analyysi aldolaasisekvenssien on osoitettu olevan myös vähentämistä proteiinin taso (kuvio 4C). Lisäksi havaitsimme, että ilmaus GLUT-1-proteiinia, sekä aldolaasisekvenssien C proteiinin vähentynyt jälkeen L-karnosiini käsittely (kuvio 4D ja 4E). Aldolaasi C on aivospesifisen isoformin aldolaasi, mutta viime aikoina on osoitettu, että mRNA-taso aldolaasisekvenssien C on 30-kertainen ihmisen mahasyövän solulinjoissa. Oligonukleotidisekvenssit, joita käytetään RT-PCR-analyysit on esitetty kuviossa 4A.

(A) Western blotting -analyysi sytosolin ja (B) tumaproteiiniuutteet HCT-116-solut 24 tuntia sen jälkeen, kun 20-50-100 mM L-karnosiini hoito tutkittiin HIF-1α, β-aktiini ja histoni H3 vasta-aineita. Liittyvät histogrammit raportoivat densitometristä arvot HIF-1α /β-aktiini ja HIF-1α /H3 suhteen. Densitometrinen arvot edustavat keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Erot katsottiin merkitsevä *** p 0,0001; (C) HCT-116 käsiteltiin CoCl

2 ja 100 mM L-karnosiini 24 tunnin tutkitaan fluoresenssi mikroskoopilla 40x suurennusta suodattimet sekundääristä vasta-ainetta vastaan ​​HIF-1α-proteiinia ja 4′-6′-diaminodino-2 -phenylindole (DAPI); (D) Kaaviokuva HRE-LUC toimittaja vektori. HRE-LUC vektori sisältää yhdeksän toista sekvenssit hypoksiavaste Element (HRE) kloonattu ylävirtaan lusiferaasigeenin. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja se edustaa keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Arvot on raportoitu prosentteina lusiferaasin aktiivisuus verrattuna 100% käsittelemättömien solujen.

(A) Taulukossa raportoi alukesekvensseissä käytetään Real Time PCR kokeet; (B) aldolaasisekvenssien A ja PDK-1 mRNA

S mitattiin reaaliaikaisella PCR kokonais-RNA-valmisteen HCT-116-solut 24 tuntia sen jälkeen L-karnosiinin hoitoa. Pylväät osoittavat kertamuutoksia mRNA

S suhteessa määrään aldolaasisekvenssien A ja PDK1 mRNA käsittelemättömissä soluissa ilmoitetaan arvo 1; (C), (D) ja (E) western blotting-analyysit yhteensä uutteissa HCT-116-solut 24 tuntia sen jälkeen, kun L-karnosiini hoito tutkittiin aldolaasi A, aldolaasi C, GLUT-1 ja β-aktiini-vasta-aineita. Histogrammit raportoivat densitometristä arvot aldolaasisekvenssien A /β-aktiini-suhde, Aldolaasientsyymit C /β-aktiini-suhde ja GLUT-1 /β-aktiini-suhde. Densitometrinen arvot edustavat keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen. Erot katsottiin merkitsevä ** p 0,001, *** p 0,0001.

antioksidantti yhdisteiden vaikutus 1 ja 2 verrattuna L-karnosiini

sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) aikana hypoksia tuottaa redox signaalin HIF-1α induktio. Itse asiassa jotkut kirjoittajat määrittelevät ROS positiivisina säätelijöinä HIF-1α [20]. Havainto, että muita antioksidantit voivat vaikuttaa tasoon HIF-1α proteiini johti meidät arvioimaan antioksidantti on kaksi uutta bis-diaminotriazole yhdisteiden (1 ja 2) (kuvio 5A), verrattuna, että L-karnosiinin, jonka DPPH määritys. Ensin mittasimme prosenttiosuus DPPH inaktivaation käyttäen 1 mM pitoisuuden kaikille yhdisteille, ja osoitimme, että yhdisteet 1 ja 2 omaavat suuren aktiivisuutta ROS scavengers verrattuna L-karnosiini (katso taulukko kuvassa 5B). Seuraavaksi tutkimme solunsisäistä ROS: n syntyminen indusoi L-karnosiini (100 mM) HCT-116-solut, ja sitä verrattiin määrään ROS tuottaa käsittelemällä saman solulinjan eri pitoisuuksien kanssa (0,05-0,5 mM) yhdisteiden 1 ja 2. Kuten on esitetty kuviossa 5C, hoidon, 0,1 ja 0,5 mM 1 ja 2 vähensi solunsisäisen ROS sukupolven HCT-116 noin 40-50%, samalla tavalla kuin 50-100 mM L-karnosiinin. Lopuksi arvioitiin myös vaikutus eri pitoisuuksia 1 ja 2 (+0,05-+0,5 mM) on HIF1-α ilmentymisen ja solujen elinkykyä. Kuten kuvioissa 6A ja 6B, lisäämällä 1 ja 2 ei ollut vaikutusta HIF-1α-proteiinin tasot eikä proliferaatiota. Lisäksi arvioimme klonogeenisten -eloonjäämiskoe kyky HCT-116-solujen proliferaatiota ja muodostaa suuri pesäke tai klooni läsnä ollessa L-karnosiinin tai 1 tai 2 (kuvio 6C). 50 mM L-karnosiini vähensi merkittävästi pesäkkeiden lukumäärä suhteessa käsittelemättömään kontrolliin näyte, kun taas yhdisteet 1 ja 2 ei vaikuttanut solujen kyky muodostaa pesäkkeitä on testattu pitoisuus. Virtaussytometria-analyysiä (FACS) vahvistettiin, että 1 ja 2 ei ollut vaikutusta solusyklin ja apoptoosia ei HCT-116-soluja (tietoja ei esitetty). Varhainen apoptoottinen kuolleisuus HCT-116-solut käsiteltiin kahta yhdistettä ei ollut merkittävästi erilainen kuin kontrollinäytteestä.

(A) Kemialliset rakenteet yhdisteiden 1 ja 2; (B) Antioksidantit aktiivisuus L-karnosiinin, 1 ja 2 mitattuna DPPH menetelmällä kuten jaksossa 1.2.4; (C) ROS tuotanto arvioitiin 24 h lisäyksen jälkeen L-karnosiinin, 1 ja 2 HCT-116-solujen koetin 2 ’, 7’-dikloori-diasetaatti (H2DCF-DA). Kaikki arvot ovat keskiarvoja ± SDS kolmen riippumattoman kokeen ja ne ilmaistaan ​​prosentteina verrattuna 100% kontrollisoluja. Erot katsottiin merkitsevä ** p 0,001, *** p 0,0001.

(A) Western blot analyysi koko uutteissa HCT-116-solujen hoidon jälkeen yhdisteiden 1 ja 2 koetettiin HIF-1α ja β-aktiini vasta-aineita. Histogrammit raportoivat densitometristä arvot HIF-1α /β-aktiini-suhde. Densitometrinen arvot edustavat keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen; (B) solujen lisääntyminen mitattiin MTT-määrityksellä HCT-116-solut 24 tuntia hoidon jälkeen yhdisteiden 1 ja 2. Kaikki arvot edustavat keskiarvoa ± SDS kolmen riippumattoman kokeen ja ne ilmaistaan ​​prosentteina verrattuna 100% kontrollisolujen ; (C) klonogeeninen -eloonjäämiskoe HCT-116-hoidon jälkeen L-karnosiini (50 mM) tai yhdisteitä 1 ja 2 (0,5 mmol) suhteessa käsittelemättömiin soluihin.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa arvioimme vaikutus L-karnosiinin kohtelu HIF-1α aktiivisuutta ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. [28].