Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hallitsematon leviämisen, keskeiseksi syöpäsolujen usein laukaisee toimintahäiriön solusyklin sääntelyviranomaisten kuten proteiinikinaaseiksi. Äskettäin solusyklin liittyvä proteiini kinaasien on tullut houkuttelevia kohteita syövän hoitoon, koska niillä perustavanlaatuinen rooli solujen lisääntymistä. Kuitenkin proteiinikinaasi kohdistettuja lääkkeitä, joita on kehitetty tähän mennessä eivät näytä vaikuttavan kliinisiä tuloksia ja myös näyttää vakavia sivuvaikutuksia; Siksi on epäilemättä tarpeen tutkia uusia lääkkeitä kohdistaminen muiden proteiinikinaasien, jotka ovat kriittisiä solusyklin etenemisen. Vaccinia liittyvä kinaasi 1 (VRK1) on mitoosi kinaasi, joka toimii solusyklin säätelyssä fosforyloimalla solusyklin liittyviä alustoille kuten este-to-autointegration kerroin (BAF), histoni H3, ja cAMP vaste-elementin (CRE) sitoutuvilla proteiini (CREB). Tutkimuksessamme havaitsimme luteoliinia kuin estäjä VRK1 seulomalla pienimolekyylinen luonnollinen yhdiste kirjasto. Täällä me arvioitiin tehoa luteolin kuin VRK1 kohdistetun estäjä kehittää tehokas anti-cancer strategiaa. Olemme vahvisti, että luteoliini vähentää merkittävästi VRK1-välitteisen fosforylaation solusyklin liittyvät substraattien BAF ja histoni H3, ja sitä on vuorovaikutuksessa katalyyttinen domeeni VRK1. Lisäksi, luteoliinia säätelee solusyklin etenemistä moduloimalla VRK1 aktiivisuutta, mikä johtaa suppression syöpäsolujen proliferaation ja apoptoosin induktio. Näin ollen meidän tutkimus osoittaa, että luteoliini aiheuttama VRK1 inhibitio voi edistää perustaa uusi solusyklin kohdistetun strategian syövän hoitoon.

Citation: Kim YS, Kim SH, Shin J, Harikishore A, Lim JK Jung Y, et ai. (2014) Luteolin vaimentaa Cancer Cell Proliferation by Targeting Vaccinia-Related Kinase 1. PLoS ONE 9 (10): e109655. doi: 10,1371 /journal.pone.0109655

Toimittaja: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 02 syyskuu 2014; Julkaistu: 13 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki relevent tiedot ovat paperi- ja sen suppoting Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Research Foundation of Korea (NRF) (2013-056085), Next-Generation Biogreen 21 Program (nro PJ009503), maaseudun kehittäminen hallinto, Korean tasavalta. Tätä työtä tukee myös Brain Korea 21 ohjelma Korean opetus-, tiede- ja teknologia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimien syntyyn liittyy häiriöstä solunjakautumisen, joka laukaisee usein puutteita säätelyssä proteiinin modulaattorit että kriittisiä rooleja solusyklin tarkastuspisteitä ja eteneminen [1]. Niiden proteiinien, jotka muodostavat solusyklin koneita, viime terapeuttiset strategiat ovat yrittäneet hyödyntää kohdistaminen useita solusyklin proteiinikinaasien parantaa lääkeaineen selektiivisyyttä ja terapeuttinen tehokkuus [2], [3]. Näin ollen, kuten solusyklin liittyvät proteiinikinaaseja ovat houkuttelevia kohteita syövän hoidossa, koska ne ovat olennaisen toimintojen ohjaamiseksi solujen kasvua. Esimerkiksi pienimolekyylisiä inhibiittoreita DNA-vaurio tarkistuspisteen proteiineja Chk 1 ja 2, joiden tarkoitus on aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin aikana interphase [4] – [6]. Lisäksi jotkut mitoosi-inhibiittorit kohdistuvat sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) perhe, Aurora-kinaasien, ja Polo kaltaisia ​​kinaasien on kehitetty provosoida haitattu mitoottisiin merkintä, mitoosi pidätys, ja mitoosi katastrofit aiheuttamalla puutteita kromosomi tiivistymistä, kromosomi linjaus, kara muodostumista, ja karan kokoonpano tarkastuspiste [1] – [3]. Useita lupaavia estäjät, kliinisiä tutkimuksia on jo tehty kehittämään uuden luokan syöpälääkkeet. Kliinisessä tutkimuksessa vaiheet, valitettavasti, niiden kliinisestä tehokkuudesta eivät osoittaneet merkittäviä tuloksia, vaan herättivät rajoitettu vastauksia tai jopa odottamattomia vakavia sivuvaikutuksia [3]. Kuitenkin tehokas esto tiettyjen vaiheen solusyklin pidetään edelleen arvokkaana strategia syövän hoitoon, siis tunnistaminen romaani, solusyklin-specific, druggable kohdeproteiinit ja kehittää niiden selektiivisiä, jotka saattavat olla potentiaalia tulla kemoterapia-aineita ovat epäilemättä vaaditaan.

tässä suhteessa olemme tutkineet, onko Vaccinia liittyvät kinaasi 1 (VRK1) voisi olla asianmukainen molekyylitasolla mukaisesti solusyklin kohdistaminen strategiaa. VRK1, jossa nimenomaan fosforyloi seriini- ja treoniinitähteitä, on mitoottinen kinaasi, jolla on tärkeä rooli solusyklin etenemistä osallistumalla monenlaisia ​​solunjakautumisen prosessien [7], [8]. VRK1 ilmentyminen on erityisesti runsaasti erittäin lisääntyvät solut, kuten sikiön ja kasvainkudoksissa, ja näyttää pääasiassa taipumus upregulaatioon aikana mitoosi vaiheen solusyklin [9], [10]. G1 /S vaiheita, VRK1 edistää sykliini D1 (CCND1) lauseke indusoimaan G1 /S siirtymisen fosforyloimalla cAMP vaste-elementin (CRE): aa sitova proteiini (CREB) ja siten parantaa sitoutumisaffiniteettia CREB on CCND1 promoottori [11 ]. Lisäksi VRK1 osallistuu ydin- kirjekuoressa (NE) liikkeitä, kuten NE kokoonpano /purkaminen kautta fosforylaation este-to-autointegration kerroin (BAF) aikana välivaiheen ja mitoosin lisäys /poisto [12]. BAF on kromatiinin liittyvä proteiini toiminta linkkinä DNA ja NE [13]. Dynaaminen tila BAF aikana solusyklin etenemisen on tiukasti säännelty VRK1 toimintaa; BAF fosforylaatiota VRK1 stimuloi chromatin vapautumista NE, ja rekrytoi NE liittyviä proteiineja ydinalueen telofaasin aikana hitaasti liikkuvista [12], [14]. Vuonna mitoosi vaiheessa VRK1 vaikuttaa histonimodifikaation fosforyloimalla histoni H3 [10]. Fosforylaatiota histoni H3 Ser10 mukaan VRK1 ja muut useita mitoosi-kinaasien on tunnettu histoni koodi asiakkuutta kromatiinin kondensoituminen mitoosi merkintä tai G2 /M faasimuutoksen. Solusyklissä, VRK1-välitteisen histoni H3 fosforylaation vaikuttaa muiden säätävät. Mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi fosfataasi 2 (MKP2), dual-spesifisyys fosfataasi, joka inaktivoi MAP-kinaasien (MAPK), on merkitystä negatiivisena säätelijänä VRK1 välittämän histoni H3 fosforylaatiota klo mitoosi vaiheessa [15]. Aikana interphase, Macro histoni H2A1.2 (MacroH2A1), joka on ydinhistonin variantti, tukahduttaa lähestymistapa VRK1 on histoni H3 eristämällä [16].

Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet merkitystä VRK1 vuonna prosessi solujen lisääntymisen. VRK1 on kriittinen rooli paitsi somaattisten solujen lisääntymistä, mutta myös sukusolujen kehittämiseen [17], [18]. Lisäksi VRK1 myös tärkeä rooli ylläpito telomere fosforyloimalla hnRNP A1, joka stimuloi telomeraasia ja sitoutuu telomeerivasta DNA-sekvenssin [19]. VRK1 vaaditaan G0 exit, Golgi pirstoutuminen, DNA-vaurioita aiheuttama apoptoosin, ja stressistä, joka tarvitaan ylläpitämään solusyklin etenemisen [20] – [24]. Näin ollen, ottaen huomioon solusyklin liittyvät ominaisuudet VRK1, tunnistaminen VRK1 estäjä vaaditaan syövän hoitomuotoja. Vaikka on raportoitu, että jotkin lääkkeet estä muita proteiinikinaasien voi estää kinaasiaktiivisuutta VRK1 [25], estävä mekanismi ja syövän vaikutukset kautta VRK1 inhibition olivat edelleen vaikeasti.

Tutkimuksessamme olemme seulotaan pienimolekyylinen luonnollinen yhdiste kirjasto ja tunnistettiin luteoliini (3 ’, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone) kuin pienimolekyylisiä estämään VRK1 kinaasiaktiivisuutta. Luteolin on luonnollisesti esiintyvä flavonoidi, joka on yleisesti jaettu kasveissa ja on hyvin tiedetään toimivan voimakas antioksidantti [26]. Perinteisessä Aasian korjaustoimenpiteitä, luteolin-runsas yrttejä on käytetty perinteisiä lääkkeitä hoitoon monia sairauksia kuten kivuliaita sairauksia, tulehdussairaudet, verenpainetauti ja syöpä [27]. Nykyään monta riviä todisteet ovat osoittaneet lukuisia farmakologisia vaikutuksia luteoliini, mukaan lukien syövän, anti-tulehdus, ja anti-allergia toimintaa [27], [28]. Vaikka on todettu, että syövän ominaisuuksia on luteolin liittyy pro-apoptoottiset vaikutukset, antiproliferatiivisia vaikutuksia, ja angiogeneesin estäminen ja etäpesäkkeiden, molekyylitason mekanismeista sen syöpälääkkeen toimintaa ei ole täysin selvitetty [29] , [30].

Täällä vahvisti, että luteolin näyttää vähensi fosforylaatiota solusyklin liittyvä alustoille histoni H3 ja BAF, ja sitä vuorovaikutuksessa VRK1, erityisesti telakointi sen katalyyttinen domeeni. Lisäksi olemme osoittaneet, että luteoliini voivat aiheuttaa solusyklin pysähtymisen estämällä VRK1 kinaasiaktiivisuutta, johtaa suppression syöpäsolujen kasvua ja apoptoosia. Siksi ehdotamme, että luteolin on estäjä VRK1, joka on yksi hyviä ehdokkaita syövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Luteolin oli analyyttisen laatua ja ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Eupatilin ja Wogonin hankittiin Dr. Baek Lab in Kyung-Hee University. Nämä yhdisteet valmistettiin DMSO: hon (Sigma-Aldrich). [

32P-γ] ATP ostettiin Perkin Elmer /NEN (Waltham, MA, USA) ja yhdistelmä-histoni H3 ostettiin Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Muut yhdistelmä-DNA-proteiinit, kuten glutationi sulfotransferaasien (GST), GST-VRK1, GST-aurora-kinaasin B (AURKB) ja His-BAF ilmennettiin

E. coli

(BL21) ja puhdistettiin affiniteettikromatografialla. Lamin B, glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja GST-vasta ostettiin Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA) ja histoni H3 fosfo-Ser10 vasta-aine hankittiin Abcam (Cambridge, UK) ja niitä vastaan ​​histoni H3, fosfo-CREB ja CREB saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). VRK1 ja fosfo-BAF (lahja Robert Craigie, NIH, USA) vasta kertyi kanin puhdistetuilla VRK1 proteiineja. Hoechst 33342 ostettiin Sigma-Aldrich. CNBr-Sepharose 4B ostettiin Sigma-Aldrich.

Soluviljely ja transfektio

BEAS-2B-soluja saatiin ATCC (Manassas, VA). Aiemmin kuvattu HeLa [31], HEK293A [16], SH-SY5Y [32], U2OS [32], ja A549 [31] soluja käytettiin tässä tutkimuksessa. Ihmisen kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja HeLa, ihmisen sikiön munuaisen solulinjan HEK293A, ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja BEAS-2B ja ihmisen neuroblastoomasolulinja SH-SY5Y kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Ihmisen luusarkoomasolulinja U2OS ja ihmisen keuhkojen adenokarsinooman A549 kasvatettiin RPMI 1640 väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. Nämä solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2: ta. Ohimenevä transfektio HeLa ja U2OS soluja suoritettiin käyttäen MP-100 microporator (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan.

proteiinikinaasi määrityksessä

in vitro kinaasin määritys suoritettiin menetelmien mukaisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla [31]. Lyhyesti, in vitro -kinaasimäärityksessä suoritettiin kinaasi, joka sisälsi GST-VRK1, GST-AURKB, His-BAF, histoni H3, ja [32P-γ] ATP: tä. Kinaasimääritys seoksia inkuboitiin 30 ° C: ssa 30 minuutin ajan ja radioaktiivisen inkorporaatio havaittiin autoradiografialla. Määrät proteiineja käytetään kinaasimääritykset mitattiin käyttäen hopeanitraattia (Sigma-Aldrich) tai Coomassie-sinisellä (Sigma-Aldrich).

solunelinkykyisyysmääritys

Soluja käsiteltiin 24 h tai 48 h flavonoideja (luteoliini, eupatilin, ja wogonin) tai dimetyylisulfoksidi (DMSO) kontrollina. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-diphenyltetarazolium bromidia (MTT) mukaan valmistajan protokollaa. Puolen maksimaalinen estävä pitoisuus (IC50) määritettiin käyttäen Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA).

Luteolin-Sepharose 4B valmistelu ja in vitro avattavassa määritys

Sepharose 4B helmi jauhe suspendoitiin aktivointi ratkaisu kytkentäreaktiota. Aktivoitu Sepharose 4B inkuboitiin kytkimen ratkaisu luteolin pyörivässä ravistelijassa 4 ° C: ssa yön yli. In vitro kaatamaan määritys, GST-VRK1 ja GST inkuboitiin luteolin-Sepharose 4B helmiä reaktioliuosta 12 tuntia. Proteiinit helmiin sitoutunut analysoitiin immunoblottauksella. Suoritimme yksityiskohtaiset menettelyt, joita on kuvattu aiemmin [33].

pintaplasmoniresonanssilla (SPR) määritys

kineettiset parametrit vuorovaikutuksen VRK1 ja luteoliini arvioitiin SPR määrityksellä käyttäen automaattinen SR7500DC järjestelmän (Reichert Technologies, Depew, NY, USA). Valmistelua varten VRK1-konjugoitu kulta siru, VRK1 immobilisoitiin CMDH siru (# 13206066), ja sitten luteoliini, eupatilin ja wogonin injektoitiin pinnalle siru ilmoitettuina pitoisuuksina, laimennettiin 10 mM fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS ), joka sisälsi 1% DMSO: ajopuskuria. Analyysi kerättyjen tietojen suoritettiin scrubber2 ohjelmisto (BioNavis, Tampere, Pirkanmaa, Suomi).

Ligandi telakointi määritys

homologiamalli kehitetty röntgen- rakennetta VRK1 palkattiin arvioida molekyylien vuorovaikutus ja sitoutumispaikan äskettäin tunnistettu VRK1 johtaa. Esillä olevassa tutkimuksessa mallin rakenne oli energiaa minimoidaan 5000 vaiheiden viehätys voimakenttäkilpiä ja konjugaattigradienttimenetelmä Discovery Studio 3.0 suite [34]. 3-D koordinaatit luteolin valmistettiin käyttämällä Valmista Ligandin moduuli ja energiaa minimoidaan 2,000 vaiheet käyttäen Smart minimizer algoritmin Discovery Studio 3.0 suite. Molekyyli- telakka-ohjelma GOLD 5,0 käytettiin arvioimaan sitova moodin VRK1 johtaa. Aiemmat NMR sitoutumista koskevat tutkimukset ovat tunnistaneet keskeiset tähteitä, jotka eivät häirityn ligandin sitova; näitä käytettiin määrittämään aktiivisen [34]. Oletusasetukset ja pisteytysfunktioita, GOLD PLP ja GOLD pisteytyksen toiminto, käytettiin pisteet telakointi vuorovaikutukset ja niiden todennäköinen telakoinnin tila sitovia.

Virtaussytometria määritys

solusyklin analyysi, HeLa-solut transfektoitiin GFP, GFP-VRK1, GFP-BAF ja sitten käsiteltiin DMSO: ssa (vehikkeli) ja 10 uM luteoliinia. Sen jälkeen solut kiinnitettiin 70% etanolilla, joka sisälsi 0,4% Tween-20 ja värjättiin propidiumjodidilla PBS: ssä. Solusyklin ja solun DNA: n sisältö analysoitiin virtaussytometrialla on FACSCalibur-virtaussytometriä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Tietojen hankinta suoritettiin Cell Quest-ohjelman (BD Biosciences). Apoptoosin analyysiä, HeLa-soluja käsiteltiin luteolin pitoisuudesta riippuvaisella tavalla ja kaksinkertainen värjättiin propodium jodidi- ja anneksiini-V allofykosyaniini. Solut analysoitiin virtaussytometrialla.

immunofluoresenssi

HeLa-soluja transfektoitiin punainen fluoresoiva proteiini (RFP), RFP-VRK1, GFP, ja GFP-BAF käyttäen mikroporaatio, ja sitten käsiteltiin 10 uM luteolin 24 tuntia. Sen jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan ja blokattiin 10% FBS PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solut värjättiin Hoechst 33342 PBS: ssä 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja tarkastella myös konfokaali laser-skannaus mikroskoopilla (Fluoview FV1000, Olympus, Tokio, Japani). HeLa-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman luteolin (10 uM) 24 tunnin ajan. Myöhemmin teimme yksityiskohtaiset menettelyt, joita on kuvattu, ja sitten solut värjättiin lamiinivektori B-vasta-aineen ja katsella esimerkiksi Zeiss fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss Oy, Jena, Saksa) tai konfokaali laser-skannaus mikroskoopilla.

kvantitatiivinen käänteistranskriptio (RT) -PCR-

kokonais-RNA HeLa-solut valmistettiin käyttäen TRI ainetta (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) valmistajan ohjeiden ja käänteistranskriptoitiin sitten tuottaa komplementaarinen DNA. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green PCR-seos (Takara Bio Inc., Shiga, Japani) ja reaaliaikainen ilmaisin-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA USA). GAPDH taso käytettiin normalisoimaan transkriptipitoisuuksissa.

Tulokset

Luteolin on voimakas estäjä VRK1 kinaasiaktiivisuuden

tutkia luteolin voitaisiin tehokkaasti estää entsyymiaktiivisuuden VRK1, teimme

in vitro

kinaasimääritys ja verrattiin estäviä vaikutuksia luteolin kanssa muiden flavonoidi-kaltaisia ​​yhdisteitä. Luteolin inhiboi merkittävästi VRK1-välitteistä fosforylaatiota BAF ja histoni H3 annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi automaattinen fosforylaation aktiivisuus VRK1 heikennettiin käsittelemällä luteolin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1A ja B). Vaikka eupatilin ja wogonin, flavonoidi kaltaisia ​​kemiallisia yhdisteitä, jotka osoittavat rakenteellista samankaltaisuutta luteolin (Fig. 1 C), heikosti estävät VRK1 kinaasiaktiivisuutta (Fig. 1 D ja E), luteolin osoitti näkyvin estävät vaikutukset BAF fosforylaatioon ja VRK1 auto-fosforylaation , mikä viittaa spesifisyyden luteolin. Spesifisyys luteolin varten VRK1 varmistettiin lisäksi sen normalisoitu estävät vaikutukset BAF fosforylaatioon ja VRK1 automaattisen fosforylaatiota (Fig. 1 F ja G). Nämä tulokset osoittavat, että luteoliinia on voimakas inhibiittori VRK1 kinaasiaktiivisuuden, joka vaaditaan modulaation solusyklin etenemisen.

(A) ja (B),

in vitro

kinaasiaktiivisuuden mittauksia ja VRK1 kanssa BAF (A) tai VRK1 kanssa histoni H3 (B) suoritettiin käyttäen kasvavia pitoisuuksia luteolin (0,0, 1,0, 10, 50, 100, ja 250 uM), ja sen jälkeen VRK1 ja alustan proteiinit värjättiin hopeanitraatilla. (C), kemialliset rakenteet ja molekyylipainot luteoliini, eupatilin, ja wogonin. (D) ja (E),

in vitro

kinaasin määritys VRK1 kanssa BAF suoritettiin lisäämällä pitoisuuksina (0,0, 1,0, 10, 50, 100, ja 250 uM) eupatilin (D) tai wogonin ( E), ja sitten VRK1 ja BAF proteiinit värjättiin hopeanitraatilla. (F) ja (G), kvantifiointi VRK1 auto-fosforylaatiota (F) tai BAF fosforylaatio (G) on kuvattu (B), (D) ja (E). Data in (F) ja (G) ovat keinoja kolmen erillisen kokeen ± SEM.

Luteolin suoraan vuorovaikutuksessa VRK1

Koska luteolin tukahdutti toiminnan VRK1 kohti alustoille, me hypoteesi, että luteolin saattavat estää kinaasiaktiivisuutta suoraan sitoutumista VRK1. Tutkia vuorovaikutusta luteolin ja VRK1 teimme avattavasta määritys käyttäen luteolin-konjugoituja sefaroosihelmet. GST ei voi sitoa joko luteolin konjugoidun Sepharose helmiä tai kontrollipallojen. Kuitenkin, GST-VRK1 onnistuneesti sidottu luteoliini-konjugoidun Sepharose-helmiä, mutta ei sitoudu ohjata helmiä, joita ei ole konjugoitu luteolin (Fig. 2A). Me seuraavaksi suoritetaan alasvetopiiri määrityksessä SH-SY5Y solulysaateista tarkastaa onko luteolin sitoutuu endogeeniseen VRK1 lisäksi rekombinantti VRK1 (Fig. 2B). Endogeeninen VRK1 voi myös sitoutua luteoliini-konjugoidun Sepharose-helmiä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että luteolin suoraan vuorovaikutuksessa VRK1

in vitro

.

(A), Avattava määritys käyttäen luteolin konjugoitua Sepharose 4B tai ohjaus Sepharose 4B rekombinantilla VRK1 proteiinia. Puhdistettu GST ja GST-VRK1 proteiineja inkuboidaan osoitetulla helmiä, ja vedä alaspäin määritys suoritettiin. Jokainen proteiinit havaittiin immunoblottauksella GST vasta-aineella. (B), Avattava määritys käyttäen luteolin konjugoitu Sepharose 4B kanssa SH-SY5Y solulysaattia. Solulysaatti inkuboidaan osoitetulla helmiä, ja sitten avattavan suoritettiin. Proteiinit havaittiin immunoblottauksella VRK1 vasta-aineella. (C), SPR tunnistus vuorovaikutuksen luteolin kanssa VRK1. Tiedot saatiin kineettinen titrausmenetelmä kanssa peräkkäin ruiskuttamalla analyyttien ilman regenerointia vaiheita. Tiedot eupatilin ja wogonin saatiin klassisilla menetelmillä.

suora vuorovaikutus luteoliini- ja VRK1 analysoitiin edelleen käyttämällä pintaplasmoniresonanssin (SPR) seurata sitova kinetiikka. Rekombinantti VRK1 proteiinit kovalenttisesti immobilisoitu sensorisirun ligandina; sen jälkeen, luteoliini, eupatilin ja wogonin lisättiin pitoisuudesta riippuvalla tavalla kuin analyytin (Fig. 2C). Kineettisten parametrien vuorovaikutuksen välillä VRK1 päällystetty anturi siru ja näiden analyyttien arvioitiin ohjelmiston ja esitetään taulukossa 1. Laskettu vakioita näiden analyyttien kohti VRK1 näytteille, että luteoliinia on eniten vahva sitoutumisaffiniteetti joukossa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että luteoliini sitoutuu suoraan VRK1 kanssa suuri sitoutumisaffiniteetti.

inhiboiva vaikutus luteolin välittää sen suoran sitoutumisen, että katalyyttinen domeeni VRK1

määrittää sitovan alueen VRK1 varten luteolin, vuorovaikutusta luteoliini- ja VRK1 arvioitiin NMR titraus kokeiluja ja

in silico

mallintamiseen. Aminohappotähteet vaikuttanut vuorovaikutus luteolin osoitti dramaattisesti lisääntynyt kemiallinen muutos häiriöitä (Fig. 3A). Nämä tähteet ovat edustettuina kirjo kemiallinen muutos häiriöistä ja myös osoitetaan molekyylitasolla kartalla VRK1 (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että nämä jäämät sijaitsevat pääasiassa lähellä katalyyttisen domeenin, joka on mukana ATP: n sitoutuminen [34].

(A), NMR-titraus suoritettiin kokeita. Spectrum kemiallisen siirtymän häiriöitä vastaan ​​aminohappotähdettä on VRK1 proteiinin sitoutumisen jälkeen ja luteoliinia. (B), kartoitus kemiallisen siirtymän häiriöitä on VRK1 proteiinia. Useimmat häirityn tähteet (esitetty punaisella) sijaitsevat lähellä katalyyttisen domeenin VRK1. (C),

in silico

mallintaminen sitoutumispaikan luteoliinia on VRK1 proteiinia. Luteolin ennustetaan sovi läheisyydessä G-silmukka, katalyyttinen sivusto, ja α-C koru.

in silico

mallintaminen sitoutumispaikan luteoliini kohti VRK1 , luteolin ennustetaan sovi läheisyydessä G-silmukan, katalyyttinen päällä, ja α-C lohko (Fig. 3C). 2, 3-dihydroxyl ryhmä, jolla on 2-fenyyliryhmä on kromee- telineen vuorovaikutuksessa E83 tähteen α-C koru. Edelleen 2-hydroksyyliryhmä myös vuorovaikutuksessa D 197 tähteen katalyyttisen silmukka. Samoin 4-keto-ryhmästä kromee- rakennusteline vuorovaikutuksessa S181 kautta vetyä liimaus vuorovaikutusta. 7-hydroksyyliryhmään on kromeeni telineen tekee myös vetysidoksia vuorovaikutusta I43 ja Q45 jäämiä G-silmukka. Näiden vetysidoksia vuorovaikutuksia, The kromeeni tukirakenne on myös vahva pinoaminen hydrofobinen vuorovaikutus F48 jäännös G-silmukan ja hydrofobiset tähteet ympäröivästä aktiivisen (ei esitetty). Luteolin on suurimman osan avaimen vuorovaikutuksia G-silmukan ja katalyyttinen tähteet, jotka lujasti vakauttaa luteolin molekyylin aktiivisen ja estää sen kinaasiaktiivisuuden.

luteoliini indusoi solusyklin pysähtymisen kautta estämällä BAF fosforylaation by VRK1

Luteolin on aiemmin osoitettu indusoivan solusyklin pysähtymisen G1 /S ja G2 /M-vaiheen siirtymiä [35] – [39]. Kuitenkin molekyylimekanismi solukierron pidättäneet luteolin on tuntematon, lukuunottamatta sitä, että Aurora B-kinaasi saattaa olla molekyylitasolla luteolin säädellä solusyklin etenemisen, näyttöön perustuen, että Aurora B estyy luteoliini- ja sillä on rooli keskeinen välittäjä mitoosi etenemisen [40]. VRK1 on toinen mitoottinen kinaasi, joka on tunnettua suorittaa koordinoida rooleja solusyklin etenemisen fosforylaation useita solusyklin liittyviä substraattien, kuten BAF, histoni H3, ja CREB [10] – [12]. Siten arvioimme onko luteolin indusoi solukierron pysähtymisen estämällä VRK1. PI-värjättyjen solujen käsiteltiin DMSO: ssa tai luteoliini analysoitiin virtaussytometrialla arvioimiseksi solusyklin. Käsittelemällä luteolin, väestön G1 vaiheessa lisääntyi merkitsevästi verrattuna DMSO-käsitellyissä soluissa (kuvio. 4A, vasen paneeli). Sitä vastoin lisääntynyt G1-vaiheen väestön hävisivät yliekspressio GFP-merkityn VRK1 (kuvio 4A, oikea paneeli), mikä osoittaa, että luteoliinia aiheuttaa pidätys alkuvaiheessa solukierron estämällä VRK1.

( A), Cell cycle analyysi suoritettiin virtaussytometrialla. HeLa-solut, jotka on transfektoitu GFP tai GFP-VRK1 käsiteltiin luteolin 24 tuntia, ja 10000 solut porteilla analyysiä varten. Määrällisiä tietoja ovat alle histogrammit. (B) ja (C), HeLa-solut vehikkeliä tai luteolin värjättiin lamiinivektori B-vasta visualisoida ydinvoiman kirjekuori ja Hoechst 33342 on visualisoitu DNA. Alexa 488 väriaine-konjugoitua vasta-ainetta käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Kalvot visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla (B), tai CLSM (C). (D), fluoresoiva värjäytyminen VRK1, BAF, ja DNA-analyysiä varten fosforylaation-välitteisen uudelleen lokalisoinnin BAF. -Solut ko-transfektoitiin GFP tai GFP-BAF kanssa RFP tai RFP-VRK1 käsiteltiin DMSO: ssa tai 10 uM luteolin 24 tuntia.

Kuten edellä on mainittu, VRK1 osallistuu fosforylaatioon-välitteisen uudelleen lokalisointi BAF sytoplasmaan, kromatiinin kondensaatio kautta histoni H3 fosforylaation, ja CCND1 ekspression CREB helpottamiseksi solusyklin etenemisen [10] – [12]. Selittää tarkemmin mekanismia solusyklin pysähtymisen by luteoliini aiheuttama häiriö VRK1 toimintaa, voimme arvioida, onko luteolin häiritsee näitä prosesseja. Koska on osoitettu, että VRK1 parantaa ilmaus CCND1, joka korreloi G1 /S etenemistä, lisäämällä aktiivisuus CRE elementin CCND1 promoottorin fosforyloitu CREB sitova, me arveltu, että CREB ja mRNA taso CCND1 voi vaikuttaa luteolin hoitoa. Kuitenkin, ei ollut merkittäviä eroja CREB ja mRNA taso CCND1 välillä DMSO ja luteoliini hoito (Fig. S1), mikä tarkoittaa, että luteolin aiheuttama G1 /S pidätys on saattanut olla seurausta vikoja muissa prosesseissa sijaan tukahduttamista CREB.

seuraavaksi testasimme mahdollista osallistumista BAF G1 /S pidätyksen aiheuttama luteolin. Vuonna

Drosophila

ja

C. elegans

, se on vakiintunut, että BAF on perustavanlaatuinen rooleja järjestämisestä ydin- rakenteen ja solusyklin etenemisen [13], [41]. Lisäksi ydinvoiman lokalisointi BAF vaikuttaa solusyklin etenemisen ihmisen soluissa; VRK1 ainoa tunnistetut ylävirtaan kinaasi BAF, voi muuttaa BAF lokalisointi fosfory- aiheuttavan vapauttamista BAF sekä DNA ja LEM-verkkotunnuksen proteiineja, kuten Lap2, emerin, ja Man1 [12], [14], [31], [42]. VRK1 välittämä BAF re-lokalisointi on olennainen prosessi DNA vapautumista aikana G1 /S siirtyminen. Havaitsemiseksi häiriöiden aiheuttamat luteolin ydinalan kirjekuoressa dynamiikka solusyklin etenemistä, meillä värjättiin ydinvoima kirjekuoressa tumalevy B-vasta-aineen. Lamin B irrotetaan kromatiinin mitoosissa kuitenkin menetys VRK1 tai ilmentymisen BAF mutantin häiritsee chromatin erottamista NE [12], [42], [43]. Havaitsimme onko tumalevy B ei hajallaan käsittelyllä luteolin. Tumalevy B vapautui sytoplasmaan myöhään Anaphase esitetyn ajoneuvojen käsiteltyjä soluja, kun taas lamiinivektori B on juuttunut kromosomeihin samassa vaiheessa, kuten on esitetty luteolin käsiteltyjä soluja (Fig. 4B), mikä viittaa siihen, että luteolin aiheuttama VRK1 esto häiritsee VRK1-välitteisen BAF fosforylaation.

lisäksi olemme edelleen havainneet, että luteoliini aiheuttama epänormaali ydin- kirjekuoren morfologia, kuten invagination ja rakkulan (Fig. 4C), joka on ilmiö, joka on indusoitu ehtyminen VRK1 [44] . Niinpä ehdotamme, että luteolin välittämää vaimennus BAF fosforylaation voisi johtaa VRK1 ehtyminen aiheuttama epänormaali ydinvoiman morfologioita. Sen vahvistamiseksi, että luteolin häiritsee VRK1 välittämän BAF fosforylaation, havaitsimme fosfori-BAF tasolla käyttäen immunoblottauksella. Fosfo-BAF taso laski 10 uM luteolin saaneista solulysaatti (Fig. S2), mikä osoittaa, että VRK1 katalyyttinen aktiivisuus vähenee luteolin

in vivo

.

Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että kohdunulkoinen ilmaus VRK1 tuloksia BAF uudelleen lokalisointi sytoplasmaan [12], [31]. Niinpä tutki tarkemmin, onko ilmiö BAF uudelleen lokalisointi vaikuttivat luteolin estoa VRK1. Kun molemmat RFP-VRK1 ja GFP-BAF otettiin käyttöön yhdessä, BAF näytti hajallaan solu, kuten on raportoitu aiemmin [31]. Olemme kuitenkin vahvistanut, että tämä ilmiö oli häiriintynyt käsittelemällä luteolin (Fig. 4D). Lokalisointi GFP-BAF on rajoitettu nucleoplasm huolimatta VRK1 yliekspressio viittaa siihen, että luteoliinia hoito vähentää tehokkaasti BAF fosforylaation estämällä VRK1, jonka jälkeen solusyklin pysähtymisen. Jotta voidaan tutkia roolia BAF aikana solusyklin, analysoimme DNA sisällön jälkeen luteolin hoidon. Kohdunulkoinen ilmaisi BAF ei vaikuta solusyklin etenemisen (kuvio. S3A). Kun luteolin hallinto, kohdunulkoinen ilmaisi BAF voinut pelastaa luteolin aiheuttama G1 kertymisen (Fig. S3B), mikä viittaa siihen, että luteolin aiheuttama G1 pidätys ei ole johtanut mukaan BAF esto mutta estämällä VRK1 välittämän BAF fosforylaation.

luteolin indusoi alentunut solujen elinkelpoisuuden ja sitä seuraavan apoptoosin

Kun estävää vaikutusta luteolin välittää sitoutuminen katalyyttinen domeeni VRK1 vahvistettiin, arvioimme sen tuumorin vastaista vaikutusta kasvainsolujen proliferaatiota ja eloonjäämistä. Vaikutukset luteolin solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määritystä eri pitoisuuksina. Havaitsimme, että luteoliini hoito vähensi kasvua kasvaimia solulinjoja HeLa ja U2OS verrattuna ei-tuumorigeenisiä solulinjoja BEAS-2B ja HEK293A (Fig. 5A). IC

50-arvot HeLa ja U2OS solut määritettiin 15,41 uM ja 36.35 uM, kun taas ne, BEAS-2B ja HEK293A solut kasvoivat moninkertainen verrattuna tuumorigeenisia soluihin (74,41 uM ja 263,3 uM) . Tämä tulos osoittaa, että inhiboiva vaikutus luteolin soluproliferaatioon on voimakkaampi tuumorigeenisiä soluja kuin ei-tuumorigeenisiä soluja, vaikka VRK1 proteiinin taso solulinjoissa ei korreloi kasvainten muodostumiseen (Fig. S4). Lisäksi luteolin estää solujen elinkelpoisuuden HeLa-solujen ajassa riippuvalla tavalla (kuvio. 5B).

(A), vaikutukset luteolin solujen elinkelpoisuuden tuumorigeenisiä (HeLa ja U2OS) ja ei-tuumorigeenisiä (BEAS-2B ja HEK293A) solulinjat.