Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat sekaantuneet säätelyyn useiden solun signalointireittien kolorektaalisyövän (CRC) soluja. Vaikka kehittyvillä todisteet osoittavat, että microRNA (MIR) -106a ilmaistaan ​​kova primaarikasvaimen ja ulostenäytteet CRC potilaiden; onko miR-106a välittää syövän etäpesäkkeiden on tuntematon. Osoitamme tässä, että miR-106a ilmenee vahvasti metastaattinen CRC soluissa, ja säätelee syöpäsolun muuttoliikettä ja invaasiota positiivisesti

in vitro

ja

in vivo

. Nämä fenotyyppejä ei liity sekoittavien tekijöiden vaikutuksesta syöpäsolujen leviämistä. MiR-106a estää ilmentymistä

transformoiva kasvutekijä-β reseptori 2

(

TGFBR2

), mikä lisää CRC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tärkeää on, miR-106a ekspressiotasot ensisijainen CRC korreloivat kliinisten syövän etenemiseen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-106a estää antimetastaattisia tavoite suoraan ja tulokset CRC solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Citation: Feng B, Dong TT, Wang LL, Zhou HM, Zhao HC, Dong F, et al. (2012) peräsuolen syövän Migration and Invasion Aloitteesta microRNA-106a. PLoS ONE 7 (8): e43452. doi: 10,1371 /journal.pone.0043452

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 17 elokuu 2012

Copyright: © Feng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäkkeitä johtaa noin 90% paksusuolen syövän ( CRC) liittyviä kuolleisuutta, mutta taustalla olevien mekanismien edelleen suurelta osin epäselvä [1]. Etäpesäke on monimutkainen, useita prosesseja jolloin CRC solujen hyökätä ympäröivien kudosten, intravasate osaksi verisuonistoon, siirtävät kautta verenkiertoon, ekstravasoitumaan parenchyma kaukaisten kudosten (maksa ja keuhkot), perustaa mikroetäpesäkkeet, ja muodostavat makroskooppiset sekundaarikasvaimia [2]. Viime vuosina useita tutkimuksia on suoritettu tutkimaan geenejä ja niiden tuotteita, jotka ovat mukana etäpesäkkeiden [3] – [7].

MikroRNA (miRRNs) käsittävät evoluutiossa-konservoituneita luokan pieniä RNA: ita, jotka voivat hiljaisuus geeniekspression transkription jälkeen läpi sekvenssispesifistä vuorovaikutus 3’alueet (UTR) ja sukulais-mRNA tavoitteet [8]. Äskettäin rooli miRNA perustamiseen ja etenemisen CRC on tullut ilmi. Suurempi kuin 50% miRNA geenien sijaitsevat hauras kromosomaalisia alueita, jotka ovat muuttuneet aikana syövän etenemistä [9], ja jotkut miRNA on todettu onkogeenejä tai tuumorisuppressorigeeneille CRC [10] – [14]. Lisäksi ilmaisu profilointi analyysi on paljastanut ominaisuus miRNA allekirjoitusta, joka voi ennustaa kliinisiä tuloksia CRC [15], [16].

miR-106a (miRBase: MIMAT0000103) on osoitettu olevan erittäin ilmaistaan ​​syöpä kudokset ja ulostenäytteet CRC potilaista [16] – [18]; kuitenkin, tarkka asema miR-106 CRC ei tunneta. Siksi korreloi miR-106a kanssa CRC maahanmuutto- ja invaasio, toivoen, että tällaisen yhdistyksen voisi tarjota käsityksen mekanismeja, joiden CRC soluja etäispesäkkeitä.

Tulokset

miR-106a ilmenee vahvasti Metastasoitunut CRC solut

ensin määritetään tasot miR-106a ilmentymistä erilaisissa ihmisen CRC soluja. Suostumuksella aikaisempien raporttien [16] – [18], miR-106a oli säädelty kaikissa kuudessa ihmisen CRC solulinjoissa verrattuna spontaanisti kuolemattomaksi, normaali ihmisen paksusuolen epiteelisoluissa (NCM640; Fig. 1A). miR-106a on enemmän ilmentyy suuresti invasiivisia soluissa suhteessa soluihin, joilla on vähemmän invasiivisia kapasiteetti (Fig. 1A ja B). Esimerkiksi ekspressiotaso miR-106a oli 9-kertainen invasiivisempia SW480 solulinjaa kuin vähemmän invasiivisia HT29 solulinjassa.

, Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi miR-106a ilmentyminen kuolemattomaksi, normaalin ihmisen paksusuolen epiteelisolujen ja erilaisia ​​CRC-soluja. Pieni nukleaarinen U6-RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena, ja palkit osoittavat keskivirheet. B, Invasive kyky joukon CRC-solujen määritetään Matrigeliä invaasio määrityksissä. Edustava koe kolmena kappaleena näytetään yhdessä keskivirheet. C, Western blot-analyysi N-kadheriinin, E-kadheriinin, vimentiinin, ja ZEB1 ilmaisun CRC-soluissa. D, kvantitatiivinen analyysi kuvanvahvistinputkia.

n

= 3,

baareja,

± SD.

Lisäksi ilmaisu epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon (EMT) merkkiaineet (E-kadheriinin, N- kadheriinin, vimentiinin, ja ZEB1) määritettiin Western blot -analyysillä. EMT voidaan pitää patologinen prosessi, joka vaikuttaa syövän etenemiseen, varsinkin kun se liittyy invaasiota ja etäpesäkkeiden. Kuten on esitetty kuviossa. 1C ja D, ilmentymisen tasojen E- ja N-kadheriinin vaihteli seitsemästä solulinjat. E-kadheriinin ekspressoitiin NCM640 ja viisi CRC solulinjoissa, mutta ei SW480, ja voimakkaammin ilmaistu NCM640, HT29, SW620, ja LOVO. N-kadheriinin, vimentiinistä, ja ZEB1 ilmentyminen oli matalampi neljässä solulinjoissa.

Kaksi CRC solulinjat, RKO ja SW480, joka on suurin invaasio potentiaali, esillä jatkuvasti alhainen ilmentyminen E-kadheriinin ja korkea ilmentyminen N-kadheriinin, vimentiinistä, ja ZEB1.

miR-106a Aloittaa CRC Cell Migration and Invasion

in vitro

ensi sitoutui

in vitro

menettämisestä toiminto analysoi määrittää roolin miR-106a CRC solujen vaeltamiseen ja invaasiota. miR-106a hiljennettiin

in vitro

kautta anti-sense-oligonukleotidit, niin ekspressiotasot määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR [19]. Huomasimme, että transfektointi miR-106a anti-sense-oligonukleotidien SW480-soluissa johti 7,3-kertaisesti alhaisempi miR-106a ilmentymisen (Fig. 2A). Anti-sense estäjiä miR-106a johti 2,5-kertaisesti alentunut muuttoa SW480-solujen, määritettynä muuttoliike määritykset

in vitro

suhteessa kontrollioligonukleotidit (Fig. 2B). miR-106a-inhibiittorit aiheutti 2,7-kertainen vähentäminen invasiivisia kapasiteetin SW480-solujen mitattuna invaasio määritykset

in vitro

verrattuna kontrollioligonukleotidit (Fig. 2C). Tärkeää on, tämä vähennys ei johdu tuhoaminen solujen elinkelpoisuuden (Fig. 2D, P 0,05). Siten nämä havainnot osoittavat, että miR-106a on välttämätöntä maahanmuutto- ja hyökkäys nämä enemmän metastaattisen CRC soluja

in vitro

, mutta ei tarvita elinkelpoisuutta.

, tasot miR-106a ilmentyminen SW480-soluissa transfektion jälkeen estäjien miR-106a, määritettynä reaaliaikaisen RT-PCR-analyysillä. Data normalisoitiin kanssa U6 pieni ydin- RNA. Edustava koe kolmena kappaleena sekä keskivirheet on esitetty. B, TranswellTM muuttoliike määrityksissä SW480 transfektoitujen solujen estäjiä miR-106a tai kontrollivektoreihin. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena ja baareissa tarkoittavat keskivirheet. Esitetään myös vaiheittain kontrastin kuvia SW480 liikkuvien solujen kalvojen läpi. C, Matrigel invaasio määrityksissä SW480 transfektoitujen solujen oligonukleotidien vastaan ​​miR-106a tai kontrollioligonukleotidit. Edustava koe kolmena kappaleena sekä keskivirheet on esitetty. Phase-kontrasti kuvia SW480-solujen tunkeutuneet kalvojen läpi on myös esitetty. D, trypaanisiniekskluusiolla määritys SW480 solujen miRNA estäjiä. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena sekä keskivirheet. E, reaaliaikainen RT-PCR-analyysi miR-106a ilmentymistä HT29 tartunnan miR-106a-ilmentävät tai kontrollivektoreihin. U6 pieni ydin- RNA käytetään sisäisenä kontrollina. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena, ja palkit osoittavat keskivirheet. F, Migration potentiaali NCM640 infektoitujen solujen miR-106a-ilmentävät tai kontrollivektoreihin, määritettynä siirtokuoppaan muuttoliike määrityksiä. Edustava koe kolmena kappaleena sekä keskivirheet on esitetty. Phase-kontrasti kuvia HT29 vaeltaneet kalvojen läpi on myös esitetty. G, Invasive potentiaali HT29 jälkeen miR-106a transduktion tai kontrollivektorille transduktio mitattiin matrigeeliä invaasio määrityksiä. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena ja baareissa tarkoittavat keskivirheet. Esitetään myös vaiheittain kontrastin kuvia HT29 tunkeutuneet kalvojen läpi. H, kasvukäyrät HT29 tartunnan MIR-106a-ilmentävät tai kontrollivektorille

in vitro

. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena sekä keskivirheet.

onko vai ei yliekspressio miR-106a siirrettävä muuttavien ja invasiivisia mahdollisia ei-metastasoituneen tai vähemmän metastaattinen CRC soluja, kloonasimme genomisen sekvenssin ihmisen miR-106a-geeni hiiren kantasolun retrovirus-johdettu vektori [20]. Sitten käytimme tuloksena vektorit ilmaista miR-106a kuolemattomissa NCM640 ja HT29 vähemmän metastaattista potentiaalia. Onnistunut transductions Mir-106a todennettiin reaaliaikaisen RT-PCR (Kuva. 2E).

Näissä molemmissa kaksi riviä, ektooppinen ilmentyminen miR-106a aiheutti merkittävän kasvun solumigraatiota ja invaasiota ( Kuva. 2F ja 2G). Tällainen korotus ei voi johtua lisääntyneestä proliferatiivinen hinnat näiden solujen (Fig. 2 H, P 0,05 päivinä 0, 2, 4 ja 6). Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen miR-106 riittää käynnistää siirtoa ja invaasion CRC solujen

in vitro

.

miR-106a Edistää CRC Invasion

in vivo

seuraava määritetään, onko miR-106a aiheuttamaa invaasio

in vivo

. Tätä varten me yli-ilmentynyt miR-106a CRC solut, jotka ovat yleensä vähemmän invasiivisia. Ensin istutettiin HT29 transdusoitu miR-106a tai tartunnan kontrollivektoreihin nude-hiiriin ihon alle. Saajahiiret kasvoi merkittävä kasvaimia 2 viikon kuluttua injektion, ja tuli kuolemaisillaan viikolla 8 injektion takia kasvaintaakkaa kun koe lopetettiin.

Viikolla 4 istutuksen jälkeen kasvaimia miR-106a-yliekspressoivia HT29 solut ja kasvaimia valvonnan infektoidut solut olivat samanlaisia ​​kooltaan, mikä viittaa siihen, että miR-106a oli minimaalinen vaikutus primaarisen kasvaimen kasvua (Fig. 3A). Kuten odotettua, kasvainten valvonnan soluja ei-invasiivisia, esitetään kasvainmassat rajoittuvat kuitu- kapselia (Fig. 3B, vasen paneeli). Sen sijaan kasvaimet miR-106a-yli-ilmentävät solut oli saaria epiteelisyöpäsolujen tunkeutuvat viereisiin strooman kudoksiin (Fig. 3B, vasen paneeli). Siten ektooppinen ilmentyminen miR-106a siirrettävä invasiivisen kapasiteettinsa syöpäsolut, jotka ovat muutoin ei-invasiivisia.

, kasvukäyrät kasvainten muodostaman HT29 infektoitu miR-106a-ilmentävät tai kontrollivektoreihin. Jokainen data piste on keskiarvo ± keskivirhe 3-4 hiirillä. B, hematoksyliini ja eosiini-värjättyä osat CRC muodostaman HT29 infektoitu miR-106a-ilmentävät tai kontrollivektoreihin 8 viikkoa istutuksen jälkeen.

TGFBR2

on välittömänä kohteena miR-106a

ymmärtää mekanismia, jolla miR-106a aiheuttaa syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota, käytimme kaksi algoritmeja (PicTar ja TargetScan) kohteiden tunnistamiseen ihmisen miR-106a [21], [22]. Niistä 990 tavoitteet ennusti TargetScan,

LAMA3

(Gene ID: 3909) ja

TGFBR2

geenejä (Gene ID: 7048) on aikaisemmin liitetty säätelyyn solumigraatiota ja /tai invaasio [23] – [27].

TGFBR2

on erityisen kiinnostava, koska ilmentymisen

TGFBR2

on osoitettu menetetään asteittain aikana maligni kehittyminen erilaisten syöpätyyppien [23], [25], [27], [28 ]. Lisäksi, TGFBR2-mRNA: ta koodaavat on 3’UTR elementti, joka on komplementaarinen miR-106a (Fig. 4A).

, Ennustettu muodostuminen duplex välillä ihmisen

TGFBR2

3’UTR ja miR-106a. B, reaaliaikainen RT-PCR-analyysit

TGFBR2

vuonna HT29 tartunnan miR-106a-ilmentävät tai valvontaa vektori.

GAPDH

mRNA käytetään sisäisenä kontrollina. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena sekä keskivirheet. C, Lusiferaasiaktiivisuus villityypin

TGFBR2

3’UTR reportterigeenin HT29 infektoitu miR-106a-ilmentävät tai kontrollivektoreihin. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena sekä keskivirheet. D, Lusiferaasiaktiivisuutta mutantti-tyyppinen

TGFBR2

3’UTR reportterigeenin HT29 tartunnan miR-106a-ilmentävät tai kontrollivektoreihin. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena. Bars tarkoittavat keskivirheet.

Todellakin, yliekspressio miR-106a johti hajoaminen

TGFBR2

mRNA, mitattuna reaaliaikaisen RT-PCR: llä (Fig. 4B). Me seuraavaksi määritetään, onko vai ei

TGFBR2

on välittömänä kohteena miR-106a-inhibitiota määrittämällä aktiivisuus lusiferaasireportterigeeniin sulautettu 3’UTR villityypin

TGFBR2

geenin. miR-106a vähensi aktiivisuutta lusiferaasireportterigeenin merkittävästi (P ​​ 0,05, Fig. 4C). Inhibitio

TGFBR2

välittämä miR-106a riippuu läsnä miR-106a homologisia sitoutumiskohdat 3’UTR

TGFBR2

geenin. Koska lusiferaasireportteri kantaa mutantin

TGFBR2

3’UTR, korvaaminen 4 nukleotidin sisällä miR-106a sitoutumiskohdat eivät inhiboi miR-106a kohdunulkoisen ilmentymisen (Fig. 4D, P 0,05). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että

TGFBR2

voi toimia välittömänä kohteena miR-106a-välitteisen hiljentäminen.

TGFBR2

on toiminnallinen Tavoite miR-106a

seuraava määritetään, onko alennettu ilmentyminen

TGFBR2

geeni on tarpeen induktion solumigraatiota ja invaasion jälkeen havaittu miR-106a yli-ilmentymisen. Me yliekspressoitu miR-106a ja konstruktiin ilmaisemalla

TGFBR2

konstitutiivisesti. Tämä konstrukti koodaa koko koodaavan sekvenssin

TGFBR2,

taas puuttuu 3’UTR elementti, jolloin saadaan eräänlainen mRNA vastustuskykyisiä miR-106a estoa. Merkillistä, saatu konstitutiivisesti ilmennetyn

TGFBR2

kumosi aikaisemmin koholla muuttoliikettä ja invaasiota alulle miR-106a (Fig. 5A), mutta ei ollut vaikutusta solujen elinkykyä (Fig. 5B, P 0,05), mikä viittaa siihen, että

TGFBR2

on todellakin toiminnallinen tavoite miR-106a.

, matrigeelin invaasio määritykset miR-106a-transduktoituja tai kontrolli-tartunnan HT29 transfektoitu tilapäisesti

TGFBR2

. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena sekä keskivirheet. B, trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä miR-106a-ilmentävien HT29 transdusoitu

TGFBR2

tai valvontaa vektori. Näkyy on edustava koe kolmena kappaleena sekä keskivirheet. C, immunoblottaus

TGFBR2

vuonna HT29 transfektoitu tilapäisesti

TGFBR2

siRNA. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena sekä keskivirheet. D, vertailu lisääntynyt liikkuvuus ja invaasion mahdollisia välillä HT29 transdusoitu miR-106a ja HT29 transfektoitu tilapäisesti

β

siRNA. Edustava koe on esitetty kolmena kappaleena. Bars tarkoittavat keskivirheet.

Lisäksi halusimme selvittää, onko vai ei hajoamista

TGFBR2

riittää miR-106a-välitteistä kasvun maahanmuutto- ja hyökkäystä. Transfektio

TGFBR2

pieni häiritsevä RNA (siRNA), mikä johti 90%: n vähennys tasot

TGFBR2

proteiinin (Fig. 5c), johti merkittävä, mutta ei täydellinen induktio solumigraation ja invaasio verrattuna induktion aiheuttama miR-106a yli-ilmentymisen (Fig. 5D). Yhdessä

TGFBR2

näyttää olevan välttämätön, mutta ei riittävä tavoitteeksi miR-106a.

miR-106a ilmentyminen lisääntyy metastaattisessa Ensisijainen CRC

On tärkeää, äskettäin microarray-analyysi osoitti, että miR-106a on yksi niistä miRNA, jotka ovat erittäin ilmaistaan ​​ensisijainen CRC verrattuna normaaliin peräsuolen epiteelikudoksen [16], [18]. Me määritetään, onko miR-106a ilmentymisen etäpesäkkeiden-positiivisia kasvaimia on suurempi kuin etäpesäke-vapaa kasvaimia, ja onko miR-1061 ilmentyminen liittyy kliinisiä tuloksia CRC potilailla. Rekrytoimme 28 CRC potilasta, jotka olivat pitkäaikaisia ​​etäpesäke eloonjääneitä jälkeen täydellisen resektioleikkaukselle primaarikasvaimen, ja verrattiin potilaiden kontrolliin kohortin potilaista metastasiaa heti diagnoosin tai etäpesäkkeiden seurannassa ( 60 kuukautta ) (Taulukko S1). Lisäksi etäpesäkkeitä elinaika hinnat potilaiden ilman etäpesäkkeitä diagnoosin stratifioitiin perustuvat miR-106a ilmentymistilanne. Todellakin, metastaasi-positiivisilla potilailla oli merkittävästi korkeammat tasot miR-106a niiden ensisijainen kasvainten suhteen potilailla, joilla ei ole metastaaseja (Fig. 6A, P 0,05). Erityisesti kaikkien näistä potilaista, joilla oli alhaisempi miR-106a oli parempi kliinisiä tuloksia (Fig. 6B,

p

0,05). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-106a on tärkeä rooli CRC etäpesäkkeitä.

, tasot miR-106a ilmentymistä primaarisessa CRC metastaasien kanssa tai ilman. Oli merkittävä ero miR-106a ilmentymistä nämä kaksi ryhmää. B, Kaplan-Meier etäpesäke elinaika oli 28 CRC potilaille ilman etäpesäkkeitä diagnoosin, kerrostunut perustuu tasoilla miR-106a ilmentymisen niiden ensisijainen kasvaimia. Aχ

2 testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin ja P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Keskustelu

Tämä työ tunnistettu miR-106a pro-etäpesäke miRNA johtava edistämiseen maahanmuutto- ja invaasion CRC soluja. Vähentäminen tämän miRNA CRC solut, jotka ovat muuten metastaattinen vähensi muuttavien ja invasiivisia potentiaalia CRC soluja. Sen sijaan säätely ylöspäin miR-106a CRC solujen vähentää muuttoliikettä ja invaasiota potentiaali nousi solumigraatiota ja hyökkäystä. Osoitimme, että miR-106a ei merkittävästi vaikuta proliferatiivinen hinnat CRC solujen

in vitro

ja

in vivo

. Tällaiset todisteet viittaavat siihen, että miR-106a saattaa vain olla rooli CRC soluinvaasiota.

Mielenkiintoista, vaikka samasta potilaasta, SW480 ja SW620-soluissa oli eri hyökkäys potentiaali ja miR-106a ilmentymisen (Fig. 1A ja B ). On mahdollista, että tämä havainto oli, koska SW480-solut ovat peräisin ensisijainen syöpään meneillään EMT ja SW620-solut ovat peräisin toissijainen syöpään. Lasku ilmentyminen ZEB1 vuonna SW620-soluissa verrattuna SW480-solut voivat johtaa palauttaminen E-kadheriinin tasoilla ja aiheuttaa käänteinen prosessi EMT tai mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) [29], jossa miR-106a voi olla roolia ylävirtaan tai alavirtaan kertoimella ZEB1.

Tulosten raportoi ensimmäistä kertaa, että tavoitteeksi geeni miR-106a,

TGFBR2

voidaan säätelee negatiivisesti miR-106a on transkription tason kautta sitominen 3’UTR

TGFBR2

mRNA CRC.

TGFBR2

on suuri TGF-β signalointimolekyylin usein todettu olevan yksi geeneistä muuttunut syöpä. TGF-β-signalointireitin lähettää monimutkainen rooli, joka on edelleen kiistanalainen, pahanlaatuisissa etenemistä kasvaimia. On osoitettu, että TGF-β voi aiheuttaa EMT ja edistää kasvainsolun invaasiota [30], kun taas toinen tutkimus on osoittanut, että alennettu

TGFBR2

ilmentyminen liittyy aggressiivinen ominaisuuksia Maksasolusyövän [25]. CRC, TGF-β voi aiheuttaa kasvun inhibition syöpäsolujen, ja

TGFBR2

oli tuumorisuppressoriproteiinia, joita tarvitaan TGF-β signalointi [31]. Tämä tutkimus osoitti, että alas-säätely

TGFBR2

kasvaa solumigraatiota ja hyökkäys HT29 (Fig. 2G ja 5D). Näin ollen, TGF-β signalointi voi olla tärkeä lähestymistapa, jonka miRNA säädellä kasvainten kehittymisen. Tuoreessa tutkimuksessa raportoitiin, että miR-17~92, aktivoitu c-Myc, vaimentaa TGF-signalointireitin, jolloin stimuloiva angiogeneesin ja kasvaimen solujen kasvua [32]. Vaikka

TGFBR2

näyttää olevan välttämätön, mutta ei riittävä tavoitteeksi miR-106a nykyisessä tutkimuksessa, suhde miR-106a ja TGF-β signalointi ansaitsee lisätutkimuksia.

ennusteeseen viittaavia analyysi lisäksi osoittanut yhteyden miR-106a ja etäpesäkkeiden. Pitkäaikainen eloonjääneiden ilman etäpesäkkeitä oli merkittävästi alhaisempi miR-106a heidän ensisijainen kasvaimia verrattuna potilaisiin, joilla tauti uusiutuu, alentavat miR-106a viittaa korkeamman etäpesäke vapaa eloonjäämisaste (Fig. 6). Tämä havainto tukee voimakkaasti käsitystä, että yli-ilmentyminen miR-106a on läheisesti mukana etäpesäke CRC.

Yhteenvetona osoitimme, että ilmaus miR-106a korreloi positiivisesti migraation ja invaasion potentiaalia CRC soluja, ja alas-säätely

TGFBR2

, yhtenä kohdegeenien Mir-106a, voisi lisätä solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Vielä tärkeämpää on, tasot miR-106a ilmentyminen ensisijainen CRC korreloivat kliinisten syövän etenemisen, mikä viittaa siihen, että miR-106a voi edustaa uusia kohde terapeuttiselle interventiolle estää CRC etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

immortalisoidut ihmisen paksusuolen epiteelisolujen linja, NCM640, oli lahja JQ Zhang ja viljeltiin DMEM täydennetty 10% FBS HT29, SW480, LOVO, SW1116, ja SW480 solulinjat hankittiin ATCC (Manassas, VA, USA) ja viljellään olosuhteissa noudattaen valmistajan ohjeita.

RNA: n eristäminen ja miRNA Analyysit

Yhteensä RNA viljellyistä soluista uutettiin Mirvana Isolation Kit (AM1560, Ambion, Austin, TX, USA). miRNA määritykset suoritettiin Mirvana qRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) yhdessä qRT-PCT alukesarjoista (4395280, Ambion) mukaisesti ohjekirjoja valmistaa. Pieni nukleaarinen U6-RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina.

Oligonukleotidi transfektio

miRIDIAN microRNA estäjä, miRIDIAN mimiikkapanelit HSA-miR-106a ja siRNA on

TGFBR2

hankittiin Dharmacon (IH-300526-08, C-300526-07, ja D-003930, Dharmacon, Lafayette, CO, USA). Solut transfektoitiin 200 nM ilmoitettu oligonukleotidien avulla Oligofectamine reagenssia (12252011, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Soluja käytettiin seuraavissa kokeissa 48 h transfektion jälkeen.

Gene kloonaus ja Ectopic Expression

Ihmisen miRNA-geeni PCR-monistettiin normaalin genomisen DNA: n ja kloonattiin MDH1-PGK-GFP 2,0 retrovirus-johdettu vektori.

TGFBR2

cDNA, josta puuttui 3′-UTR monistettiin PCR: llä normaalista genomisesta DNA: sta ja ilmennetty pWZL-blastisidiinia vektori. Viral sukupolven ja infektio kohdesoluja on kuvattu aikaisemmin [33]. Infektoidut solut valitaan 2 ug /ml puromysiiniä (P9620, Sigma, St. Louis, MO, USA), 200 ug /ml hygromysiiniä (H9773, Sigma), ja 10 ug /ml blastisidiini (sc-205604, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA).

In vitro Migration and Invasion Analyysit

migraatio ja hyökkäys potentiaalia CRC solujen arvioitiin, kuten aiemmin on kuvattu pienin muutoksin [34].

CRC-soluja (2,5 x 10

5) maljattiin päällystämättömän ylähuoneissa (24-kuoppaiset inserttejä, huokoskoko, 8 um; BD Bioscience, Bedford, MA, USA) siirtokuoppaan muuttoliikkeen määrityksiä. CRC-soluja (2,5 x 10

5) asetettiin Matrigelillä päällystetyn ylähuoneissa (24-kuoppaiset inserttejä, huokoskoko, 8 um; BD Bioscience) varten hyökkäystä määrityksissä.

väliaineen päällyskomponentti oli imettyjä ja korvataan seerumittomassa alustassa 2 h ymppäyksen jälkeen, ja alustaa, joka sisälsi 20% seerumia käytettiin chemotractant alakammioissa. Solujen annettiin kulkeutua 24 h, ja sitten solut molemmin puolin kammion kiinnitettiin 50/50% asetoni /metanolia. Solut kammion pohjaan värjättiin kristallivioletilla (C3886, Sigma). Sitten kuva kunkin kuopan vietiin kuva tumien solujen kanssa × 10 tavoite, ja solutumien kunkin kentän laskettiin käyttäen Image-J ohjelmisto (NIH; https://rsb.info.nih.gov /ij /).

eläinkokeet

Kuusi kahdeksaan viikkoa vanhoja karvattomia hiiriä käytettiin tutkimuksessa, ja kaikki kokeelliset menettelyt hyväksynyt Animal Care komitean Shanghai Jiaotong yliopisto . 10

6 HT29 200 ul: aan DMEM injisoitiin kylkien hiirten ihon alle. Halkaisijat kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa tarkasti jarrusatulat. Kolme-to-neljä hiirtä per ryhmä lopetettiin kussakin 4 aikapisteessä (viikkoa 2, 4, 6, ja 8 elinsiirron). Tuumorit poistettiin ja punnittiin. Kudosnäytteet kiinnitettiin 10% puskuroidussa formaliinissa 12 tuntia ja sitten pestiin PBS: llä, ja ne toimitetaan 70% etanolia, minkä jälkeen sen upotettiin parafiiniin, leikattiin leikkeiksi, ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H9627 ja E4009, Sigma).

SYBR Green Reaaliaikainen RT-PCR

kokonais-RNA solujen uutettiin ja käänteistranskriptoidaan, kuten aiemmin on kuvattu [35]. Ylävirran ja alavirran alukkeet

TGFBR2

geeni saatiin Primerbank (https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/): 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 ’ja 5′-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 ”. SYBR green reaaliaikainen RT-PCR ja vastaavat data-analyysi on kuvattu aikaisemmin [35]. β-aktiini-mRNA: n, käytettiin sisäisenä kontrollina (alukkeet: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ’ja 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’).

immunoblottauksella

Solut kerättiin RIPA lyysipuskuria . Proteiinit solulysaatit ratkaistu PAGE-geelissä, siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), sitten estettiin 5% rasvatonta maitoa PBS /Tween-20, jonka jälkeen inkuboitiin vasta-aineella againstN-kadheriinin (sc-271386, Santa Cruz), E-kadheriinin (sc-21791, Santa Cruz), vimentiinistä (sc-373717, Santa Cruz), ZEB1 (sc-25388, Santa Cruz) tai TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz) . Määrä kohdeproteiinin kalibroitiin käyttäen β-aktiini (sc-130656, Santa Cruz), ja suhteelliset intensiteetit saatiin.

Muodosta

TGFBR2

3’UTR sekvenssit kloonattiin pMIR-SELVITYS lusiferaarikonstrukti (AM5795, Ambion) [36]. Mutant

TGFBR2

3’UTR tuotettiin kanssa QuickChange kohdennettu mutageneesi Kit (200519, Stratagene, Palo Alto, CA, USA).

Luciferase Reporter Assay

Cells 50% konfluenssiin 24-kuoppalevyillä transfektoitiin Fugene6 (E2691, Promega, Madison, WI, USA). Lusiferaasireportterigeenillä-konstrukti (200 ng) ja PRL-SV40 Renilla lusiferaasi-konstrukti (1 ng [käytetään normalisointia]) kotransfektoitiin kuhunkin kuoppaan. Solu-uutteet valmistettiin 24-48 h transfektion jälkeen, ja mitattiin Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1910, Promega).

Kliininen peräsuolen kasvaimet

Ensisijainen peräsuolen kasvaimia ja vastaavassa normaalissa peräsuolen kudokseen oli kerättiin vuosina 2004 ja 2006, ja käsitellään protokollan mukaisesti hyväksymän eettisen komitean Ruijin sairaalan Shanghain Jiaotong yliopiston School of Medicine. TNM vaiheessa kasvain määritettiin luokituksen mukaan ehdottaman AJCC Cancer Staging Manual [37]. Seuranta tietoja tiivistetysti lopussa 2011, Seuranta-ajan mediaani oli 60 kuukautta. Tuore kudos kerättiin potilailta, snap-jäädytetty, ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Osittainen osia samasta kudokset värjättiin sitten hematoksyliinillä-eiosin validoimiseksi läsnäolo kasvain ja kudosten, jotka sisältävät 90%: kasvainsoluja käytettiin qRT-PCR kasvaimia. Kokonais-RNA eristettiin jäädytetyistä kudoksesta käyttäen TRIzol uuttamalla (15596, Ambion) ja Mirvana miRNA Isolation Kit (AM1560, Ambion). miRNA määritykset suoritettiin Mirvana qRT-PCR miRNA Detection Kit (AM1558, Ambion) yhdessä qRT-PCT alukesarjoista (4395280, Ambion) mukaisesti valmistajan käyttöohjeista. Pieni nukleaarinen U6-RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Ensisijainen kasvaimia stratifioitiin kuin miR-106a alhaisemmat tai korkeammat erottamaan onko miR-106a tasot korreloivat etäpesäkkeitä. Kasvaimet katsottiin miR-106a alempi tai korkeampi, jos normalisoitu ilmaus miR-106a asui ylä- tai 50% kasvaimia ryhmässä, vastaavasti.

Solun kasvun ja kannattavuuden Pitoisuus

määrittämiseksi kasvu, 2,5 x 10

4 solut maljattiin kuhunkin kuoppaan 12-kuoppalevyllä. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, solut kerättiin ja laskettiin hemosytometrillä välein 2 päivä päivään 6. solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen, solut trypsinoitiin ja laimennettiin 0,4% trypaanisinisellä (302643, Sigma) värjäys liuosta ja laskettiin hematosytometrillä.

tilastollinen analyysi

tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirheet. Student t-testiä (kaksisuuntainen) käytettiin vertaamaan kahta ryhmää (P 0,05 katsottiin merkitseväksi) ellei toisin mainita (χ

2 -testi).

tukeminen Information

Taulukko S1 .

korrelaatio miR-106a ilmaisutapoja etäpesäkkeitä peräsuolen syöpäpotilailla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043452.s001

(DOC) B