Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

surviviini ilmaistaan ​​eturauhassyöpä (PCA), ja sen downregulation herkistää PCa solujen kemoterapia-aineiden

in vitro

ja

in vivo

. Pieni kalvoon sitoutuneiden vesikkelit nimeltään eksosomeiksi, erittyy endosomimembraanin osastoon, sisältävät RNA: n ja proteiinin, että ne helposti kuljettaa kautta eksosomi sisäistämisen vastaanottaviin soluihin. Viimeaikainen kehitys on osoittanut, että kasvain- eksosomeiksi pelata useita rooleja kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden ja tuottaa näitä toimintoja kautta immuuni paeta, kasvaimen invaasio ja angiogeneesi. Lisäksi eksosomi analyysi voi antaa uusien biomarkkereiden diagnosoida tai seurata PCa hoitoon.

Methods

Eksosomit puhdistettiin plasman ja seerumin 39 PCa potilaista, 20 BPH potilailla, 8 eturauhassyöpä toistuvat ja 16 tervettä verrokkia käyttävät ultrasentrifugoinnin ja niiden määrät ja laadut kvantitoitiin ja visualisoida sekä plasmasta ja puhdistetun eksosomeiksi ELISA ja Western blottauksella, vastaavasti.

tulokset

Surviviinispesifisiä lisääntyi merkitsevästi kasvaimen -johdannainen näytteitä, verrattuna BPH ja säätimet käytännössä mitään eroa määrä surviviinin havaittu eksosomeiksi kerätty vastadiagnosoidun potilaalla ilmenee alhainen (kuusi) tai korkea (yhdeksän) Gleason tulokset. Eksosomi Surviviinivasteita tasot olivat korkeampia potilailla, jotka olivat uusiutunut kemoterapiaa kontrolleihin verrattuna.

Johtopäätökset

Nämä tutkimukset osoittavat, että surviviinia olemassa plasmassa eksosomeiksi molemmista normaalista, BPH ja PCa aiheita. Suhteelliset määrät exosomal surviviinia PCa plasmassa oli huomattavasti suurempi kuin niillä, joilla on pre-inflammatorinen BPH ja valvonta plasmassa. Tämä ero ilmentyminen exosomal surviviini nähtiin sekä äskettäin diagnosoitu ja kehittyneitä Eturauhassyövän henkilöillä, joilla on korkea tai matala-asteinen syöpiä. Analyysi plasman exosomal Surviviinin pitoisuudet voivat tarjota kätevä työkalu diagnosoidaan tai seurantaan PCa ja voi, kun se on kohonnut alhainen sekä korkean Gleason pisteytetään näytteitä, joita käytetään varhaista havaitsemista.

Citation: Khan S, Jutzy JMS, Valenzuela MMA, Turay D, Aspe JR, Ashok A, et al. (2012) Plasma-Derived Exosomal surviviinia uskottava biomarkkeri Early Detection of Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (10): e46737. doi: 10,1371 /journal.pone.0046737

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 04 syyskuu 2012; Julkaistu: 16 lokakuu 2012

Copyright: © Khan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on rahoitettu osittain antelias käynnistää rahasto PI (NRW) Center for Molecular Biology and Gene Therapy, joka on sittemmin nimetty uudelleen Terveydenhuollon erot ja molekyylilääketieteen sekä Loma Linda University. PI on myös osaltaan varoja hänen henkilökohtainen tili. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maailmanlaajuisesti eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä ja kuudenneksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä [1], [2]. Iän myötä, etnisyys ja suvussa ovat ainoat vakiintunut riskitekijöitä ja ei ole tiedossa ehkäistävissä riskitekijöitä perustettu tähän mennessä [2]. Eturauhasen syöpiä (PCA) ovat yleensä hidaskasvuisia maligniteetit, joille on ominaista epätasapaino määrien solunjakautumisen ja solukuoleman [3]. Leikkaus ja sädehoito ovat tehokkaita paikallisia sairaus, mutta ei ole olemassa tehokasta hoitoa strategiaa uusiutuvassa tai metastasoituneen PCa joka on epäonnistunut leikkaus, sädehoito tai hormonihoito [4]. Tärkeä haaste on kehittää hoitoja, jotka ovat tehokkaampia riippuu ymmärrystämme molekyylimekanismin (t) Eturauhassyövän eteneminen, joka johtaa meidät tunnistaa monia mahdollisia terapeuttisia kohde- geenejä ja prosesseja, jotka ovat mukana apoptoosin, soluproliferaatioon, etäpesäke, ja kasvutekijän signalointi. Yhteensä eturauhasen antigeenin (PSA) on mullistanut PCa seulonta ja on johtanut yleinen lasku PCa etäpesäkkeitä ja kuolema [5]. Valitettavasti soveltaminen PSA on johtanut myös yli-tunnistus ja ylihoito PSA ei ole syöpä erityinen eikä korvike biologista käyttäytymistä PCa [5], [6]. Kohonneet PSA-tasot voivat heijastaa syövän läsnäolon, mutta voi myös olla läsnä seurauksena infektio, krooninen tulehdus tai hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) [7], [8]. BPH on osoitettu esiintyvän yli 70% miehistä yli 70-vuotiaita, mutta ei pidetä esiaste eturauhassyövän, vaikka ne usein rinnakkain [9]. Sen vuoksi on tarpeen jatkaa seulomiseksi biomarkkerit, jotka ovat syövän erityinen ja jotka ovat havaittavissa varhain taudinkulku.

prosessit sekä solujen eloonjäämistä ja solukuoleman ovat mukana erittäin säännelty signalointireittien jotka ovat parhaillaan kiivasta tutkimuksen. Tiedetään, että apoptoosin säätelyyn on keskeinen rooli kehitettäessä eturauhassyövän ja sen etenemistä androgeenista itsenäinen valtio, joka johtuu osittain säätelyn antiapoptoottisten geenien jälkeen androgeenideprivaatio [10] – [12]. Useat tekijät osoittavat, että yksi tärkeimmistä tapahtumista etenemiseen liittyvä jälkeen hoidon epäonnistumiseen on lisääntynyt resistenssi apoptoosin [13], [14], mikä johtuu pääasiassa säätelyn antiapoptoottisten geenien, kuten Bcl-2, Bcl-X

L, Mcl-1 [15], ja Surviviinispesifisiä [16]. Surviviinia estäjä-of-apoptoosin (IAP) proteiini perheenjäsen, liittyy PCa kehittämiseen, eteneminen, ja lääkeresistenssin [17] – [20]. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että yli-ilmentyminen surviviinin PCA kasvaimissa liittyy huonoon ennusteeseen ja lisääntynyt kasvaimen uusiutumisen [21]. Sen sijaan, se on myös osoitettu, että pudotus surviviinin ilmentymisen siRNA lisää kemosensitiivisyys eturauhassyöpäsolujen, vähentää tuumorigeenisuus [22].

Perinteisesti Surviviini on katsottu sytoplasmisen tai tumaproteiini. Äskettäin Surviviinivasteita on myös osoitettu olevan solun ulkopuolella, sisältämä pieni kalvoon sitoutunut rakkulat tunnetaan eksosomeiksi [23], [24]. Eksosomit ovat läsnä seerumin ja virtsan ja sisältävät monenlaisia ​​proteiineja ja RNA: iden ja edustavat niiden kudoksen alkuperän tekee niistä mahdollinen lähde tai altaan uudenlaisten PCa biomarkkereiden [25]. Yhdenmukainen Surviviinivasteita osallistumisesta epäsuotuisa kliinis parametreja, solunulkoinen kaupan surviviinin koko kasvain microenvironment voisi olla vastuussa augmenting aggressiivinen asema kasvain samalla kielletään tai minimoimiseksi terapeuttisia tuloksia. Olemme äskettäin osoittaneet, että eksosomi sitoutunutta Surviviinispesifisiä proteiinia voidaan erittävät syöpäsolut ja on tarttunut ympäröiviin soluihin, jotka tuottavat kentän vaikutus, joka antaa yleisen stressin eloonjäämisen fenotyypin.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia olemassaolo exosomal surviviinin plasmassa eturauhassyövän potilaiden kanssa erilaisia ​​PCa esityksiä ja verrata sen exosomal ekspressiotasoja, jotka havaittiin ohjaus vapaaehtoisilla ilman diagnosoitu syöpä ja potilaille diagnosoitu hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu tai BPH. Viimeisten 25 vuotta Gleason pisteytysjärjestelmä on käytetty auttaa arvioimaan ennuste miesten eturauhassyövän. Yhdessä muiden parametrien, eturauhasen syöpä on lavastettu keinona ennustaa ennustetta ja ohjata hoito [26]. Solunulkoista Surviviinivasteita havaittiin voimakkaasti ilmaistu plasmassa eksosomeiksi Eturauhassyövän potilaalla ilmenee Gleason tulokset 6 (pieni) ja 9 (korkea), ja potilailla oli uusiutunut kemoterapiaa. Kuitenkin, ei ollut merkittäviä eroja Surviviinispesifisiä tasojen välillä eikä matalalla tai korkealla Gleason tulokset. Lisäksi, vaikka eksosomeiksi sisältäviä surviviinia löytyivät seerumia potilailla, joilla on diagnosoitu BPH, kokonaistaso oli merkittävästi pienempi kuin löydetty plasmasta PCA potilaista. Uskomme, että lisäksi diagnostisia markkereita, prognoosi-, ennakoivaa ja terapeuttinen markkereita tarvitaan toimia korvikemuuttujiin ennustamiseen sairauden vakavuus, valitsevat hoidot ja seuranta vastaukset hoitoihin [27] – [30]. Meidän osoitus exosomal surviviinin plasmassa potilaan on äskettäin diagnosoitu matala-asteinen PCa tarjoaa perustelut osoittavien hyödyllisyyttä exosomal surviviinin varhaisena, helposti mitata biomarkkereiden PCA diagnoosia. Exosomal Surviviinivasteita voidaan myös tutkia biomarkkerina seurata kohteiden hoito kehittyneitä Eturauhassyövän.

Tulokset

Plasman surviviinin myös terveiden ja PCa potilaat

surviviinia oli havaittavissa plasmassa kaikista terveiden verrokkien ja PCa potilaita. Mittaustulokset plasman surviviinin terveillä valvontaa ja PCa potilailla on esitetty kuviossa 1A. Plasman keskimääräinen Surviviinin tasot olivat merkittävästi erilaiset välillä terveiden verrokkien (61,5 pg /ml kontrolleissa [n = 10]) sekä eri syövän potilasryhmät (Gleason 6 = 401,7 pg /ml [n = 10], Gleason 9 = 375,2 pg /ml [n = 10], ja altistaa kestävät kemoterapian agentti Taxoteren = 410 pg /ml [n = 8]; P 0,05 kutakin vertailua vs. kontrolli). Kun surviviinin tasot verrattiin kolmesta ryhmästä Eturauhassyövän potilaiden kaksisuuntainen vertailuja, yksikään ei ollut merkittävästi erilainen kuin muut.

. Surviviini tasot mitattiin plasmasta peräisin Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10), ja Taxotere-resistenttejä (n = 8). B. surviviinin mitattiin seerumissa peräisin BPH (n = 20), ja PCa (n = 19). Vertailut suoritettiin käyttäen MANOVA normaalilla terveiden verrokkien (n = 10 ja 6 vastaavasti). (**, P 0,05, ***, p 0,001; tilastollisesti merkitsevä).

Surviviinispesifisiä voidaan kerätä seerumista otettu terveiden verrokkien, BPH ja PCa Potilaat

kuten mitä on mitattu edellä plasmassa, surviviinia oli myös havaittavissa seerumissa potilailla, joilla ei ole aiemmin syövän diagnoosi sekä potilailla, joilla on hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) ja joilla on diagnosoitu eturauhassyöpä (PCa) (kuvio 1B). Keskimääräiset seerumin Surviviinin tasot olivat merkitsevästi (P ​​ 0,001) suurempi PCA aiheista (150 pg /ml [n = 19]) kuin seerumin jalostettu terveillä (59,7 pg /ml [n = 6]) sekä BPH potilaat (55 pg /ml [n = 21]).

Plasma ja seerumi surviviinia PCA potilaalla esiintyy käytettäessä exosomal allas

Olemme aiemmin osoittaneet, että viljellyt PCa solut vapauttavat Surviviinispesifisiä solunulkoiseen miljöö sisällä eksosomeiksi [23]. Nämä pienet, kalvo-vesikkelit ovat myös tiedetään esiintyvän plasmassa sekä seerumin syöpäpotilaiden [31], [32]. Eksosomit joten ne kerättiin erotussentrifugoinnilla, ja kvantitoitiin käyttäen asetyylikoliiniesteraasin entsyymitestejä kuin me ja muut ovat aiemmin kuvattu [24], [33]. Plasman keskimääräinen eksosomi tasot olivat merkittävästi erilaiset välillä terveiden verrokkien ja eri syöpäpotilaiden ryhmät (P 0,001), kun taas merkittäviä eroja eksosomi määrä ei löydetty joukossa PCA potilasnäytteelle ryhmissä (kuvio 2A). Tämä oli myös verrattaessa eksosomi määriä löytyy BPH ja PCa näytteitä kuin terveiden verrokkien (kuvio 2B). On kiinnostavaa, että näyttää olevan mitattavissa ero surviviinia ja eksosomeiksi riippuen lähteeksi sekä Surviviinispesifisiä ja eksosomi määrät olivat suuremmat, kun puhdistettua plasmasta sitten kun puhdistettu seerumista.

. Eksosomi tasot mitattiin plasmasta peräisin Gleason 6 (n = 10), Gleason 9 (n = 10), ja Taxotere-resistenttejä (n = 8). B. eksosomi mitattiin seerumissa peräisin BPH (n = 20), ja PCa (n = 19). Vertailut suoritettiin käyttäen MANOVA normaalilla terveiden verrokkien (n = 10 ja 6 vastaavasti). (**, P 0,05, ***, p 0,001; tilastollisesti merkitsevä).

Plasma-johdettu eksosomeiksi sisältävät Surviviinispesifisiä

Eksosomit leimasi immunoblottauksella summalle Surviviiniproteiini ja Lysosomaalinen kalvoproteiini 1 (LAMP1). LAMP1 on tunnettu eksosomi proteiinia, joka on yleisesti käytetty, jotta varmistetaan Western blot loading [24], [34], [35]. Eksosomeiksi eristetty PCa potilaan plasmasta osoittivat parannettu surviviinin kuormia verrattuna eksosomeiksi eristetty kontrolleihin (kuva 3). Western blot-analyysi osoitti, että pieni exosomal surviviinia ei ollut havaittavissa plasmassa näytteistä kuuden valvonnan, jolla ei ole aiemmin diagnosoitu syövän verrattuna eksosomi-spesifisen proteiinin Lamp1 (kuvio 3A). Sen sijaan, eksosomeiksi eristetty kaikista kaksikymmentä esikäsittelyn PCa aineet sisälsivät suuria määriä surviviinin proteiinia verrattuna LAMP1 proteiinin tasot (kuvio 3B). Kiinnostavaa kyllä, ei ollut merkittävää eroa exosomal Surviviinispesifisiä sisältöä potilaiden välillä Gleason 6 PCa ja ne, joilla Gleason 9 PCa (kuvio 3C), kun normalisoitu vastaan ​​Lamp1 (p 0,05).

. Vasta-aineet Surviviinia ja Lamp1 käytettiin Western blottaus ohjaus potilaan puhdistettu exosomal proteiinia. B. Sekä Surviviinivasteita ja Lamp1 vasta-aineita havaittiin Länsi-blottaus eksosomeiksi-johdettu Gleason 6 ja Gleason 9. C. osuus analyysi surviviinin tiheyden Lamp1 tiheyden näytettiin kummassakin Gleason 6, ja Gleason 9 normaalilla terveiden verrokkien (* *, p 0,05, tilastollisesti merkitsevä) ilman merkitystä kirjata välillä Gleason 6 ja Gleason 9 plasmapohjaista eksosomeiksi.

Differential surviviinin ilmentymistä olemassa BPH ja PCa johdettuja eksosomeiksi

Kuten edellä, eksosomeiksi kerätty BPH ja PCa potilaan seerumit karakterisoitiin immunoblottauksella ja surviviinin ja LAMP1 proteiinia (kuvio 4A). Eksosomit eristetty PCa ja BPH potilaan seerumit osoittivat parannettu Surviviinispesifisiä kuormia verrattuna eksosomeiksi eristetty valvonta (Kuva 4A, kuvio 4B ja kuva S1). Mielenkiintoista, vaikka surviviinia havaittiin useimmissa ja koholla tietyissä BPH potilaille, sen yleinen taso oli huomattavasti pienempi kuin löytyy PCA ja ei ollut merkittävää eroa mitattuna BPH ja ohjata potilaan seerumit (kuva 4B).

A. Vasta-aineet Surviviinia ja Lamp1 käytettiin Western blottaus potilaan puhdistettua exosomal proteiinia. B. osuus analyysi surviviinin tiheyden Lamp1 tiheyden näytettiin sekä BPH ja PCA normaali terveiden verrokkien (**, p 0,05, ***, p 0,001; tilastollisesti merkitsevä), jossa ei ole merkitystä kirjata normaalin valvonnan ja BPH.

PCa potilailla, joilla tauti eteni ilmentävät korkeita exosomal surviviinin

Lisäksi arvioimme eksosomeiksi kerätty PCa kokeneiden potilaiden taudin etenemistä hoidon aikana kemoterapiaa. Kuten meidän Gleason potilaan eksosomeiksi, Western blotting osoitti Surviviiniproteiini tasoa (kuva 5A) oli selvästi suurempi verrattuna syövän vapaa verrokeilla, joka vahvistettiin olevan merkittävä densitometrisen analyysin jälkeen (kuvio 5B).

. Surviviinispesifisiä ja Lamp1 vasta näytettiin positiivinen. B. Densitomet- analyysi surviviinin /Lamp1 ilmentymistä terveellä kontrolli (normaali) ja chemoresistance (CR) tapaukset (**, p 0,05, tilastollisesti merkitsevä).

kliiniset ja patologiset ominaisuudet

esikäsittely koskevat tiedot alkuperäisen plasma Surviviinispesifisiä ja PSA-tasoihin ja Gleason tulokset hankittiin tutkituissa potilaissa. Nämä patologiset ominaisuudet esitetään yksityiskohtaisesti taulukoissa 1, 2, 3, 4. Kaikkiaan kahdeksassa tapauksessa eturauhassyövän uusiutumisen jälkeen tavanomaisen hoidon, kymmenen tapausta Gleason 6, kymmenen tapausta Gleason 9, (taulukko 1); ja kymmenen valvonta tapauksissa (taulukko 2) on kerätty plasma analysoitiin. PSA plasmasta (kliininen raportti) ja siitä -ultrasentrifugissa-puhdistettu eksosomeiksi osoitti, että vaikka proteiinin pitoisuudet eivät olleet samanlaisia, oli samankaltaisuutta suuntaus plasman plasmasta peräisin eksosomi PSA-arvot. Tärkeää on, Surviviinivasteita määrä vaikkakin merkittävästi vähemmän eksosomeiksi olivat yhdenmukaiset potilaat arvioitiin ja annettiin herkkyys ELISA, pikogrammojen Surviviinia verrattuna nanogrammaa varten PSA, on tarkempi.

Lisätutkimukset käyttäen sera sijaan plasman tehtiin kuusi valvontaa, kaksikymmentä BPH tapauksissa (taulukko 3) ja 19 ylimääräistä PCa tapauksissa (taulukko 4). Kuten aikaisemminkin, ELISA tulokset surviviinin herkemmän ja vakaa kvantitointi kuin ei ELISA-PSA. Kvantitointi seerumeista BPH potilailla havaittiin keskimäärin 52,9 pg /ml Surviviinispesifisiä ja 1,3 ng /ml PSA. Vertailun vuoksi, kun sitä arvioidaan PCA potilailla, surviviinia keskimäärin 149 pg /ml ja PSA keskimäärin 0,3 ng /ml (taulukot 3 ja 4). BPH numerot sekä Surviviinispesifisiä ja PSA ovat lähes 3 kertaa pienempi kuin vuonna PCA potilaiden seerumit. Valitettavasti osti BPH näytteitä ei tullut kliiniseen PSA ELISA määrinä, että meillä on peräisin PCA tapauksista (taulukko 3).

korrelaatiot surviviinin PSA

potilaan plasman /seerumin näytteiden arvioitiin surviviini, kaikki näytteet (Gleason 6, Gleason 9, toistumisen tai PCa näytteet) oli suurempi kuin 100 pg /ml surviviini (taulukko 5). Sitä vastoin vain 60% Gleason 6, 80% Gleason 9 plasmaa ja 84% PCa seerumeista oli PSA on suurempi kuin 4 ng /ml. Toistuva potilasnäytteille kaikilla oli suurempi kuin 4 ng /ml. Hallinnassa plasmaa ja BPH seerumit, näytteistä ei ollut surviviinin pitoisuus on suurempi kuin 100 pg /ml, ja ei PSA-pitoisuus on suurempi kuin 4 ng /ml (taulukko 5).

Keskustelu

eturauhassyövän vastustaa apoptoosin muuttuneisiin ilme sekä pro- ja antiapoptoottisten proteiinien siten ohittaen sisäinen valvonta tarkistuspisteitä, kukoistava epäsuotuisa mikroympäristöihin, ja hankkimalla invasiivisen fenotyyppi [20]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että apoptoosin inhibitio, pikemmin kuin parannettu soluproliferaation, on kriittinen piirre, joka vaikuttaa eturauhasen syövän synnyn. Niistä sääntelyviranomaisten Eturauhassyövän apoptoosin, kiinnostus on viime aikoina keskittynyt surviviinia monitoiminen jäsen estäjän apoptoosin (IAP) geeniperheessä joka ehkäisee solukuoleman ja ohjaa mitoottisiin etenemistä. Valikoiva surviviinin yli-ilmentyminen on liittynyt korkeampi kasvaimen, edenneen taudin vaiheessa, nopea syövän etenemiseen, lyhyt elossaololuku, ja kestävyys hoito potilailla, joilla oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [17] – [19].

surviviinia olemassa useita subsellulaaristen paikoissa kuten mitokondriot, solulimassa, ja ydin. Äskettäin on myös havaittu, että solunulkoiseen tilaan [23], [24]. Olemme osoittaneet, että ekstrasellulaarisen surviviinia olemassa multimolecular komplekseja, jotka sisältävät lämpöshokkiproteiinit [24]. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että nämä kompleksit asuvat tai eksosomeiksi, ja että syövän hoito voivat parantaa niiden julkistaminen eksosomeiksi syöpäsolujen [24]. Solunulkoinen Surviviinivasteita pystyy välittävän pro-selviytymisen kentän vaikutus kautta sen erityksen syöpäsoluja ja otto ympäröivään terveeseen ja transformoituja soluja [23]. Linkittäminen solunulkoinen Surviviinivasteita n kyky parantaa solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja kasvainsolun invaasio kanssa kalvoon suojaava kaupan toimintatavat saadaan lisätukea hypoteesia, että surviviinin on keskeinen rooli patobiologian syöpäsolun kasvua ja suojaa hoitotoimenpiteiden.

Useat aiemmat tutkimukset ovat tutkineet plasman surviviinin syöpäpotilailla [36], [37]. Aikuisten T-solu- leukemia ja supernatantit in vitro viljelmistä kiinteän kasvaimen solujen tasot surviviinin proteiini oli alhainen verrattuna solun surviviinin proteiini ja mRNA-tasoja [37]. Tämä havainto johti päätelmään, että Surviviiniproteiini plasmassa eivät kuvaa solun surviviini tasoilla. Lisäksi Surviviinivasteita plasmatasot arvioitiin verrattuna alfafetoproteiini (AFP) potilailla, joilla on krooninen C-hepatiitti virusinfektion (HCV) kanssa ja ilman maksasolusyövän (HCC) [36]. Vaikka ole tehnyt yhtä luotettavina näissä tutkimuksissa kuin AFP, Surviviinin tasot määritettiin olevan mitattavissa oleva merkittävä kärsivillä potilailla, joilla HCV ja mitattavissa, mutta ei merkittävää niissä kanssa HCC. Vaikka ei ole täysin selvää, nämä tulokset voidaan selittää havainto, että HCV-tartunnan HCC soluista tuli vastustuskykyisiä solukuolemaa ja siten Surviviinispesifisiä vapauttamalla verrattuna valvoa tai HCV-tartunnan saaneiden solujen yksinään [36].

Eturauhasen antigeenin (PSA) määritys on controversially hyödynnetty eturauhassyövän seulontaan, vaikka aluksi se oli visioi kuin arvioinnin välineenä hoitovasteen [38]. Sen käyttö seulontatyökaluna johtui sekä USA eturauhassyöpä taakka ja tarve havaita sen läsnäolo kerrallaan joka sallisi parantava hoito alkaa. Valitettavasti sen käyttö uskotaan ovat johtaneet sekä yli diagnoosia ja ylihoito ja siten kiireellisesti uusien biomarkkereiden löytyy täydentää PSA johdon ja hoito [39]. Exosomal Surviviini mittaukset voivat tarjota toisen plasma-pohjainen määritys läsnäolo PCa. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet ensimmäistä kertaa, että eksosomeiksi sisältävä Surviviinispesifisiä voidaan puhdistaa plasmasta kerättiin kärsivillä potilailla Eturauhassyövän. Vaikka oli pieni ero eksosomi määrän, exosomal Surviviinin tasot olivat korkeampia eksosomeiksi puhdistettu PCa potilaita kuin seerumeista terveillä. Lisäksi tässä tutkimuksessa ja että suoritetaan toisten [36], [37], plasma-kvantitatiivisesti surviviinia potilailta otetuista näytteistä, joilla ei ole vahvistettu syöpädiagnoosin, oli myös vähentänyt Surviviinin tasot verrattuna PCa potilaiden seerumit. Lähde tämän exosomal surviviinin allas, mutta epäselvää, voivat olla peräisin immuunijärjestelmän soluihin [40], kuten lymfosyyttien [41], monosyyttien [42] ja dendriittisolut [34], kaikki surviviinin sisältävien solujen [43], joka on osoitettu vapauttavan eksosomeiksi. Surviviini ilmentyminen liittyy vakiintunut piirteitä biologisesti aggressiivinen eturauhassyöpä, kuten korkeampi lopullinen Gleason ja etäpesäkkeiden kautta paikallisiin imusolmukkeisiin [20]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että potilaat, jotka oli epäonnistunut hoito Taxotere oli kohonneita exosomal surviviinin. Lisäksi ja erityisen kiinnostavia, huomasimme, että potilailla, joilla on joko puolivälissä (Gleason 6) tai suuri (Gleason 9) Gleason tulokset oli korkeampi exosomal Surviviinispesifisiä tasolle, eikä merkittävää eroa Surviviinispesifisiä niiden välisen. Tutkimuksemme vaikkakin vankempi plasmassa tutkittiin näkyvät kanssa, mitä on todettu virtsaa, kasvain eksosomeiksi ja PSA [31]. Näissä tutkimuksissa virtsa eksosomi PSA kuvataan läsnä 20 24 PCa yksilöiden taas meidän käsissämme, kasvain eksosomi surviviini löytyy 47 47 yksilöitä. Vai ei syövän hoito vaikuttaa kasvaimen eksosomi Surviviinispesifisiä tasoilla on vielä arvioitava.

Tässä nykyisessä tutkimuksessa, tarjoamme vakuuttavia todisteita siitä, että kiertävä Surviviinispesifisiä voi olla hyödyllinen diagnostinen ja prognostinen markkeri ihmisen PCa. Tuloksemme osoittavat, että surviviinia analysoitiin suoraan seerumi /plasma tai seerumi /plasmasta peräisin eksosomeiksi, oli pienempi potilailla, joilla on BPH ja terveiden verrokkien kuin miehillä PCA. Surviviinivasteita tasot eivät muuttuneet, on jatkuvasti korkea, osalta Gleason pisteet ja potilaat, joilla on toistuminen, mikä viittaa siihen, että surviviini tasoilla voitaisiin käyttää varhaisen havaitsemisen ja voisi ehkä jonakin päivänä paremmin erottamaan BPH PCA. Vertaamalla potilaiden kanssa ja ilman kasvaimia, mutta kummallakin on korkea PSA-arvot on myös tärkeä seuraava askel, koska käsissämme kaikki BPH näytteet olemme hankkineet on suhteellisen ei-syöpä PSA-arvot [44].

rooli exosomal surviviinin on vielä tuntematon. On mahdollista, että hoito-korosti, solu vapauttamaan eksosomeiksi sisältävien surviviinin ja muut antiapoptoottisten proteiinien, RNA: t tai miRNA suoritetaan viimeisenä keinona suojautua stressiä vallitsevalle kasvain microenvironment. Suurempi tutkimuksissa enemmän tapahtumia ja pidempi seuranta-aika tarvitaan kehittämään varmemmalla lausuma yhdistys surviviinin ilmentymisen eksosomeiksi tai kasvaimen mikroympäristössä eturauhasen syöpä etenemistä ja mikä tärkeintä, etäpesäkkeitä ja selviytymistä. Nämä havainnot tarjoavat perusteet arvioida edelleen exosomal surviviinin ja sen roolia vastustuskykyä androgeenin perustuva hoito eturauhasen syöpä ja nostaa kohdennetun yhdistelmähoitoa edenneen eturauhassyövän.

havainto, että surviviinia, joka on ainutlaatuinen ihmisen estäjä apoptoosin (IAP), on solujen välisen liikenteen ja signalointiominaisuudet on merkittävä. Yhdenmukainen Surviviinivasteita osallistumisesta epäsuotuisa kliinis parametreja, ihmiskaupan Surviviinispesifisiä koko kasvain microenvironment voi ajaa aggressiivinen tila kasvain, kieltävät tai minimoida hoitotuloksen. Meidän nykyinen työ osoitamme, että vaikka kokonaismäärä eksosomeiksi vuodattamatta osaksi potilaan plasman ei muuta merkittävästi aikana syövän kehittymiseen, taso surviviinin niissä eksosomeiksi kasvaa huomattavasti. Tärkeää on, etenemiseen keski myöhäisvaiheen ei aja tuntuvaa Surviviinispesifisiä kasvu osoittaa, että Surviviinispesifisiä voivat osoittautua hyödyllisiksi biomarkkerina varten aiemmin havaita eturauhasen syöpä. Todellakin, Surviviinispesifiset testaus, suoritetaan kasvaimeen eksosomeiksi, mahdollistaa molekyyli-pohjainen diagnoosi, että aika voi myös tukea hoitopäätöksiä ja tautien vastaus valvonta johtaa parempaan eturauhassyövän hoito.

Materiaalit ja menetelmät

Patient Plasma ja seerumi

Plasma kerättiin kymmenen terveillä vapaaehtoisilla miehillä, ja kaksikymmentä kahdeksan PCa potilaille. Plasma kahdenkymmenen PCa aiheista saatiin näyte pankin SPECS konsortio, joka on havainnoiva kliininen tutkimus, jossa käytetään eturauhasessa ja kliiniset arvot on saatu tietoisen suostumuksensa johtamiseksi geeni allekirjoitukset ennustava tuloksen aikaan diagnoosin. SPECS on ohjannut tohtori Dan Mercola päässä University of California, Irvine. Näytteet olivat pre-prostatektomia plasma satunnaisesti valittu kymmenen huonolaatuisen PCa tapauksissa (Gleason 6) ja kymmenen korkea-asteen PCa tapauksissa (Gleason 9). Lisäksi plasmaa kahdeksan kehittynyt-tautia PCa potilaat osallistuvat toisen linjan kemoterapia tutkimuksessa kerättiin myös. Nämä potilaat olivat epäonnistuneet kemoterapian kanssa Taxotere. Yhdeksäntoista seeruminäytteet kerättiin PCa potilaiden ja kuusi valvonnan kautta San Manuel Band operaation intiaanit Biospecimen laboratorion Loma Linda yliopistoissa Cancer Center. Kaksikymmentä BPH näytteitä hankittiin Bioserve Biotekniikka, Beltsville, MD. Bioserve Biotekniikka tarjoajana näistä näytteistä on voimassa niin määritelty HIPPA Act of 1996 tarjoaa ne meille rajoitetun tietokokonaisuus suojattujen potilastietojen.

Verta kerättiin tyhjiössä putkiin, jotka sisältävät natriumia hepariinia. Putkia sentrifugoitiin 2000 g × 7 minuuttia, ja plasma poistettiin sitten ja jaettiin eriin varastointia varten -80 ° C: ssa. Kaikki näytteet saatiin aikana IRB-hyväksytty tutkimuksissa seuraavat asiakirjat tietoisen suostumuksen mukaisesti yliopiston politiikan sekä Loma Linda University ja University of California at Irvine.

Human Surviviinispesifisiä Immunoassay

Koko plasma näytteet altistettiin kaupallisesti saatavilla ihmisen surviviini Immunoassay (R & D Systems, Minneapolis, MN) käyttäen valmistajan ohjeita, jotta kvantitoimiseksi surviviinin pitoisuuksia.

eksosomi eristäminen

plasma mikrovesikkelit eristettiin, kuten aiemmin on kuvattu, vähäisin muutoksin [45]. Sulatettu, kylmäsäilytetyt plasmaa (2 ml), sentrifugoitiin 30 minuutin ajan 500 x g, 45 min 12000 x g ja 18 h 110000 x g. Pelletit suspendoitiin uudelleen suuren määrän PBS: ää, suodatettiin 0,22 um suodattimen (Millipore, Billerica, MA), ja sentrifugoitiin 110,000 x g 1 tunnin ajan. Mikrovesikkelien pelletit pestiin kerran suuri tilavuus PBS: ää, sentrifugoitiin 110000 x g 1 tunnin ajan, ja suspendoitiin uudelleen 50-200 ml: aan PBS: ää. Määrä 110000 x g pelletti proteiinien talteen mitattiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL). Eksosomit käytettiin tuoreena valmisteet immunoblottauksella tai oli säilytetty -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten. Sillä seeruminäytteet, kaupallisesti saatavilla ExoQuick (SBI, Mountain View, CA) käytettiin kuvatulla myyjän. Lyhyesti, 100 ui seerumia inkuboitiin 100 ui ExoQuick liuosta ja sen jälkeen 2 tunnin inkubointi 4 ° C: ssa ja sen jälkeen sentrifugoimalla 1500 x g 30 minuuttia. Sentrifugoinnin jälkeen eksosomeiksi näkyvät beige tai valkoinen pelletti alareunassa astian, joka sitten liuotetaan 500 ui dH

2O.

eksosomi määrän

määrän kvantitoimiseksi eksosomeiksi vapautetaan, arvioimme aktiivisuus asetyylikoliiniesteraasin, entsyymin, joka liittyy näihin rakkulat. Asetyylikoliiniesteraasin aktiivisuus arvioitiin, kuten on kuvattu Savina et al. [46]. Lyhyesti, 40 ui eksosomi fraktio suspendoitiin 110 ul: aan PBS: ää. 37,5 ml tätä PBS-laimennettiin eksosomi fraktio lisättiin sitten yksittäisiin kuoppiin 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikrolevylle. 1,25 mM Asetyylitiokoliini ja 0,1 mM 5,50-ditiobis (2-nitrobentsoehappo) lisättiin sitten eksosomi jakeet lopullisessa tilavuudessa 300 ui, ja absorbanssin muutos 412 nm: ssä tarkkailtiin 5 minuutin välein 30 minuutin ajan.

Human PSA Immunoassay

eristetty eksosomeiksi potilaiden ”plasma tehtiin ihmisen prostataspesifisen antigeenin (PSA) käyttäen PSA Immunoassy (American Research Products, Inc., Waltham, MA, USA) sarja sarjan valmistajan ohjeita, jotta kvantitoimiseksi PSA-pitoisuudet eksosomeiksi.

Western blot -analyysi

Western blot -analyysiä varten, soluja tai exosomal valmisteet lyysattiin käyttäen hajotuspuskuria (50 mM Tris (pH 7,5), 1 % NP40, 0,25% DOC, 150 mM NaCl

2, 1 mM PMSF, 10 ug /ml aprotiniini /leupeptiini /pepstatiini, 20 mM NaF, 0,2 mM EGTA, 1 mM EDTA (pH 8,0), H2O). Proteiinin pitoisuuksien BCA-määrityksellä (Pierce, Rockford, IL) käytettiin. Proteiinit eksosomeiksi (20-40 ug) erotettiin käyttämällä 12% Bis-Tris polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Billerica, MA) ja tutkittiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: hiiren monoklonaalinen anti-LAMP1 (Abcam, Cambridge, MA ), ja kanin polyklonaalista anti-surviviinia (Novus, Littleton, CO). Toissijainen vasta-aineita (IR-värin konjugoitu) oli vuohen anti-kani-ja vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini (LICOR, Lincoln, Nebraska).