Krooninen sairaus

tiivistelmä

Great on pyritty kehittämään uusia ja tehokkaita hoitomuotoja vastaan ​​haimasyöpä parantamiseksi Hoitotuloksista. Kasvain-necrosis factor-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) on sellainen terapeuttinen sytokiinien valikoivalla tappava vaikutus kohti pahanlaatuisia soluja. Jotkut ihmisen haiman syövät ovat luontaisesti resistenttejä TRAIL-välitteisen apoptoosin tai terapian. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että histonideasetylaasi-inhibiittori LBH589 voi synergisesti TRAIL laajentaa apoptoosin myös TRAIL-resistentit solut. LBH589 laski c-FLIP tasot kaikissa testattu solulinjassa ja surviviinin tasoja joissakin testatuista solulinjoista. Pakotettu ilmentymä kohdunulkoisen c-FLIP, mutta ei surviviini, poisti osuuskunta apoptoosin induktio yhdistelmällä LBH589 ja TRAIL, mikä osoittaa, että c-FLIP downregulation on keskeisessä asemassa LBH589 herkistymistä haimasyövän soluja Trail. Lisäksi LBH589 vähentynyt c-FLIP vakaus ja läsnäolo proteasomin estäjä MG132 esti c-FLIP päässä vähentäminen LBH589. Vastaavasti, havaitsimme kohonneita ubiqutinated c-FLIP in LBH589-käsitellyissä soluissa. Nämä tiedot siis osoittavat, että LBH589 edistää ubiqutin /proteasomin välittämää hajoamisen c-FLIP, mikä downregulation c-FLIP. Yhdessä LBH589 indusoi c-FLIP hajoamista ja sen mukaisesti herkistää haimasyövän soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin, korostamalla uusia terapeuttisia hoito vastaan ​​haimasyöpä.

Citation: Kauh J, Tuuletin S, Xia M, Yue P, Yang L, Khuri FR, et al. (2010) c-FLIP hajoaminen välittää herkistyminen haimasyöpäsoluissa Trail indusoiman apoptoosin, jonka histonideasetylaasi- estäjä LBH589. PLoS ONE 5 (4): e10376. doi: 10,1371 /journal.pone.0010376

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2010; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2010 Julkaistu: 28 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Kauh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Georgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholar palkinto (SY. S.) ja osastojen tutkimusrahasto (JK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi vaikeimmista syöpien hoitoon, vaikka se on vain 3% kaikista syövistä. Huolimatta useista kliinisistä lääketutkimuksista uusilla kemoterapia-aineiden, viimeksi kuluneiden 25 vuoden aikana 5 vuoden pysyvyys on 5%, ja eloonjäämismediaani 6 kuukauden aikana on pitkälti pysynyt ennallaan. Keskimääräinen elinaika on noin 6 kuukautta [1], [2]. Yksi syy heikkoon säilymiseen haimasyövän on epäherkkyys useimmat perinteiset hoidot, mukaan lukien kemoterapiaa ja sädehoitoa [3]. Siten uusi ja tehokkaita terapeuttisia aineita tai hoito tarvitaan pikaisesti hoitoon haimasyövän.

Apoptoosi on olennainen osa mekanismeja, jotka ylläpitävät normaalia kudosta homeostaasin [4]. Vapauttaminen apoptoosin koneen kiertämisen ja apoptoosin on yleinen mekanismi syöpään. Useimmat chemotherapies ratkaisunsa apoptoosin. Siksi kiertäminen apoptoosin on pääasiassa vastuussa riittämättömyys nykyisen hoitomuotojen [2], [5]. On tunnettua, että solut voivat kuolla apoptoosin ensisijaisesti ulkoista kuolema reseptorin aiheuttamaa reitin ja /tai luontaisia ​​mitokondrioiden välittämää reitin [6]. Aktivointi ulkoisen kuoleman reseptori-välitteisen apoptoottista reittiin kuuluu ligatoimalla kuoleman ligandin (esim, tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi; TRAIL) ja sen vastaavan solun pinnan kuoleman reseptori (t) tai aggregaatiota (esim trimerisaation) kuoleman reseptorit, jolloin muodostuu kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin (DISC), minkä jälkeen aktivoimalla pilkkomalla kaspaasi-8 DISC. Koska Bid toimii kaspaasi-8 alustan, aktivointi ulkoista kuoleman reseptori apoptoottista reitin myös käynnistää luontaisista apoptoottista polku [7].

Kuoleman ligandi TRAIL on viime aikoina noussut mahdollisina syövän terapeuttisena aineena, koska se ensisijaisesti indusoi apoptoosia transformoitu tai pahanlaatuisten solujen [8]. Tällä hetkellä rekombinantti ihmisen TRAIL testataan vaiheen I kliinisissä kokeissa. Lisäksi agonistisia vasta-aineita DR4: n ja DR5, jotka suoraan aktivoivat ulkoista apoptoottisen reitin, on myös testattu vaiheen I tai II kokeissa [9]. Täten syöttämällä reseptori, erityisesti TRAIL kuoleman reseptori välitteistä apoptoosia on ollut intensiivisen tutkimuksen syövän terapeuttisena kohteena [10], [11]. Monet prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet terapeuttista potentiaalia kohdistaminen TRAIL /kuoleman reseptori-välitteistä apoptoosia in haimasyövän [12] – [20]. Kuitenkin tärkeä asia tässä suhteessa on luontainen resistenssi tiettyjen syöpäsolujen kuten haimasyövän soluja TRAIL /kuolema reseptorin aiheuttaman apoptoosin [17], [18].

Cellular FLICE-estävä proteiini (c- FLIP), joka estää kaspaasi-8 aktivaation estämällä rekrytointi kaspaasi-8 DISC, on ensisijainen estäjä TRAIL /kuoleman reseptori-indusoidun apoptoosin [21], [22]. Tasot c-FLIP, mukaan lukien sekä FLIP

L ja FLIP

S ovat annetussa asetuksessa ubikitiinipromoottori /proteasomin välittämää hajoaminen [23] – [25]. Kohonnut c-FLIP ilmentymisen suojaa soluja kuoleman reseptori-välitteistä apoptoosia, kun taas downregulation c-FLIP kemikaalien tai pieniä häiritseviä RNA herkistää soluja kuolemaan reseptori-välitteistä apoptoosia [26]. Yliekspressio c-FLIP on ehdotettu olevan keskeinen mekanismi taustalla TRAIL vastus haimasyövän [13], [17].

LBH589 (panobinostat) on yleiseurooppalainen histonideasetylaasi- (HDAC) estäjä lupaavin syövän vastaisen aktiivisuus [27]. Single-aine tehoaa haimasyöpä on osoitettu prekliinisissä kokeellisissa malleissa [28]. Tässä tutkimuksessa olemme paljastaneet uutta toimintaa LBH589, joka herkistää haimasyövän soluja TRAIL-indusoitua apoptoosia. Lisäksi olemme osoittaneet, että LBH589 helpottaa ubiqutin /proteasomin-välitteistä c-FLIP hajoamista, mikä johtaa parantamiseksi TRAIL-indusoidun apoptoosin haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

LBH589 saatiin Novartis (Basel, Sveitsi). Liukoinen rekombinantti ihmisen TRAIL ostettiin PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ). Proteasomin inhibiittoria MG132 ja proteiinisynteesi-inhibiittorin cyclohexemide (CHX) ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kaniinin polyklonaalista anti-DR5-vasta-aine hankittiin ProSci Inc (Poway, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-DR4-vasta-aine (B-N28) hankittiin Diaclone (Stamford, CT). Hiiren monoklonaalinen anti-kaspaasi-3-vasta-aine hankittiin IMGENEX (San Diego, CA). Kaniinin polyklonaalista anti-XIAP, anti-kaspaasi-8, anti-Mcl-1 ja anti-PARP-vasta-aineiden ja hiiren monoklonaalinen anti-surviviiniperäisten-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Hiiren anti Bcl-2-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Kanin anti-GAPDH polyklonaalisella vasta-aineella ja hiiren anti-Bax monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Trevigen (Gaithersburg, MD). Hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma Chemical Co.

Cell Lines and Cell Culture

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt hankittiin American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Sillä vahvistetaan haimasyövän solulinjoissa että stabiilisti ilmentävät kohdunulkoinen c-FLIP tai surviviiniperäisten, Panc-1-solut infektoitiin lentiviruksien kätkeminen lentiviral ekspressiovektorit FLIP

L ja surviviinista vastaavasti kuten aiemmin on kuvattu [29], [30]. Olemme myös infektoitujen solujen kanssa, lentivirukset kuljettavat Lac Z-ekspressiovektoriin kontrollina [29]. Yksittäisen solun kloonit resistenttejä blastisidiinia lisättiin ja alistettiin seulonta ilmentymisen kohdeproteiinin Western-blottauksella. Nämä solulinjat viljeltiin DMSM väliaineessa, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

Cell eloonläämismääritys

solut ympättiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille ja käsitellään seuraavana päivänä aineiden kanssa ilmoitettu. Elinkykyisten solujen lukumäärä määritettiin käyttäen sulforodamiini B (SRB) -määrityksellä, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Yhdistelmä indeksi lääkeinteraktion (esim synergia) laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ). Tilastollinen merkitys erot kahden hoitojen analysoitiin kaksipuolinen parittomia opiskelijan

t

testejä käyttämällä Graphpad InStat 3 ohjelmisto (GraphPad Software, San Diego, CA). Tulokset katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä

P

0,05.

Detection of Apoptosis

Apoptoosi arvioitiin anneksiini V värjäyksellä käyttämällä anneksiini V-PE apoptoosin havaitsemisen hankittua kittiä BD Biosciences (San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Olemme myös havainneet kaspaasin aktivaatio Western blottauksella (kuten alla on kuvattu), kuten ylimääräisen indikaattorin apoptoosin.

Western blot -analyysi

Koko-solu-proteiini lysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella, kuten on kuvattu aikaisemmin [32], [33].

immunosaostus varten havaitseminen Ubiqutinated c-FLIP

Pancin-1 /FLIP

L-5-solut, jotka ilmentävät stabiilisti FLIP

L, transfektoitiin HA-ubikitiinipromoottori plasmidilla käyttäen FuGENE 6 transfektioreagenssin (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) valmistajan ohjeita. 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin LBH589 tai MG132 plus LBH589 4 tuntia ja sitten lyysattiin immunosaos- Flag-FLIP

L käyttäen Flag M2 -vasta-ainetta (Sigma Chemicals), kuten aikaisemmin on kuvattu [34], jota seuraa havaitseminen of ubikitinoitu FLIP

L kanssa Western blottaus käyttämällä anti-HA-vasta-(Abgent, San Diego, CA).

tulokset

LBH589 herkistää haimasyöpäsoluissa Trail aiheuttama Apoptosis

ensin määritellään herkkyyden haimasyövän solulinjoissa käytetty tässä tutkimuksessa TRAIL. Kuten esitetty kuvassa. 1A, neljä haimasyövän solulinjoissa osoitti ero herkkyydet: MiaPaca-2 ja Bxpc3 näytteillä annoksesta riippuvaa vähenemistä solujen selviytymistä upon TRAIL käsittely ja siten olivat herkkiä TRAILin, kun taas Panc-1 ja Capan-2 olivat resistenttejä TRAIL koska he osoittivat minimaalista vastauksena Trail suhteen vähentää solujen selviytymistä. Kun yhdistetään LBH589, parannettu solu-tappamisen vaikutuksia havaittiin paitsi TRAIL-herkkien solujen (esim BCPC-3), mutta myös TRAIL-resistenttejä solulinjoja (esim, Panc-1 ja Capan-2), koska yhdistelmän LBH589 ja TRAIL olivat paljon enemmän kuin kummallakaan aineella yksinään alenevassa selviytymisen haimasyövän soluja (Fig. 1 B). Yhdistelmä indeksit LBH589 (esim 12,5 nM) ja TRAIL (3,125-26 ng /ml) yhdistelmän testattu solulinjoissa olivat 0,5 (Fig. 1 C), mikä osoittaa, että LBH589 ja TRAIL yhdistelmä kykenee synergiavaikutukset vähenee solujen eloonjäämistä haiman syöpäsoluja. Lisäksi olemme suoraan havaita apoptoosin mittaamalla anneksiini V-positiivisten solujen ja kaspaasi pilkkominen soluissa altistuvat LBH589 yksin, TRAIL yksinään ja niiden yhdistelmä. Kanssa solujen eloonjäämistä tietojen yhdistelmä LBH589 ja TRAIL oli paljon tehokkaampi kuin kunkin yksittäisen aineen yksin indusoimaan pilkkominen kaspaasi-9, kaspaasi-8, kaspaasi-3 ja PARP (Fig. 2A) ja lisäämällä anneksiini V-positiivisia solut (eli apoptoottisten solujen) (Fig. 2B). Erityisesti LBH589 ja TRAIL yksin aiheutti noin 18% ja 21% apoptoosin, tässä järjestyksessä; kuitenkin, yhdistelmä LBH589 ja TRAIL indusoi noin 62% apoptoosin, mikä on tietenkin suurempi kuin additiivinen vaikutus. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että LBH589 herkistää haimasyövän soluja TRAIL-indusoitua apoptoosia.

, Määritettyjä solulinjoja istutettiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille ja käsitellään seuraavana päivänä annetut pitoisuudet TRAIL 24 tuntia. Solujen lukumäärät arvioitiin käyttämällä SRB-määritystä. Tiedot ovat neljällä rinnakkaisten määrityksen; baareja, ± SDS. *,

P

0,01 verrata käsittelemättömät solut.

B

, Ilmoitettu solulinjoja siirrostettiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille hoidettiin annetut pitoisuudet TRAIL yksinään, LBH589 yksin, tai vastaavien yhdistelmän LBH ja TRAIL 24 tuntia. Solujen lukumäärät arvioitiin käyttämällä SRB-määritystä. Tiedot ovat neljällä rinnakkaisten määrityksen; baareja, ± SDS. In Bxpc-3 ja Panc-1-soluja, kukin yhdistelmä on huomattavasti tehokkaampi kuin joko TRAIL yksinään tai LBH589 yksin laskeva solujen eloonjäämistä (

P

0,05 tai 0,001). In Capan-2-solut, LBH589 50 nM yhdessä 12,5 ng /ml tai 25 ng /ml on huomattavasti tehokkaammin kuin LBH589 tai TRAIL yksinään laskeva solujen eloonjäämistä (

P

0,001). Niin ovat LBH589 25 nM tai 50 nM yhdistettynä TRAIL (

P

0,05).

C

, yhdistelmät indeksit (CI) laskettiin tietojen perusteella esitetty kuvassa. 1B avulla CompuSyn ohjelmistoa.

, Määritettyjä solulinjat käsiteltiin DMSO-kontrollin, 50 nM LBH589 25 ng /ml TRAIL yksinään tai LBH589 plus TRAIL. 16 tunnin kuluttua solut altistettiin valmistamiseksi kokosolu-proteiinin lysaatit havaitsemiseksi kaspaasi lohkaisu käyttämällä Western-blottauksella. Casp, kaspaasi; CF, halkaistut fragmentti.

B

, Panc-1 soluja käsiteltiin 25 ng /ml TRAIL yksinään, 50 nM LBH589 yksin tai niiden yhdistelmän: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin mittaus apoptoosin käyttämällä anneksiini V: värjäystä. Prosentuaalinen positiivisten solujen oikeassa yläkulmassa ja oikeassa alakulmassa neljännesten edustaa koko apoptoottinen solupopulaation.

LBH589 Vähentää tasot c-FLIP ja surviviinia haimasyöpäsoluissa

Ymmärtää mekanismeja, joilla LBH589 herkistää haimasyövän solulinjat TRAIL: n indusoiman apoptoosin, ensin analysoi moduloivia vaikutuksia LBH589 c-FLIP, DR5, DR4 ja TRAIL, jotka ovat suoraan mukana sääntelyn TRAIL /kuolema-reseptorivälitteisen apoptoosin kolmessa haimasyövän solulinjoissa. Pancin-1 ja Capan-2-soluissa oli korkeammat pohjapinta taan C-FLIP (erityisesti FLIP

L) kuin Bxpc-3-soluissa. Treatment näistä solulinjoista kanssa LBH589 laski tasolle c-FLIP kaikissa kolmessa solulinjojen pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3A). C-FLIP vähennys tapahtui 3 tuntia ja alkoi korostua 12 tunnin kuluttua ja sen jälkeen lähettää LBH589 hoitoon (Fig. 3B). LBH589 ei muuttanut tasoja TRAIL joko testattujen solulinjojen (Fig. 3A) ja vain vähän lisääntynyt DR5 ilmentymistä yksi kolmesta testattujen solulinjojen (ts Bxpc-3) (kuviot. 3A ja 3B). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että C-FLIP donwregulation on tärkeä tapahtuma aiheuttama LBH589.

annetaan solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LBH589 kuten 12 h (

) tai 50 nM LBH589 varten ilmoitettu ajat (

B

). Käsittelyjen jälkeen solulinjoja altistettiin valmistamiseksi kokosolu-proteiinin lysaatit ja sen jälkeen Western blot-analyysi havaitsemiseen osoitettujen proteiinien.

Lisäksi myös tutkinut moduloivia vaikutuksia LBH589 on muita proteiineja, mukaan lukien surviviinista, XIAP, Bcl-2, Mcl-1, ja Bax, jotka säätelevät mitokondriot-välitteistä apoptoosia. LBH589 laski surviviini tasoilla Panc-1 ja Capan-2-soluihin, mutta ei Bxpc-3-solut (Fig. 3A). Aika tietenkin analyysi Surviviinin tasojen Pancin-1-soluissa osoitti että korostunut surviviini vähennys tapahtui 12 tuntia post LBH589 hoitoon (Fig. 3B). LBH589 ei muuttanut tasoa Bax ja XIAP näissä solulinjoissa; kuitenkin nostivat Mcl-2 näissä solulinjoissa sekä Bcl-2 tasot Bxpc-3-solut (Fig. 2A). Yhdessä nämä tulokset viittaavat myös siihen, että surviviini vähentäminen voi myös olla tärkeä tapahtuma aiheuttamien LBH589.

pakotettu ilmentymä Ectopic c-FLIP, mutta ei surviviinia suojaa soluja Apoptoosin indusointi yhdistämiseen LBH569 ja TRAIL

sekä c-FLIP ja surviviiniin osallistuvat säätelyyn TRAIL solujen herkkyys [35]. Voit selvittää osallistumisen c-FLIP ja surviviiniin downregulation herkistymiseen haimasyövän solujen TRAIL aiheuttaman apoptoosin LBH589, loimme Panc-1 solulinjoja, jotka pysyvästi ilmensivät kohdunulkoinen FLP

L tai surviviinista kautta lentivial ilmaisun järjestelmä ja sitten tutki niiden vastaukset yhdistelmä LBH589 ja TRAIL. Ilmaisu Kohdunulkoisten surviviiniperäisten tai c-FLIP oletettiin Western blottauksella kuten esitetty kuvassa. 4A. Lac Z on merkitystä proteiinin ja tässä käytettiin kontrollina. Kuten edellä on osoitettu, yhdistelmä LBH589 ja TRAIL alentaa tehokkaasti solujen selviytymistä Lac Z- tai surviviiniperäisiin ilmentämissolulinjat, mutta ei ole tehnyt niin molemmissa solulinjoissa, jotka ilmentävät kohdunulkoinen FLIP

L (Fig. 4B), joka osoittaa täytäntöön ilmentymisen ektooppinen FLIPL sijaan surviviini, antaa solun resistentiksi täydennetty apoptoosin LBH589 ja TRAIL yhdistelmä. Havaitsemalla apoptoosin, olemme havainneet, että yhdistelmä LBH589 indusoituu voimakkaasti pilkkominen kaspaasin 8, kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP Panc-1-solulinjoja, jotka ilmentävät Lac Z tai surviviinista, mutta vain vähän on FLIP

L ilmentävää Panc-1-soluissa (kuvio. 5A). Yhteisymmärryksessä yhdistelmä LBH589 ja TRAIL aiheutti noin 79% ja 69% apoptoosin Pancin-1 /lacZ-1 ja Panc-1 /surviviinipe- 4-soluissa, vastaavasti, mutta vain noin 25% apoptoosin Pancin-1 /FLIPL-5-soluissa (kuvio. 5B), joka edelleen varmistaa, että FLIP

L yli-ilmentyminen antaa solun resistentiksi yhdistelmä LBH589 ja TRAIL. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että c-FLIP downregulation avainasemassa in LBH-589-välitteinen herkistyminen haimasyövän solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

, ilmentyminen kohdunulkoisen surviviinin tai c-FLIP eri trasnfectants kuten havaittiin Western-blottauksella surviviinipeptidillä tai c-FLIP-vasta-ainetta.

B

, Annetut transfektantit ympättiin 96-kuoppalevyille ja käsitelty konsentraatiot LBH589 yksinään, 25 ng /ml TRAIL yksinään tai yksittäisiä yhdistelmä LBH589 TRAILin kanssa. 24 tunnin kuluttua solut altistettiin SRB-määritys mittaamiseksi solujen eloonjäämistä. Tiedot ovat neljällä rinnakkaisten määrityksen; baaria; ± SDS. *,

P

0,0001 ja #,

P

0,001 verrattuna LBH589 hoito yksinään.

osoitti transfektantteja käsiteltiin ilman ja yhdessä 50 nM LBH589 plus 25 ng /ml TRAIL (L /T) 16 h (

) tai 24 h (

B

). Solut kerättiin sitten valmistamiseksi kokosolu-proteiinin lysaatit havaitsemiseksi kaspaasi ja PARP lohkaisu käyttämällä Western-blottauksella (

) tai mittausta varten apoptoosin käyttämällä anneksiini V-värjäyksellä (

B

). Prosentuaalinen positiivisten solujen oikeassa yläkulmassa ja oikeassa alakulmassa neljännesten edustaa koko apoptoottinen solupopulaation.

LBH589 Donwregulates c-FLIP kautta edistäminen Ubiqitin /proteasomin välittämää Hajoaminen

Koska kriittinen rooli c-FLIP downregulation välittämisessä parantamiseksi TRAIL aiheuttaman apoptoosin LBH589 kuten edellä on osoitettu, olemme edelleen osoitettu, miten LBH589 laski c-FLIP tasolle. Koska c-FLIP proteiinien tiedetään säätelevän ubikitiini /proteasomin välittämää hajoaminen [23], [25], me sitten selvitettävä, havaitun downregulation c-FLIP by LBH589 olisi välittyvän tätä prosessia. Niinpä ensimmäinen tutki LBH589 edistää c-FLIP hajoamista. Tätä varten me käsiteltiin Panc-1cells joko DMSO: ssa tai LBH589 4 tuntia ja pestiin sitten pois lääkeaineen sen jälkeen täyttämällä solut tuoreella elatusaineella, joka sisältää inhibiittorin CHX. Ilmoitettuina aikoina post CHX, solut kerättiin Western blotting analysoida c-FLIP hajoamisnopeutta. Kuten esitetty kuvassa. 6A, vähentäminen tai hajoamisnopeutta FLIP

L LBH589 käsiteltyjä soluja oli ilmeisesti nopeammin kuin DMSO hoidettuun kontrolliryhmään soluissa, mikä osoittaa, että LBH589 todellakin helpottaa c-FLIP hajoamista. Seuraavaksi käsitellään solut LBH589 puuttuessa ja läsnä ollessa proteasomin inhibiittoria MG132 ja sitten verrataan c-FLIP modulaatio näissä olosuhteissa. Kuten esitetty kuvassa. 6B, LBH589 vähentynyt c-FLIP tasot ilman MG132, mutta ei läsnä MG132, viittaa siihen, että LBH589 aiheuttama c-FLIP hajoaminen on proteasomin-riippuvainen. Immunosaostuksella /Western blotting, myös havaittiin korkeimmat ubiqutinated FLIP

L käsitellyissä soluissa LBH589 plus MG132 verrattuna soluihin, altistetaan LBH589 yksinään tai MG132 yksinään (Fig. 6C), mikä osoittaa, että HNK lisää c-FLIP ubikitinaation . Yhdessä voimme päätellä, että LBH589 indusoi ubikitiini /proteasomin välittämää c-FLIP hajoamista, mikä johtaa downregulation c-FLIP ihmisen haimasyövän soluja.

, Panc-1-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 50 nM LBH589 4 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä 3 kertaa, ja syötettiin uudelleen tuoreella alustalla, joka sisälsi 10 ug /ml CHX. Ilmoitettuina aikoina lähettää CHX, solut kerättiin valmistamiseksi kokosolu-proteiinin lysaatit ja sen jälkeen Western blot-analyysi. Proteiinitasot kvantitatiivisesti NIH Image J ohjelmisto (Bethesda, MA) ja normalisoitiin GAPGH. Tulokset piirrettiin suhteellinen c-FLIP tasot verrattuna aikaan 0 CHX hoidon (alempi kuva).

B

, Panc-1-soluja esikäsiteltiin 20 uM MG132 30 minuuttia ennen kuin lisättiin 50 nM LBH589. Jälkeen co-hoidon 4 tuntia, solut kerättiin valmistamiseksi kokosolu-proteiinin lysaatit ja sen jälkeen Western blot-analyysi.

C

, Panc-1 /FLIP

L-5-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti kohdunulkoinen lippu-FLIP

L transfektoitiin HA-ubikitiinipromoottori plasmidilla käyttäen FuGENE 6 transfektioreagenssia 24 tuntia. Sitten solut esikäsiteltiin 20 uM MG132: ssa 30 minuuttia ja sitten yhteistyössä käsiteltiin 50 nM LBH589 4 tuntia. Koko-solu-proteiini lysaatit valmistettiin sitten immunosaostukseen (IP) käyttäen anti-Flag-vasta-ainetta ja sen jälkeen Western blotting (WB) käyttäen anti-HA-vasta-aineen havaitsemiseksi ubikitinoituja FLIP

L (Ub-FLIP

L) ja anti- -seinälippu vasta-havaitsemista varten kohdunulkoisen FLIP

L.

keskustelu

Ihmisen haimasyövän kasvaimia tai solulinjoja näytteille heterogeeninen vastauksia TRAIL. Jotkut näistä kasvaimista tai solulinjoja ovat luonnostaan ​​herkkiä TRAIL-indusoidun apoptoosin [17], [18]. Tässä tutkimuksessa olemme esittäneet uuden havainnon, että histonideasetylaasi-inhibiittori LBH589 tehokkaasti täydentää TRAIL-indusoitua apoptoosia ihmisen haimasyövän soluja, mukaan lukien ne, jotka kestävät TRAIL-indusoitua apoptoosia. Koska LBH589 näyttää syövän vastaista aktiivisuutta prekliinisissä haimasyövän mallit [28] ja että kasvain-selektiivinen TRAIL on potentiaalinen syövän terapeuttista proteiinia ja testataan vaiheen I kliinisissä kokeissa, meidän havainnot edellytä lisäarviointia yhdistelmästä LBH589 ja TRAIL mahdollisena terapeuttisia hoito vastaan ​​haimasyövän eläinmalleissa ja kliinisissä kokeissa.

sekä surviviinin ja XIAP ehdotetaan säännellä TRAIL-välitteisen apoptoosin [12], [36], [37]. Jotkut HDAC-inhibiittorit, kuten natrium- butyraattia ja LAQ824 raportoitu lisäävän TRAIL: n indusoiman apoptoosin, johon donwregualtion surviviinin ja XIAP [38], [39]. Tuore tutkimus on ehdottanut, että LBH589 tehostaa TRAIL: n indusoiman apoptoosin kautta downregulation XIAP mesoteliooma soluissa [40]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että LBH589 laski surviviinin tasoilla kaksi (eli Panc-1 ja Capan-2) kolmen testattiin haimasyövän solulinjoissa, mutta ei ilmeisesti vaikuta tasot XIAP (Fig. 3). Lisäksi valvotaan ilmentymisen ektooppinen surviviinin ei resistenssiä LBH589 /TRAIL: n indusoiman apoptoosin (kuviot. 4 ja 5). Siten surviviiniperäiset ja XIAP tuskin olla mukana säätelyyn LBH589-välitteisen herkistymisen TRAILin aiheuttama apoptoosin haiman syöpäsoluissa.

Bcl-2-perheen jäseniä, kuten Bcl-2 ja Mcl-1 ovat olleet ehdotetaan sääntely TRAIL: n indusoiman apoptoosin [14], [35]. Muut HDAC-inhibiittorit parantavat TRAIL-indusoitua apoptoosia erilaisissa syöpäsoluissa, joissa modulaatio Bcl-2-perheen jäsenten, kuten downregulation Bcl-2 ja Bcl-X

L ja säätelyä Bax ja Bim [39], [41] – [ ,,,0],44]. Tutkimuksessamme LBH589 ei muutu Bax tasoja. Yllättäen LBH589 nostivat Bcl-2 ja Mcl-1 (Fig. 3). Täten modulaatio näiden proteiinien on todennäköisesti liittyy LBH589-välitteisen voimistaa TRAIL-indusoitua apoptoosia näissä solulinjoissa; pikemminkin kasvaa Bcl-2 ja Mcl-1 saattaa voi LBH589 vaikutuksesta herkistettäessä haimasyöpäsoluissa Trail indusoiman apoptoosin. Siten edelleen sisällyttäminen Bcl-2 tai Mcl-1-estäjä Tämän hoito voi johtaa jopa tehokkaampi syövän vastaista tehoa kuin yhdistelmän LBH589 ja TRAIL ja olisi tutkittava tarkemmin.

DR5 induktio ja c-FLIP downregulation ovat tärkeitä mekanismeista huume välittämä lisääminen tai herkistymistä TRAIL: n indusoiman apoptoosin [45]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että LBH589 joko ei lainkaan tai vain heikosti lisääntynyt DR5 ilmentymistä haimasyövän solulinjoissa (Fig. 3), viittaa siihen, että DR5 modulaatio on vähäinen rooli LBH589-välitteinen herkistyminen on TRAIL: n indusoiman apoptoosin näissä soluissa. c-FLIP tasoja on ehdotettu liittyvän herkkyys haimasyöpäsoluissa Trail indusoiman apoptoosin; erityisesti korkeampi c-FLIP havaittiin TRAIL-resistenttejä haimasyövän solulinjoissa verrattuna TRAIL herkkien solujen [17]. Inhibition c-FLIP, jossa on pieni häiritsevä RNA: ta tai pieni molekyyli herkistää haimasyövän soluja TRAIL-indusoidun apoptoosin [13], [17]. Lisäksi muut HDAC-inhibiittorit, kuten LAQ824, MS-275, FR901228, valproiinihapon ja droxinostat on osoitettu säätelevät vaimentaen c-FLIP tasoilla ja parantaa syöttämällä reseptorin indusoiman apoptoosin [46] – [52]. Tutkimuksessamme olemme myös havainneet, että TRAIL-resistenttejä solulinjoja Pancin-1 ja Capan-2 oli korkeammat pohjapinta taan C-FLIP kuin TRAIL-herkkien solulinja (Bxpc-3) (Fig. 3A). Kuten muutkin HDAC-inhibiittorit, LBH589 vähentynyt c-FLIP solulinjojen näissä kolmessa testattu solulinjoissa; Tämä c-FLIP downregulation on nopea tapahtuma, koska c-FLIP vähennys havaittiin jopa 3 tunnin kuluttua LBH589 hoitoon (Fig. 3). Tärkeää on, täytäntöön ilmentymisen ektooppinen c-FLIP (ts FLIP

L) poistetaan LBH589: n kyky parantaa TRAIL-indusoitua apoptoosia (kuviot. 4 ja 5). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että downregulation c-FLIP on kriittinen LBH589 välittämää herkistymistä haimasyövän solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin.

c-FLIP tiedetään säätelevän ubikitiini /proteasomin välittämää hajoaminen [ ,,,0],23], [24]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että c-FLIP downregulation aiheuttama tiettyjen HDAC-inhibiittorit tapahtuu mRNA tasolla [39], [51]. Miten HDAC-inhibiittorit downregulate c-FLIP tasoja ei ole täysin selvitetty. Tutkimuksessamme havaitsimme, että LBH589 helpottanut c-FLIP hajoamista, mikä käy ilmi CHX Chase määrityksessä. Läsnäolo proteasomin estäjä MG132 esti c-FLIP supistamisesta aiheuttama LBH589. Lisäksi LBH589 nostivat ubikitinoituja c-FLIP (Fig. 6). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että LBH589 helpottaa ubqitin /proteasomin-välitteistä c-FLIP hajoamista, mikä johtaa c-FLIP downregulation. Parhaan tietomme mukaan päätelmää c-FLIP hajoamista tai alisäätely by LBH589 on uusi ja optio lisätutkimuksia siitä, kuinka esto histonideasetylaasi johtaa c-FLIP hajoamista.

maksimaalinen plasman LBH589 vuonna ihmissyöpäpotilaat vaihtelevat 200 nM 1300 nM riippuen tutkituilla annoksilla [53]. Pitoisuudet LBH589 käytettiin tutkimuksessamme että downregulate c-FLIP ja parantaa TRAIL: n indusoiman apoptoosin ovat välillä 12,5 ja 100 nm ja näin ollen sisällä kliinisesti saavutettavissa alueella. Tulevassa kliininen koe yhdistelmän on perusteltua.

Kiitokset

F.R. Khuri ja S-Y. Sun ovat Georgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholars.