Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia tärkeä rooli vastus syöpäsolujen kemoterapiaa. Kuitenkin tarkka mekanismeista tätä prosessia ei ymmärretä hyvin. Lisäksi mukaan solulinjat, hypoksia eri vaikuttaa solun kuolemaan. Tutkimus vaikutuksista hypoksia indusoiman apoptoosin 5 kemoterapeuttisten 7 syöpäsolutyyppien osoitti, että hypoksia yleensä esti lääkkeen indusoiman apoptoosin. Useimmissa tapauksissa vaikutus hypoksian oli sama kaikille lääkkeet yhdessä solutyypissä. Ilmaisu profiili 93 osallistuvien geenien apoptoosin samoin kuin proteiinin taso BCL-2: n perheen proteiinit jälkeen tutkittiin. HepG2-solut, jotka ovat vahvasti suojattu solukuoleman hypoksia, hypoksia vähentynyt runsaasti lähes kaikki pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit, kun taas yksikään niistä vähenevät A549-soluja, joita ei ole suojattu solukuolemaa hypoksian. HepG2-solut, hypoksia laski NOXA ja BAD runsautta ja muutettu elektroforeettisen liikkuvuuden BIM

EL. BIM ja NOXA ovat tärkeitä välittäjiä etoposidi-indusoituvaa solukuolemaa HepG2-soluissa ja hypoksian aiheuttama muutos näiden proteiinien runsaasti tai translaation jälkeiset modifikaatiot selittää osittain chemoresistance. Lopuksi, modulaatio runsautta ja /tai translaation jälkeisiä modifikaatioita useimpien proteiinien BCL-2: n perheen hypoksia liittyy p53-riippuvainen ja riippumattaman reittejä ja on riippuvaista solutyypistä. Parempi käsitys näistä solusta soluun vaihtelut on ratkaisevan tärkeää, jotta voidaan voittaa hypoksian aiheuttamaa vastusta ja lievittävät syövän hoidossa.

Citation: Sermeus A, Genin M, Maincent A, Fransolet M, Notte A, Leclere L, et ai. (2012) Hypoksia aiheuttama modulaatio Apoptosis ja Bcl-2-proteiinit eri Cancer Cell tyypit. PLoS ONE 7 (11): e47519. doi: 10,1371 /journal.pone.0047519

Editor: Elad Katz, University of Edinburgh, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 12 syyskuu 2012; Julkaistu: 5. marraskuuta 2012

Copyright: © 2012 Sermeus et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AS ja ovat Research Fellow FNRS (Fonds de la Recherche scientifique, Belgia). MG ja LL tukevat FRIA (Fonds pour la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture, Belgia). HR on vastaanottajan FNRS-Télévie avustusta. Tässä artikkelissa esitellään tuloksia Belgian Ohjelman Interuniversity puolalaiset vetovoima aloittanut Belgian valtio, VNK, tiedepolitiikan ohjelmointi. Vastuu kuulu sen tekijöistä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on yksi tärkeimmistä kuolinsyistä kehittyneissä maissa. Hoidot sisältävät usein käyttö kemoterapian mutta lääkeresistenssi on yleinen syy hoidon epäonnistumiseen ja uusiutumisen. Useimmat kemoterapeuttiset lääkkeet aiheuttaa solukuoleman laukaisemalla apoptoosin. Apoptoosi säätelee proteiinien BCL-2 (B-solulymfooma-2) perhe, joka pääasiassa toimittava mitokondrioiden tasolla. Tämä proteiinien perhe voidaan jakaa kolmeen luokkaan sen mukaan, toiminta ja rakenne proteiinien [1]. Ensimmäinen, BAX: n kaltaiset proteiinit, kuten BAX (BCL-2 liittyvä x-proteiinin) ja BAK (BCL-2 homologinen antagonisti /tappaja), ovat kuolemaan tekijöitä. Aktivoinnin jälkeen ne oligomerise klo mitokondrioita ja aiheuttaa mitokondrioiden ulkokalvon permeabilisation, joka provosoi solukuoleman. Bcl-2: n kaltaisia ​​proteiineja, kuten BCL-2, Bcl-x L (B-solulymfooma-extra suuri), BCL-w ja MCL-1 (myeloidisolun leukemia 1), ovat selviytymisen tekijöistä. Ne muodostavat heterodimeerejä BAX /BAK ja estävät niiden toiminnan. Lopuksi BH3 (BCL-2-homologiadomeeni 3) -vain proteiinit, kuten BID (BH3-vuorovaikutuksessa domain syöttämällä agonisti), BAD (BCL-2-antagonisti solukuoleman), BIM (BCL-2: n kanssa vuorovaikutuksessa välittäjä solun kuolema), BIK (BCL-2 vuorovaikutuksessa tappaja), PUMA (p53 ilmen- tymisen lisääntymisen modulaattori apoptoosin) ja NOXA, apoptoosin neutralisoimalla antiapoptoottisten BCL-2: n kaltaisten molekyylien ja joidenkin niistä suoraan aktivoimalla BAX /BAK. Vuonna terveitä soluja, BH3-vain proteiinit eivät joko ole läsnä tai pitää ei-aktiivinen tai erottautuvat. Sen jälkeen proapoptoottiset signaalit, ne tulevat transkriptionaalisesti ilmen- tymisen lisääntymisen ja /tai translaation jälkeen modifioitu (ja /tai relocalised) saada täyden proapoptoottiset toiminto [1], [2].

Yksi tärkeimmistä syistä vastustuskyky kemoterapia indusoimaan apoptoosin on p53-mutaatio. p53 on todellakin keskeinen pelaajalle apoptoosin induktio korosti soluissa [3], [4] Toinen tunnettu syy vastus on kasvain hypoksia [5]. Vaikutukset hypoksia syöpäsoluihin ovat solutyyppi riippuvaisia ​​ja vaihtelevat voimakkuuden ja keston puute O

2. Vaikea ja pitkäaikainen hypoksia voi käynnistää apoptoosin tai nekroosin kun lievä hypoksia on suojaava [6], [7]. Itse asiassa lievä hypoksia häiritsee useiden komponenttien apoptoottisen reitin transkriptionaalisella sekä post-translaation tasolla.

Edelliset tulokset ryhmämme osoitti, että hypoksia suojaa kasvainsolujen indusoiman apoptoosin kemoterapeuttiset aineet. Hypoksia suojaa HepG2-soluissa vastaan ​​etoposidi-indusoitua apoptoosia sekä MDA-MB231-soluja vastaan, paklitakselin indusoiman apoptoosin [8], [9], [10]. Kuitenkin muissa solutyypeissä, hypoksia ei ehkä ole mitään vaikutusta tai jopa pahentaa indusoiman apoptoosin kemoterapeuttiset aineet. Se on esimerkiksi tapauksessa etoposidi indusoiman apoptoosin A549 ja MCF-7-soluissa sekä epirubisiini indusoiman apoptoosin MDA-MB231-soluissa [8], [10]. Nämä tulokset ovat myös korostanut, että soluvasteita hypoksia on hyvin monimutkainen, eri signaalintransduktioreitteihin sekä useita transkriptiotekijöitä. Erityisesti p53 transkriptiotekijä näyttää olevan tärkeä rooli solun käyttäytymistä hypoksiaolosuhteissa [8]. Tavoitteena työ on ymmärtää, miten hypoksia saattaa eri tavalla vaikuttaa kemoterapeuttisen lääkkeen aiheuttama apoptoosin syöpäsoluissa. Siksi meidän ensimmäinen laajennettu aiemmat havainnot käyttäen 7 syöpäsolun linjat, jotka ovat peräisin eri elimissä ja joilla on erilaiset p53 asema, altistettiin 5 apoptoosia aiheuttavat lääkkeet käytetään kemoterapiassa, jotka kohdistuvat eri solureiteillä. Useimmissa tapauksissa, hypoksia osittain välttää solukuoleman ja vaikutus hypoksian oli sama kaikille lääkkeet yhdessä solutyypissä. Toiseksi, havaitsimme, että hypoksia moduloitu runsaasti useimpien proteiinien BCL-2: n perheen solutyypissä-riippuvaisella tavalla. Kolmanneksi HepG2-soluissa, jotka on suojattu hypoksia vastaan ​​etoposidi-solukuolema, havaitsimme lasku BAD ja NOXA proteiinin tasolla sekä muutos elektroforeettisen liikkuvuuden BIM

EL (BIM pidemmät) in hypoxia- Inkuboidut solut. Tulokset mitätöintiä tutkimukset viittaavat siihen, että yhdistetyn menetys BIM ja NOXA aikana hypoksiaa ainakin osittain osuus chemoresistance.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hypoksia Incubation

Human hepatooma- HepG2-soluissa, ihmisen keuhkojen A549-soluja, ihmisen rinta- adenokarsinooma MDA-MB231-soluja, ihmisen hepatooma Hep3B-solut, ihmisen osteogeeninen sarkooma U2OS soluja, ihmisen koolonin adenokarsinooma HT-29-solujen ja ihmisen eturauhasen adenokarsinooma PC-3-soluja (ATCC) pidettiin kulttuuri 75-cm

2 polystyreeniä pulloissa (Costar) ja vastaavasti D-MEM (matala glukoosi) (Gibco), MEM (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), joka sisälsi 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä (Gibco), Mc Coy 5A-alustassa (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) ja F12 Kaighn väliaineessa (Gibco), joka sisälsi 10% FCS: ää ja inkuboitiin atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2.

hypoksia kokeissa soluja inkuboitiin seerumittomassa CO

2-riippumatonta väliaineessa (Invitrogen), jota oli täydennetty 0,5 mM L-glutamiinia (Sigma) kanssa tai ilman etoposidi (Sigma), metotreksaatti (Sigma), paklitakseli (Molecular Probes), sisplatiinia (Sigma) tai kamptotesiinin (Sigma) 16 tuntia. Inkubointi hypoksiaolosuhteissa suoritettiin kotitekoisia yrityshautomot sisälsi 99% N

2 ja 1% O

2. Taso hypoksia keskipitkällä meidän kokeellisissa olosuhteissa on 10 mm Hg liuenneen hapen keskipitkän. Tämä taso hypoksia saavutetaan noin 10 minuutin inkuboinnin jälkeen. PO

2 tasoa mitattiin liuenneen hapen mittari (Inolab Oxi 730) varustettu Cellox 325 anturi. Normoxic ohjaus soluja inkuboitiin samoissa olosuhteissa, mutta normaalissa atmosfäärissä (21% O

2).

siRNA transfektio

siGENOME SMARTpool ihmisen (Dharmacon; käytettiin 50 nM) BCL2L11 ( BIM, M-004383-02), PMAIP1 (NOXA, M-005275-03), BAD (M-003870-02) tai TP53 (M-003329-03) transfektoitiin DharmaFECT1 transfektioreagenssin (Dharmacon; käytetään sellaisena 1:500 laimennus). Kun yhdistetään BIM ja NOXA siRNA, kukin siRNA käytettiin 25 nM. SiGENOME RISC-Free ohjaus siRNA (D-001220-01, Dharmacon, käytettiin 50 nM) tai siGENOME Non-kohdistaminen siRNA Pool # 1 (D-001206-13, Dharmacon, käytettiin 50 nM) käytettiin negatiivisina kontrolleina. Soluja inkuboitiin 24 tuntia transfektion väliaine ja Sitten väliaine korvattiin tuoreella alustalla, jossa oli 10% FCS. 6 tuntia myöhemmin (tai 30 tuntia myöhemmin BIM siRNA), soluja inkuboitiin hypoksiaolosuhteissa tai normoksia kemoterapeuttisten aineiden tai ei.

subsellulaarifraktiointikokeet

Solut, kylvetään 75-cm

2 pulloja, kerättiin sakkaroosi M /4 ja homogenoitiin 3 lyöntiä B-männän Dounce. Homogenaattia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 1418

g

(Labofuge 400R Heraeus Instruments). Supernatantti otettiin talteen ja sentrifugoitiin 81085

g

(Beckman L7-35, roottori 50 Ti) ajaksi riippuvainen tilavuuden. Pelletti suspendoitiin uudelleen sakkaroosi M /4 ja nimetty MLP jae. Supernatantti väkevöitiin sentrifugoimalla Amicon Ultra-4 putkia (Millipore) ja nimetty S osa. Kaikki näytteet lopulta homogenisoitiin sonikoimalla.

Western blot -analyysi

Proteiinin uutto suoritettiin, kuten on kuvattu [9]. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE 15% polyakryyliamidigeelillä, on 4-12% NuPAGE Bis-Tris geeleillä MES-puskurilla (Invitrogen) tai 3-8% NuPAGE Tris-asetaatti geelit (Invitrogen) ja sitten siirrettiin PVDF-kalvolle (Hybond-P, Amersham varten kemiluminesenssidetektiolla tai Immobilon-FL, Millipore fluoresenssin havaitsemiseen). Kemiluminesenssidetektiolla suoritettiin, kuten on kuvattu [11] käyttämällä inkuboimalla yön yli erityisiä primaaristen vasta-aineiden. Fluoresenssin havaitsemista, kalvoja blokattiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa Odyssey estopuskurilla (LI-COR) ja sitten yön yli 4 ° C: ssa Odyssey estopuskurissa jossa oli 0,1% Tween, joka sisälsi spesifistä vasta-ainetta. Kun 4 x 5 minuuttia pesua PBS-Tween 0,1% ja inkubaatio sekundaari- vasta-aineella (vuohen anti-kani tai anti-hiiri-IRDye-leimattua vasta-ainetta, LI-COR, 1:10,000 laimennus) suoritettiin 1 tunti Odyssey esto puskuri, jossa oli 0,1% Tween seurasi 4 pesua 5 minuuttia PBS-Tween ja 2 pesua PBS: ssä. Kalvo kuivattiin sitten 1 tunti 37 ° C: ssa ja skannata Odyssey infrapuna Imaging System (LI-COR).

Immunofluoresenssivärjäys

HepG2-solut ympättiin 40000 solua /hyvin suojalasin diat 24-kuoppaisilla levyillä. Inkuboinnin jälkeen tai ilman etoposidin tai paklitakselia, immunofluoresenssivärjäys suoritettiin, kuten on kuvattu [11]. Ensisijainen vasta-alfa-tubuliinin värjäytymistä hiiren anti-alfa-tubuliinin (# T5186 Sigma) (1/100 laimennos). Alexa Fluor-647-konjugoitua anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Molecular Probes) käytettiin 1/1000 laimennus.

kaspaasi-3/7 Activity Assay

fluorogeenisen substraatin Ac-DEVD-AFC (BD Pharmingen), käytettiin mittaamaan kaspaasi-3/7 aktiivisuuden mukaan [12]. Solu-uutteet valmistettiin, kuten on kuvattu [13]. Solut ympättiin 25-cm

2 pulloihin. Määritys kaspaasi 3/7 aktiivisuus suoritettiin [8] käyttäen 20 ug uutteet.

laktaattidehydrogenaasin Release Assay

(LDH) vapautuminen mitattiin ”Sytotoksisuus Detection Kit ”Roche Applied Science kuvatulla [9]. Elatusaineet alkaen inkuboidaan solut poistettiin ja sentrifugoitiin pelletoimiseksi solufragmenteilla ja apoptoottisia kappaleita. Jotta solujen hajottamiseksi, Triton X100 (Merck), 10% PBS: ssä, lisättiin tämän pelletti sekä solut jäävät kiinni pohjassa kuoppien. Prosenttiosuus LDH: n vapautuminen laskettiin seuraavasti: [LDH-aktiivisuuden väliaineessa (1) + LDH-aktiivisuus solujen fragmentteja ja apoptoottisten kappaleiden (2)] /[(1) + (2) + LDH-aktiivisuus solujen jäljellä kuopissa].

Transient transfektio ja lusiferaasimääritys

Solun transfektio suoritettiin 24-kuoppalevyillä (50000 solua per kuoppa ja HepG2 ja MDA-MB231-soluja, 30000 A549-solut ja 40.000 Hep3B-solut) SuperFect reagenssilla (Qiagen). 923 ng (1385 ng MDA-MB231-solut) ja reportteriplasmidilla pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc, joka sisältää 6 HRE cis-elementtejä PGK-geenin liittyy tymidiinikinaasin pohjapinta promoottori ja tulikärpäsen lusiferaasi geeni [14], jotka ko-transfektoitiin 577 ng (115 ng MDA-MB231-solut) normalisointi vektorin (pCMVβ vektori, joka koodaa β-galaktosidaasi, Clontech) väliaineessa ilman seerumia 6 tuntia (tai 3 tuntia Hep3B-solujen ennen uuden väliaineen tuoreella kasvualustalla). Jälkeenpäin soluja inkuboitiin hypoksiassa tai normoksia 16 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut hajotettiin Passive Lysis Buffer (Promega) ja β-galaktosidaasi määritettiin rinnakkain tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus, määritettiin käyttäen Luciferase Assay System (Promega).

Taqman Low Density Array

inkuboinnin jälkeen kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRI-reagenssia Solution (Applied Biosystems). mRNA sisältyvät 2 ug kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttämällä ”High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” Applied Biosystems mukaan valmistajan ohjeiden. 100 ng retro- transskriboidun kokonais-RNA: 50 ui sekoitettiin sitten 50 ul: aan ”Taqman Universal PCR Master Mix” (Applied Biosystems) ja ladataan yksi 8 täyttöä satamissa mikrofluidistiikkaan array. ”TLDA Human Apoptosis Panel” ovat 384-kuoppaiset mikrofluidinen kortit, jotka sisältävät määritykset 96 ihmisen geenit. Niiden avulla suorittaa 96 reaaliaikainen PCR-reaktioissa samanaikaisesti 4 näytettä. mRNA: n ekspression taso kvantitoitiin käyttäen kynnyssyklinä menetelmää 18S ohjearvon geenin.

RT Real-time-PCR mRNA kvantifiointi

Inkuboinnin jälkeen kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRI-reagenssia Solution (Applied Biosystems). mRNA sisältyvät 2 ug kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttäen SuperScript II käänteistranskriptaasi (Invitrogen). Eteenpäin ja käänteinen alukkeiden sekvenssit ovat saatavilla taulukossa S1 ja suunniteltiin käyttäen Primer Express 1.5 ohjelmisto (Applied Biosystem). Monistusreaktio määrityksissä sisälsi 1 x SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja alukkeita (Applied Biosystems, 300 nM). RPL13A käytettiin viitteenä geeni normalisoinnin ja mRNA: n ilmentymisen taso kvantitoitiin käyttäen kynnyssykli menetelmällä.

Heatmap ja TILASTOANALYYSI

Heatmaps kertyi tietojen kanssa muunnettava logaritmi pohja 2 tulokset TDLA (n = 1) ja keinot kolme arvoa qRT-PCR-tuloksiin. Tilastolliset analyysit tehtiin ANOVA 1 ja Tukeyn monivertailu testeissä käytetään GraphPad Prism.

Tulokset

Hypoksia on erilaisia ​​vaikutuksia Drug aiheuttama solukuolema erityyppisten solujen

jotta saataisiin tarkempi käsitys mekanismien aloittanut hypoksia, jotka johtavat syöpäsolujen vastustuskyky, laajensimme aiempien huomautusten muilla syöpäsolulinjoja peräisin eri elimissä ja joilla on erilaiset p53 asema ja muut apoptoosia indusoivien kemoterapeuttiset lääkkeet, jotka kohdistuvat eri solureiteillä . Käytetyt solulinjat ovat HepG2 (p53 villityypin hepatoomasolut), A549 (p53 villityypin keuhkokarsinooma solut), U2-OS (p53 villityypin osteogeeninen sarkooma solut), MDA-MB231 (p53-mutantti rinta-adenokarsinoomasoluja), HT-29 (p53 mutantti paksusuolen adenokarsinoomasolua), Hep3B (p53-tyhjä hepatoomasolujen) ja PC-3 (p53 null eturauhasen adenokarsinoomasolua) soluja. Kemoterapeuttisten aineiden valittu ovat etoposidi (topoisomeraasin II estäjä), metotreksaatti (DNA ja RNA-synteesin estäjä), paklitakseli (estäjä mikrotubulusdynamiikan), sisplatiini (alkyloiva aine) ja kamptotesiiniä (topoisomeraasi I: n estäjä).

Ensinnäkin, lääkkeen konsentraatio käyttää kunkin solutyypin valittiin määrittämällä kaspaasi-3/7 aktiivisuus 16 tunnin kuluttua inkubaation huumeita. Kussakin tapauksessa konsentraatio joka indusoi kohtalaisesti apoptoosin valittiin. Sillä aineet indusoiva ei kaspaasiaktiivisuus, yleistä toksisuutta arvioitiin mittaamalla laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapauttaa 40 tunnin kuluttua inkubaation tekijöille. Kun pitoisuudet valittiin, vaikutus hypoksian (1% O

2) indusoimaa solukuolemaa kunkin aineen jokaisessa solutyypissä tarkkailtiin kahden samoja tekniikoita (kuvio 1).

HepG2 , A549, U2OS, MDA-MB231, HT-29, Hep3B ja PC-3-soluja inkuboitiin alla normoksia (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2) puuttuessa (CTL) tai läsnäolo etoposidi (ETO), paklitakseli (TAX), sisplatiini (CIS) tai kamptotesiinin (CPT) 16 (A, C, E, G, J) tai 40 tuntia (B, D, F, H, I, K) . Pitoisuus käytetään kunkin molekyyli ilmoitettu kuvaajat (uM). (A, C, E, G, J), kaspaasi-3/7-aktiivisuus määritettiin mittaamalla fluoresenssi vapaa AFC vapautuu katkaisun kaspaasin 3/7 spesifisen substraatin Ac-DEVD-AFC. Tulokset ilmaistaan ​​suhteessa fluoresoivan (RFU) keskiarvoina ± 1 SD (n = 3). (B, D, F, H, I, K) LDH: n vapautuminen arvioitiin. Tulokset on esitetty prosentteina keskiarvoina ± 1 SD (n = 3). (A-K) Tilastollinen analyysi suoritettiin ANOVA 1. ns: ei-merkitsevä; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Symbolit yläpuolella normoxic sarake ovat vertailu normoxic ohjaus ja symbolit yläpuolella hypoksinen sarake ovat verrattuna vastaavaan normoxic ehto (joko samalla).

Havaitsimme, että, yleensä, p53 mutatoitunut tai null-solut ovat vaikeampia tappaa kuin p53 villityypin soluissa. Useimmissa tapauksissa vaikutus hypoksian solukuolemaan oli sama kaikissa molekyyleissä yhdessä solutyypissä. Kuitenkin tämä vaikutus vaihtelivat solutyypin. Havaitsimme myös, että hypoksia oli useammin suojaava vaikutus solukuolemaa kuin raskauttava vaikutus. Esimerkiksi hypoksia suojattu HepG2 ja MDA-MB231-soluissa vastaan ​​solukuolema kaikki molekyylit testata havaitsimme mitään vaikutusta tai pahenemista lääkkeen aiheuttamista solukuoleman hypoksia A549 ja Hep3B soluja. Hypoksia voi siis suojata p53 villityypin sekä p53 mutatoituja soluja. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset syntyy matriisi tietoja vaikutuksesta hypoksia indusoiman apoptoosin 5 molekyylien 7 solutyypeissä (taulukko 1). Tulokset osoittivat, että vaikutus hypoksian on erilainen sen mukaan, solun tyypin, mutta vakio kaikille huumeita yhdessä solutyypissä. Parhaan tietomme mukaan tämän havainnon ei ole koskaan aikaisemmin.

Expression profiili mRNA ja proteiinit Mukana apoptoosi erityyppisten solujen

Jotta ymmärtää miksi hypoksia suojattu jotkut solulinjat vastaan ​​huumekuoleman mutta ei muita, valitsimme neljä solulinjojen kätkeminen eri p53 asema ja joiden vaikutus hypoksia on erilainen: HepG2, A549, MDA-MB231 ja Hep3B soluja. Käytimme etoposidi kuten solukuoleman induktori, koska se on tehokas kaikissa neljässä solulinjoissa ja sen toimintatapa on hyvin tiedossa. Vaikutus hypoksia paklitakselin aiheuttama kuolema HepG2-soluissa tutkittiin myös.

Etoposide ja paklitakselin ovat Aktiivinen ja HIF-1 aktivoidaan hypoksiaolosuhteissa kaikissa solutyypeissä

Hypoksia on kuvattu usein estämään vahingollista vaikutusta kemoterapia-aineiden [15]. Jotta voidaan tarkistaa, jos hypoksia estää etoposidi aiheuttaman DNA-vaurioita ja /tai paklitakselia aiheuttama mikrotubulusten vakiintuminen tai jos se toimii tasolle alavirtaan aiheuttamien vahinkojen lääke, ATM (ataksia teleangiektasia mutatoidun) fosforylaatio tutkittiin 1 tunnin kuluttua etoposidi inkubaation ja morfologia mikrotubulusten kuitujen tutkittiin 16 tunnin jälkeen paklitakselin altistuksen. Etoposide laukaisee solukuoleman indusoimalla kaksijuosteisen DNA katkoksia, jotka johtavat ATM aktivointia. Tulokset osoittivat, että se todellakin indusoi fosforylaatiota ATM neljän solutyypeissä. Ei vaikutusta hypoksian havaittiin induktio P-ATM, jopa HepG2 ja MDA-MB231-soluja, jossa hypoksian laski etoposidi-indusoitua apoptoosia (kuvio 2A). HepG2-solut, jotka on suojattu hypoksia paklitakseli-välitteisen solukuoleman, hypoksia ei näytä muodostumisen estämiseksi paksun mikrotubulusten kuitujen aiheuttama paklitakseli (kuvio 2B ja tietoja ei ole esitetty). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että hypoksia suojaa soluja alavirtaan lääkkeen aiheuttama vahinko.

(A) vaikutus hypoksian, etoposidi ja paklitakselilla runsautta ja fosforylaatiota ATM. HepG2, A549, MDA-MB231 ja Hep3B-soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan normoksia (N, 21% O

2) tai hypoksian (H, 1% O

2), kun läsnä vai ei (CTL) etoposidia (ETO, 100 uM Hep3B soluissa ja 50 uM toisessa solutyypeissä) tai paklitakselin (TAX, 10 uM) HepG2-soluissa. ATM ja P-ATM havaittiin tumaproteiiniuutteet western-blottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta. Rajaamaton western blotit on esitetty kuvassa S1. (B) vaikutus hypoksia, etoposidi ja paklitakselilla mikrotubulusten. HepG2-soluja inkuboitiin 16 tuntia normoksia (21% O

2) tai hypoksian (1% O

2), kun läsnä vai ei etoposidia (50 uM) tai paklitakselia (10 uM). Inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin, permeabilised ja värjättiin alfa-tubuliinin käyttäen spesifistä vasta-ainetta. Havainnointi suoritettiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla jolla on vakio valomonistimen.

Monet suojaavia vaikutuksia hypoksia välittyvät HIF-1 (hypoksia-indusoituva factor-1) transkriptiotekijä, joka on heterodimeeri, joka koostuu yksi konstitutiivisesti alayksikkö, HIF-1-beeta, ja yksi alayksikkö stabiloidaan vain hypoksisissa olosuhteissa, HIF-1-alfan [5]. Siksi tutkittiin, jos tämä tekijä tehokkaasti käyttöön hypoksian solulinjoissa, jossa hypoksia ei ole suojaava vaikutus (kuvio 3). Hypoksian aiheuttamaa kertyminen HIF-1-alfa mutta etoposidi laski tämän kertymistä A549, MDA-MB-231 ja Hep3B soluja. HepG2-solut, etoposidi ei ollut lainkaan tai lievä inhiboiva vaikutus mukaan kokeen. Vaikutus Etoposidin on HIF-1-alfa-proteiinin taso on jo todettu [16]. Arvioima lusiferaasireportteri, HIF-1 oli aktiivinen jokaisessa solutyypissä aikana hypoksiaa ja tämä korreloi mRNA runsaasti kaksi sen kohdegeenien (LDHA ja BNIP3).

HepG2, A549, MDA-MB231 ja Hep3B-soluja inkuboitiin 16 tuntia normoksia (N, 21% O

2) tai hypoksian (H, 1% O

2) (AD), kun läsnä vai ei (CTL) ja etoposidi (ETO, 100 uM in Hep3B soluissa ja 50 uM toisessa solutyypeissä) tai paklitakselin (TAX, 10 uM) HepG2-soluissa (A, C, D). (A) HIF-1-alfa havaittiin yhteensä solu- uutteiden Western-blottauksella käyttämällä spesifistä vasta-ainetta. Alfa-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta. Rajaamaton western blotit on esitetty kuvassa S1. (B) ennen inkubointia, solut ko-transfektoitiin kanssa pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc-reportterin plasmidilla, joka koodaa tulikärpäsen lusiferaasi ja pCMVß normalisointi plasmidi. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona välistä suhdetta, tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuus ja ß-galaktosidaasin aktiivisuus ± 1 SD (n = 3). Tilastollinen analyysi suoritettiin ANOVA 1. ***: P 0,001. Symbolit ovat vertailun normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa saman solutyypin. (C, D) inkuboinnin jälkeen kokonais-RNA uutettiin, toimitettiin käänteistranskriptio ja sitten monistus läsnä ollessa SYBR Green ja spesifisiä alukkeita BNIP3 (c) tai LDHA (D). RPL13A käytettiin taloudenhoito geeni datan normalisointi. Tiedot esitetään kertainen induktio keskiarvona ± 1 SD (n = 3). Tilastollinen analyysi suoritettiin ANOVA 1. ns: ei-merkitsevä; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Symbolit yläpuolella hypoksinen pylväät ovat verrattuna vastaavaan normoxic ehto (joko samalla).

Yhteenvetona että hypoksia suojaa HepG2 ja MDA-MB231-solujen kuolemaa vastaan, mutta ei A549 ja Hep3B soluja ei voitu selittää eroa etoposide- tai paklitakselin aiheuttama vahinko tai HIF-1 aktivaatio.

Expression profiili mRNA apoptoosiin liittyvässä

tulokset kuviosta 2 viittaavat siihen, että ero vaikutus hypoksia solukuolema tapahtuu alavirtaan induktion soluvaurioita. Meillä on siis oletettu, että hypoksia vaikuttaa signaalitransduktioreaktioteihin jotka laukaisevat apoptoosin. Nämä reitit ovat erityisesti riippuen p53 vaan myös muista transkriptiotekijät. Geenien ilmentyminen tutkimukset suoritettiin näin löytää geenit, joiden ilmentymiseen eri säädellään hypoksia suojelualueilla soluissa verrattuna ei-suojattuja soluja. Taqman Low Density Array (Applied Biosystems), joka mahdollistaa tutkimuksen runsaudesta 93 mRNA: iden tiedetään osallistuvan apoptoosin prosessiin (sekä 3 siivous mRNA: t) käytettiin. Tulokset on esitetty lämpökarttana kuviossa 4, kun taas numeeriset arvot esitetään taulukossa S2. Kuten odotettua, havaitsimme induktio HIF-1 kohdegeenien (BNIP3, BNIP3L ja GAPDH) 16 tunnin hypoksian neljässä solutyypeissä. Induktio p53 kohdegeenien (Rahastolla-1, BAK1 ja BAX) havaittiin HepG2 ja A549-soluja 16 tunnin jälkeen etoposidia inkuboinnin, mutta ei p53 mutatoitunut (MDA-MB231-solut) tai nolla (Hep3B-soluja) solut. P53 kohdegeenin PMAIP1 (NOXA) indusoitiin etoposidin kaikissa solutyypeissä.

Tulokset saatiin käyttämällä ”TLDA Human Apoptosis Panel” (Applied Biosystems) (TLDA). HepG2, A549, MDA-MB231 ja Hep3B-soluja inkuboitiin 16 tuntia normoksia (N, 21% O

2) tai hypoksian (H, 1% O

2), kun läsnä vai ei etoposidi (E, 100 uM Hep3B soluissa ja 50 uM toisessa solutyypeissä) tai paklitakselin (T, 10 uM) HepG2-soluissa. Inkubaation jälkeen, uutettiin kokonais-RNA, toimitettiin käänteistranskriptio ja sitten TLDA analyysiin. 18S käytettiin taloudenhoito geeni datan normalisointi. Varsinainen numeeriset arvot on esitetty taulukossa S2. Genes lihavoitu ovat geenejä, joiden ilmentyminen on vahvistanut qRT-PCT.

Sitten haetaan geenejä, joiden ilmentyminen profiili on yhdensuuntainen solukuoleman profiili kunkin neljän solutyyppien, eli geenejä, joiden ilmentyminen säädeltiin vähentävästi hypoksia HepG2 ja MDA-MB231-solut ja muuttumattomina tai lisääntynyt A549 ja Hep3B soluja, tai päinvastoin. Ei kuitenkaan ole tällaista mentymisprofiili voitiin havaita. Mielenkiintoista on, että ilmaus BCL2L11 (kutsutaan myös BIM), BIK, CASP10, CASP3, DEDD2, NALP1 ja TRADD väheni hypoksia etoposidi-inkuboitiin HepG2-soluissa, kun taas niiden ekspressio lisääntyi tai muuntamattomia A549-soluissa, korreloivat apoptoottisten profiilia näiden kahden solutyypin. Lisäksi BIRC3 ja MCL1 ilmentymisprofiili oli käänteistä apoptoottisten profiilin HepG2 ja A549-soluja. Ilmaisu profiili Näiden geenien validoitiin yhden reaaliaikaisen RT-PCR-reaktioissa. Tulokset on esitetty lämpökarttana kuviossa 5, kun taas numeeriset arvot annetaan taulukossa S3. Profiilia BAK1, BAX, BBC3 (kutsutaan myös PUMA) ja PMAIP1 (kutsutaan myös NOXA) on myös validoitu, koska ne ovat hyvin tunnettuja välittäjäaineita etoposidi-solukuolema. Useimmat tulokset saadaan käyttämällä Taqman Low Density Array vahvistettiin. On kuitenkin huomattava, että ilmaus lähes kaikkien tutkittujen geenien väheni hypoksia kaikissa etoposidi-altistetuissa soluissa.

HepG2, A549, MDA-MB231 ja Hep3B-soluja inkuboitiin 16 tuntia normoksia (N, 21% O

2) tai hypoksian (H, 1% O

2), kun läsnä vai ei etoposidi (E, 100 uM Hep3B-soluissa ja 50 uM muissa solutyypeissä) tai paklitakselia (T, 10 uM) HepG2-soluissa. Inkubaation jälkeen, uutettiin kokonais-RNA, toimitettiin käänteistranskriptio ja sitten tosiaikaisen PCR: n läsnä ollessa SYBR Green ja spesifisiä alukkeita. Todelliset numeeriset arvot annetaan taulukossa S3. Geenit lihavoitu ovat geenejä, joiden ilmentyminen arvioitiin proteiinin tasolla western blot-analyysit.

Expression profiili liittyvien proteiinien Apoptosis

Lisäksi säänneltävä muutoksia geenien ilmaisu, useimmat liittyvien proteiinien apoptoosin tiedetään myös säädellä post-translaation tasolla [2]. Etoposidi ja paklitakselin indusoida apoptoosia aktivoimalla pääasiassa sisäisen reaktiotien [17], [18], [19], joka säätelee runsaus ja solunosasijaintia proteiinien BCL-2-perheen. Siksi tutkittiin proteiinin runsaasti BCL-2: n perheen proteiinien neljä solutyyppien sekä solunosasijaintia joitakin niistä HepG2 ja A549-soluja (kuvio 6).

HepG2, A549, MDA-MB231 ja Hep3B-soluja inkuboitiin 16 tuntia normoksia (N, 21% O

2) tai hypoksian (H, 1% O

2), kun läsnä vai ei (CTL) ja etoposidi (ETO, 100 uM Hep3B solut ja 50pM muissa solutyypeissä) tai paklitakselin (TAX, 10 uM) HepG2-soluissa. (A) Proteiinit havaittiin yhteensä solu- uutteiden Western blottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. alfa-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta. Rajaamaton western blotit on esitetty kuvassa S1. (B) Inkuboinnin jälkeen subsellulaarifraktiointikokeet suoritettiin ja proteiinit havaittiin MLP (mitokondrioita-lysosomiin-peroxisome) ja S (sytosolinen) fraktiot western-blottauksella käyttäen spesifisiä vasta-aineita. TOM20 ja β-aktiini käytettiin lastaus säätimet MLP ja S jakeet vastaavasti. Eräässä kokeessa edustaja kolmesta. Rajaamaton western blotit esitetty kuvassa S1.

Ensin tutkittiin proapoptoottisten BAX ja BAK proteiineja. BAX kokonaisproteiinista taso oli hieman suurempi etoposidin HepG2, A549 ja Hep3B soluissa, mutta pysyi ennallaan MDA-MB231-soluissa. Hypoksia hieman vähentynyt BAX runsautta HepG2-soluissa, mutta ei vaikuttanut muihin solutyyppeihin. Tämä proteiini oli läsnä MLP (mitokondrioita-lysosomiin-peroxisome) osa, sekä sytosolissa HepG2 ja A549-solut. Etoposide lisääntynyt BAX runsautta sytosoliin HepG2-soluissa ja MLP osa A549-solut; tämä kasvu estyi hypoksia.