Krooninen sairaus

tiivistelmä

varhainen havaitseminen virtsarakon syöpä (BCA) on keskeinen onnistuneen potilaiden hoitoon ja hallintaan. Kautta genomista ja proteomiikka tutkimuksissa olemme tunnistaneet useita virtsarakon syöpään liittyvien biomarkkerit, jotka ovat potentiaalisia kliinistä hyötyä. Eräässä tapauskontrollitutkimuksessa, selvitimme huokoiset virtsoissa 127 aiheista: 64 kasvain aiheita ja 63 valvontaa. Virtsa pitoisuudet seuraavia proteiineja arvioitiin entsyymi-immunologinen määritys (ELISA); C-C-motiivi kemokiini 18 (CCL18), plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori 1 (PAI-1) ja CD44. Tiedot verrattiin kaupalliseen ELISA-pohjainen BCA detektiomäärityksen (BTA-Trak ©) ja mitätöity virtsan sytologia. Käytimme analyysi pinta-ala käyrän receiver operating ominaiskäyrät verrata kykyä CCL18, PAI-1, CD44, ja BTA havaita BCA huokoiset virtsanäytteistä. Pitoisuus virtsassa CCL18, PAI-1, ja BTA merkittävästi koholla henkilöillä, joilla BCA. CCL18 oli tarkin biomarkkereiden (AUC; 0,919; 95%: n luottamusväli [CI], +0,8704-0,9674). Monimuuttuja regressioanalyysi korostettu CCL18 (OR; 18,31; 95% CI, 4,95-67,70,

p

0,0001) ja BTA (OR; 6,43; 95% CI, 1,86-22,21,

p

= 0,0033) itsenäisiksi ennustajia BCA mitätöidään virtsanäytteistä. Yhdistelmä CCL18, PAI-1 ja CD44 parantaa pinta-ala käyrän to0.938. Alustavat tulokset osoittavat, että CCL18 oli erittäin tarkka biomarkkeri BCA havaitsemiseksi tässä kohortissa. Seuranta CCL18 in mitätöity virtsanäytteistä on mahdollista parantaa noninvasiiviset testit BCA diagnoosia. Lisäksi käyttämällä yhdistelmää CCL18, PAI-1 ja CD44 voidaan tehdä mallia vakaampi virheiden havaitsemiseen BCA yli yksittäisten biomarkkerit tai BTA.

Citation: Urquidi V, Kim J, Chang M, Dai Y, Rosser CJ, Goodison S (2012) CCL18 on Multiplex Virtsa-Based määritys Detection virtsarakon syöpään. PLoS ONE 7 (5): e37797. doi: 10,1371 /journal.pone.0037797

Editor: Konradin Metze, University of Campinas, Brasilia

vastaanotettu 26. tammikuuta 2012 Hyväksytty: 28 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 21, 2012

Copyright: © 2012 Urquidi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusmäärärahat National Cancer Institute RO1 CA116161 (SG), Florida Department of Health James ja Esther kuningas Team tiedepalkinto 10kt-01 (CJR), lentoemäntä Medical Research Institute (CJR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Charles J. Rosser, Steve Goodison ja Virginia Urquidi ovat työntekijöitä Nonagen Bioscience Corp. kirjoittajat patentteja virtsarakon syöpään allekirjoitus. Ei ole niin kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

varhainen havaitseminen virtsarakon syöpä (BCA) parantaa merkittävästi todennäköisyyttä onnistuneen potilaan hoidon ja hallinta. Kehittäminen molekyyli määrityksiä, joita voidaan diagnosoida sairaus tarkasti, tai joka voi lisätä nykyisten menetelmien arvioinnin, olisi merkittävä edistysaskel. Molekyylikerros määritys, joka oli sovellettavissa ei-invasiivisesti saatu kehon nesteiden, helpottaisi paitsi diagnoosi vaarassa potilaiden, mutta myös oireeton seulonta, seuranta sairauden toistuminen ja hoitovasteen mukaan. Kynnyksellä kehittynyttä proteomiikka ja genomiikka teknologioiden ja niihin liittyvien bioinformatiikan kehitys, tuo nämä tavoitteet esiin.

Kultakanta diagnosoimiseksi BCA liittyy kystoskopialaitteita tarkastelu virtsarakon yhdessä koepala ja patologisen arvioinnin virtsarakon vaurion. Mitätöidään virtsan sytologia (VUC) pysyy go-ei-invasiivisia lisänä kystoskopian havaitsemiseen BCA. Vaikka VUC on spesifisyys 93%, sen herkkyys on melko synkkä 25-40%, erityisesti matala-asteista ja matalan vaiheen kasvaimista [1], [2]. Tarve tarkempi virtsan biomarkkereiden havaitsemiseksi BCA on ilmeinen. Useita molekyyli- testit on kehitetty havaita virtsarakon kasvaimet, mukaan lukien virtsarakon kasvaimen antigeeni (BTA) [3], ydin- matriisin proteiini 22 (NMP-22) [4], ImmunoCyt ja Urovysion [5]. Valitettavasti koska niiden rajallinen herkkyys ja /tai spesifisyys, mikään näistä määrityksistä ovat osoittautuneet riittävän tarkkoja korvata kystoskopiaa tai VUC. Siten ei ole olemassa virtsa-pohjainen BCA testit, hallitsevat kentän tasalla. Riittämätön voima yhden biomarkkereiden saattaa osittain selittää, miksi havaitsemiseksi BCA käyttäen virtsa-analyysin edelleen haaste. Tarvitaan evoluutio kohti testit, seurata useita biomarkkereita, jotta saavutetaan haluttu diagnostinen tarkkuus.

Kynnyksellä uuden korkean suoritustehon genomi- ja proteomiikka tekniikoita ajaa biomarkkereiden löytö eteenpäin, ja olemme palkanneet näitä tekniikoita sarjassa kokeet [6], [7], [8], josta olemme peräisin sekä nukleiinihappo- ja proteiinin biomarkkereiden paneelit, jotka helpottavat ei-invasiivisia havaitseminen BCA ennennäkemättömän tarkasti. Lisäksi valinta ja validointi 14 proteiineja proteomic tutkimuksista, ja jonkin verran proteiinia tuotteita Genomisen allekirjoitusta, perustui tilastollisiin sijoitusta yhdessä BCA, ja saatavuus kaupallinen ELISA. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko valvonta joidenkin näiden tavoitteiden avulla immuunipohjaiset detektiomäärityksiä voisi vahvistaa mahdollinen kliininen hyöty ei-invasiivisia diagnostinen testi. Käyttäen ELISA-määritykset, me seurataan kolme tavoitetta proteiineja (CC motiivi kemokiini 18, CCL18; plasminogeeniaktivaattori estäjä 1, PAI-1, ja CD44) virtsanäytteistä peräisin kohortin 127 aiheita, ja verrataan diagnostisia suorituskykyä että saadaan käyttämällä kaupallista BTA -Trak määritys ja VUC.

tulokset

Väestörakenteen, kliiniset ja patologinen ominaisuudet kohortti on esitetty taulukossa 1. Ainoastaan ​​28% syövän kohortin oli positiivinen VUC taas VUC spesifisyys oli 98 %. Virtsan CCL18 ja PAI-1 olivat havaittavissa useimmissa aiheista ilman näyttöä BCA. Sekä BTA ja CD44 havaittiin näytteissä sekä kasvain ja kontrolliryhmiin. Tarkoittaa virtsan tasoa (taulukko 2) ja CCL18 (637,39 pg /ml vs. 4,81 ug /ml,

p

0,0001), PAI-1 (6,82 ng /ml vs. 0,06 ng /ml,

p

0,0001), ja BTA 1630,55 U /ml vs. 14.54 U /ml,

p

0,0001) olivat merkitsevästi suurempi koehenkilöillä, joilla BCA kuin potilailla, joilla ei ole näyttöä BCA. Virtsan keskimääräinen CD44 kohosi henkilöillä ilman BCA verrattuna koehenkilöihin, BCA (117,22 ng /ml vs. 53,09 ng /ml,

p

0,0001). ELISA tiedot esitetään boxplot kuvassa (kuva 1).

Kyky Testin biomarkkereiden ennustaa läsnäoloa BCA analysoitiin käyttämällä nonparametric ROC-analyysit, mukaan National Cancer Institute suuntaviivat [9]. Perustuen alla oleva pinta-ROC-käyrän (AUROC), päätimme Youdenin Index raja-arvot maksimoida summa herkkyys ja spesifisyys. Virtsan CCL18 oli tarkin biomarkkereiden jossa ala käyrän alainen 0,919 (95% CI: +0,8704-,9674). Youdenin Index cutoff-arvo (kuvio 2), virtsan CCL18 jos herkkyys on 88%, spesifisyys 86%, positiivinen ennustearvo 86% ja negatiivinen ennustearvo 87%. PAI-1 oli epätarkempi biomarkkeri BCA tunnistus (AUC: 0,686; 95% CI: 0,6119-0,7601). Youdenin Index cutoff-arvo (kuvio 2), virtsan PAI-1 analyysit paljastivat herkkyys on 42%, spesifisyys on 100%, positiivinen ennustearvo 100% ja negatiivinen ennustearvo on 63%. Kohonneita virtsan CD44 eivät olleet osoitus BCA (AUC: 0,488; 95% CI: +0,383-+0,5937). BTA toimi myönteistä viitteenä määritys ja todettiin olevan AUROC on 0,818 (95% CI: ,74-,90, kuva 2). Youdenin Index kynnysarvon, virtsan BTA edellyttäen herkkyys on 80%, spesifisyys 84%, positiivinen ennustearvo 84% ja negatiivinen ennustearvo 80%.

Tulokset on normalisoitu virtsan kreatiniinia. Mediaani tasot kuvataan vaakasuorilla viivoilla. Merkitys (

p

0,05) arvioitiin Wilcoxonin rank sum test.

Perustuu ala ROC-käyrän (AUROC), Youdenin Indeksi raja-arvot maksimoisi summa herkkyys ja spesifisyys määritettiin kullekin biomarker (timantti). Taulukossa tarkastaminen kullekin biomarkkereiden.

monimuuttuja regressioanalyysimme että oikaistu vaikutukset iän ja rodun, kohonnut CCL18 (OR: 18,31; 95% CI: 4,95-67,70;

p

0,0001), kohonnut BTA (OR: 6,43; 95% CI: 1,86-22,21;

p

= 0,0033) ja vähensi virtsan tasot CD44 (OR: 0,039; 95% CI: 0,004 -0,35;

p

= 0,0036) liittyivät BCA mitätöidään virtsanäytteistä (taulukko 3).

Kuten edellä todettiin, yksi biomarkkerit jäävät se ei ottanut huomioon monimutkaisuus heterogeeninen kasvainten näin multiplex määritys tunnistaa paneelin biomarkkereiden voi osoittautua hyödylliseksi. Hyödyntämällä Youdenin Index raja-arvot CCL18, PAI-1 ja CD44, nämä biomarkkerit yhdistettiin ja analysoitiin (kuvio 3). Yhdistelmä CCL18, PAI-1 ja CD44 (käyrän alapuolinen alue: 0,938) saavutti herkkyys 86%, spesifisyys 89%, positiivinen ennustearvo 89% ja negatiivinen ennustearvo 86%.

keskustelu

Käyttämällä uusia lähestymistapoja [6] – [8], olemme tunnistaneet alustavan diagnostinen allekirjoitus 14 biomarkkereiden liittyvien BCA. Tässä tutkimuksessa raportoimme havainnot kolme näistä 14 biomarkkereiden.

Perustuu ala ROC-käyrän (AUROC), Youdenin Indeksi raja-arvot, joka maksimoi summa herkkyys ja spesifisyys määritettiin . Tiedot sisällä luku tarjoavat suorituskykyä arvoja. PPV, positiivinen ennustearvo. NPV, negatiivinen ennustearvo.

Lisääntynyt virtsan tasoa CCL18, PAI-1, ja BTA, liittyivät merkittävästi läsnäolo BCA. Vuonna univariate analyyseissä, CCL18 osoittautui markkeri useimmat liittyvät BCA (AUC; 0,919; 95% CI, 0,8704-0,9674), joiden kokonaispituus positiivinen ennustearvo 86% ja negatiivinen ennustearvo 87%. Monimuuttuja regressioanalyysi korostettu CCL18 (OR; 18,31; 95% CI, 4,95-67,70,

p

0,0001), BTA-Trak © (OR; 6,43; 95% CI, 1,86-22,21,

p

= 0,0033) ja CD44 (OR; 0,039; 95% CI, +0,004-0,35, p = 0,0036) itsenäisinä muuttujia havaitsemiseen BCA mitätöidään virtsanäytteistä. Kokonaispituudeltaan tarkkuus 92%, CCL18 ylitti selvästi muita biomarkkerit, kuten BTA, kun kohdeproteiini BCA havaitsemista virtsa-analyysi. Sisällyttäminen ylimääräisiä markkereita (esim PAI-1 ja CD44) ja multiplex paneeli ei saa lisätä ennusteita merkittävästi (AUC 0,919 vs. 0,938), mutta niiden lisäksi voidaan tehdä mallia vakaampi virheitä mikä kuvaa hyöty multiplex-määritys diagnosoida BCA.

CCL18 on jäsen sytokiiniperheen eritettyjen proteiinien mukana immunosäätely- ja tulehduksellisten prosessien. CCL18 arvellaan edistää invasiivisuus syöpäsolujen laukaisemalla integriini klustereiden ja parantaa niiden noudattamista soluväliaineen, ja reseptori (PITPNM3) tämän sytokiinin on äskettäin tunnistettu [10]. Valikoima sytokiinien ja niiden reseptorien tiedetään poikkeuksellisesti ilmaista kasvainsoluissa, joten on mahdollista, että CCL18 voi toimia parakriinisellä tavalla aikana kasvaimen aloittamisen /laitoksessa. Biomarkkerina on pahanlaatuinen sairaus, CCL18 on raportoitu olevan osoitus munasarjojen [11], [12] ja kohdunkaulan syöpä [13]. Proteomiikka lähestymistapa tunnistettu seerumin CCL18 kuten korreloi munasarjasyöpä, ja tämä havainto validoitiin käyttäen ELISA 535 näytettä. Yhdessä CXCL1, CCL18 seurantaa ylitti CA125 kuin kiertävä munasarjasyövän biomarkkereiden [12]. Tutkimuksessa analysoidaan ero geeniekspression 33 kiinteässä kudosnäytteistä tunnistettu CCL18 yhdeksi kaksikymmentä transkriptien merkitsevästi yliekspressoitu invasiivisen kohdunkaulan syövistä [13].

PAI-1 on jäsen serimiproteinaasi estäjä superperheelle ja on pääasiallinen inhibiittori kudoksen plasminogeeniaktivaattori (tPA) ja urokinaasi (uPA), jolloin se säätelee fibrinolyysin [14]. PAI-1 pidetään monitoiminen proteiini, joka voi myös moduloida kasvainsolujen kasvua ja muutto angiogeneesi ja solun adheesion [15], [16]. Tulokset eri ihmisen syövissä ovat osoittaneet, että tasot tPA tai uPA ovat merkittävästi suurempia syöpäkudoksessa suhteessa vastaavassa normaalissa kudoksessa [17] – [19]. Hudson

et

al.

Raportoitu, että sekä ei-invasiivisia ja invasiivisen ihmisen BCA solulinjat tuottavat PAI-1 [20], ja kohonnut PAI-1-geenin ja proteiinin ilmentymistä kudoksissa ja plasmassa on havaittu BCA potilailla, joilla on huono ennuste [21]. Tutkimuksessa, seuranta- PAI-1 kudoksissa, seerumissa ja virtsassa, huomattavasti korkeampi kudoksissa ja seerumissa korreloi huonoon ennusteeseen, mutta tämä ei ole totta virtsasta PAI-1 [21]. Tutkimuksessamme etsimme läsnäolon BCA, ja ei pitänyt ennustetta. Pystyimme osoittamaan, että virtsan PAI-1 on merkittävästi kohonnut potilailla, joilla oli BCA (6,82 vs. 0,06,

p

0,0001) kuitenkin Monimuuttuja-analyysissä, PAI-1 ei olisi itsenäinen ennustaja BCA. PAI-1 ei voi olla tehokas stand-alone biomarkkeri BCA havaitsemiseen, mutta lisätutkimuksia tarvitaan määrittää, jos se tuo lisäarvoa useiden biomarkkereiden paneelit.

Useat tutkimukset ovat tutkineet CD44 biomarkkerina syövän, mukaan lukien BCA. CD44 on läsnä kaikissa läpäisevä glykoproteiini, joka voi olla vuorovaikutuksessa eri ligandeja, esimerkiksi hyaluronihappoa disyntaasit, ja on osallisena solu-vuorovaikutuksiin, soluadheesiota ja muuttoliike [22]. Selostukset Tämän geenin läpi monimutkainen vaihtoehtoisen silmukoinnin seurauksena lukemattomia mRNA ja proteiini-isoformit kanssa toiminnallisen monimuotoisuuden, ja tämä vaikeuttaa päästä yhteisymmärrykseen joista CD44 tavoitteet ovat voimassa biomarkkereita. Klatten

et

al.

Osoittaneet poissa CD44v6 ilmentyminen poistetun kudos on itsenäinen haitallinen ennustaja BCA toistuminen ja eloonjäämiseen [23], ja yli-ilmentyminen CD44V8-10 vuonna hilseillyttä urothelial solut on raportoitu olevan riippumaton prognostisia ennustaja potilailla, joilla on BCA [24]. Olemme aikaisemmin kehittäneet sandwich-ELISA-määrityksessä, joka mittasi CD44v6 proteiinin isoformi proteiinin urothelial solulysaateista. Eräässä tutkimuksessa 65 tapausta, sandwich-ELISA-määrityksessä saavutti 81% herkkyys ja 100% spesifisyyttä BCA diagnoosia [25]. Mukaisesti nämä toteamukset, tutkimus pystyi yhdistämään liukoinen CD44v6 mRNA syöpäpotilaan virtsaan BCA [26]. Meidän urothelial solu profiloinnin ja validointitutkimuksessa [7] vahvistavat, että valvonta CD44 selostukset voivat olla kliinisessä arvioinnissa, mutta liukenee virtsan CD44-proteiini ei näytä lupaavalta diagnostinen biomarkkereiden.

Tiedämme, että tutkimuksemme on useita rajoitukset. Ensin kolmannen asteen hoitolaitoksessa, meillä on taipumus nähdä enemmän korkea-asteen, korkea-vaiheessa tauti, mikä näkyy tutkimuksessamme kohortissa. Vahvista luotettavuutta CCL18, myöhemmät tutkimukset on arvioitava suurempi ikäluokkien jotka sisältävät potilailla, joilla on matala-asteista, matala-vaiheen tauti. Toiseksi, jalostettu, kallisteta virtsoissa analysoitiin. Virtsassa sentrifugoitiin ja erotettiin solupelletti ja supernatantti ennen varastointia -80 ° C: ssa. On mahdollista, että juuri mitätöity virtsanäytteistä voi antaa erilaisia ​​tuloksia, ja se on raikas virtsa että olisi käytetty materiaali point-of-care määrityksissä. Tutkimme parhaillaan suorituskykyä valittujen biomarkkereiden virtsoissa käsitellään kautta useita eri protokollia, kuten tuoretta mitätöidään virtsoissa. Seuraavaksi herkkyys VUC meidän kohortin pääasiassa korkealaatuisesta (aste 3) sairaus (28%) oli pienempi kuin olisi odotettavissa. Tämä asettaa kyseenalaiseksi tunnetut välinen tarkkailija vaihtelu tulkinnassa VUC. Seuraavina tutkimuksissa, me käyttää kahta cytopathologists tulkita näitä tuloksia. Lisäksi on epävarmaa, kuinka proteiinin koostumus virtsan supernatantin voi muuttua jäädytetty varastoinnin. Määrä jäädytys-sulatus-syklien pidettiin 1-2 jakamalla virtsan supernatantti useita pieniä eriä. Lopuksi meidän otoskoko 127 on pieni ja kaksi ryhmää, jotka kuuluivat 127 aiheita olivat suhteellisen homogeenisia, eli joko aktiivisia syöpä, tai ohjaus tapauksissa ole aktiivisia syöpää, ei ollut syöpää, ei virtsatieinfektio, ei virtsakivitauti, eikä brutto hematuria. Näin emme voineet arvioida herkkyys /spesifisyys meidän biomarkkereiden eri vaiheissa /laadut. Spesifisyys lupaavia biomarkkerit kuten CCL18 on testattava ikäluokat, joiden tiedetään olevan ongelmallisia muiden virtsa perustuvissa määrityksissä (esim hematuria, virtsatieinfektio, kivet ja virtsaamisen toimintahäiriö). Kun kehitämme diagnostinen molekyyli allekirjoituksia ja valita tiettyjä tavoitteita nukleiinihappoon perustuvia tai immuuni-pohjaisen määrityksen kehittämiseen, meidän havainnot vahvistetaan suurissa, mahdollisille ja monikeskustutkimus yhteistyöhön vaiheen 2 ja 3 tutkimuksissa koostuu aiheista paitsi BCA, vaan virtsatieinfektio, virtsakivitauti, brutto hematuria ja virtsaamisen oireista.

kehitys virtsa-pohjainen virtsarakon syöpä biomarkkereita olisi paljon hyötyä sekä potilaiden että terveydenhuollon järjestelmiä. Olemme osoittaneet alustavassa tutkimuksessa, että kohonnut virtsan pitoisuus CCL18 proteiinin on vahvasti sidoksissa läsnäolo BCA. Lisäksi yhdistelmä CCL18, PAI-1 ja CD44 saa lisätä ennakoivan valtaa CCL18 merkittävästi, mutta saattavat tehdä mallin vakaampi virheitä. Suuremmat, mahdollisille tutkimuksia tarvitaan määrittämään mahdollista roolia CCL18 arvioinnissa potilaat, jotka ovat vaarassa BCA.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja näytteen käsittely

Under MD Anderson Cancer Center Orlando Institutional Review Board hyväksyntä ja tietoisen kirjallisen suostumuksen, mitätöity virtsanäytteitä, ja siihen liittyvät kliiniset tiedot otettiin takautuvasti talteen. Tutkimus kohortti koostui 63 yksilöiden ole aiempaa urothelia syöpä, brutto hematuria, aktiivinen virtsatietulehdus tai virtsakivitauti, ja 64 yksilöiden äskettäin diagnosoitu urothelial karsinooma. Potilaat, joiden tiedetään munuaissairaus tai dokumentoitu munuaisten vajaatoiminta ei ilmoittautunut. Kansainvälisen konsensuksen paneelin Virtsarakon kasvainmerkkiaineet [27], tämä kohortti toimi toisen vaiheen (validointi tutkimus). Raportoidaan käyttäen Stard kriteerien [28]. Meidän syöpä ryhmässä, aksiaalinen kuvantaminen vatsan ja lantion ja kystoskopia tehtiin, ja uroteelisyövässä vahvistettiin histologinen tarkastelu poistetun kudoksen. Olennaisia ​​tietoja potilaan kliinisen tilan lavastus, histologista arviointia [29], [30] ja tulos rekisteröitiin (taulukko 1).

Ennen tahansa terapeuttisen intervention, 50-100 ml mitätöidään virtsaa saatiin kunkin kohteen. Viisikymmentä millilitraa virtsaa käytettiin kliinisen laboratorion analyysit per vakiomenettelyjä. Jäljellä virtsa alikvootti annetaan yksilöllinen tunnistenumero ennen välittömästi laboratorioon käsittelyä. Kukin virtsanäytteen sentrifugoitiin 600 x g 4 ° C: ssa 5 min. Supernatantti dekantoitiin ja annosteltiin, kun taas virtsan pelletti jäädytettiin. Sekä supernatantti ja pelletti säilytettiin -80 ° C: ssa ennen analyysiä. Alikvootteja virtsa supernatantit sulatettiin ja analysoitiin proteiinipitoisuus käyttämällä Pierce 660 nm Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen NanoDrop spektrofotometrillä (ND-1000, ThermoScientific, Wilmington, DE, USA).

Virtsa perusteella Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) B

tasot ihmisen CC-motiivin kemokiini 18 (CCL18), joka tunnetaan myös nimellä CCL18 (Cat # ab100620 Abcam, Cambridge, MA, USA), ihmisen plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori 1 (PAI-1, Cat # EA-0207 Signosis Inc., Sunnyvale, CA, USA), ja CD44 (Cat # ab 45912 Abcam, Cambridge, MA, USA) seurattiin virtsanäytteistä käyttäen entsyymi-immunologinen määritys. Kaupallisesti saatavilla ELISA-määrityksiä käytettiin myös tason mittaamiseksi virtsan hemoglobiinin (Cat # E88-135 Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA), ja BTA (BTA-Trak © Ca # 662150 Polymedco Inc. Cortlandt Manor, NY, USA ). Lukijat Näiden määritysten sokaisi siitä taudin tilasta. Kaikki määritykset tehtiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kalibrointikäyrät valmistettiin käyttäen puhdistettua standardeja kunkin proteiinin arvioitu. Käyrän sovitus toteutettiin joko lineaarisia tai neljän parametrin logistinen regressio valmistajan ohjeita noudattaen.

Kreatiniinin määritys

kreatiini muuttuu ei-entsymaattisesti metaboliitin kreatiniinin, joka diffundoituu vereen ja erittyy virtsaan munuaisten vakionopeudella. Niinpä virtsan kreatiniini on hyödyllinen työkalu normalisoida tasoa muiden molekyylien virtsassa [31], [32]. Alustavat tulokset (ei esitetty) osoittivat, että johtuen verivirtsaisuus (mikroskooppinen tai brutto verta virtsassa), joka sisältää kohonneet proteiineja, proteiini ei olisi hyvä merkkiaine normalisointia. Näin ollen pitoisuudet kaikkia seurattiin proteiinien (CCL18, PAI-1, CD44 ja BTA) normalisoitiin virtsan kreatiniinin ja näiden pitoisuuksien on raportoitu suhteena suhteessa virtsan kreatiniinin arvoja. Kreatiniinin määritys suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (Cat # KGE005 R 0,05 ja kaikki raportoidut

p

arvot olivat 2-puolinen. Kaikki analyysit suoritettiin SAS-ohjelmiston versioon 9.1.3.

Kiitokset

Kirjoittajat ovat kiitollisia 127 henkilöitä, jotka osallistuivat tähän kliinisessä tutkimuksessa.