Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munuainen on herkkä lääkkeen myrkyllisyydestä useita ksenobioottien ja on myös erittäin herkkä kehitystä pahanlaatuisia kasvaimia. Molemmissa tapauksissa

in vitro

tutkimukset antavat käsityksen soluvaurioita, ja edustaa tarkoituksenmukaisia ​​malleja tutkia joko mekanismeista myrkyllisiä vaikutuksia useiden nephrotoxicants tai hoitomenetelmät munuaisten syöpään. Kehittää tehokkaita menetelmiä perustamista ihmisen normaalia ja kasvaimen munuaisten solumalleja on siksi ratkaisevan tärkeää. Tässä tutkimuksessa, joka on teknisesti yksinkertainen ja nopea protokolla eristämiseksi ja kulttuuri ihmisen proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen ja ihmisen munuaisen syöpäsolujen kirurgisista näytteistä on esitetty. Kasvain ja normaalit kudokset käsiteltiin käyttämällä samaa menetelmää, joka perustuu mekaaniseen erittelemään kudoksen, jota seuraa entsymaattinen digestio ja solujen puhdistamisen peräkkäisiä seulomalla. Yleinen menettely kestää noin tunnin. Tuloksena solujen valmisteet ovat erinomaiset elinkyvyt ja tuotto. Perustaminen primääriviljelmien kaikista näytteistä saavutettiin onnistuneesti. Alkuperä ensisijainen viljellyistä soluista perustettiin kautta morfologista arviointia. Normaalien solujen puhtaus varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksellä ja käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio analyysi spesifisten merkkiaineiden.

Citation: Valente MJ, Henrique R, Costa VL, Jerónimo C, Carvalho F, Bastos ML, et ai . (2011) nopean ja yksinkertaisen menetelmän perustaminen Ihmisen normaali ja Cancer Munuaisten Primary soluviljelmissä lähtien kirurgisista näytteistä. PLoS ONE 6 (5): e19337. doi: 10,1371 /journal.pone.0019337

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: Joulukuu 23, 2010 Hyväksytty: 28 maaliskuu 2011; Julkaistu: 4. toukokuuta 2011

Copyright: © 2011 Valente et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Human proksimaalisten tubulusten epiteelisolujen (HPTEC) vastaavat suuret solutyyppi ihmisen aivokuoren tubulointerstitiumiin ja, mikä tärkeintä, pääkohde useita vierasaineiden, lääkkeiden väärinkäytöstä antibiooteille, antineoplastiset aineet, metallit, ja mykotoksiinien [1] – [5]. Primaariviljelmät HPTEC voi tarjota hyvin kuvattu

in vitro

mallissa fenotyyppisesti edustava HPTEC

in vivo

. Tämä

in vitro

järjestelmä on liittänyt tutkimuksen munuaissolulinjoissa toiminta, liikenne prosessit, ja solumekanismeja proksimaalisten tubulusten vahinkoa vierasaineiden ilman häiriöitä muista tekijöistä, jotka liittyvät

in vivo

kokeiluja . Tätä varten on välttämätöntä saavuttaa korkeasti rikastetun HPTEC valmisteiden munuainen kudosta. Useita tekniikoita on kuvattu eristämistä ja viljelyä HPTEC. Nämä menetelmät ovat perustuneet aikaavievää tekniikoita kuten isopyknisellä sentrifugoinnin kanssa Nycodenz tai Percoll [6] – [9], tai jopa monimutkainen mikrodissektion protokollia tai ilman entsymaattisesti [10], [11]. Suurimmat puutteet Näiden menetelmien tarjoaa alhaiset saannot ja työvoimavaltaista menettelyjä.

Lisäksi ksenobioottisille aiheuttamaa toksisuutta, munuaiset myös altis kehittämiseen hyvänlaatuinen (esim oncocytoma) tai pahanlaatuinen (esim munuaissolukarsinooma syöpä, RCC) kasvaimet. RCC sisältää 85% munuaisten syövistä aikuisilla, ja yli 3% aikuisista syöpäsairauksia. Yli 30000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain, se on kuudenneksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa, vastaten noin 12000 kuolemaa vuodessa [12], [13]. Sen histologinen ulkonäkö, RCC voidaan jakaa alatyyppeihin: tavanomainen tai kirkas solu, papillaarinen, kromofobista leikettä, ja unclassifiable RCC [14], [15]. Tyhjennä solu RCC on yleisin muoto munuaissyöpäsolujen. Se on peräisin proksimaalisen epiteelissä, ja osuus 80 ja 85% munuaisten kasvain [12], [15]. Papillaarisen RCC on toiseksi yleisin alatyyppi munuaissyöpä, joiden esiintyvyys noin 10% munuaisten pahanlaatuisia kasvaimia, ja on ominaista kasvainsolujen järjestetty papillaarinen kokoonpano [16], [17]. Kromofobista leikettä on harvinainen alatyypin RCC, joiden esiintyvyys on noin 5% munuaisten pahanlaatuisia kasvaimia. Kuten selkeä solu RCC, se kehittyy munuaiskuoressa [18], [19].

RCC etiologia on vielä tunnistamatta, kehittää joko satunnaista muodossa tai perinnöllinen sairaus, ja riippumatta alatyyppi on, se kuvataan hyvin vastustuskykyinen tavanomaisille radio-, kemo- ja immunoterapia hoito [12], [15], [20]. Siksi löytämään uusia strategioita terapeuttisesta edelleen etusijalla. Tässä suhteessa, soluviljelmä Ihmisen munuaisten kasvainsolujen (HRTC) on osoittautunut olevan sopiva in vitro malli tutkimus terapeuttisia lähestymistapoja RCC [15], [21] – [23]. Lisäksi ohella tutkimukset kasvaimen soluviljelmissä, on tarpeen testata myrkyllisyys mahdollisten terapeuttisten aineiden normaalin vastine solut. Siksi se on tärkein tavoite Tämän tutkimuksen esittää yksinkertaisen ja nopean menetelmän perustamaan ihmisen munuaisen primääriviljelmissä, sekä normaali (HPTEC) ja kasvainten (HRTC), saatu saman elimen.

menettely esitetään tässä on mukautettu aikaisemmin vakiintuneilla menetelmillä [6], [9], [24] – [26], ja sitä käytetään käsittelemään normaaleissa ja tuumorikudoksissa. Se perustuu mekaaniseen eriteltyinä kudoksen seuraa entsymaattinen ruuansulatuksen ja solujen puhdistamisen peräkkäisiä seulomalla. Tämä tekniikka mahdollistaa erottamisen solufraktiota joka on hyvin rikastettu HPTEC tai HRTC päässä vastaavasti normaalin munuaisen kuorikerroksen ja kasvainten munuaiskudosnäytteillä, jossa paljon korkeampi tuotto ja solujen elinkelpoisuus kuin muut vahvistettu eristämistä menettelyjä. Yleinen menettely on teknisesti yksinkertainen, joka mahdollistaa helppo toteutus soluviljelmissä laboratorioissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Seuraavat materiaalit saatiin GIBCO ™ Invitrogen (Barcelona, Espanja), ellei toisin mainita.

Soluviljelyelatusaine: Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine ravinneseosta F-12 (DMEM /F-12) ja GlutaMAX-I ™, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS ), penisilliiniä /streptomysiiniä (50 U /ml /50 ug /ml), fungitsonia (2,5 ug /ml) ja ihmisen transferriini (5 ug /ml).

Hankin puskuroitu suolaliuos (HBSS) ilman CaCI

2 ja MgCl

2.

kollagenaasia: liuotetaan 50 mg kollagenaasia tyyppiä 2, 315 U /mg (Worthington, Lakewood, NJ) 25 ml ei-viljelyväliaineessa suodatussteriloida 0,22 pm suodattimen. Käytetty tuore.

0,05% trypsiini-EDTA-liuosta.

Jäädytys ratkaisu: 90% FBS ja 10% dimetyylisulfoksidia.

inkubaatiosäiliöön: klavoida 250 ml PYREX® lasi-vaipalla varustetun pulloon (Vidrolab 2, Gandra, Portugali), jossa on magneettinen baari sitä. Lämpötila kollagenaasiliuos säiliössä pidetään 37 ° C: ssa kierrättämällä lämmintä vettä vaipan läpi pullon (Fig. 1).

Kollageeni pinnoitettu pulloihin: 75-cm

2 muovi kulttuuri pulloja päällystetty yön yli 37 ° C: ssa 40 ug /ml liuosta kollageenin G naudan vasikan ihon (Biochrom AG, Berliini, Saksa) PBS: ssä.

Steriilit solun- kanssa silmäkooltaan 100, 70, ja 40 pm (BD Falcon ™, BD Biosciences, USA).

0,4% Tryptan liuosta (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

AccuGENE® 1 x PBS (Lonza Laboratories, Verviers , Belgia).

immunosytokemiallinen värjäys: hiiren monoklonaalinen anti-pan sytokeratiini-vasta-ainetta, vuohen anti-hiiri-IgG-FITC-vasta-ainetta, ja Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

RT-PCR-analyysi: RNeasy Mini RNA: n eristys (Qiagen, USA) ja RevertAid ™ H Minus Ensimmäinen jalusta Synthesis Kit (Fermentas, Tanska).

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi Portugalin Oncology Institute-Porton eettisen komitean. Kaikki haastatellut potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

Tissue Collection

Ihmisen munuaiskudosnäytteillä saatiin yhteensä 6 potilasta (3 urosta ja 3 narttua) voimakkaassa nephrectomy munuaissyövän klo Portugali Oncology Institute-Porto (IPO-Porto). Potilas keski-ikä oli 62 ± 5 vuotias. Kudosnäytteet (noin 10 g kukin) kerättiin alueilta makroskooppisesti todettu normaalia (aivokuoren) tai kasvaimen heti näytteen uuttamalla, asiantuntijan uropathologist. Kyseessä olevien alueiden vahvistettiin myöhemmin histopatologisissa peili näytteitä. Kudokset pantiin erotettiin steriiliin 50 ml: n putkiin jääkylmällä viljelyalusta ja sitten siirrettiin soluviljelmään laboratoriossa jäällä.

Kaikki yksilöt kävivät myöhemmin rutiinia kudosten käsittely (formaliini kiinnitys ja parafiiniupotusta). Histopatologiset analyysi osien arvioimiseksi tyypin munuaissyövän, lajittelu- ja lavastus suoritettiin patologian osaston, IPO-Porto.

HPTEC ja HRTC eristäminen pöytäkirjan

Munuaissyöpä eristäminen tapahtui 30 minuuttia munuaisten kudoksen keräämistä. Kaikki seuraavat menettelyt suoritettiin kudosviljelmän Flow huppu, steriileissä olosuhteissa. Välttämiseksi cell ristikontaminaation, suosittelemme käsittely normaalin ja kasvaimen yksilöt kahden yksittäisen kudosviljelmän huput. Jos tämä ei ole mahdollista, niin, seuraavia ohjeita olisi lisättävä: vain yksi kirurginen näyte tulisi käyttää kudosviljelmän huppu kerrallaan (tänä aikana pitää muiden kudosten jäällä steriiliin astiaan), konepelti tulee puhdistaa ennen käyttöönottoa muiden kirurgisten näytteen, ja pulloja tai väliaineen alikvootit pitäisi omistaa käytettäväksi vain normaali tai syöpäsoluja.

laboratoriokasvatuksessa kaappi, siirrä kudoksen 60 mm petrimaljaan. Pinseteillä ja saksilla, leikellä pois (i) kuitumainen kapselin ja viereisen ydin alkaen aivokuoren kudos ja (ii) mitä tahansa rasvaa, verihyytymiä ja sidekudoksen kasvaimen kudoksista.

Leikkaa kudosnäytteen pieniksi paloiksi kanssa skalpelleja.

Siirrä kudosfragmenttien steriiliksi 50 ml: n sentrifugiputkeen, huuhtele niitä voimakkaasti jääkylmällä HBSS (sisältää EGTA että löysää soluliitos kautta kalsiumia kelatoiva vaikutus) ja dekantoidaan supernatantti. Toista tämä viimeinen vaihe, kunnes liuoksessa ei ole verta.

Kaadetaan pinnalla oleva neste pois, siirtää fragmentit puhtaaseen 60 mm petrimaljaan ja hienoksi hienonna kudoksen noin 1 mm

3 kappaletta skalpelleja.

Suspendoidaan pieniä palasia 25 ml: ssa esilämmitettyä ei-viljelyväliaineeseen, ja yhdistää sen kollagenaasiliuos (1 mg /ml lopullinen konsentraatio) inkubaatioastiassa. Inkuboidaan 20 minuuttia 37 ° C: ssa varovasti sekoittaen.

Kuljeta pilkottu kudos sivulle ensimmäisen seulan (100 um) 50 ml: n sentrifugiputkeen. Samaa menettelyä sovelletaan sitten seuraavat seulojen (70 ja 40 um). Seulomalla 100 pm seulan avulla poistetaan kaikki pilkkoutumattomiin sidekudoksen, kun taas toiminta 70 ja 40 um: n seulalla on poistaa kontaminoivat putkimaisen fragmentteja ja glomerulusten, vastaavasti.

Pese seulottiin solut sentrifugoimalla (400

g

, 5 min 4 ° C: ssa), ja suspendoidaan pelletti uudelleen HBSS. Toista tämä kaksi kertaa, ja sitten suspendoidaan solupelletti elatusaineeseen lisäyksin. Määritä solujen lukumäärä ja elinkelpoisuuden Neubauer hemosytometriin käyttäen trypaanisinistä ratkaisu.

Kuvassa 1 on esitetty kaavamaisesti yleisen menettelyn.

Cell Culture Protocol

siemeniä eristetty solujen kollageenipäällysteisiin 75 cm

2 dosviljelypulloihin tiheydeksi 5 x 10

4 solua /cm

2 ja inkuboi kosteutetussa ilmakehässä 95% ilma /5% CO

2 37 ° C: ssa. (Huom: RPMI 1640 väliaineessa täydentää voidaan käyttää vaihtoehtoisesti kasvaa HRTC) B

Muuta keskipitkällä 24 h kuluttua ensimmäisestä kylvö ja 48 tunnin välein.

Anna solujen kasvaa, kunnes -80% konfluenssiin, ennen kuin ne jatkoviljeltiin tai jäädytetty.

Kun viljellään edellä kuvatulla tavalla, solut saavuttavat konfluenssin noin 10-13 päivä sen jälkeen, kun kylvö.

Cell Subculture Protocol

Poista soluviljelyväliaineessa ja pese yksisolukerros joko ennen lämmitettiin HBSS tai PBS: ää ja 1 ml trypsiini-EDTA-heikentää soluadheesiota pulloihin pintaan.

Lisää riittävästi trypsiini-EDTA-liuosta kattamaan pulloon pinnalle ja inkuboidaan 37 ° C: ssa 3 min. Noudata soluja ylösalaisin optisella mikroskoopilla varmistaa riittävä solujen irtoaminen.

Lopeta trypsiinin toiminnan lisäämällä 10 ml: aan täydennettyä kasvualustaa ja suspendoi irrotettuja soluja toistuvasti pipetointirobotin pinnan yli viljelmän pulloon.

Siirrä uudelleensuspendoitiin solut sentrifugiputkeen, pullo huuhdotaan keskipitkän ja lisää huuhdellaan soluja sentrifugiputkeen. Seed solususpensiota uuteen 75-cm

2-pulloihin 01:03 alakulttuuri suhde.

Näissä olosuhteissa HPTEC kuin ensimmäisen kanavan ulottuville konfluenssiin 3-5 päivää, ja HRTC 7 päivää.

Cell kylmäsäilytys, sulatus ja jatkomaljausta pöytäkirjan

Kun trypsinisaation, siirrä irrotettuja soluja sentrifugiputkeen ja pelletti solut sentrifugoimalla (400

g

, 5 min 4 ° C: ssa).

Suspendoidaan pelletti kustakin pullosta 3 ml jäätymisen ratkaisu.

Siirto 1 ml solususpensiota 2 ml kylmäpulloon ja jäädyttää välittömästi -80 ° C: ssa .

To reseed suspensiot, solut nopeasti sulatetaan lisäämällä esilämmitettyä täydennetty keskipitkällä ja siirrettiin 15 ml: n sentrifugiputkeen.

solujen pelletoimiseksi sentrifugoimalla 400

g

, 5 minuuttia.

pelletti suspendoidaan uudelleen lämmennyt elatusaineeseen, ja siirretään 75 cm

2 pulloissa, yksi injektiopullo pulloa kohti.

HPTEC ja HRTC ovat onnistuneesti kylmäsäilytetyt sekä eristettyjä soluja ja solujen suspensioita saatiin trypsinointikäsittelyn jälkeen, säilyttää normaali kasvu sulatuksen jälkeen.

Morfologiset Arviointi

Yksikerroksinen johdetut viljelmät kaikki 12 ensisijaista isolaatit (6 normaali, 4 selvä munuaissyöpää ja 2 kromofobista leikettä RCC), ja vastaavan ensimmäisen kolmen kanavan tutkittiin valomikroskoopilla mukaisesti käänteisen optisella mikroskoopilla. Kuolemattomaksi läheisen munuaistiehye epiteelisolujen linja on peräisin normaalin aikuisen ihmisen munuaisen, HK-2 solulinja (ATCC, CRL-2190), tutkittiin myös vertailun.

immunosytokemi- Värjäys varten sytokeratiinivasta

tutkia epiteelin alkuperä on saatu normaalin ja kasvaimen munuaisten solujen reaktiivisuus anti-sytokeratiini-vasta-aine arvioitiin suspensioiden välillä kohdissa 1 3. Kaksi kuolemattomia solulinjoja, jotka ovat peräisin normaalista (HK-2) ja kasvaimen (A-498) ihmisen munuaisen käytettiin positiivisena kontrollina.

Lyhyesti HPTEC tai HRTC kasvatettiin noin semiconfluence 24-kuoppalevyillä (alkutiheydellä: 1,0 × 10

5 solua /kuoppa), pestiin steriilillä PBS: llä, vahvistettu 20 minuuttia 4%

p-

formaldehydiä, ja läpäiseviksi 5 minuuttia 1% Triton X-100 liuosta. Sen jälkeen, kun esto, jossa on 1% naudan seerumin albumiinia, 0,4% Triton X-100 ja 4% natriumatsidia seos, soluja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren monoklonaalisten anti-pan sytokeratiini-vasta-aine (1:100), ja sen jälkeen vuohen anti-hiiri-IgG-FITC-vasta-ainetta (1:100) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, tumat vastavärjättiin 5 ug /ml Hoechst 33258: ssa 5 minuuttia ja sitten pestiin PBS: llä jälleen. Kuvat otettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse E400). Asianmukaiset negatiivisia kontrolleja sisällytettiin taata positiivisia vasta-reaktiivisuus.

käänteistransskriptaasi-PCR (RT-PCR) analyysi spesifisten

Suspensiot (noin 3,0 x 10

6 solua kutakin) ensimmäisen kanavan normaaleihin soluihin 4 luovuttajien analysoitiin RT-PCR: llä vahvistaa alkuperä ja puhtaus isolaattien. Siten mRNA ilmaus kolmen ominaisuuden proteiinien arvioitiin: uromodulin (distaalinen tubulussoluihin), akvaporiini 3 (kerääjä tiehytsoluja) ja aminopeptidaasi A (proksimaalisten tubulussoluihin). Lyhyesti, RNA eristettiin kaikista näytteistä, joissa RNeasy Mini RNA: n eristys kit, ja pitoisuudet määritettiin käyttämällä ND-1000 Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). cDNA valmistettiin RNA: sta käyttäen RevertAid ™ H Minus ensimmäisen jalusta Synthesis Kit ja monistettiin RT-PCR: llä käyttäen aiemmin julkaistu alukkeita sekvenssit ja vastaavat hehkutus olosuhteissa [27]. Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), käytettiin housekeeping-geeni, joka on seos, munuaisten soluja positiivisena kontrollina kaikki proteiinit analysoitiin, ja vesi negatiivisena kontrollina. RT-PCR-tuotteet ladattiin denaturoivassa 2% agaroosigeeleillä, värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin UV-transilluminaattori.

Tulokset

histopatologia

HRTC viljelmät olivat peräisin RCC kirkas cell (4 tapausta) tai kromofobista leikettä (2 tapausta) alatyyppeihin. Selkeä solu RCC tapausta säveltänyt soluja acinar tai keuhkorakkuloiden järjestely, jolla oli ominainen optisesti kirkas sytoplasma erottuva solukalvojen, muuttuva ydin- koon ja tunnettuutta on nucleoli (Fig. 2A). Kromofobista leikettä RCC tapaukset ominaista suuret solut, joissa hieman eosinofiilinen sytoplasma, näkyvä solukalvojen ja epäsäännöllisen muotoisia ytimet (Fig. 2B). Molemmat tapaukset värjättiin hajanaisesti solulimassa kanssa Hale kolloidisen raudan tahra.

(A) Tyhjennä solu munuaissolukarsinooma, ja (B) kromofobista leikettä munuaissyöpää.

Ominaisuudet Ensisijainen Cell Cultures

taulukossa 1 esitetään yhteenveto tärkeimmistä ominaisuuksista kustakin luovuttajasta ja vastaavan isolaattien. Menetelmä tarjoaa valmisteet munuaisten solujen erinomainen elinvoimaisten solujen (96,5 ± 1,4% ja 89,7 ± 4,1% normaalin ja kasvaimen munuaisten solut, vastaavasti) ja tuotokset (18,7 ± 6,9 × 10

6 HPTEC /g aivokuoren kudosta ja 3.1 ± 4,7 × 10

6 HRTC /g kasvainkudoksen). Vietetty aika, alkuperäisestä kokoelma munuaisten yksilöitä kylvö isolaattien, kesti noin 1 tunti.

perustaminen primääriviljelmien onnistuneesti saavutettu kaikista kahdestatoista kudosnäytteiden (6 normaalista cortex plus 4 selvää munuaissyöpää ja 2 kromofobista leikettä RCC). Kaikki pidettiin kulttuurin vähintään kolme kanavaa. Ensisijainen eristettyjä soluja, normaali ja tuumorista peräisin, saavuttivat konfluenssin noin 10 päivän kuluessa. Kun ensimmäinen passage, normaali munuaisen epiteelisolujen osoitti suurempi taipumus lisääntyä

in vitro

kuin syöpäsoluja. Kaikki primääriviljelmissä (ensimmäinen ja alakulttuurien) olivat vapaita fibroblastisen liikakasvua.

Under faasikontrastimikroskopiaan, konfluentteja primaariviljelmiä normaalien munuaisten soluista osoitti hyvin homogeeninen morfologia. HPTEC kulttuuri näyttely mukulakivi ulkonäkö (Fig. 3A), ominainen epiteelisolujen, kuten HK-2-solut (Fig. 3B). Muodostuminen tyypillisiä kupolit (hemicysts) oli näkyvissä, kun HPTEC Viljelmät erittäin konfluentteja, osoitus transepiteelinen liuenneen aineen kuljetuksen yksisolukerrokset.

(A) Ensisijainen HPTEC, (B) HK-2 solulinjan (C) ensisijainen kirkas solu RCC, ja (D) ensisijainen kromofobista leikettä RCC. Suurennos: 400x.

HRTC olivat tehokkaasti eristettiin selkeä solujen ja kromofobista leikettä RCC ja luonteenomaista litistetty polygonaalinen morfologia ja läsnäolo lipidirakkuloiden sytoplasmassa. Nämä kasvain alatyyppejä voitaisiin erottaa useissa ja koko rakkulat: kirkas solut esittelevät koko sytoplasmassa käytössä moniulotteisen rakkulat (Fig. 3C), kun taas kromofobista leikettä soluissa rakkulat ilmestyi pienempiä määriä ja ulottuvuus, ja sytoplasman ei ole ” tyhjä ”kuten selkeä solu RCC (Fig. 3d). Valomikroskooppinen ulkonäkö ensisijainen isolaattien (normaali ja kasvainten) ja seuraavat kolme kohtia ei ole ollut huomattavan erilainen. Sytokeratiinia ilmentyi kaikissa RCC primääriviljelmissä (Fig. 4), joista selviää niiden epiteelin alkuperä.

Hoechst 33258, anti-sytokeratiini-vasta värjäystä, ja sulautui kuvia kaksinkertaisella värjäys ensisijainen viljellyistä HPTEC, kirkas solu ja kromofobista leikettä RCC-soluja. HK-2 ja A-498-soluja käytettiin kontrollina ihmisen normaalia ja kasvaimen epiteelin munuaissoluissa, vastaavasti. Suurennus: 200x.

edelleen karakterisoimiseksi proksimaalisen tubulussolut primääriviljelmässä, spesifisten markkeriproteiinien arvioitiin immunosytokemiallisen värjäys hiiren monoklonaalinen vasta-aine ihmisen sytokeratiini ja RT-PCR-analyysiä varten uromodulin, akvaporiini 3, ja aminopeptidaasi A. Nämä solut ilmaistu sytokeratiini tasaisesti, joka oli samanlainen kuin HK-2-solut (Fig. 4), mikä vahvistaa sen epiteelin luonteen. RT-PCR-analyysi HPTEC primääriviljelmien 4 potilaalta, joilla oli suoritettu. Kaikki neljä isolaatit säilytetään molekyylitason ominaisuudet HPTEC, osoittaa korkea ilmentyminen aminopeptidaasi A ominainen proteiini proksimaalisten tubulussoluihin (Fig. 5). Lisäksi solut olivat hyvin viikko tai puuttui ilmentymistä distaalisen putkimainen ja kerää kanavan markkereita, uromodulin ja akvaporiini 3, vastaavasti.

Uromodulin (distaalinen tubule markkeri), akvaporiini 3 (kokoojakanavaan markkeri), ja aminopeptidaasi A (läheisen munuaistiehye markkeri) perusterveydenhuollossa viljellyissä HPTEC johdettu 4 luovuttajien ja HK-2-soluissa. RNA eristettiin seoksesta munuaisten soluja käytettiin positiivisena kontrollina ja veden negatiivisena kontrollina. Expression of glyceraldehydes-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin talon pitäminen geeni.

Keskustelu

Useat

in vitro

munuaisten valmisteita on käytetty fysiologisen ja toksikologisia tutkimuksia, mukaan lukien yksittäiset perfusoidaan munuainen, munuaisten viipaleita, nephron segmenttejä, solulinjat, ja primaariviljelmiä [28]. Näistä soluviljelmässä tarjoaa etuja saatavuuden useampia soluja ja mahdollisuus suorittaa useita ja kokeiden toisto pitkän ajan. Käyttö perustettu solulinjojen toksikologisessa tutkimukset voivat aiheuttaa monia rajoituksia verrattuna primääriviljelmien. Itse asiassa, arvo toksikologista tutkimukset suoritettiin olennaisesti transformoidut solut voivat olla kyseenalainen. On hyvin tunnettua, että kuolemattomia solulinjoja tehdään erilaistamattomuuden (eli menetys alkuperäisen solun spesifisyys) seurauksena pitkään passage

in vitro

[29], ja niillä on ominaisuuksia, jotka eivät ole läsnä niiden kudoksessa alkuperä johtuu niiden kuolemattomaksi. Siksi muuttunut soluvastetta myrkyille voidaan nähdä. Sen sijaan primaariviljelmiä säilyttää monet ilmiasun alkuperäisen kudoksen, kuten normaali fysiologisia toimintoja, ja siksi voi olla erittäin merkityksellinen malleja geenin löytö, tavoite validointi, huumetestit, ja kehitys biomarkkereita. Lisäksi hyödyntämällä useita luovuttajia varten näytteitä kudoksen tuottaa riippumattomia isolaatteja ensiöparit mahdollistaa tutkijoiden osoittaa epäyhdenmukaisten yksilöiden kesken.

Vaikka useat kirjoittajat ovat aiemmin raportoitu menetelmiä eristämistä ja ensisijaisesti kulttuurin HPTEC [6], [9], [11] ja HRTC [12], [14], laaja soveltaminen näiden inhimillisen kulttuurin valmisteita on haitannut vaatimaton tuotto ja heikentynyt solujen elinkykyä.

tässä tutkimuksessa kuvaamme optimoidun menetelmän perustamiseksi ihmisen ensisijaisen soluviljelmissä sekä normaalin ja kasvaimen kudokset, korjattu potilaan näytteen heti radikaali nephrectomy menettely. Huomattavaa on, että näytteenotosta heti resektion jälkeen kuin mahdollista on tärkeä tekijä saamiseksi solususpensiot suurella elinkelpoisuuden on selvä lasku määrän onnistuneesti viljelty materiaalin mitä kauemmin kudosta pysyy

ex vivo

[ ,,,0],24].

Koska proksimaalitiehyeet sijainti rajoittuu kokonaan munuaiskuori, perustettiin viljelmät käyttäen soluja eristettiin progressiivinen entsymaattisella irtaantuu uloimmasta kuorikerros normaalin ihmisen munuainen. Jauhamiseen näytteen pieniksi paloiksi mahdollistaa hyvän poistamisen punasolujen aikana alku- pesuvaiheet ja maksimoi entsymaattista ruoansulatusta. Sopiva valinta entsyymin, inkubaatioaika, lämpötila ja pitoisuus optimaalisen ruoansulatus on hankittava parasta kudosta dissosiaatio ilman liiallista tuhoa. Kollagenaasikäsittelyn tiedetään olevan vähemmän haitallista epiteelisolujen kuin on pilkkomalla muiden entsyymien (kuten trypsiiniä) ja olosuhteissa esitetyt meidän menettelyssä saadaan solususpensiot parempi tuotto ja elinkykyisyyksiä kuin vahvistettu edellisten eristysmenettelyin. Askelsuodatuksenohjauksella kollagenaasia sulattaa läpi sarjan seuloja pienentyessä silmäkoko poistaa putkimainen fragmentteja ja glomerulusten, ja jättää materiaali, joka tuottaa seuraus munuaisten epiteelisolujen proksimaalinen fenotyyppi johtuu todennäköisesti niiden korkeasta proliferaatiopotentiaali. Lisäksi, ensimmäisen väliaineen muutos, 24 h sen jälkeen, kun pinnoitus, minimoi kiinnitys muiden ei-epiteelisolujen.

menettelyä tulisi olla suhteellisen yksinkertainen ja nopea minimoimiseksi vaurioon eristämisen aikana ja aika, joka tarvitaan, ennen kuin solut voivat olla kokeissa käytettävien. Tämä saavutetaan meidän menetelmällä, koska se ei sisällä aikaa vievää toimenpiteet, kuten Percoll-tiheysgradienttisentrifugaatiolla [6], [9], tai monimutkaisten mikrodissektion [10], [11], tai immu- tekniikoita [30]. Toimenpide kestää lähes 1 tunti suorittamiseen, mikä mahdollistaa nopeamman perustamisen ensisijainen soluviljelmissä verrattuna edelliseen HPTEC tai HRTC kulttuurin protokollia.

perustaminen primääriviljelmien onnistuneesti saavutettu kaikista kirurgisista näytteistä. Kaikkiaan 12 eri munuaisten primääriviljelmissä saatiin. Näistä kulttuureissa, 6 oli normaalista cortex, 4 kirkkaasta munuaissyöpää ja 2 kromofobista leikettä RCC. Meidän menettelyssä, kasvain primaariviljelmiä kestää kauemmin päästä alakonfluenssista kuin ensimmäisen split kuin normaali aivokuori primääriviljelmien. Normaali aivokuori primääriviljelmissä esitti homogeeninen morfologia, kun taas primaarikasvaimen kulttuureissa oli enemmän heterogeeninen morfologia. Normaali munuaisten soluviljelmissä näytetään epiteelin morfologia, joka oli yhdenmukainen raportoitu ominaisuudet HPTEC [9], [24], [25]. Optinen mikroskooppinen analyysi ylös kolmanteen kulku osoitti, että tämä eriytetty morfologia ei muuttanut päälle alakulttuuria. Emme yritä tarkistaa eliniän ensisijainen normaali tai kasvain kulttuureissa, koska se on hyvin tiedossa, että vaihtelu fenotyypin tapahtuu korkeammissa kohdissa [26], [29], [30]. Kasvu kuvio ja morfologia HK-2 solut eivät poikkea ensisijainen viljellyistä HPTEC arvioituna valomikroskoopilla. Tärkeää on, fibroblasti saastuminen ei havaittu lyhytaikainen primääriviljelmiä, mutta saattaa olla ongelma, kun pidempi primääriviljelmässä tai edelleen alakulttuurit. Tämän ongelman, on suositeltu vaihdosta L-valiini D-valiini ja L-arginiinista L-ornitiini in HPTEC väliaineessa [6] tai käyttää hormoni-täydennetty seerumittomassa elatusaineessa [9].

läsnäolo markkereita perustettiin karakterisoimiseksi HPTEC primääriviljelmien. Erityisesti epiteelin luonteen HPTEC viljelmistä vahvistettiin immunosytokemialla, joilla on positiivinen värjäytymistä sytokeratiinia ja proksimaalisten tubulusten alkuperä RT-PCR: llä selkeä osoitus proksimaalisen tubuluksen sukasauman entsyymin aminopeptidaasi A. Lisäksi nämä solut osoittivat hyvin heikkoa tai ei lainkaan ilmaus distaalisen putkimainen ja kerää kanavan markkereita, uromodulin ja akvaporiini 3, vastaavasti. Nämä tulokset osoittavat, että tärkein HPTEC viljelmiä peräisin proksimaalisen tubulussolut, ilman merkittävää saastumista solut muista osista nephron. Siten meidän menetelmä mahdollistaa eristää ja kasvattaa hyvin eriytynyt primääriviljelmiä, jotka ilmaisevat erityisiä proksimaalisten tubulusten proteiineja.

sytologinen tasalaatuisuus meidän HPTEC primääriviljelmien arvioitiin immunosytokemiallisessa värjäystä sytokeratiinia ylös kolmanteen kulun ja kaikissa tapauksissa reaktiot olivat homogeenisia voimakkuudeltaan ja oli samanlaiset profiilit.

Cell luonnehdinta tehty tässä tutkimuksessa vahvistavat muut tutkimukset osoittavat, että HPTEC kulttuureissa säilyttävät eriytetty ominaisuudet PTC enintään kolme kanavaa [9], [31] . Tämä

in vitro

mallia voidaan käyttää tutkimuksiin, jotka liittyvät munuaisten vamma, mukaan lukien xenobiotic aiheuttaman toksisuuden HPTEC, siis tarvita ekstrapolointi eläinsoluviljelmiä ja edustavuutta munuaisten solujen

in vivo

kuin vakiintunut munuaissolulinjoissa.

Huomattavaa on, että nämä munuaisten solut läheisen munuaistiehye voidaan kasvattaa kalvon suodatin tukee, jolloin solut, jotka morfologisesti ja toiminnallisesti paremmin edustaa omia

in vivo

kollegansa. -Soluja viljeltiin näissä kalvo tukee käytetään tutkia proksimaaliseen liikennejärjestelmien, sekä vaikutus eri vierasaineiden sekä apikaali- ja basolateraaliseen puolin proksimaalisten tubulusten solujen [32].

menettelyä myös tehokkaasti sovellettu eristämiseen HRTC kahdesta morfologisesti ja geneettisesti erilaista alatyyppiä RCC, eli selkeä solu ja kromofobista leikettä RCC. Molemmat kehittää ihmisen munuaisen kuorikerroksen soluista. Kuitenkin selkeä solu RCC uskotaan olevan peräisin epiteelin proksimaalisten kierteisten tubulusten, kun taas kromofobista leikettä RCC näyttävät olevan peräisin aivokuoren segmentti keräyksen kanavan [33]. Primaarisella viljelmiä normaalien epiteelisolut proksimaalisen alkuperää aiheuttavat erittäin homogeeninen morfologia, merkittävien morfologisten heterogeenisuus selkeä solu RCC viljelmiä totesi. Tämä tulos on sopusoinnussa aikaisempien raporttien osoittavat vaihtelua niiden koko ja muoto [34]. Solut esitteli odotetun histologisia ominaisuuksia kuvataan aiemmissa tutkimuksissa [18], [19], [35].

menetelmä osoittautui teknisesti yksinkertaisempaa, nopeammin ja korkeampaa menestystä perustamaan kasvain ensisijainen kulttuureissa kirurgisista näytteistä kuin vahvistettu edellisten eristysmenettelyin [12], [14]. Ensisijainen kulttuureissa RCC syövistä ovat hyödyllisiä välineitä tutkia biokemiallisten ja molekyylitason muutokset liittyvät neoplastisen tilan. Lisäksi kehittämisen RCC kulttuurien ohella niiden vastaavassa normaalissa kollegansa, voi tuottaa realistisempi malli kehittämiseen ja testaamiseen uusien hoitomuotojen.

Yhteenvetona esitämme hyödyllinen ja yksinkertainen menetelmä onnistuneen perustaminen primääriviljelmien peräisin tuoreesta ihmisen normaali aivokuoren ja tuumorikudoksissa. Se yhdistää eri tekniikoita on jo kuvattu kirjallisuudessa, ja tulokset optimoitu eristys menetelmää, jolloin saatiin soluvalmisteilla erinomainen kannattavuus ja hyödyntämistä.