Krooninen sairaus

tiivistelmä

Medulloblastoma (MB) on yleisin pahanlaatuinen lapsipotilailla aivokasvain. Vaikka polkuja, jotka ovat vapautettiin MB on vielä täysin selvitetty, vahvistus ja /tai yli-ilmentyminen

MYCN

geeni, joka on on kriittinen rooli pikkuaivojen kehityksen säätelijänä hermoesiastesolut solukohtalo-, on ollut tunnistettu useissa MB alaryhmiin. Fenotyypiltään poikkeava ilmentyminen MYCN liittyy suuri-cell /anaplastic MB variantti, jonka osuus 5-15% tapauksista ja liittyy aggressiivinen sairaus ja huono kliiniseen tulokseen. Jotta paremmin ymmärtää roolin MYCN megatavuina

in vitro

ja

in vivo

ja tukea kehitystä MYCN kohdistetun terapeuttiset loimme kasvainperäinen neuropallo solulinjat päässä GTML (

Glt1-tTA /TRE-MYCN-Luc

) geneettisesti hiirimallissa. Pieni osa GTML neuropallojen todettiin olevan kasvutekijä riippumaton, ilmaistuna CD133 (merkki hermoston kantasoluja), ei ole eroa, kun MYCN peruuttaminen ja olivat erittäin tuumorigeenisiä kun ortotooppisesti istutetaan pikkuaivot. Pääkomponenttina analyyseistä yhden solun RNA määrityksessä tiedot osoittivat, että kliiniset ehdokas aurora-A estäjä MLN8237 muuntaa GTML neuropallojen muistuttamaan ei-MYCN ilmentävissä. Korreloi tämän, MLN8237 merkittävästi laajentanut elinaikaa hiirillä GTML MB vieraskudossiirteitä. Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että MYCN kriittinen rooli laajentamiseen ja selviytymistä aggressiivinen MB-lisäys soluihin, ja luoda GTML neuropallojen tärkeänä voimavarana kehittää uusia hoitostrategioita.

Citation: Ahmad Z, Jasnos L, Gil V, Howell L, Hallsworth A, Petrie K, et al. (2015) Molecular and

In vivo

Characterization of Cancer-lisäysaineistolla peräisin olevia soluja MYCN riippuva Medulloblastoma. PLoS ONE 10 (3): e0119834. doi: 10,1371 /journal.pone.0119834

Academic Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 16 tammikuu 2015; Julkaistu 18 maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Ahmad et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat varoja Institute of Cancer Research, American Institute for Cancer Research (11-0301), Cancer Research Iso-Britannia (C34648 /A12054 ), ja aivokasvain Charity (SDBTT 6/88). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lapsilla medulloblastooman (MB) on useimmin esiintyvä primitiivinen neuroektodermaalinen kasvain (PNET) peräisin aivoissa ja on luokiteltu neljään suurta alatyyppiä perustuen kopiomäärä vaihtelua ja transkriptio profiilit: MB

WNT , MB

SHH (Sonic hedgehog), MB

Group3 ja MB

Group4 [1,2]. Huolimatta edistysaskeleet MB molekyylien luokittelu, useimmissa lapsipotilaiden MB (lukuun ottamatta poikkeavien SHH ja WNT väyliä) kasvaimia synnyttävän signalointi polkuja, jotka ovat terapeuttisesti kohdistettavaksi vielä tunnistamatta. Viimeaikainen tutkimus on kuitenkin osoittanut, että MB kätkeminen MYCN monistuminen ja /tai yliekspressio voidaan myös kohdentaa [3]. Monistaminen

MYCN

geeni liittyy huonoon ennusteeseen [4,5], havaitaan MB

SHH, MB

Group3 ja MB

Group4 alatyyppejä [6-10] ja on poikkeuksellisesti ilmaistu suurin osa ihmisen MB [11]. Huolimatta kasvavasta merkityksestä MYCN terapeuttisena tavoite MB kuitenkin meillä on vielä huono käsitys siitä, miten poikkeavien

MYCN

ilme muuttuu hermostoputken kantasolujen /progenitorisolujen kasvaimiin. Olemme aiemmin raportoitu geenimuunnossolulinjoissa hiirimallissa (GEMM) on MYCN-ajettu MB (GTML:

G

LT1-tTA /

T

RE-

M

YCN-

L

uc

), jossa MYCN ilmentymistä ohjataan doksisykliiniä (DOX) (Tet-off). Käyttämällä tätä järjestelmää osoitimme, että kohdennettuja ilmentyminen MYCN indusoi sekä klassisia ja suuri solu anaplastinen (LCA) patologia riippumattomia SHH [11]. Alaryhmä luokittelu perustuu geenien ilmentyminen on johdettu ihmisen medulloblastooman näytteistä verrattuna siirtogeenisiä hiiriä, ehdotti, että GTML ja GTML /Trp53

KI /KI hiirillä näkyy ilmentymisen profiilit ominaisuus ihmisen MB

Group3 [3]. Neuropallo linjat perustetaan GTML hiiristä lisääntyä voimakkaasti, ilmaista hermosolujen markkereita, ja muodostaa kasvaimia, kun ortotooppisesti istutetaan hiirien aivoissa [12]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että GTML neuropallo viljelmät sisältävät kasvaimen lisäys soluihin, joten tämä voi olla käyttökelpoinen järjestelmä, jossa transformatiivisia roolia MYCN megatavuina synnyssä voitaisiin selvitetty.

Tässä yhteydessä teimme sarjan molekyyli ja sytologinen tutkimukset luonnehtia neuropallo viljelmiä perustetaan GTML hiirillä. Yhden solun analyysi paljasti laajennus homogeeninen solupopulaatio on riippuvainen MYCN ilmaisun hengissä. Nämä sferoidit ovat vastustuskykyisiä erilaistumista, ja ominaisuuksia, jotka ovat luonteenomaisia ​​osittain sitoutunut hermo kanta- ja progenitorisolujen kanssa MYCN ilmaisua, kuten säätelyä nestiinin, CD133, Otx2, ja Musashi, ilmentyminen, jotka liittyvät ylläpitämiseksi erilaistumattoman tilan, ja tyypillisiä MB-varsi /esisolujen. Pikkuaivojen istuttaminen GTML neuropallojen osapopulaatioiden osoitti, että kasvain etenevä-potentiaali oleskelleet CD133 +, mutta ei CD15 + tai CD15- soluja. Lisäksi kasvainten kanssa MLN8237, Aurora-A-kinaasin estäjä, joka indusoi MYCN onkoproteiinia hajoaminen [13], todellisuudessa laajentaa eloonjäämisaste GTML hiiriä aggressiivinen MB. Nämä tulokset aseman selkeyttämiseksi MYCN solumuutoksen ja etenemisen MB vahvistaminen hypoteesia, että MYCN ajaa laajentamiseen ja rikastaminen CD133 + kasvaimen lisäys soluja, jotka kykenevät tuottamaan aggressiivinen MB.

Materiaalit ja menetelmät

hiiri kasvatuksessa

GTML hiirimallissa on kuvattu aiemmin [11]. Kaikki hiiri menettelyt hyväksyttiin Institute of Cancer Research eettisen komitean seuraavan UK Home Office ohjeiden (Project License Number: 70/7945). Kaikki Leikkaus suoritettiin anestesiassa isoflurothane, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

neuropallo eristämistä ja viljelyä

Kudos eristettiin GTML kasvaimia tai synnytyksen jälkeiseen P5, P8, P21 pikkuaivot ja keskiaivojen ja siirrettiin kylmään HBSS (Invitrogen). Kudokset leikattiin sitten 2-3 mm

2 kpl ja entsymaattisesti hajotettiin 37 ° C: ssa käyttäen Liberase Blendzyme 1 (0,62 Wunsch yksikköä /ml, Roche) PBS: ssä 15-45 minuutin ajan. Entsyymi Reaktio pysäytettiin käyttäen 10 tilavuus-% vasikan sikiön seerumia (FCS, PAA) ennen kuin solut hierrettiin DMEM /F12-väliaineessa, joka sisältää B27 ja suodatetaan 70μm mesh. Tämän jälkeen soluja viljeltiin DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen), jota oli täydennetty 2%: B27 lisä (Invitrogen), 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF, Sigma), 20 ng /ml fibroblastien kasvutekijä (bFGF-basic, Invitrogen) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä.

tutkimiseksi solunjakautumisen hinnat, neuropallojen hajotettiin pipetoimalla, ja solut värjättiin trypaanisinisellä laskettiin hemosytometrillä. Vaihtoehtoisesti, solut laskettiin käyttäen guava PCA-96 väline värjäyksen jälkeen guava ViaCount Flex-reagenssia (1:50, Millipore), mukaan valmistajan protokollan.

arviointia erilaistumisen potentiaalin, solut maljattiin peitelasit päällystetty poly-D-lysiinillä (0,1 M, Sigma), 0,1% gelatiinia tai laminiinin (0,5 ng-2.0μg /ml, Invitrogen), ja kasvatettiin erilaistumisen olosuhteissa jopa 14 päivää. Erilaistumista väliaine koostuu DMEM /F12-väliaineessa, jota täydensi 10% FCS, B27 tai ilman 1 ug /ml retinoiinihappo (Sigma Aldrich). Meillä on myös päällystetty juuri järjestetty GTML solujen läsnä ollessa 0.5-1.0mg /ml kollageenia (Invitrogen; A1048301) pro-eriyttäminen Neurobasal media seerumin.

Orthotopic implantaation

tutkia kasvaimia mahdolliset solut saadaan suoraan primaarikasvaimista, GTML aloilla, tai niiden johdannaisia ​​resuspendoitiin neuropallo median ja ruiskutetaan pikkuaivoissa FVB /N-naarashiiriä: seuraavat numerot soluja istutettiin: primaaristen kasvainten (25 tai 100 solua /site ), M10519 soluja (kohtia 10-27, 25 10000 solua /site) tai juuri lajitellut solut (10 solua /site).

Hiiret vuotiaita 6-8 viikkoa nukutettiin käyttämällä hengittämällä anestesia isoflurothane. Viilto (1 cm

2) tehtiin keskiviivan päänahan yli pikkuaivot, ja pieni reikä, jonka halkaisija on 1 mm tehtiin kallon käyttäen hammaslääkärin poraa asemassa 1mm sivusuunnassa keskiviivasta ja välillä 1 ja 2 mm posteriorisesti lambdoidal ompeleen välttää ilmeinen verisuonia. Solut injektoitiin syvyys 2 mm käyttäen 10 ui Hamilton ruisku stereotaksiakehykseen. Neula jätettiin paikoilleen vielä 2 minuuttia, jotta vältetään palautusjäähdyttäen. Neula poistettiin varovasti, jotta irtoa syöpäsoluja. Kallo suljettiin sitten kirurgisesti liimaa. Istutuksen jälkeen kasvaimen etenemistä seurattiin viikoittain käyttäen IVIS Living Image System (Caliper Life Sciences) mukaan valmistajan ohjeiden. Luciferase kuvantaminen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11], paitsi että D-lusiferiini kaliumsuola (Parkin Elmer) PBS: ssä käytettiin 15 mg /kg.

Doksisykliini hoito suoritettiin, kuten on kuvattu edellisessä paperi [11] . Lyhyesti, hiiriä edenneessä kasvaimia mitataan signaalin 1×10

9 fotoneja /s ruokittiin chow (TestDiet), joka sisältää doksisykliini 200 mg /kg antamaan päivittäinen annos on noin 32 mg /kg. Kasvaintaakkaa määritettiin bioluminenssina.

immunohistokemia ja Immunosytokemia

immunosolukemialliset neuropallojen upotettiin OCT kiinnitysväliaineet (BDH) ja jäädytetään hitaasti isopropanolia jäähdytettiin nestemäisellä typellä. Sitten 4 um paksu jääleikkeitä kiinnitetty poly-lysiinillä päällystetty kalvot (VWR) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA, Sigma) PBS: ssä 10 minuutin ajan. Tämän jälkeisen pesun TBS kohdat blokattiin sitten 10% naudan seerumin albumiinia (BSA, Sigma), 15 mM glysiiniä (Sigma) ja 0,02% Triton X100 (Sigma) TBS: ssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Hiiren vasta kohdat tukittiin käyttämällä MOM esto Kit (Vector Laboratories) mukaan valmistajan ohjeiden. Leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön estoliuoksessa (0,1% BSA-PBS: ssä) huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen myöhemmin pesua TBS: llä kalvot leimattiin sekundaarisia vasta-aineita, jotka on konjugoitu Alexa Fluor (1: 500, Molecular Probes). Objektilasit vastavärjättiin DAPI (Sigma) ja sitten tehtiin päällystettiin Fluoromount G (Southern Biotech).

Immunohistokemiaa kasvain näytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydi PBS: ssä 24 tuntia ja 7 päivää. Näytteet kalkki 0,3M EDTA ja sen jälkeen käsitellään käyttäen Leica ASP300S kudostenkäsittelijä luoda parafiini lohko. Leikkeitä leikattiin 4 uM varten hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja immunohistokemia suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14].

Vasta-aineet, joita käytetään immunohistokemia immunosytokemia olivat: MYCN (OP-13, Calbiochem), Ki67 (556003, BD Pharmingen ), GFAP (Z0334, DAKO), CD15 (332778, BD Bioscience), Tuj1 (BAM1195, R sekä kasvaintaakkaa ja

in vitro

solukasvua korreloi lineaarisesti lusiferaasisignaaliin intensiteetti (S1 Kuva.) [11].

Ensisijainen kudokset kirurgisesti eristettiin kasvavista kasvaimista seurattiin viikoittain lusiferaasin kuvantaminen ( Fig. 1A ja S1 kuva). Leikattu kasvaimia hajotettiin ja viljeltiin seerumittomassa Neurobasal väliaineessa, joka sisältää EGF: n ja bFGF: n [20], ja vahvistetaan neuropallojen kuluessa 3-7 päivää (Fig. 1A), toisin kuin eksplantaatteja Keskiaivon tai pikkuaivot villityypin hiirillä (joka oli rajallinen elinikä 7-10 kohtia). Solut perustettu vähintään 6 eri primaaristen kasvainten eri-ikäisten olivat kuolemattomia ja osoitti kaksinkertaistaa ajan noin 24 tuntia. (S2 Taulukko ja S1 Kuva.). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että kyseessä on erittäin proliferatiivisen, transformoitu solu todennäköisesti vetämänä MYCN ilmentymistä.

(A) perustaminen GTML aloilla kulttuuriin. Ensisijainen solut eristettiin GTML kasvaimia, jotka tunnistettiin bioluminisenssimääri- signaalit (ylhäällä vasemmalla) ja morfologia, ja sitten hajotetaan yksittäisiksi soluiksi. M10519 GTML neuropallojen viljeltiin sen jälkeen 10 päivää, on myös esitetty. Mitta-asteikko: 100 um. (B) vaikutus MYCN peruuttamisesta solun kasvuun. M10519 GTML aloilla ympättiin tiheydellä 1×10

5 solua /ml, kun läsnä on poissa ollessa 1 ug /ml DOX, ja leviämisen pallojen mitattiin WST-1 metabolisen määrityksessä. Virhepalkkien, ± SD. (C) vaikutus MYCN peruuttamisesta solusyklin. M10519 GTML neuropallo hoidettiin DOX ennen solusyklin analyysit käyttämällä FACS. (D) Western analyysit. M10519 GTML aloilla viljeltiin 1 ug /ml DOX.

Jotta voidaan tutkia roolia MYCN kasvuun GTML solujen, käsittelimme M10519 GTML neuropallojen (sekä muita solulinjoja, katso S2 kuvio .) kanssa DOX, ja löysi selviä todisteita siitä, että kasvu on riippuvainen MYCN (Fig. 1 B). Solusyklin analyysit käyttämällä virtaussytometria osoitti selvästi kertynyt kasvu vapaan soluja G1 vaiheessa sisällä 4-6 tuntia hoidon (Fig. 1 C), Kasvu rajoitus oli yhtenevä täydellinen poistaminen MYCN, mutta ei c-Myc-proteiinin (S1 Fig . ja S3 kuvassa.), kevyemmästä Ki67, lisääntyminen merkki, ja nestiinifenotyypin, hermostoputken varsi ja /tai kantaisä merkki, 48 tunnin kuluttua peruuttamisen MYCN (Fig. 1D ja S1 Kuva.). Mielenkiintoista on, että toisin kuin meidän aiemmin perustettu GTML linjat villin tyypin

Trp53

[12], pidätettiin GTML soluja laajennetaan nopeasti poistamisen jälkeen DOX (S1 Kuva.), Viittaa siihen, että MYCN peruuttaminen on sytostaattinen murto nämä solut ja että kasvun pysähtymisen on palautuva. Epäjohdonmukaisuutta joukossa GTML soluja hyödynnetään kahdessa tutkimuksessa saattaa johtua ainakin osittain siitä, että kaikki GTML solujen osoitettu nyt esillä olevassa tutkimuksessa satama spontaani mutaatioita alueella

Trp53

koodaavan geenin p53 DNA: ta sitova domeeni [3]. Lupasimme analyysi sen selvittämiseksi, onko korvaavia ylössäätely hiiren c-Myc-proteiinin on osallisena vapautumista solusyklin pysähtymiseen ja totesi, että c-Myc taso oli vakio (S1 Kuva. Ja S3 kuvassa.), Mikä viittaa siihen, että ainakin meidän neuropallo kulttuureissa , c-Myc ei kompensoi vähentäminen MYCN (kuten aiemmin raportoitu esiintyvän hermostoputken progenitorisolujen [21]). Klonogeenisten potentiaaleja M10519 soluja, yksi GTML linjat, tutkittiin johdetun alalla määrityksiä, jotka osoittavat, että 42% yhden M10519 solut kykenivät muodostamaan aloilla viljelmässä (S4 kuvassa).

MYCN ilmentymistä ajaa laajentamiseen solujen ilmentävät merkkiaineita tyypillinen hermo varsi ja /tai progenitorisolujen ja MB

luonnehtia GTML neuropallojen selvitimme ilmaus hermoston kantasolujen /kantasolujen markkereita immunosolukemiallisella. Huomasimme, että nestiinifenotyypin, merkkiaine hermostoputken kantasolujen /progenitorisolujen, ja leviämisen markkeri Ki67 ilmaistiin GTML neuropallojen on MYCN riippuvalla tavalla (kuvio. 2A). Expression of neurospesifinen kantaisä markkeri Tuj1 [22] ei kuitenkaan näkyvästi muuttanut MYCN peruuttaminen (Fig. 2A), mikä tarkoittaa, että ehtyminen MYCN ei dramaattisesti vaikuta erottelua kulttuuriin. Toisin kuin edellisessä havainto GTML kudoksissa [11], ei näkyvästi laskua katkaistun Caspase 3, merkkiaine apoptoosin, havaittiin kun MYCN peruuttamisesta (Fig. 2A ja S3 kuvassa.). Saadakseen tarkemman kuvan geeniekspression yhteismarkkinavaiheessa solutasolla, me tutkinut M10519 viiva (löysimme GTML linjat totesimme tässä tutkimuksessa olivat hämmästyttävän samankaltaisia) käyttäen 96-plexed yksisoluisia qRT-PCR (S5 Fig. Ja S6 Fig .). Tämä analyysi osoitti, että yhteinen markkereita MB ja hermoston kantasolujen lukien NeuroD1 [23], CD133 (Prominin 1) [24-27], Otx2 [11,28], ja Musashi [29] vaimentua mukaan MYCN peruuttaminen (Fig. 2B ja S5 kuvassa.). Taajuus soluja, jotka ilmentävät merkkiaineita, kuten CD133 ja Musashi myös laski DOX, kun taas muut kantasolujen merkkiaineita, kuten Sox2 ei vaikuttanut MYCN peruuttaminen (Fig. 2C ja S5 kuvassa.). Expression of merkkiaineita astrosyyttien ja ependyymisoluissa (GFAP) [30], astrosyytit (S100B) [31], rae neuroni progenitorit ja gliooman (Olig2) [32-34] olivat tuskin havaittavissa (S5 Fig.) Tai harvoin (S5 Fig .) yhden solun analyysejä. Korreloi nopea kasvu kulttuuri, MYCN ilmaisu säädelty master säätimet solusyklin etenemistä, E2F1 ja E2F2, jotka molemmat ovat MYCN tavoitteet [35] (S5 Fig.). CD133, markkeri S, G2, ja M vaiheet hermo kantasolujen [36] (Fig. 2B ja 2C). MYCN, kuten odotettua, oli tuskin havaittavissa M10519 soluissa, joita käsiteltiin DOX (Fig. 2B ja 2C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että MYCN ilmentymisen tulokset laajentamiseen solujen markkereita tyypillisiä hermoston kantasolujen ja /tai esisolujen liittyy MB kasvaimien syntyyn.

(A) M10519 GTML aloilla käsiteltiin kanssa tai ilman Dox varten 17 päivää. Immunofluoresenssianalyysi suoritettiin cryosectioned aloilla anti-Ki67, anti-nestiinin, tai anti-Tuj1, anti-GFAP, ja anti-c-kaspaasi 3 yhdessä anti-MYCN. Tumat vastavärjättiin DAPI. Bar, 50 um. (B) lämmön kartan keskimäärin ekspressiotasot (Cq-arvot, n = 96) 13 hermo kantasolujen geenejä on esitetty. (C) Prosenttiosuudet ilmentävien solujen CD133, Musashi, Sox2, MYCN, ja CD15 näkyvät. Tutkimme WT1 ja WT2 soluja (katso teksti), käsittelemätön M10519 pallojen (M10519), M10519 aloilla käsitelty DOX 24 tuntia (Dox), tai M10519 pallojen käsitelty MLN8237 24 tuntia (MLN8237).

96-geeni (katso S3 taulukko ja Janos

et al

[19]) ekspressioprofiileja 96 yhden M10519 soluilla jonkinasteisen heterogeenisuus (S6 Fig.). Yhden solun Biomark HD ilmaisun tulokset on esitetty S3 taulukossa. Arvioida ero korrelaatiokerroin jakaumat tietokokonaisuuksien johdettu kahden populaation, käyttäen Kolmogorov-Smirnov-testiä, lasketaan pareittain korrelaatiokertoimet ekspressiotasoja 96 geenien tietyssä solupopulaatiossa. Keskimääräinen korrelaatiokerroin (

R

) ja M10519 neuropallojen oli 0,77, ja ero M10519 solujen ja WT1 (

R

= 0,71, N

M10519 = 1081, N

WT1 = 990, D = 0,2662,

P

= 2.2×10

-16) tai WT2 (

R

= 0,60, N

M10519 = 1081, N

WT2 = 990 D = 0,57,

P

= 2.2×10

-16) soluissa oli tilastollisesti merkitsevä. Nämä tulokset osoittavat, että vaikka ilmaisua profiilit yksittäisten solujen M10519 neuropallossa väestö eivät ole täysin yhdenmukaisia ​​ominaispiirteitä, transkription profiileja solujen välille WT1 ja WT2 neuropallo johdetut viljelmät normaalista pikkuaivoja ovat huomattavasti heterogeenisiä. Lisäksi MYCN peruuttamista johti merkittävään vähentämiseen heterogeenisyyden indeksi (

R

= 0,69, N

M10519 = 1081, N

M10519 + Dox = 990, D = 0,27,

P

= 2.2×10

-16). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että MYCN ilmaisu nostaa tasoa solujen tasalaatuisuuden ja laajenee solujen hermo varsi ja progenitorimerkkiaineiden.

MYCN asemien laajentamista solujen resistenttejä erilaistumista ärsykkeiden kulttuuri

Mielenkiintoista, vaikka kantasolujen ja /tai kantaisä kaltainen transkriptio profiilin laajennetun solujen neuropallo kulttuureissa GTML solut, jotka ilmentävät MYCN näytetään vain rajoitetusti erilaistuminen potentiaali

in vitro

. Seuraavat 8 päivää kasvun seerumissa sisältävien pro-eriyttäminen media, olemme huomanneet, että kolme GTML riviä säilytetään morfologisia ominaisuuksia tyypillisiä erilaistumattomien solujen (S2 kuvio.), Vaikka havaittiin, että hermo varsi /kantaisä nestiiniä säädeltiin vähentävästi jälkeen 2 päivää ja MYCN peruuttaminen (Fig. 1 D). Sitä vastoin samat ehdot aiheuttama erilaistumista neuropallojen perustetaan villityypin pikkuaivoja (S2 Kuva.). Näennäinen erilaistumisen häviäminen potentiaalia GTML soluissa mukaan geneettiset tai epigeneettiset muutos voi tapahtua pitkittyneen MYCN aktivoinnin. Olemme myös havainneet, että GTML solut eivät pystyneet täysin erottaa erilaisissa olosuhteissa (esimerkiksi käsittelemällä retinoiinihapon, vahva erilaistumisen indusoinnissa (S2 kuvio.), Tai viljellään väliaineessa, joka sisälsi 0,5 mg-1 mg /ml kollageenia (tietoja ei ole esitetty )). Kun M10519 soluja kasvatettiin pro-erilaistumisen väliaineessa, joka sisältää seerumia ja retinoiinihapon hapot, kun havaitsimme downregulation MYCN, jota ohjataan

Glt1

promoottori, joka on aktivoitu progenitorisolujen, ja nestiinifenotyypin klo 48-96 tunnin , havaitsemme mitään merkittäviä muutoksia tasojen hermosolujen merkkiaineiden synaptofysiinin ja Tuj1 ja glial merkki GFAP (S3 kuvassa.). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että MYCN ilmentyminen johtaa rikastamiseen solujen markkereita tyypillisiä varren ja /tai progenitorisolujen, ajo laajeneminen erittäin proliferatiivisen resistenttejä soluja erilaistumista ärsykkeisiin. Näennäinen erilaistumisen häviäminen potentiaalia GTML aloilla on vastakohtana neuropallojen peräisin ihmisen Mt (joka

MYCN

tila ei ole tutkittu) [27] tai

Ptc

– /- hiirimallissa [37], mikä viittaa siihen, että jatkuva ilmentyminen MYCN ajaa peruuttamatonta sitoutumista laajentamista solujen hermo varsi ja progenitorimerkkiaineiden.

MYCN perustuva GTML neuropallojen säilyttää ominaisuudet primaarikasvainten

in vivo

osoittivat äskettäin, että neuropalloja peräisin GTML hiiret ovat kykeneviä muodostamaan kasvainten MYCN riippuvalla tavalla, kun ortotooppisesti istutetaan pikkuaivoja ei-siirtogeenisten poikueesta [12]. Kuten odotettua, lisäksi DOX ruokavalion pienenee nopeasti bioluminesenssin (Fig. 3A) ja kasvaimen taakkaa (Fig. 3B) hiirillä istutettiin M10519 soluja. Arvioidaan vaikutusta MYCN peruuttamisesta

in vivo

, tutkimme ilmentyminen biologisten merkkiaineiden potilaalle tehdä kasvaimia.