Krooninen sairaus

tiivistelmä

arvioitiin mekanismi kapsaisiinin välittämää ROS sukupolvi haiman syöpäsoluja. Sukupolvi ROS oli noin 4-6-kertainen enemmän kuin valvoa ja jo 1 tunnin kuluttua kapsaisiini hoidon BxPC-3 ja AsPC-1-soluissa, mutta ei normaaleissa HDPE-6 solua. Sukupolvi ROS inhiboitui katalaasi ja EUK-134. Rajata mekanismi ROS sukupolvi, entsymaattisen toiminnan mitokondrioiden monimutkaisten-I ja monimutkainen-III määritettiin puhtaassa mitokondrioissa. Tuloksemme osoittavat, että kapsaisiinin estää noin 2,5-9% ja 5-20% monimutkaisten-I aktiivisuus ja 8-75% monimutkaisten-III aktiivisuuden BxPC-3 ja AsPC-1-soluissa, mikä oli attenuable by SOD, katalaasi ja EUK-134. Toisaalta, kapsaisiini hoito eivät estäneet kompleksin I tai monimutkaisia-III toimintaa normaaleissa HDPE-6 solua. ATP-tasot rajusti tukahdutti kapsaisiini kohtelu sekä BxPC-3 ja AsPC-1-soluissa ja vaimennetaan katalaasi tai EUK-134. Hapettaminen mitokondrioiden erityisiä kardiolipiini oli huomattavasti suurempi kapsaisiini käsitellyissä soluissa. BxPC-3 peräisin ρ

0 soluja, joista puuttuu mitokondrio-DNA, olivat täysin resistenttejä kapsaisiini välittämä ROS sukupolvi ja apoptoosin. Tuloksemme osoittavat, että vapautuminen sytokromi c: n ja pilkkominen sekä kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 hajoamisen johdosta mitokondrion kalvon potentiaalia merkittävästi estänyt katalaasi ja EUK-134 BxPC-3-soluja. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että kapsaisiini hoitoon paitsi estävät entsyymiaktiivisuutta ja ilmentymä SOD, katalaasi ja glutationi peroksidaasi mutta myös vähentää glutationin tasolle. Yli-ilmentyminen katalaasin lyhytaikaisella transfektiolla suojasi soluja kapsaisiini-välitteisen ROS ja apoptoosin. Lisäksi kasvaimet hiiristä suullisesti ruokittu 2,5 mg /kg kapsaisiini määrä aleni SOD aktiivisuuden ja kasvu GSSG /GSH tasoilla verrattuna kontrolleihin. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, osallistuminen mitokondrion kompleksin I ja III kapsaisiini-välitteisen ROS: n syntyminen ja lasku antioksidantti tasoja aiheuttaen vaikean mitokondriovaurioita johtaa apoptoosin haiman syöpäsoluissa.

Citation: Pramanik KC, Boreddy SR, Srivastava SK (2011) rooli mitokondrio elektroninsiirtoketju komplekseja Kapsaisiini välittämä oksidatiivinen stressi Johtavat apoptoosi haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (5): e20151. doi: 10,1371 /journal.pone.0020151

Editor: Michael Polymenis, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 19 huhtikuu 2011; Julkaistu: 25 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Pramanik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute, National Institutes of Health R01 CA129038; R01 CA106953. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi tappavin kaikki kiinteä aine pahanlaatuisten Yhdysvalloissa [1]. Ponnistelut ovat suunnattu kehittämiseen adjuvanttia ja neoadjuvant hoitojen yritetään parantaa eloonjäämisaste [1]. Haimasyöpä yleensä vastaavan huonosti tavanomaisiin hoitomuotoja, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa [2]. Valitettavasti, myrkyllisyys ja luontainen vastus kemoterapeuttisen aineen, kuten 5-fluoriurasiili (5-FU) ja gemsitabiini haimasyövän ovat edelleen syitä huonoon ennusteeseen [3]. Ei ole yksimielisyyttä optimaalisen terapeuttisen aineina haimasyövän, siis kehittää uusia lähestymistapoja estämään ja hoitamaan haimasyöpä on tärkeä tehtävä. Epidemiologiset tutkimukset tukevat edelleen oletuksesta, että ruokavalio sisältää runsaasti hedelmiä, vihanneksia ja mausteita voi olla suojaava vastaan ​​eri ihmisen maligniteettien kuten haimasyövän ja että kulutus chili voivat suojata ruoansulatuskanavan liittyviä syöpiä [4], [5], [6 ], [7], [8], [9], [10].

Kapsaisiini, joka on homovanillic hapon johdannainen (N-vanillyyli-8-metyyli-noneeniamidi) on aktiivinen ja mausteinen komponentti hot chili pippuri (Fig. 1A) [11], [12] ja sitä on käytetty elintarvikelisäaineena pitkään kaikkialla maailmassa, erityisesti Etelä-Aasian ja Latinalaisen Amerikan maissa [13], [14], [15], [16 ], [17]. Tämä alkaloidi on käytetty kivun ja tulehduksen hoitoon, liittyy erilaisia ​​sairauksia [18], [19], [20], [21]. Useat viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että kapsaisiini on antiproliferatiivinen vaikutus maksan [22] mahalaukun [23] eturauhasen [24] paksusuolen [25] ja leukemiasoluja [26]. Kapsaisiini yleensä saa aikaan fysiologisen stimuloimalla vanilloidi 1 (TRPV-1) reseptori, kuitenkin reseptorin riippumattomia vaikutuksia kapsaisiinia on havaittu syövän soluihin [25], [26], [27]. Kapsaisiini estää syöpäsolujen kasvun NF-kB inaktivaation, ROS sukupolvet, solusyklin pysähtymisen ja moduloimalla EGFR /HER-2 reittejä [28], [29], [30], [31], [32], [33 ]. Tarkka molekyylitason mekanismi, jonka kapsaisiini aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja apoptoosin on epämääräinen. Olemme osoittaneet aiemmin, että kapsaisiinin aiheuttaman apoptoosin haiman syöpäsoluissa liittyi ROS: n syntyminen ja mitokondrion häiriöitä [34]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jonka kapsaisiini aiheuttaa ROS sukupolvi ja solukuolemaa ei ollut selvä.

(

) rakenne kapsaisiini. Apoptoosin indusoiva vaikutus kapsaisiinia (150 uM, 24 h) (

B

) BxPC-3, (

C

) AsPC-1 ja (

D

) HPDE- 6 solua, määritettiin käyttämällä anneksiini-V /FITC ja propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla cytometery. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 4) neljästä itsenäisestä kokeesta. * Tilastollisesti erilaisia ​​verrattuna valvonnan analysoitiin Studentin t-testiä (

P 0,05

). (

E

) BxPC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla kapsaisiinia 24 tuntia ja (

F

) Cell käsiteltiin eri aikavälein 150 uM kapsaisiinin ja analysoitiin immunoblottauksella katkaisua kaspaasi-9, kaspaasi-3, ja PARP, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kukin blotti oli riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-β-aktiini-vasta tasapuolisen Proteiinilisäyksen. Nämä kokeet tehtiin kolme kertaa itsenäisesti Samanlainen havainto tehdään kussakin kokeessa.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että kapsaisiini aiheuttaa ROS (superoksidiradikaalia ja vetyperoksidi) sukupolven estämällä mitokondrioiden monimutkainen-I ja Monimutkainen-III aktiivisuus ja ATP-tasot BxPC-3 ja AsPC-1 ihmisen haimasyövän solulinjoissa, vaikuttamatta BxPC-3 peräisin ρ

0 ja normaali HDPE-6 solua. Samalla katalaasin ja glutationiperoksidaasin aktiivisuus ja ilmentyminen tukahdutetaan kapsaisiini hoitoon. Täydentäminen soluihin PEG-katalaasi, PEG-SOD, EUK-134 (katalaasi jäljittelevät) tai transfektoimalla solut katalaasiliuokseen lähes täysin tukossa kapsaisiini välittämä ROS ja apoptoosin. Lisäksi kasvainten 2,5 mg /kg kapsaisiini käsitellyt hiiret osoittivat laski SOD toimintaa ja kasvua GSSG /GSH tasolla. Tutkimus tarjoaa suoran todisteita siitä, miten kapsaisiinin hyödyntää mitokondrioita aiheuttaa oksidatiivista stressiä, joka johtaa apoptoosin haiman syöpäsoluissa.

Tulokset

Kapsaisiini laukaisee apoptoosin haimasyövän soluissa, mutta ei normaaleissa HDPE-6 solut

Apoptoosi määritettiin flow cytometery käyttämällä anneksiini-V /FITC ja propidiumjodidilla. Hoito BxPC-3 ja AsPC-1 solujen 150 uM kapsaisiini 24 tuntia johti noin 2,5-5 taittuu lisääntyä apoptoosin (Fig. 1 B-C). Mielenkiintoista on, että kapsaisiini ei onnistunut indusoimaan apoptoosia normaaleissa HDPE-6-solut (Fig. 1 D). Apoptoosin indusoiva vaikutus kapsaisiinia vahvistettiin lisäksi western-blottauksella. Kuten on esitetty kuviossa. 1E, kapsaisiini hoito aiheutti merkittäviä kaspaasi-9, kaspaasi-3, ja PARP, kuten ilmeistä niiden pilkkoutuminen pitoisuutena riippuvaisella tavalla. Toisaalta, kapsaisiini hoito ei aiheuttanut pilkkoutuminen kaspaasien tai PARP normaaleissa HDPE-6-soluja (tietoja ei esitetty). Aikana riippuvainen tutkimus, lohkaisu kaspaasi 9/3 ja PARP näkyivät 16 ja 24 h kapsaisiinia hoidon (Fig. 1 F).

Kapsaisiini aiheuttaa sukupolven mitokondrion ROS haiman syöpäsoluissa

Solunsisäinen ROS sukupolvi, jonka kapsaisiini arvioitiin virtaussytometrialla käyttämällä hydroetidiini (HE) ja DCFDA. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, joka aikariippuvainen tutkimuksessa, kapsaisiini hoito aiheutti noin 8-9 taittuu lisääntyminen superoksidiradikaalia 1-2 tunnin joka laski 24 h mitattuna HE fluoresenssin virtausta cytometery. Samoin sukupolven vetyperoksidin upon kapsaisiini käsittely kasvoi 4-7 taittuu 1-2 tuntia ja sitten laski, mutta ylläpitää arvoja suurempia superoksidi 24 h, mitattuna DCF fluoresenssi virtausta cytometery (Fig. 2B). Sukupolvi ROS oli jo 1 h verrattuna tarkastusten BxPC-3-soluissa. Jotta onko antioksidantit voivat estää ROS sukupolvi, solut esikäsiteltiin PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalaasia (500 U /ml) tai 50 uM EUK -134 (solun läpäisevä katalaasi jäljittelevää) ennen kapsaisiinin hoitoon. PEG-SOD esti lähes täysin superoksidiradikaalin sukupolven kun taas PEG-katalaasin täysin tukossa vetyperoksidia sukupolven mitattuna HE ja DCF fluoresenssin vastaavasti virtauksen cyometery (kuvio S1A-B). Vahvista spesifisyyden antioksidantteja, käytimme PEG-katalaasia estää superoksidiradikaalista sukupolvi. Kuten odotettua, PEG-katalaasia epäonnistui täysin estää superoksidiradikaalia sukupolven (Kuva S1C). Samoin PEG-SOD epäonnistui estämään vetyperoksidin sukupolven (tuloksia ei ole esitetty). Seuraavissa kokeissa, mittasimme koko ROS (superoksidiradikaalia + vetyperoksidi) sukupolvi. Samoin kapsaisiini hoito lisäsi yhteensä ROS noin 2,5-4,5 kertaiseksi AsPC-1-solujen maksimin ollessa 2 h hoidon (Fig. 2C). Kapsaisiini hoito ei aiheuta merkittävää ROS normaalissa HDPE-6-soluja, mikä viittaa siihen, että normaalit solut ovat resistenttejä vaikutukset kapsaisiinin (Fig. 2D). Yhdistelmänä hoidossa, tuloksemme osoittavat, että PEG-SOD, PEG-katalaasi ja EUK-134 oleellisesti estetty kapsaisiini välittämä yhteensä ROS sukupolven BxPC-3-soluissa (kuvio. 2F).

(

) ja (

B

) BxPC-3-soluja käsiteltiin DMSO tai 150 uM kapsaisiinin eri ajankohtina ja värjättiin HE ja DCFDA ja analysoitiin superoksidiradikaalia ja vetyperoksidia vastaavasti virtauksen cytometery. (

C

) AsPC-1, (

D

) HDPE-6, (

E

) BxPC-3 ρ

0-soluja käsiteltiin 150 uM kapsaisiini 2, 4 ja 24 h ja analysoitiin yhteensä ROS (superoksidi ja vetyperoksidi), jonka virtaussytometrillä sen jälkeen, kun solut oli värjätty HE ja DCFDA. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 3) neljästä itsenäisestä kokeesta ja data edustaa kertaiseen ROS haltuunsa. * Tilastollisesti eri verrokkiin verrattuna analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin post-hoc testi

P 0,05

). (

F

) vaikutus antioksidantteja kapsaisiiniherkkiin välittämän koko ROS sukupolven BxPC-3-soluissa. Soluja käsiteltiin PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalaasia (500 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 tunti ja sen jälkeen 150 uM kapsaisiinin 2 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 3) neljän itsenäisen kokeen. * Tilastollisesti eri kuin verrokkiryhmän (

P 0,05

) ja ** tilastollisesti erilainen verrattuna kapsaisiinin hoito (

P 0,05

), analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin postitse -hoc testi.

BxPC-3 peräisin ρ

0-solut olivat täysin resistenttejä kapsaisiini välittämää ROS sukupolvi

vakiinnuttaminen osuutta mitokondrioiden ROS sukupolvi, jonka kapsaisiini, me tuotti ρ

0 variantteja BxPC-3-soluissa. ρ

0-solut luodaan ja ylläpidetään inkuboimalla BxPC-3-solujen kanssa 60 ng /ml etidiumbromidia, ja 50 mg /ml uridiinia 12 viikkoa ja tunnettu siitä, että PCR: llä vahvistaa ehtyminen mtDNA ja normaali oksidatiivisen phosphosrylation raportoitu aikaisemmin [35]. Selviytyminen ρ

0 solujen riippuu ATP peräisin anaerobisesta Glykolyysivaiheen. ρ

0-solut eivät kykene tuottamaan ROS ETC monimutkaisia, koska niissä ei ole normaali oksidatiivisen fosforylaation [35], [36]. Verrattuna villityypin BxPC-3-soluissa, yhteensä ROS sukupolvi ei lainkaan havaittu BxPC-3 ρ

0-solut käsittelemällä kapsaisiinin (Fig. 2E). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että BxPC-3 ρ

0 solut kokonaan vastustuskykyisiä vaikutuksia kapsaisiinin verrattuna villityypin BxPC-3-soluissa.

Kapsaisiini hoito estää ETC Complex-I ja Complex -III toiminta

Mitokondrioiden ETC kompleksit ovat suuria generaattoreita ROS soluissa ja kudoksissa. Koska havaitsimme ROS sukupolvi, jonka kapsaisiini, halusimme nähdä jos mitokondriot ovat mukana tässä prosessissa. Siksi määritettiin entsymaattisen toiminnan ja ilmentyminen mitokondrioiden monimutkaisten-I, kompleksi-II, kompleksi-III ja kompleksi-IV kapsaisiini käsitelty BxPC-3, AsPC-1, HDPE-6 ja BxPC-3 ρ

0 soluja. Kapsaisiini hoito estää kompleksi-I aktiivisuus noin 5-20% vuonna BxPC-3 ja 2,5-9% vuonna AsPC-1-soluissa verrattuna vastaaviin kontrolleihin (Kuva. 3A-B). Toisaalta, kuten odotettua, kapsaisiini eivät estäneet kompleksin I aktiivisuus BxPC-3 ρ

0-solut (joista puuttuu mitokondrio-DNA) ja normaalin HDPE-6-solut (Fig. 3C). Seuraavaksi halusimme tutkia onko tämä lasku monimutkainen-I aktiivisuus voidaan vaimentaa antioksidantteja. Tuloksemme osoittavat, että solujen esikäsittely katalaasin tai EUK-134 merkittävästi esti pienenee monimutkainen-I aktiivisuus kapsaisiini (Fig. 3d). Lisäksi kapsaisiini hoito vähensi proteiinin tasot monimutkaisten-I proteiinikompleksi 4 h hoidon ajan riippuvainen tutkimus ja katalaasi tai EUK-134 esti tätä muutosta (Kuva. 3E-F). Samoin, kompleksi-III-aktiivisuuden kapsaisiini estyi 8-75% sekä BxPC-3 ja AsPC-1-solut (Fig. 4A-B). Siitä huolimatta, kapsaisiini jättänyt vähentää monimutkaisten-III aktiivisuuden BxPC-3 ρ

0 soluja (Fig. 4C). Vaatimaton väheneminen kompleksi III aktiivisuus kuitenkin havaittiin HDPE-6 solujen kapsaisiini hoito (Fig. 4C). Lasku kompleksi-III aktiivisuuden BxPC-3-soluista kapsaisiini lievitti katalaasi ja EUK-134 (Fig. 4D). Suostumuksella toimintotiedot, ilmaus monimutkaisten-III proteiinikompleksi rajusti vähennetty BxPC-3-soluissa kapsaisiinia hoidon (Fig. 4E). Vaikutus kapsaisiinin proteiinin taso kompleksi-III kumottiin katalaasi ja EUK-134 (Fig. 4F). Tuloksemme osoittavat, että mitokondrioiden kompleksi-III on enemmän mukana kapsaisiini välittämää ROS sukupolvi verrattuna monimutkaisten-I. Kapsaisiini ei ollut vaikutusta kompleksin-II ja IV (tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että esto mitokondrioiden monimutkaisten I ja monimutkainen-III kapsaisiini aiheuttaa ROS sukupolvi.

entsymaattinen toiminta mitokondrioiden monimutkaisten Olin päättänyt puhtaassa eristettyjä mitokondrioita ohjaus ja 150 uM kapsaisiinia käsitelty (

) BxPC-3 ja (

B

) AsPC-1 soluja 2, 4 ja 24 tuntia. (

C

) vertailu kompleksin I aktiivisuus AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ

0 ja HDPE-6-soluja käsiteltiin 150 uM 24 tuntia. (

D

) Kapsaisiini välittämää väheneminen monimutkaisten-I aktiivisuus estyi esikäsittely BxPC-3-solujen kanssa katalaasin (2000 U /ml) ja EUK-134 (50 uM) 1 tunti sen jälkeen 150 uM kapsaisiini 24 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​haltuunsa keskiarvona ± SD (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. * Tilastollisesti eri kuin verrokkiryhmän (

P 0,05

) ja ** tilastollisesti erilainen verrattuna kapsaisiinin hoito (

P 0,05

), analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin postitse -hoc testi. (

E

) Complex-I-proteiinin ilmentyminen määritettiin immunoblottauksella puhtaalla mitokondrion proteiini eristetään ohjaus ja 150 uM kapsaisiini käsitelty BxPC-3 solujen osoitetun ajanjaksoja tai (

F

) 1 h ennen hoidon katalaasin (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) ja sen jälkeen 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia. Immunoblottauksella kullekin proteiinille suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin. Blotit riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-Cox-IV mitokondrioiden proteiineista tasapuolisen Proteiinilisäyksen.

Mitokondrioiden kompleksi-III aktiivisuus määritettiin puhtaan eristettyjä mitokondrioita ohjaus ja 150 uM kapsaisiini käsitelty (

) BxPC-3 ja (

B

) AsPC-1 soluja 2, 4 ja 24 tuntia. (

C

) vertailu kompleksin III aktiivisuus AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ

0 ja HDPE-6-soluja käsiteltiin 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia. (

D

) Kapsaisiini välittämää väheneminen monimutkaisten-III aktiivisuus vaimenee esikäsittely BxPC-3-solujen kanssa katalaasin (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 tunti sen jälkeen 150 uM kapsaisiini 24 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​haltuunsa keskiarvona ± SD (n = 3) neljän itsenäisen kokeen. * Tilastollisesti eri kuin verrokkiryhmän (

P 0,05

) ja ** tilastollisesti erilainen verrattuna kapsaisiinin hoito (

P 0,05

), analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin postitse -hoc testi. (

E

) kompleksi-III-proteiinin ilmentyminen määritettiin immunoblotting puhtaalla mitokondrion proteiini eristetään ohjaus ja 150 uM kapsaisiini käsitelty BxPC-3 solujen osoitettuun ajanjaksoja tai (

F

) Esikäsittely katalaasia (2000 u /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 tunti ja sen jälkeen 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia. Expression monimutkaisten-III-proteiinin määritettiin immunoblottauksella eristetyistä puhdasta mitokondriot, kuten on kuvattu menetelmässä. Kukin blotti oli riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-Cox-IV-vasta tasapuolisen Proteiinilisäyksen. Nämä kokeet tehtiin kolme kertaa itsenäisesti Samanlainen tulos saatiin kussakin kokeessa.

Vaikutus kapsaisiinin mitokondrion ATP sukupolven

Mitokondrioita merkittävä energianlähde soluihin. Meidän vieressä halusi tietää kapsaisiini välittämää Mitokondrioiden hengitysteiden komplekseja vaikuttaa ATP sukupolvi. Voit selvittää tasot ATP, arvioimme kompleksi-V ATP syntaasin aktiivisuus eristettyjä mitokondrioita ohjaus ja kapsaisiini käsiteltiin BxPC-3 ja AsPC-1-soluissa. Sukupolvi ATP kautta monimutkainen-V mitokondrioissa. Kapsaisiini hoito köyhdytettyä ATP-tasot noin 75% sekä BxPC-3 ja AsPC-1-soluja verrattuna kontrolliin (Fig. 5A-B). Havaitsimme myös, että katalaasi ja EUK-134 merkittävästi esti lasku ATP-tasot vastauksena kapsaisiini hoitoon (Kuva. 5C). Edelleen vahvistaa nämä havainnot, ilmentyminen mitokondrion kompleksin V-proteiini määritettiin western blottauksella. Tuloksemme osoittavat, että kapsaisiinin hoito pienensi ilmaus monimutkainen-V-proteiinin aloitetaan jo 1 h, mutta oli näkyvämpi 16 ja 24 h (Fig. 5D). Tämä lasku kompleksi-V ilmentyminen oli vaimennettu katalaasi ja EUK-134 (Kuva. 5E). Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että kapsaisiinin hoito rajusti häiritsee mitokondrioiden toimintoja työntämällä solut kohti apoptoosin.

(

) BxPC-3 (

B

) AsPC-1-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia, ja (

C

) BxPC-3-soluja käsiteltiin katalaasilla (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 h ennen 150 uM kapsaisiinin hoitoa 24 tuntia ja ATP-syntaasin aktiivisuus määritettiin puhtaana mitokondrioita proteiini eristetään ohjaus ja käsitellyistä soluista kuvatulla menetelmällä osiossa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. * Tilastollisesti merkitsevä verrattuna ohjaus tai ** tilastollisesti merkitsevä verrattuna kapsaisiinin hoitoon, analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin post-hoc-testi (

P 0,05

). (

D

) vaikutus kapsaisiinia hoidon monimutkaisiin-V-proteiinin ilmentymisen. BxPC-3-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin varten osoitetun ajanjaksoja tai (

E

) BxPC-3-soluja käsiteltiin katalaasilla (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 h ennen käsittelyä 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia. Expression monimutkaisten-V-proteiinin määritettiin immunoblottauksella puhtaassa mitokondrioiden proteiinin, kuten on kuvattu menetelmässä osassa. Kukin blotti oli riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-Cox-IV-vasta tasapuolisen Proteiinilisäyksen. Nämä kokeet tehtiin kolme kertaa itsenäisesti samanlaisia ​​tuloksia saatiin kussakin kokeessa.

Kapsaisiini häiritsee mitokondrion kalvon potentiaalia ja aiheuttavat hapettumista mitokondrioiden lipidejä

Liiallinen solunsisäisten ROS johtaa solujen apoptoosia häiritsevät mitokondrion kalvon potentiaalia. Muutos mitokondrion kalvon potentiaalia kapsaisiini näin ollen määritettiin värjäämällä solujen kanssa mitokondrion kalvon herkkä väriaine TMRM ja analysoitiin virtaussytometrialla. Olemme havainneet, että kapsaisiini-hoito vähensi merkittävästi mitokondrion kalvon potentiaalia BxPC-3-solujen 26% kontrolliin verrattuna (Fig. 6A). Vahvistamaan, onko kapsaisiini välittämä ROS aiheuttaa muutoksen mitokondrion kalvon potentiaalia, katalaasi ja EUK-134 käytettiin. Solujen esikäsittely sekä antioksidantteja ja sen jälkeen kapsaisiini esti täysin lasku mitokondrion kalvon potentiaali (Fig. 6A). Olemme edelleen tutki mahdollisuutta onko kapsaisiini indusoivat edullisesti mitokondrioiden -lipidiperoksidaation BxPC-3-soluissa. Tätä tarkoitusta varten solut värjättiin nonyyli akridiinioranssilla (NAO) havaitsemiseksi hapetus kardiolipiini, mitokondrion kalvon lipidikomponentti, fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometrialla [37]. Kardiolipiinin on yksinomaan läsnä mitokondrioita ja jälkeen merkitty NAO ja näyttelyitä keltainen fluoresenssi. Kun analysoimme solut alla fluoresenssimikroskoopissa, havaitsimme, että lähes kaikki solut verrokkiryhmässä näytteille keltainen väri. Kuitenkin keltainen värjäys väheni ja muuttui vihreäksi kapsaisiini käsitellyissä soluissa osoittaa radikaaleja hapetus kardiolipiini (Fig. 6B). Kuitenkin, katalaasi ja EUK-134 esti täysin hapettumisen kardiolipiini (Fig. 6B). Nämä tulokset vahvistettiin virtaussytometrialla jossa havaittiin, että kapsaisiini aiheuttaa kardiolipiini hapettumista BxPC-3-soluissa, kuten on esitetty siirtymää NAO fluoresenssin kohti vasemmalle (Fig. 6C). Olemme edelleen käyttää katalaasi ja EUK-134, onko hapettumista kardiolipiiniä voidaan estää. Olemme havainneet, että lisäämällä katalaasia tai EUK-134 esti lähes täysin muutos NAO värjäytymistä (Fig. 6C), mikä viittaa, että lasku NAO fluoresenssin johtui hapettumisen mitokondriaalisen lipidin kardiolipiini mitokondrion ROS.

(

) BxPC-3-soluja käsiteltiin katalaasilla (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 tunti ja sen jälkeen 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia ja muutos mitokondrion kalvon potentiaali määritettiin värjäämällä solujen kanssa mitokondrion kalvon herkkä väriaine TMRM ja analysoitiin virtaussytometrialla. Oikea paneeli näyttää kvantitoimiseksi mitokondrion kalvon potentiaalia. (

B

) Vaikutus kapsaisiinin mitokondrion lipidiperoksidaatiolta. BxPC-3-soluja käsiteltiin katalaasilla (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 tunti ennen käsittelyä 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia ja värjättiin nonyyli akridiinioranssilla (NAO) havaitsemiseksi hapettumista kardiolipiiniä, mitokondrio membraanilipidiin komponentti fluoresenssimikroskopialla, ja (

D

) virtaussytometria ja oikea paneeli esittää kvantitoimiseksi mitokondrioiden cardiolipid hapettumista. Edustavia tulos kolmen kokeen suorittaa itsenäisesti. * Tilastollisesti erilaisia ​​verrattuna ohjaus (

P 0,05

) tai ** tilastollisesti erilaisia ​​verrattuna kapsaisiinin hoito yksinään (

P 0,05

), analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seuraa Bonferronin post-hoc-testi.

kapsaisiini aiheuttama apoptoosin on attenuable by antioksidantteja

Havaitsimme, että kapsaisiini aiheuttaa ROS sukupolvi häiritsemällä mitokondrioiden toimintaan. Kun mitokondrioiden toiminnot häiriintyvät, sytokromi-c vapautuu mitokondriot sytosoliin ja aktivoi kaspaasi-3 cascade johtaa solujen apoptoosiin. Mietimme, onko katalaasi ja EUK-134 voi kumota kapsaisiinin aiheuttamaa apoptoosia. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, PEG-SOD, PEG-katalaasi ja EUK-134 merkittävästi suojattu BxPC-3-soluja kapsaisiinin aiheuttamaa apoptoosia. Nämä tulokset varmistettiin vielä arvioimalla vapautuminen sytokromi-c ja lohkaisu kaspaasi-3 western blottauksella. Tuloksemme osoittavat, että sekä katalaasi ja EUK-134 merkittävästi esti julkaisun sytokromi-c sytosoliin ja pilkkominen kaspaasi-3 välittävät kapsaisiini (Fig. 7C). On huomionarvoista, että BxPC-3 ρ

0-solut, jotka eivät pysty tuottamaan ROS kautta mitokondrioita, olivat täysin resistenttejä apoptoosin indusoivan kapsaisiinia (Fig. 7B), mikä vahvistaa osallistumisen mitokondrioiden kapsaisiinin välittämä ROS sukupolvi ja apoptoosin.

(

) BxPC-3-soluja esikäsiteltiin PEG-SOD (100 U /ml), PEG-katalaasia (500 U /ml) tai EUK-134 (50 uM ) 1 h ja sitten käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin 24 tuntia, (

B

) BxPC-3 ρ

0-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin 24 h, ja apoptoosia oli määritetään anneksiini V /FITC ja propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla cytometery. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. * Tilastollisesti erilaisia ​​verrattuna ohjaus (

P 0,05

) tai ** tilastollisesti merkitsevä verrattuna kapsaisiinin hoito (

P 0,05

), analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin post-hoc-testi. (C) Sytokromi-c: n ja Cl-kaspaasi-3 määritettiin immunoblottauksella in BxPC-3-soluja esikäsiteltiin katalaasin (2000 U /ml) tai EUK-134 (50 uM) 1 tunti ennen käsittelyä 150 uM kapsaisiini 24 h. Kukin blotti oli riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta tasapuolisen Proteiinilisäyksen. Nämä kokeet tehtiin kolme kertaa itsenäisesti ja samanlaiset tulokset saatiin.

Kapsaisiini hoito häiritsee solujen redox homeostaasin seurauksena oksidatiivisen stressin

Redox homeostaasiin solussa johtuu hyvä tasapaino solunsisäinen ROS ja ROS huuhteluilman antioksidantteja ja entsyymi järjestelmiä. Alentunut GSH on solunsisäinen antioksidantti, ja on tunnettua ylläpitää solun hapetus-pelkistys-tasapainossa. Siksi mitataan intrasellulaarisen GSH tasoilla ja määritettiin myös tasot hapettuneen muodon GSH (GSSG). Kuten on esitetty kuviossa. 8A, kapsaisiini hoito huomattavasti GSSG tasolla; ja laski GSH tasoilla ilmaisee siirtymistä redox tasapainon kohti hapettumista tilassa (Kuva. 8A-B). Toinen entsyymi järjestelmiä pelata rooli redox tasapainossa sisältävät (SOD), katalaasi ja glutationi peroksidaasi (gpx). Superoksidiradikaaleja syntyvät monimutkaisten-I ja monimutkainen-III mitokondrioita ja muuttuvat nopeasti vetyperoksidia vuoksi jakaantumisen mukaan superoksididismutaasi. Kuten on esitetty kuviossa. 8C, kapsaisiini hoito esti 23-51% SOD aktiivisuuden ajasta riippuva tutkimus. Kaksi muuta entsyymit (katalaasin ja GPX) ovat mukana myrkkyjä solunsisäisten peroksidien kuten vetyperoksidi. Tuloksemme osoittavat, että kapsaisiini vähensi entsymaattinen aktiivisuus katalaasin 2 tunnin sisällä hoidon (Fig. 8D). Nämä havainnot varmistettiin katalaasiproteiinia ilme. Havaitsimme, että katalaasi-ekspressio väheni 2 tunnin kuluttua kapsaisiinia hoidon (Fig. 8 D-E). Koko meidän tutkimuksissa havaitsimme, että katalaasi tai EUK-134 lisäravinteiden esti ROS sukupolvi ja suojasi soluja vahingollisia vaikutuksia kapsaisiini, mikä osoittaa selvästi, että katalaasi on ratkaiseva rooli kapsaisiini välittämää oksidatiivista stressiä ja apoptoosin haiman syöpäsoluissa. Koska glutationiperoksidaasi- on toinen tärkeä entsyymi, joka käyttää GSH substraattina puhdistaa vetyperoksidia, päätimme sen entsymaattinen aktiivisuus ja proteiinin ilmentymisen. Kuten voidaan nähdä kuviosta. 8 F-G, kapsaisiini vähensi GPX aktiivisuuden ja ilmentymisen BxPC-3-solujen vastauksena kapsaisiini hoitoon. Itse asiassa, ilmaus GPX väheni merkittävästi heti sen jälkeen 1 h kapsaisiinin hoitoon. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että ehtyminen GSH tason ja esto SOD, katalaasi ja GPX jonka kapsaisiini häiritsee solun redox homeostaasin mikä lisää oksidatiivista stressiä.

(A) Vaikutus kapsaisiinin tasoista hapettuneen glutationin (GSSG). BxPC-3-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin 2, 4 ja 24 tuntia ja GSSG ja (

B

) GSH-tasot määritettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa pakkausta. Nämä kokeet toistettiin kahdesti saatu samanlaisia ​​tuloksia joka kerta. (

C

) SOD, (

D

) Katalaasi, (

F

) GPX aktiivisuudet määritettiin, kuten on kuvattu menetelmässä osiossa. BxPC-3-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin 2, 4 ja 24 tuntia. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 3) kolmen riippumattoman kokeen. * Tilastollisesti erilaisia ​​verrattuna ohjaus (

P 0,05

) analysoituna yksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferronin post-hoc-testi.

(E) ja (G) B-ilmentäminen katalaasin ja GPx1 määritettiin immuno- BxPC-3-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 150 uM kapsaisiinin varten osoitettu aika. Kukin blotti oli riisuttu ja uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta tasapuolisen Proteiinilisäyksen. Nämä kokeet suoritettiin kolme kertaa itsenäisesti ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin.

ektooppinen ekspressoituminen katalaasi suojaavat soluja kapsaisiini välittämää ROS ja apoptoosin

Koska havaitsimme, että kapsaisiini välittämä ROS , mitokondriovaurioita ja apoptoosin voitiin vähentää katalaasi tai EUK-134, halusimme seuraavaksi onko ektooppinen ilmaus katalaasi voi suojata soluja kapsaisiini välittämän vaurioita. Me transfektoitiin soluihin katalaasiliuokseen ilmentävät plasmidilla ja pystyivät saavuttamaan noin 1,6 kertainen yliekspressio katalaasin verrattuna vektorisäädön (Fig. 9A). Lasku katalaasin ilmentämisen kapsaisiini hoito on estetty soluissa, jotka on transfektoitu katalaasin (Fig. 9A). Lisäksi katalaasi yli ilmentävät BxPC-3-solujen täysin tukossa yhteensä ROS sukupolvi, jonka kapsaisiini ja suojasi soluja apoptoosin verrattuna kapsaisiini käsitelty vektorin transfektoiduissa soluissa (Kuva. 9B-C). Vapauttamista sytokromi c: n ja lohkaisu kaspaasi-3 oli myös täysin tukossa soluissa yli-ilmentävät katalaasia (Fig. 9A). Kuviossa.