Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkeatasoinen gliooma (World Health Organization luokka III anaplastinen astrosytooma ja luokka IV glioblastoma multiforme), yleisin ensisijainen pahanlaatuisen aivojen kasvaimet, näyttää solun hierarkia, jossa itseuudistuvien, tuumorigeenisiä syövän kantasolut (CSCS) kärkeen. Vaikka CSC hypoteesi on ollut houkutteleva malli kuvaamaan monia näkökohtia kasvain käyttäytymisen, se on edelleen kiistanalainen johtuen ratkaisemattomia kysymyksiä myös käyttämällä

ex vivo

analyysit ero kasvuolosuhteet. CSC väestö on vahvistettu pahanlaatuinen gliooma suosituimmuusjärjestelmistä kasvainmuodostusta soluista suoraan eristettiin potilaan kudosnäytteistä. Kuitenkin suora vertailu useiden kasvainsolupopulaatioissa kanssa analyysin tuloksena fenotyyppien kunkin populaation sisällä edustaja kasvain ympäristö ei ole selkeästi kuvattu. Suoraan testata suhteellinen Tuumorigeenisuustutkimuksissa CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsoluja samassa mikroympäristössä, me kuulusteltiin täsmäsi kasvaimia puhdistettiin primaarisen ihmisen tuumorin istutetaan ksenografti hiirimallissa ja seurataan kilpailukykyinen

in vivo

kasvaimen kasvun -tutkimukset serial

in vivo

Elintensisäistä mikroskoopilla. Vaikka CSCS olivat pieni vähemmistö alkuperäisen siirrettyjen syöpäsolun väestön CSCS, ei ei-varsi kasvainsoluja, ajoi kasvaimen muodostumisen ja tuotti kasvaimia näyttämään solun hierarkia. Tuloksena kasvainten, joka on osa alkuperäisen siirrettyjen CSCS ylläpidetään ilmentymisen kantasolujen ja proliferaatiota markkereita, jotka olivat merkittävästi korkeampia kuin ei-kantasolujen tuumorisolupopulaatioon ja osoitti, että CSCS syntyy solun heterogeenisyyttä tuumorin sisällä. Nämä head-to-head vertailuja täsmäsi CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsoluja antaa ensimmäisen toiminnallisen näyttöä käyttämällä eläviä kuvantamisen, että samalla mikroympäristössä, CSCS enemmän kuin ei-kantasolujen kasvainsolut ovat vastuussa kasvaimen leviämistä, mikä vahvistaa funktionaalinen määritelmä CSC.

Citation: lathia JD, Gallagher J, Myers JT, Li M, Vasanji A, McLendon RE, et al. (2011) Direct

In Vivo

Todisteita Kasvain eteneekö Glioblastoma Cancer Kantasolut. PLoS ONE 6 (9): e24807. doi: 10,1371 /journal.pone.0024807

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 22 elokuu 2011; Julkaistu: 22 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 lathia, et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Work in Rich lab tukee Damon Runyon Cancer Research Foundation, National aivosyövän Society, Goldhirsh Foundation, James S. McDonnell Foundation, ja NIH apurahat CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), CA151522 (ABH), 5P50-NS-20023-26 (REM) ja National Research Service Award CA142159 (JDL). REM tukee Pediatric aivosyövän Foundation. JNR on Damon Runyon-Lilly Clinical tutkija tukee Damon Runyon Cancer Research Foundation. ABH tukee National aivosyövän Society. AYH tukee St. Baldrick säätiö, Dana säätiö, Cancer Research Institute, ja Gabrielle Angel Foundation. JDL tukee amerikkalainen aivosyövän Association Fellowship (sponsoroi Joelle SYVERSON Fund). AYH ja JDL tunnustaa pilotti apurahavaroja päässä Case Kattava Cancer Center (RES50-5509). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen kasvaimet yleisesti näyttää heterogeenisyys niiden neoplastisia osastoihin, jotka voivat olla peräisin yhdistelmästä stokastisen geneettisiä kopioluvun muutoksia ja epigeneettisestä hierarkia, joka oli mukana ajan mittaan [1]. Integrointi käsite, joka kasvaimet voivat sisältää kantasolun kaltainen populaatio vastaa niiden ylläpito ja lisäys voi olla informatiivinen sekä syövän ja kantasolujen kentät [2]. CSC: n hypoteesi voi tarjota oivalluksia terapeuttisia vastus ja kasvaimen uusiutumisen sekä korostavat monimutkaisuus syöpä. Jännitys ympäröivä CSC hypoteesi laimentaa kiista suhteessa sopivan koemalli järjestelmien toiminnallisesti määritellä CSCS CSC taajuus, ja yleisesti informatiivinen immunofenotyypeissä [3]. Normaali ja neoplastiset kantasolut nykyään määritellään toiminnalliset analyysit itseuudistumisen ja erilaistumista, ovat tarkimmat määritys tasalla CSCS että kasvaimen leviämistä. Ksenotransplantaatio mallit ovat vahvistaneet parantaa kasvaimen muodostumisen kapasiteetti CSC-fraktiolla erilaisissa ihmisen kasvaimissa, ja on käytetty arvioimaan taajuutta kasvaimen lisäys soluihin [4], joka on melko korkea joissakin maligniteettien [3]. Koska markkinarako, jossa sekä normaalissa ja neoplastisia kantasolut sijaitsevat käskee itseuudistumiseen ja huolto, elävän eläimen in vivo kuvantamisen tekniikoita on sovellettu joitakin kantasolukkoa – etenkin hematopoieettisen ja leukemiasolujen kantasolujen – määrittää kasvutavat natiivissa mikroympäristössä [ ,,,0],5], [6], [7], mutta hakemus kiinteä kudoksiin on ollut rajallista. Solid kasvain CSCS on tunnettu siitä, ex vivo tai erillisillä populaatiot, jotka ovat olleet informatiivisia määritettäessä differentiaalisesti säännelty väyliä mutta ovat estäneet suora analyysi kasvaimen etenemisen mahdollisia eri kasvainsolun jakeet. Arvioidaan mahdollisuuksia CSCS suorassa vertailussa ei-kantasolujen kasvainsoluihin edustaja mikroympäristön, me differentiaalisesti leimattu GBM solufraktioita johdettu ihmisen kasvain ja seurataan kasvaimen käyttäytymisen ksenotransplantaatiomenettelyssä mallin ajan käyttäen Elintensisäistä mikroskoopilla. Huolimatta pieniä määriä CSCS at elinsiirrot, kasvaimen leviäminen johtui CSCS ja heidän jälkeläisilleen osoittaa kykyä CSCS, mutta ei ei-varsi kasvainsoluja, ajaa kasvaimen muodostumisen ja levittää solujen epäyhtenäisyys.

Materiaalit ja menetelmät

Siirtäminen glioomasoluihin

Ihmisen glioomasoluihin saatiin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja hyväksytyin IRB protokollia Cleveland Clinic (Protocol 2559) ja Duke University (Protocol 7409). Gliooma soluja ohimenevästi siirrostettiin kuten nude-hiirissä hyväksyttyjen Cleveland Clinic IACUC protokolla ARC 8699 ja in vivo kuvantaminen tehtiin alle Case Western Reserve University Protocol 2009-0109). Alustavaa CSC kasvainten muodostumista tutkimuksissa tuumorinäytesylinterin käytetty (T4302) oli äskettäin diagnosoitu luokan III anaplastinen astrosytooma 40 vuotta vanha mies, joka poistettiin kirurgisesti Duken yliopistossa. Hetkellä poistamisen, näytteen leimasi olevan EGFR polysomy (EGFRvIII negatiivinen), MGMT negatiivinen, ehjä PTEN, ja polysomy kromosomien 7 ja 10. solun sekoitus tutkimuksia (kilpailu määritys), tuumorinäytesylinterin käytetty (T4121) oli toistuva glioblastoma multiforme (GBM) diagnosoitiin 26 vuotta vanha mies, joka poistettiin kirurgisesti Duken yliopistossa. Hetkellä poistamisen, näytteen leimasi olevan täydennetty EGFR (mutta EGFRvIII negatiivinen), MGMT positiivinen, PTEN menetykset, kromosomi 9p21, ja polysomy kromosomien 1p36, 1p32, ja 19q13. Kokeisiin tutkimukset, kasvaimen solut poistettiin ksenograftit ja CSCS rikastettiin perustuu CD133 ilmentymistä virtaussytometrialla (käyttäen CD133 /2-APC-vasta-aine, Miltenyi) ja sitten toiminnallisesti määritettiin itseuudistumiseen, multi-linjan erilaistumisen, kantasolu- markkeri ilmaisun ja kasvaimen leviämistä, kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Otaksuttu CSCS alkaen GBM yksilö T4302 oli transdusoitiin lentiviruksesta ilmaista vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP). Kasvaimen näytteen T4121, oletetun CSCS leimattiin keltainen fluoresoiva proteiini (YFP), tai ei-kantasolujen kasvaimen solut leimattiin syaani fluoresoiva proteiini (CFP, tuumorinäytesylinterin T4121), jonka lentiviruksen (Sigma). Leimatun CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsoluja (johdettu T4121) sekoitettiin 10%: 90% [tai 1:09] (CSC: ei-varsi kasvainsolun) suhteen ja istutetaan kuorikerros nude mouse syvyydessä on 1,5-2 mm. Kallon ikkunat oli asennettu kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Kuvantamistutkimukset hyödynnetään 25000 siirretyt solut. Kaikki kirurgisia toimenpiteitä tehtiin osana hyväksyttyä Cleveland Clinic IACUC protokollaa.

Multiphoton kuvantamisen

Elintensisäinen mikroskopia tehtiin käyttämällä multiphoton kuvantamisen kuten aikaisemmin on kuvattu [10] käyttämällä Leica SP5 kuvantamisjärjestelmä kanssa 16W Femto Second laser viritetty 840-860 nm ja keskittyi läpi 20X vesiupotukseen linssi (numeerinen aukko 1,0). Ennen kuvantaminen, hiiret nukutettiin ja injektoitiin suonensisäisesti korkean molekyylipainon fluoresoivat dekstraania ( 150 kD) korosta verisuonistoon. Kuvat otettiin yli 200 um 2 um z-pinot. Enimmäisintensiteetti ennusteet, jotka edustavat 200 mikrometriä perusteellisesti, oli tasaisesti oikaistu Photoshop (Adobe) ennen näyttöön. Kolmiulotteiseen rekonstruktiot, tietojen tuotiin Imaris ohjelmisto (BitPlane) pinta-mallinnus ja tilavuus määrällisesti kullekin solupopulaation.

Immunovärjäys ja tilastollinen analyysi

Jäädytetyt leikkeet leikattiin käyttäen kryostaatti (Leica) ja immunovärjäyksellä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [11], jossa on vasta-aineita Tra1-85 (R 400.000 solua. Immunofenotyypitys siirretyn solupopulaatioiden varmistettiin virtaussytometrillä käyttämällä CD133 lauseke (CD133 /2-APC-vasta-aine, Miltenyi) kunkin solupopulaation, kuten aikaisemmin on kuvattu [8]. Immunovärjäys kullakin solupopulaation in vitro tehtiin käyttämällä vasta-aineita on kuvattu edellä ja määrällisesti perustuu vähintään 150 soluja 10 kenttää. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA.

Automatisoitu kuvien analysointi

Suuret-of-view (FOV) kuvaa kasvaimen poikkileikkausten hankittiin käyttäen Leica DM4000, 40X tavoite , Q-Imaging CCD-kenno, Prior 8-dia moottoroitu vaiheessa Image-Pro 6.2, ja YFP, CFP, CY5 (DRAQ5 merkitty ytimet), ja Texas Red (Sox2, Tra-1-85, tai PH3) suodattimen kuutioiksi. Suuri FOV kuvia (~500 MB /kanava) tuotiin Image-Pro analysoitavaksi räätälöityjä makroja. Kunkin cross-jaksossa, Draq5 kanavan tuotiin ja spektrisesti parannettu tasoittaa ulkonäkö kunkin ytimen. Tumat segmentoidaan, morfologisesti ”laajentuneet” laajentaa rajoja sytoplasmaan, ja ”vedenjakaja” suodatetaan solujen erottamiseen. Kiinnostava alue (ROI) vedettiin ympärillä suurin kasvain ja CFP, YFP, ja Texas Red kanavat lastattiin peräkkäin. Kukin kanava spektrisesti suodatetaan ja ”kerrotaan” solun maskin kuvatulla tavalla. Segmentointi kautta morfometrisiin ja intensiteetin profiilit spesifisiä kunkin merkin /tahra seuraa kuvan logiikka toimintoja YFP, CFP, ja vasta-aine positiivinen solumäärät. Sillä Immunofenotyypitys siirretyn väestön tuloksena binary ydinvoiman naamio oli ”kerrotaan” vastaaviin PH3 /Sox2 kanava. Positiivisuus määritettiin automaattisesti perustuu keskimääräisen ydin- intensiteetti PH3 tai Sox2 yläpuolella ennalta määritetyn kynnyksen.

Tulokset

Pahanlaatuinen gliooma ovat kiinteitä syöpiä, joille solun hierarkioita on toistuvasti määritelty, sallien kuulusteluun solujen jotka voidaan takautuvasti rikastaa CSC ominaisuuksia, kuten itse uusiminen, erilaistuminen potentiaali, kantasolujen merkki ilmaisun, ja in vivo kasvaimen leviämistä. Tilanteen korjaamiseksi ero in vivo kasvaimen etenemisen mahdollisia, käytimme malleja, joissa meillä oli aiemmin osoittanut kykyä toiminnallisesti rikastaa tai heikentäviä CSC ominaisuuksien ex vivo, joissa käytetään fluoresoivia solunpintamarkkeria merkinnät [8], [11]. Vaikka on kiistanalaista CD133 kuin CSC merkki, monet ehdotti gliooma CSC markkereita (kuten L1CAM [12], A2B5 [13], ja integriini alfa 6 [11]) päällekkäisyys CD133. Huomaamme, että CD133 rikastaa varten CSCS GBM-kalvoon yksilöihin, joita käytetään tutkimukseen ja erottelee varten tumorsphere muodostumisen tehokkuutta verrattuna integriinin alfa 6 (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi CD133 jakeet tehokkaasti levittää sekundaarikasvaimia ja CD133 rikastaminen CSCS näistä kasvaimista on hiljattain käytetty validoimiseksi CSC-erityinen ei-reseptori tyrosiinikinaasin ja typpioksidisyntaasia isoformi [14], [15]. CD133-ilmentyminen arvioitiin leimauksen jälkeen virtaussytometrialla 11%: YFP-solujen (CSC peräisin) ja 1% CFP-soluja (ei-varsi on johdettu) on CD133 positiivinen (tuloksia ei ole esitetty). Viruksen merkinnät menettely ei muuttanut kasvua ominaisuuksia (tuloksia ei ole esitetty).

In vivo

havainto syövän kantasolujen kasvua osaksi kasvain

Toistaiseksi kasvun kiinteä kasvain CSCS ei ole arvioitu yksittäisen solun resoluutio yli ajallinen ajan myötä in vivo. Tarkkailla mahdollisuudet kasvain eteneekö CSCS yksin, käytimme Elintensisäistä mikroskopialla käytettäessä potilaalle tehdä ksenotransplantaatio hiirimallissa tunnistaa ja jäljittää kasvua pieniä määriä CSCS kasvaimeen ajan (Fig. 1A). Varhain seurantajakso kun rajoitettu määrä CSCS oli läsnä (T4302, päivinä 3 13), CSCS liittyivät verisuonten verisuonia kapealla (Fig. 1 B, C), kuten Gilbertson ja työtoverit [16] ja kasvoi läheisyyteen verisuonia (Fig. 1 D, E). Ajan (päivästä 13-20), kasvain kyhmy muodostuu nopeasti ja kasvainsoluja havaittiin tunkeutua syrjäseuduille (siniset nuolet), yhteinen histologinen tunnusmerkki pahanlaatuinen gliooma. Tulokset antavat ensimmäisen kasvaimen kasvun ajallista ajan kuluessa CSCS elävien kuvantaminen ja vahvistaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa siirrettyjen CSCS.

Kasvaimen muodostuksen ksenotransplantaatio malli havaittiin GFP-leimatun CSCS ajan, kuten on esitetty koe- suunnitella kaavamaisen (A). Projektio micrographs (BD) osoittaa kasvaimen muodostumisen ajan ja kolmiulotteinen rekonstruktiot kuvattu mikrokuvissa (E, E ’) paljasti kasvain solut tiiviisti verisuonia (E’, esitetty valkoisilla nuolilla D, E) ja reuna-alueilla (D, E, näkyy sinisenä nuolet). Fluoresoiva dekstraania (näkyy punaisena) ruiskutettiin verenkiertoon valaisemaan verisuonten ennen kuvausta. Scale palkki edustaa 50 um.

Syöpä kantasolut selvitä kuin kantasolujen kasvainsoluihin

in vivo

Useat tutkimukset ovat osoittaneet ero kasvainmuodostusta kapasiteetin välillä CSCS ja non -stem kasvainsolut [8], [15], [17], [18], mutta head-to-head välinen vertailu kahden populaation korkealla resoluutiolla tai aikariippuvainen tavalla ei ole tehty. Tämä arviointi on kriittinen kuin pahanlaatuinen gliooma koostuu useista solupopulaatioiden on cross-talk välillä väestön ja miten solupopulaatioiden vuorovaikutuksessa todennäköisesti informatiivinen suhteen kasvaimia synnyttäviä prosesseja. Arvioida käyttäytymistä CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsolujen identtisellä mikroympäristön, olemme istutetut differentiaalisesti leimattua ihmisen CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsoluja, jotka ovat peräisin saman vanhempien kasvain samaan vastaanottajan hiiren ja seurataan in vivo käyttäytyminen ajan käyttäen Elintensisäistä mikroskopia (Fig. 2A). Sequential in vivo arviointi samalla palvelimella, joissa ensimmäinen seos CSC (10%, YFP leimattu) ja ei-kantasolujen kasvainsoluja (90%, CFP leimattu) osoittivat, että CSCS outgrew ei-varsi kasvainsoluja, jossa on 51,9-kertainen tilavuuden kasvu että CSCS ja 0,92 kertainen lisäys ei-kantasolujen kasvainsoluja (Fig. 2B) ja siellä oli rajoitettu sekoittuneet kasvu keskuudessa väestön (Fig. 2C, D). Useiden solupopulaatioiden saman kasvaimen, nämä kuvantamisen tulokset ovat ensimmäinen todiste ero kasvaimen muodostumisen kapasiteetin välillä CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsoluihin in vivo käyttämällä korkean resoluution peräkkäistä kuvantaminen.

Fraktioitu CSCS ja ei-varren kasvain solut leimattiin eri fluoresoivat proteiinit ja istutetaan hiiriin 10% syövän kantasoluja (YFP) 90% ei-kantasolujen kasvainsolu (CFP) suhde esitetyn kokeellisen suunnittelun kaavamaisen (A). CSCS outgrew ei-CSCS in vivo, kuten on esitetty yhteenveto kuvaaja (B), joka on laskettu kolmiulotteinen rekonstruointi ulokkeen micrographs (B, C). Lisäksi kasvainpopulaatiot ei sekoittuvat in vivo (ei varsi kasvain väestö merkitty keltaisella soikea). Fluoresoiva dekstraania (esitetty violetti) ruiskutettiin verenkiertoon valaisemaan verisuonten ennen kuvausta. Mittakaava edustaa 100 um.

Tuloksena kasvaimet sisälsivät syövän kantasoluja ja heidän jälkeläisilleen

sekundaarikasvaimia muodostama istutetut CSCS sisältää useita solupopulaatioiden, mutta aiemmat tutkimukset ovat pitkälti keskittyneet histologia toissijaisten kasvainten tai ilmaus kasvainmerkkiaineet mutta on ollut vähän tietoa osalta heterogeenisuuden aste sekä panos useiden solutyyppien kehittämiseen heterogeenisyys. Sen jälkeen, kun hiirille kehittyi neurologisia oireita (vaihteluväli 37-42 päivää transplantaation jälkeen), käytimme histologinen tutkimus vahvistaa fenotyypin siirrettyjen solujen tuloksena kasvaimia. Rajata rajat kasvainten, kudokset värjättiin ihmisen spesifisen antigeenin, Tra-1-85. Huomasimme, että vaikka molemmat YFP positiivinen (CSC johdettu) ja CFP positiivinen (ei varsi johdettu) olivat havaittavissa, valtaosa kasvainsolujen olivat peräisin CSCS; 94,5 prosenttia Tra-1-85 positiiviset solut kasvaimessa oli YFP positiivisia (CSC johdettu) verrattuna 0,2 prosenttia, mikä oli CFP positiivinen (ei-varsi on johdettu, Fig. 3A, B).

Kasvaimet solusta sekoittamalla kokeiden (n = 3) arvioitiin määrittää niiden koostumuksen. Myöhemmät arviointi johtaa kasvaimia osoittaa, että suurin osa solujen kasvain massa oli peräisin ihmisestä ja johdettu CSC vahvistanut Tra-1-85 värjäys ja YFP ilmaisun, näytetään edustava micrographs (A) ja pylväsdiagrammi (B) . Perifeerinen istutetut tuumorisoluja (YFP positiivinen CSCS ja niiden jälkeläiset) havaittiin olevan yhteydessä verisuonia. Micrograph päässä multiphoton kuvantaminen ja kolmiulotteinen rekonstruktio (C) esittävät läheisessä yhteydessä kasvainsolujen (vihreä) viereisten verisuonten (violetti, valaisee loisteputki dekstraanin injektiolla verenkiertoon ennen kuvantaminen). Histologinen tutkimus tuloksena kasvainten vahvistaa läheisessä yhteydessä perifeeristen tuumorisolujen verisuoniston käyttäen CD31 immunovärjäystä (D; CD31 punaisella kasvainsolut vihreä, ytimien violetti). Scale palkki edustaa 50 um. Tiedot näytetään keskiarvoina +/- SEM ***, P 0,001 arvioituna yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

Association välillä verisuonten ja syövän kantasoluja ja heidän jälkeläisilleen

Kyky kasvain solut voivat kasvaa pitkin verisuonia on fenotyyppi, joka on usein tunnistettu ihmisen gliooman kirurgisista näytteistä. Arvioida, onko tämä fenotyyppi toisteta kasvaimia yhteistyön tuloksena-transplantaatiota CSCS ja sovitettu ei-kantasolujen kasvainsoluja, arvioimme kasvaimen verisuonistossa käyttämällä multiphoton mikroskopia ja histologinen tutkiminen johtaa kasvainten (Fig. 3C, D). Päivänä 38 (esitetty kuviossa. 2B), olimme pystyttävä tunnistamaan ryhmä kasvainsolujen kehällä kasvain ja kolmiulotteinen analyysi osoitti, että CSCS ja niiden jälkeläiset (YFP-solut) olivat lähellä verisuoniston (Fig. 3C). Histologinen tarkastelu johtaa kasvaimen käyttämällä vasta-ainetta CD31 merkitä verisuonten vahvisti myös, että CSCS ja niiden jälkeläiset (YFP + solut) olivat todellakin lähellä verisuonistoon alueilla erotetaan suurin tuumorimassaan, ilmiö havaitaan myös GBM potilailla (Fig. 3D).

Syöpä kantasolut levittää heterogeenisyys

in vivo

Voit selvittää, istutetut kasvainsolujen sisälsivät kantasolujen kaltaisia ​​soluja, arvioimme ilmaus CSC merkki, Sox2 [19], ja totesi, että 25,9 prosenttia siirrettyjen CSCS ja heidän jälkeläisilleen (YFP solua) Sox2 positiivisia verrattuna 0,1 prosenttia ei-kantasolujen kasvainsoluihin ja heidän jälkeläisilleen (CFP soluja, Fig. 4A, B). Olemme myös arvioitiin lisääntymistä käyttämällä M-vaihe merkki fosforyloidun-histoni H3 (PH3) ja totesi, että 1,7 prosenttia CSCS ja heidän jälkeläisilleen (YFP solut) olivat aktiivisesti M-vaiheeseen verrattuna alle 0,01 prosenttia ei-kantasolujen kasvainsoluja ja heidän jälkeläisilleen (CFP soluja, Fig. 4C, D). Nämä erot leviämisen nähdään mallissamme tueksi kliiniset raportit viittaavat siihen, että lisääntyvissä CSCS (perustuen CD133-positiivisuuden) luonnehtivat aggressiivinen luokan GBM kasvaimia [20].

histologinen tutkimus suoritettiin alkaen johtaa kasvaimia solussa sekoittamalla kokeiden (n = 3) määrittää osa kantasolujen kaltaisia ​​soluja arvioimana Sox2 ilmaisu ja läsnäolo lisääntyvien solujen kuten vahvistettiin M-vaihe merkki fosforyloidun histoni 3 (PH3). Edustavia micrographs (A) ja pylväsdiagrammi (B) osoittavat Sox2 lauseke (punainen) liittyy syövän kantasoluja sekä niiden jälkeläiset (vihreä), mutta ei muiden kuin kantasolujen kasvainsoluihin ja niiden jälkeläiset (sininen). Edustavia micrographs (C) ja pylväsdiagrammi (D) osoittaa PH3 lauseke (punainen) liittyy syövän kantasoluja sekä niiden jälkeläiset (vihreä), mutta ei muiden kuin kantasolujen kasvainsoluihin ja niiden jälkeläiset (sininen). Scale palkki edustaa 50 um. Tiedot näytetään keskiarvoina +/- SEM ***, P 0,001 arvioituna yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), ytimet vastavärjättiin Draq5 (violetti).

Saada arvostusta heterogeenisuuden aste perustetun siirretyn CSCS (YFP-positiivisia soluja), arvioimme fenotyypin solujen ennen siirtoa. CSC: n viljelmät sisälsivät 74,8 prosenttia Sox2-positiivisten solujen (eli in vitro) verrattuna 24,9 prosenttia Sox2 positiivisia YFP-soluja (CSC johdettu) kasvaimessa (toisin sanoen in vivo, Fig. 5A-C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että in vivo ympäristö tarjoaa valaisevaa vihjeitä luoda tasapainotilan erilaistumisen tilasta ja siten solujen heterogeenisyys. Samanlainen väheneminen nähtiin Sox2 positiivinen kuin kantasolujen kasvainsoluja (CFP-solut) alkuperäisestä populaatiosta 7,1 prosenttia kulttuurin 0,1 prosenttia kasvain (Kuva. 5A-C). Erot kasvu havaittiin myös kesken väestö viljelmässä verrattuna sisällä kasvain. Käyttäminen M-vaihe merkki PH3 korvikkeena proliferaation, havaitsimme 2,1 prosenttia YFP positiivisia soluja (CSC johdettu) ja 0,2 prosenttia CFP positiivisia soluja (ei varsi johdettu) viljelmässä verrattuna 1,7 prosenttia YFP positiivisia soluja ja alle 0,01 prosenttia CFP-positiivisten solujen kasvaimissa (kuvio 5A-C). Nämä tulokset osoittavat, että vaikka ei-kantasolujen kasvainsoluihin vallitsevia varhaisina ajankohtina pistettä, koska suhde aikaan transplantaation, kasvava kasvaimia oli rajoitettu määrä soluja, jotka ovat peräisin ei-kantasolujen kasvainsoluja, joista muutama ilmaistuna kantasolujen merkkiaineita tai olivat aktiivisesti yleistyvät. Tuloksena kasvaimet muodostuivat CSCS ja heidän jälkeläisilleen, murto-osa, joka sisälsi yhä kantasolu- merkki ilmaisun ja olivat aktiivisesti lisääntyvissä.

edustaja micrographs (A) ja pylväsdiagrammi (B) kasvatetut solut ennen elinsiirtoa osoittamaan Sox2 ja PH3 lauseke (punainen) on korkeampi CSC osa soluista verrattuna ei-varsi syöpäsoluja. Yhteenveto kuvassa on merkki ilmentyminen in vivo ja in vitro analyysit (C). Scale palkki edustaa 50 um. Tiedot näytetään keskiarvoina +/- SEM ***, P 0,001 ja N. S. ei edusta merkittävää (p 0,05) arvioituna yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), ytimet vastavärjättiin Hoechst 33342 (sininen).

Keskustelu

kasvain microenvironment on kriittinen säätelijänä kasvaimen muodostumisen ja huollon maksut hoitovasteen ja epäonnistumisen. Kuitenkin monet CSC ja aivokasvaimen tutkimuksia ei ole asianmukaisesti mallinnettu mikroympäristö. Usein CSC ja ei-kantasolujen kasvainsoluja viljellään eri olosuhteissa, jotka ovat eri materiaalia ja CSCS kasvanut aloilla ja ei-kantasolujen kasvainsoluja viljellään toisissaan kiinni. Koska nämä olosuhteet aktivoida erilaisia ​​solun signalointireitteihin, jotkut CSC tulokset voivat johtua kulttuuriin esineen sijaan luontainen solu eroja. Useat tutkimukset suoritetaan kanssa populaatiot erillään, mikä ei salli välistä signalointia soluja, jotka on kriittinen solujen kasvua tai arvioimalla kunkin solutyypin osuutta kasvaimen muodostumisen in vivo. Lisäksi kapealla vuorovaikutukset komponentteja kuten verisuonistossa tai strooman voida täysin arvioida, ellei tutkimuksia suoritetaan in vivo. Paremmin mallintaa kasvaimen mikroympäristössä, me differentiaalisesti leimattu CSCS ja ei-kantasolujen kasvainsoluja ja otettiin soluja samaan in vivo olosuhteissa. Arviomme kasvu tarjoaa ensimmäisen suoraa näyttöä kasvaimen leviäminen vankka kasvain CSC alaryhmästä in vivo käyttäen elävää kuvantamisen ja osoittaa, että pieni osa kasvainsolujen voi edetä heterogeeninen kasvain. Tutkimuksemme tarjoavat merkittäviä etuja ex vivo tai sovitetun väestötutkimukset takia kykymme sopivampi malli in vivo ympäristössä ja arvioimiseksi, miten monia populaatioita reaaliajassa korkean resoluution mikroskoopilla.

On olemassa monia näkökohtia ksenotransplantaatio malleja, jotka tarjoavat mahdollisia etuja, mutta on edelleen rajoituksia. Käsitteellisesti nämä elinsiirron määritykset tarjoavat paremman in vivo ympäristön kustannuksella arvostusta tuumorigeenisia prosesseja reaaliaikaisesti, mikä voidaan päätellä jälkeen kasvaimen muodostumisen. Kuitenkin tämä musta laatikko lähestymistapa voidaan käsitellä käyttämällä eläviä kuvantamisen kuvattu tässä raportissa. Käytetään eläviä kuvantaminen, koukerot ksenotransplantaatio mallia voidaan selvitetty ja informatiivinen ennusteita voidaan tehdä kasvainten kehittymiseen, ylläpito ja hoitovaste. Huolellinen käyttö ksenotransplantaatio mallien mahdollistaa ymmärtää paremmin vuorovaikutuksen CSCS ja ei-varsi tuumorisoluissa, sekä solujen viestintä verisuonia, CSC kapealla useilla aivokasvaimia [16]. Lisäksi nämä lähestymistavat voivat selventää äskettäin tunnistettu ilmiö GBM CSC erilaistuminen verisuonten soluihin ja selkeyttää roolia tämän plastisuus tuumorigeenisia prosesseissa [21], [22], [23], [24]. Huomattavaa on, että emme tarkkailla yhdentymisen leimattujen solujen verisuonen seinämään (tuloksia ei ole esitetty). Nämä verisuonten yhteisvaikutuksia kauaskantoisia terapeuttisia vaikutuksia varsinkin kun otetaan angiogeneesin jossa monet hoitomuotoja tutkitaan. Lisäksi enemmän arvostusta vuorovaikutusta microenvironment ja siirrettyjen kasvainsoluihin voi selittää viive kasvaimen kasvua elinsiirron malleissa. Tätä korostaa se havaintomme kuvassa 1, jossa CSC kasvu välillä päivä 35 päivään 38 on varsin merkittävä, mutta yhtenevä dynamiikan kasvaimen kasvua sisällä transplantaation malli [25], [26]. Nämä erot ovat todennäköisesti kuvastaa monivaiheisen prosessin, joka sisältää kasvainsolujen eloonjäämisen, sopeutuminen vastaanottavaan ympäristöön, jonka jälkeen eksponentiaalista kasvua, joka voidaan ekstrapoloida ymmärtää uusiutumisen potilailla.

Tuloksemme myös osoittaa, että tällainen lähestymistapa voidaan määritellä paremmin syövän solujen heterogeenisyys, joka on kriittinen sekä perustiedot tumorigeneesin ja mallin sopivammin testata lupaava esikliinisiä hoitoja. Meidän tutkimuksissa saatu kasvaimia, jotka muodostivat sisälsi heterogeeninen populaatio, joka arvioidaan Sox2 ilmaisua, vaikka merkittävä edustus YFP solujen (CSC johdettu). Tämän tyyppinen in vivo linjan jäljittäminen on rajoitettu GBM tutkimuksissa ja myös tulokset vahvistavat, että CSCS ilmentämään kantasolujen markkeri voi tuottaa soluihin, jotka eivät ilmennä kantasolujen markkeri, joka osoittaa siirtymistä kantasolujen todetaan in vivo. Prekliinisissä tutkimuksissa luottaa kasvaimen kokoa kuin arvio tehoa. Meidän osoitus, että pieni osa syöpäsolujen etenee kasvaimen in vivo edustaa täydentävä lähestymistapa tehon arvioimiseksi tietyn hoitoa linjaa jäljittämistä. Siirtämistä kliinisessä yhteydessä, terapian, joka tappaa suurin osa soluista ja jättää jälkeensä pienen populaation tulenkestävien solujen (todennäköisesti rikastunut CSCS) ilmestyy tehokas, jos kasvain koko on mitattu tulos. Kuitenkin jäljellä olevia soluja, joista jotkut ovat CSCS, ovat omiaan edistämään kasvaimen uusiutumisen, kuten usein nähty potilailla jälkeen hoitojen tehokkuuden kasvainten koko [27]. Näin ollen arvioidaan solulinjat kasvaimen hoidon jälkeen yhdessä kasvaimen koon arviointeja ja histologinen analyysi todennäköisesti saadaan tarkempi näkemys vaikutusta hoidon. Kyky arvioida kasvainsolujen käyttäytymistä itsensä kliiniset malli on arvokas. Tuloksemme (tämän raportin ja [11], [28]) että muista ryhmistä [16] osoittavat, että kasvaimen solut ovat läheinen suhde verisuoniston; kuitenkin, FDA hyväksyi verisuonen endoteelisolujen kasvutekijän (VEGF) neutraloivat vasta-bevasitsumabi (Avastin) on ollut sekoitettu menestystä kliinisesti, vaikka menestys prekliinisissä malleissa [29]. Vastustuskykyä VEGF hoitojen oletetaan esiintyvän kautta kiertämisen tai välinpitämättömyyden ja niihin moduloidun angiogeneesin, vaskulogeneesiä, verisuonten normalisointi [30], [31]. Kuitenkin hallitseva tila vastus on vielä määrittelemättä ja lähestymistapamme käyttävät useita kasvainsolupopulaatioissa ja korkean resoluution in vivo mikroskopia todennäköisesti kriittisen oivalluksia. Sillä suurempi vaikutus, nämä menetelmät voidaan yhdistää käyttämällä fluoresoivia reportteri järjestelmien arvioimiseksi transkriptionaalista aktiivisuutta reaaliajassa ja korrelaatio terapeuttisen vasteen. Toinen alue, jolla nämä kuvantamisen lähestymistavat on hyödyllistä on arviointia sonic hedgehog (Shh) estäjät. On epäselvää, jos toimintatapa on suoraan kasvainsoluihin, kasvain strooman tai molemmat, ja selvittäminen vaikutusmekanismi on välitön prioriteetti kuin useat Shh inhibiittorit ovat parhaillaan tutkittavana erilaisia ​​kasvaimia kuten GBM [32] , [33].