Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant glykosylaatio on yhteinen piirre monissa maligniteetteja kuten paksusuolen ja peräsuolen syöpiä (CRC). Noin 15% CRC osoittavat mikrosatelliittimerkki epävakaus (MSI) fenotyyppi, joka liittyy korkean taajuuden bialleelisten lukukehysmutaatioita vuonna A10 koodaus mononukleotidi mikrosatelliittimerkkien että

transformoiva kasvutekijä beeta reseptori 2

(

TGFBR2

) geeni. Jos ja miten heikentynyt TGFBR2 signalointia MSI CRC soluissa vaikuttaa solun pinnalla glykaani rakenteessa on paljolti hyödyntämättä. Tässä käytimme TGFBR2 puutosta MSI koolonkarsinoomasolulinja HCT116 mallina järjestelmän. Stabiilien kloonien annetaan doksisykliiniä (DOX) indusoitavissa ilmentymistä yhden kopion villityypin

TGFBR2

siirtogeenin tuotettiin rekombinaasin välittämää kasetin vaihto (RMCE). Kaksi itsenäistä kloonia, DOX-indusoituvan ilmentymisen villityypin TGFBR2 proteiinin ja käyttökuntoon sen signaloinnin toiminto on esitetty. Metabolinen leimauskokeiden käyttämällä tritioidun siaalihapon esiaste

N

asetyyli-D-mannosamiinia (ManNAc) paljasti merkittävän supistumisen (-30%) ja sen sisällyttäminen syntetisoituneeseen sialoglycoproteins on TGFBR2 riippuvaisesti. Erityisesti olemme havainneet huomattavasti pienempään sialyloiduilla SS1-integriini upon rekonstruoitu TGFBR2 signalointia, joka ei vaikuttanut SS1-integriini proteiinin liikevaihdon. Erityisesti TGFBR2 Liuottamisen ei vaikuttanut transkriptipitoisuuksissa jonkin tunnetun ihmisen sialyylitransferaasien tutkittaessa reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että käyttövalmiiksi TGFBR2 signalointia käytettäessä isogeenisestä MSI solulinjassa malli järjestelmä voi moduloida sialyloituminen solupintaproteiinien kuten SS1-integriiniä. Lisäksi meidän malli järjestelmä on sopiva paljastaa taustalla molekyylitason mekanismeja muuttaa MSI kasvaimen glykobiologiaan.

Citation: Lee J, Ballikaya S, Schönig K, Ball CR, Glimm H, Kopitz J, et al. (2013) transformoivan kasvutekijän beeta-reseptorin 2 (TGFBR2) Muutokset Sialylaatio in mikrosatelliittimerkki Epävakaa (MSI) peräsuolen syövän Cell Line HCT116. PLoS ONE 8 (2): e57074. doi: 10,1371 /journal.pone.0057074

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 17 marraskuu 2012; Hyväksytty: 17 tammikuu 2013; Julkaistu: 27 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tarjosi DFG (GE592 /6-1) JK ja J.G. ja DFG (KFO 227) ja C.R.B. ja HG Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin 15% perinnöllinen ja satunnaista Kolorektaalituumorien näyttää suurtaajuisen mikrosatelliitti epävakaus (tässä kutsutaan MSI) fenotyyppi. MSI ilmentyy pituus muunnelmia useita lyhyitä toistuvat sekvenssit (mikrosatelliitit) aiheuttama menetys normaalia DNA mismatch korjaus (MMR) toiminto näissä kasvainsoluissa. Jos MSI vaikuttaa koodaavan mikrosatelliitteihin on ilmaissut geenien tuloksena lukukehysmutaatioita johtaa ennenaikaisiin translaation päättymisestä ja heikentynyt proteiinien toimintaa [1] – [3]. Suuri määrä geenejä kätkeminen mikrosatelliitteihin niiden koodaavat alueet on tunnistettu ja todettu usein vaikuttaa lukukehysmutaatioita MSI Kolorektaalituumorien [4] – [7]. Mutaatiot rajoitettu määrä näiden geenien uskotaan ajaa MSI kasvaimien syntyyn.

TGFBR2

on yksi mielenkiintoinen MSI kohdegeenien, koska se on osa avaimen signalointireitin paksusuolen epiteelisolujen ja todettu inaktivoitua korkealla taajuudella bialleelisen lukukehysmutaatioita MSI Kolorektaalituumorien [8]. TGFBR2 on transmembraaninen seriini-treoniini-kinaasi, joka kykenee tukahduttamaan proliferaatiota ja indusoi apoptoosin ja erilaistumisen laukaisee transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-ß) aktivointi [9] – [11]. Kun ligandin TGF-SS1 muodostumista hetero-tetrameerinen reseptorin kompleksin, joka koostuu tyypin 1 (TGFBR1) ja tyypin 2 (TGFBR2) reseptorit on aloitettu ja loppupään proteiineja, kuten Smad2 ja Smad3 tullut fosforyloitu [10], [12] . Nämä fosforyloitu Smad proteiinit sitten liittää Smad4 ja kun translokaation tumaan suoraan transkription eri kohdegeenien, kuten

Smad7

[13] tai

SERPINE

[14].

Monet proteiineja, varsinkin solunpintaproteiinit, ovat glykosyloituja ja vaativat glykaanin muutoksia, jotta antaa normaalia toimintaa solussa viestintä, tunnistaminen ja tarttuvuus. Lisäksi muuttaa solun pinnan glykosylaatiota on tuumorigeneesiin ja etäpesäkkeiden [15] – [17]. Paksusuolen syöpä, mRNA: n ekspressio eri glykosyylitransferaaseja havaittiin lisääntynyt verrattuna vastaavassa normaalissa paksusuolen limakalvon [18], [19]. Lisäksi, fukosyloitu- solupinnan proteiinien on myös liitetty syövän [20]. Fukosyylitransferaasit liittyy muodostumiseen kasvaimen antigeenien, kuten sialyyli-Le

x ja -Le

[21]. Sialihappo on avaintekijä glykoproteiinien ja on korreloinut etäpesäkkeitä [22]. Eri asemointi siaalihapon solun pinnalla johtaa verhota tai paljastumisen erityisten sakkarideja, jotka ovat tärkeitä etäpesäke [23]. On osoitettu, että siaalihapon korreloi

in vivo

tumorgenicity CRC solulinjassa HCT116 [24].

SS1-integriini on yksi jäsen suuren proteiinin tartuntareseptorien proteiinien tiedetään voidaan sialylaatioaste. Integriinit ovat glykoproteiineja, jotka muodostavat hetero- dimeerisiä komplekseja α- ja ß-alayksiköistä annetaan eri ligandia taipumuksia. Koska signalointi integriinien on mukana useissa keskeisissä solun toiminnoissa, kuten polttoväli tarttuvuus ja liikkuvuus, heikentynyt integriinin signalointia on liitetty syövän etäpesäkkeiden [25], [26]. On raportoitu, että sitovat lektiinin SNA sialoidun SS1-integriini on lisääntynyt paksusuolen kasvainkudoksessa verrattuna normaaleihin paksusuolen epiteelin [27]. Lisäksi, de-sialylaatiota SS1-integriinin on osoitettu stimuloivan sen sitoutumista glykoproteiineja soluväliaineen [28], [29].

Vaikka TGFBR2 signalointi on osallisena solu-solu-viestintä, soluadheesion ja solun Siirtolaisuutta rooli tämän reitin glykosylaatiomallissa solupinnan proteiinien on suurelta osin tutkimaton. Kokeellinen näyttö viittasi mahdollisen yhteyden mutatoitunut MSI kohdegeenien ja glykosylointimalli solun pinnalla [30]. Tässä tutkimuksessa käytimme TGFBR2 käyttövalmiiksi saattamista MSI peräsuolen syövän solulinja HCT116 mallina järjestelmän analysoida TGFBR2 riippuvan muutoksia proteiinin glykosylaation. Olemme havainneet lasku globaalissa sialyloituminen juuri syntetisoidun proteiinien siten kääntäen heijastaa lisääntynyt sialylointia havaittu ensisijainen Kolorektaalituumorien. Erityisesti olemme määritelleet TGFBR2 signaloinnin modulaattorina sialylaation tasot SS1-integriini.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit

S2F-cLM2CG-FRT3 [31] sisältää tet-ohjattu kaksisuuntainen transkriptio yksikkö samanaikainen sääntelyn kaksi reportterigeeneistä firefly

lusiferaasin

ja punaista fluoresoivaa proteiinia

mCherry.

ekspressiokasetti on reunustaa kaksi hetero-erityistä FLP-tunnustusta sivustoja, mutatoitu F3 ja villityypin F sivustolla [32]. Retroviruksen kokoonpano, käytimme vektorit pVPack-GP ja pVPack-VSV-G (Stratagene). Rekombinaatio välittyy entsyymi Flpo-rekombinaasia, jota koodaa plasmidi pCAGGS-Flpo-IRES-Puro saatu Michael Hahn (DKFZ, Heidelberg). Plasmidi pE11.F3.HygTK.F [31], joka koodaa hygromysiini B fosfotransferaasigeeni-tymidiinikinaasin (HygTK) translaation fuusioproteiinia käytettiin antibiootti valinta ja sukupolven HCT116- HygTK master solulinjassa. Retrovirusvektori S2F-cLM2CG-FRT3-TGFBR2 muodostettiin monistamalla PCR: llä villityypin

TGFBR2

cDNA ekspressioplasmidin pcDNA3.1 /His-TGFBR2 [30] käyttäen alukkeita, jotka kuljettavat

EcoRI

tai

NotI

(NEB) restriktiokohtia (taulukko S1) ja korvaaminen

EcoRI Twitter /

Notl mCherry

fragmentti S2F-cLM2CG-FRT3. Todentaminen oikean insertion päällä ja sekvenssi villityypin

TGFBR2

geeni vahvistettiin DNA-sekvenssianalyysillä.

Cell Lines

Kaikkia solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä (PAA) täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää Gold (PAA) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA) käyttäen vakio-olosuhteita. Vanhempien CRC solulinja HCT116 on ostettu European Collection of Cell Cultures (ECACC). Tämä MMR-solulinjaan esittelee MSI fenotyypin ja on tehonnut TGF-ß-välitteisen signaloinnin takia bialleelisten lukukehysmutaatioita vuonna A10 koodaus mikrosatelliittimerkkien endogeenisen

TGFBR2

geeni. HCT116 AWE17 (HCT116-Tet-On) solulinja on pysyvästi transfektoitu johdannainen vanhempien HCT116-solulinjaa annetaan konstitutiivista ilmentymistä käänteisen transkription transaktivaattoria (rtTA) ja EGFP-proteiinia [33]. HepG2 solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina Smad2 signalointi. 293T-solut saatiin ATCC: stä. Signalointia kokeissa soluja ilman ravintoa 17 tuntia, kun läsnä ja poissa ollessa 1 ug /ml DOX (Sigma) ja sen jälkeen inkuboitiin 10 ng /ml yhdistelmä-DNA-TGF-SS1 (Cell Signaling) 1 h. Transfektio suoritettiin kokeita käyttäen Fugene HD transfektion mukainen reagenssi valmistajan ohjeiden (Roche). Antibiootti valinta suoritettiin käyttäen hygromysiini B (Hyg, 100 ug /ml, PAA), puromysiiniä (1,5 ug /ml, Sigma) ja gansikloviirin (Gan, 40 uM, Roche) ja osoitetut vaiheet.

Generation HCT116-TGFBR2 Cells

Olemme hakeneet retrovirus- lähestymistapa kuvattu aiemmin [31]. Lyhyesti, 10

6 293T-solut ko-transfektoitiin 3 proviruksen plasmideilla [34], [35]. 10

5 HCT116-Tet-On-solut (-30% konfluenssi) infektoitiin MOI 0,01 ja 0,05 varmistaa yhden kopion virus integraatio. Onnistuneesti transdusoiduissa HCT116-Tet-On-soluja indusoitiin 0,2 ug /ml DOX ja mCherry-positiiviset solut seulottiin ja eristettiin FACS (On-Off-On). Yhden mCherry-positiiviset solut valittiin kloonilaajenemisen (HCT116-mCherry). Ensimmäisessä rekombinaation vaiheen (RMCE), 5 x 10

5 HCT116-mCherry solut ko-transfektoitiin 6-kuoppalevyille 2 ug pE11.F3.HygTK.F plasmidi kuljettaa Hyg-TK-ekspressiokasetin reunustaa kaksi rekombinaatiokohdat (F3 /F) ja 2 ug pCAGGS-Flpo-IRES-Puro (kuvio 1A). Tuloksena HCT116-HygTK master solukloonien, jotka ovat Hyg kestäviä ja herkkiä Gan (Hyg

r, Gan

s), tehtiin toinen RMCE johtaa HCT116-TGFBR2 klooneja että siirrettävä DOX-indusoituvaa ilmentymistä TGFBR2 ja lusiferaasi samanaikaisesti (kuvio 1A). Kvantitointi DOX-indusoituvan ilmentymisen tasot määritettiin Lusiferaasimäärityksiä.

(A) Kaavamainen ääriviivat rekombinaation välittämää kasetin vaihto (RMCE). Retroviruksen transduktio suoritettiin käyttäen provirus- vektori S2F-cLM2CG-FRT3, joka sisältää kaksisuuntaisen DOX-indusoituva promoottori (P

tetbi) mahdollistaa samanaikaisen ilmentymisen kahden merkkiaineen geenien (

lusiferaasin

ja

mCherry

) in HCT116-mCherry klooneja. Expression kasetteja reunustaa mutantti (F3) ja villityypin Flp-rekombinaasin kohdesivustot (F), jotka mahdollistavat suunnattu kasetin vaihto kautta Flpo-rekombinaasi. Retroviruksen pakkaussignaalin (Ψ

+) ja pitkät terminaaliset toistot (LTR) on osoitettu. (B) karakterisointi viruksen integraation sivustot nrLAM-PCR ja sekvensointi. Vuonna yläosassa, klooni kohdennettua integraatiota sivustoja ja vaikuttaa genomista loci (avoin lukukehys (ORF);

aldehydidehydrogenaasille perhe 1 jäsen L1

(

ALDH1L1

)) on kuvattu. Alaosassa, 5′- ja 3’virus LTR DNA-sekvenssit (pienet kirjaimet) sekä reunustavan genomisen DNA-sekvenssit (isot kirjaimet) esitetään.

PCR ja sekvensointi

Standard PCR suoritettiin käyttäen Hot FIREPol DNA Polymerase (Solis Biodyne) seuraavia sykliolosuhteita: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 15 min; 35 sykliä 95 ° C: denaturaatio 30 s, 60 ° C annealing 30 s, 72 ° C murtovenymä 1 min ja lopullinen venymä vaihe 72 ° C: ssa 2 min. DNA-sekvensointi suoritettiin käyttämällä BigDye Terminator v1.1 sekvensoinnin kittiä (Invitrogen). Analyysi, jotka toteutetaan ABI3100 geneettistä analysaattoria (Applied Biosystems).

Lineaarinen monistus-välitteisen (LAM) -PCR

Genominen DNA uutettiin solulinjat mukaan valmistajan protokollan käyttäen DNeasy Veri Tissue Kit (Qiagen). Myös ei-rajoittavat (nr) LAM-PCR suoritettiin kuten aiemmin kuvattu [36]. Lyhyesti, 1 ug gDNA peräisin transdusoitujen solukloonien käytettiin lineaarisen vektorin monistamisen genomin liittymissä biotinyloidun alukkeen (taulukko S1). Rikastuksen jälkeen monistettujen fragmenttien kautta magneettisia helmiä, toinen DNA-juoste tuotetaan. Ligaation jälkeen tunnetun oligonukleotidia tuntematon osa amplikonien, kaksi sisäkkäistä eksponentiaalinen PCR: t suoritettiin. Edelleen valmistamiseksi näytteiden adapterit lisättiin molempiin päihin amplikonien ylimääräisellä eksponentiaalinen PCR, jotta Roche 454-spesifinen monistaminen ja sekvensointi. Rinnakkaiseen sekvensointi eri näytteiden 6-10 emäsparin viivakoodi käytettiin. 40 ng DNA: ta monistettiin käyttäen seuraavia PCR-ohjelma: alkudenaturaatio 120 s 95 ° C: ssa; 12 sykliä 95 ° C: ssa 45 s, 58 ° C: ssa 45 s ja 72 ° C: ssa 60 s; lopullinen venymä 300 s 72 ° C: ssa. Raaka LAM-PCR-amplikonin sekvenssit erotettiin mukaisesti käyttöön viivakoodin, edelleen leikataan ja tasataan ihmisen genomin käyttäen BLAT (Assembly helmikuu 2009) [37].

lusiferaasimäärityssysteamiä

Lusiferaasiaktiivisuutta mitattiin Luciferase Assay System (Promega) kahtena mukaisesti valmistajan ohjeiden ja normalisoitiin proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä (BioRad).

Western blot -analyysi

solupelletit resuspendoitiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natrium-deoksikolaatti, 0,1% SDS, 0,1 mM CaCl

2 ja 0,01 mM MgCl

2) . Sonikoinnin jälkeen inkuboinnin (1 h, 4 ° C) ja sentrifugoitiin (12000 g, 20 min, 4 ° C) proteiinipitoisuus lysaattia mitattiin Bradfordin menetelmällä. Immunoblottausta, 50 ug proteiinia erotettiin 4-12% Bis-Tris -geeleillä (NuPAGE, Invitrogen), ja säh- köisesti nitroselluloosakalvolle. Blokkauksen jälkeen kalvo 30 minuuttia huoneenlämpötilassa (RT) 5% kuorittu maito /TBST (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,5 M NaCl: a ja 0,1% Tween-20), seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin blokkausliuoksessa: hiiren anti-TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz, 1:500, 4 ° C, yön yli); Hiiren anti-ß-Actin (MP Biomedicals; 1:30,000, RT, 1 h); kanin anti-fosfo-Smad2 (Ser465 /467, Cell Signaling, 1:1000, 4 ° C, yön yli); kaniini-anti-Smad2 (86F7, Cell Signaling, 1:1000, 4 ° C, yön yli). Useiden pesuvaiheiden jälkeen (10 min kukin RT) TBST: ssä, blotteja inkuboitiin toissijaisen vasta-lampaan anti-hiiri-IgG-HRP (1:5000; GE-Healthcare) ja vuohen anti-kani-IgG-HRP: tä (1:2500; Promega) 1 tunnin ajan RT: ssä. Kolmen pesuvaiheet (10 min kukin RT) TBST: ssä, signaalit havaittiin käyttämällä Western Salama Plus ECL (PerkinElmer).

Real-Time RT-PCR

1 ug kokonais-RNA: ta oli eristetty kanssa RNeasy Kit (Qiagen) ja käänteistranskriptio käyttäen oligo-dT-alukkeita ja SuperScript II käänteiskopioijaentsyymin mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen). Reaaliaikaiseen käänteistranskriptio (RT) -PCR kokeissa spesifisiä alukkeita (taulukko S1 ja S2) ja PowerSYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) käytettiin. Kolmena rinnakkaisena eri cDNA näytteiden (-dox vs. + Dox) analysoitiin StepOnePlus termo-PCR-laitteessa (Applied Biosystems), jossa seuraava ohjelma: 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Tiedot analysoitiin StepOne Software v2.1 (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen oli normalisoitu ilmentymisen viitteen geenien

GAPDH

ja

hydroxymethylbilane syntaasi

(

HMBS

).

proliferaatiotestillä

MTS leviämisen määritykset suoritettiin kolmena kappaleena kanssa CellTiter 96 Aqueous kit (Promega) mukaan valmistajan ohjeiden.

sisällyttäminen radioaktiivisen leimatun monosakkaridit

5-10 × 10

4 solua /kuoppa siirrostettiin kolmena kappaleena on 6-kuoppalevylle. 24 tunnin kuluttua solut uudelleen syötettiin 2 ml uutta väliainetta, joka sisälsi 0,185 MBq vastaavien

3H-leimattua sakkaridi (

3H-ManNAc (

N

– [mannosamiini-6-

3H]), [185-370 GBq /mmol] tai

3H-L-fukoosin (L-6-

3H), [1,48-2,22 TBq /mmol], American Radiolabeled Chemicals, Inc.) ja 10 ng /ml TGF-SS1. Soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai poissa ollessa 0,5 ug /ml dox saamiseksi konfluenssiin 60-80%. 72 tunnin jälkeen solut pestiin 3 kertaa PBS: llä ja raaputettiin pois. Soluja sentrifugoitiin 5 min nopeudella 1000 g huoneenlämpötilassa ja pestään PBS: llä. Solupelletti liuotettiin 400 ul: aan 0,2 N NaOH: a 1 tunnin ajan 56 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin Lowry-määrityksellä. 1 ug BSA ja 400 ui 10% TCA lisättiin saostaa proteiinit sentrifugoimalla (10 min, 12000 g, RT) ja poistaa rekisteröimätön leimatun sakkarideja. Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen 400 ul: aan 1 N NaOH: lla ja neutraloitiin 200 ui 2,5 N etikkahappoa ja sekoitettiin 10 ml tuikeseosta (Ultima Gold, PerkinElmer). Näytteet laskettiin käyttäen nestetuikeanalysaattoria (TRI-CARB 2900TR, Packard) ja dpm Mittaukset tehtiin automaattisella sammutus- korjauksen soveltamisessa muuttaneet Spectral indeksi External Standard /Automaattinen Tehokkuus ohjaus (tSIE /AEC) menetelmällä. Tulokset ilmaistiin dpm ja normalisoidaan proteiinin määrä (mg).

radioaktiivinen leimaaminen ja SS1-integriini Immunosaostaminen (IP) B

kaksoisleimausta käyttämällä

35S-L-metioniini [37 TBq /mmol] (American Radiolabeled Chemicals, Inc.) ja

3H-ManNAc, 1-2 x 10

6 solua ympättiin kolmena rinnakkaisena 10 cm levyt. 24 tunnin kuluttua väliaine korvattiin 5 ml uuden median, joka sisälsi 1,11 MBq

3H-ManNAc, 0,37 MBq

35S-L-metioniinia ja 10 ng /ml TGF-SS1. Soluja kasvatettiin läsnä tai poissa ollessa 0,5 ug /ml Dox. 72 tunnin jälkeen solut pestiin 3 kertaa PBS: llä ja raaputettiin pois. Solut sentrifugoitiin 5 min nopeudella 1000 g 4 ° C: ssa ja pestiin PBS: llä. Pelletti suspensoitiin uudelleen 150 ul: RIPA-puskuria. Soluja sonikoitiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, kun taas pyörivä. Kun oli sentrifugoitu 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan 12000 g saatua lysaattia käytettiin määrittämään proteiinin pitoisuus Bradford-määrityksellä. Sillä SS1-integriinin IP, 1,6 mg lysaattia inkuboitiin 1,7 ug SS1-integriini-vasta-aine (P5D2 päässä DSHB, Iowa), jonka tilavuus oli 300 ui 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Kontrollina epäspesifinen sitoutuminen helmiin, kunkin solun klooni inkuboitiin ilman vasta-aineen läsnä ollessa tai poissa ollessa DOX ja laskee vähennettiin tuloksista. 25 ui proteiini-A /G-agaroosin (Oncogene) pestiin 3 kertaa 1 ml: lla RIPA-puskurilla ja inkuboitiin sitten lysaatin ja vasta-aine yön yli pyörittämällä 4 ° C: ssa. Helmet pestiin 5 kertaa 500 ul: RIPA-puskurilla ja eluoitiin 2 x 200 ui 1x proteiinin näytepuskuria (106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris-emästä, 2% SDS: ää, 10% glyserolia, 0,51 mM EDTA) 99 ° C 5 min. Näytteet sekoitettiin 10 ml: aan tuikeseosta ja lasketaan jonka luquid tuikenestettä analysaattorin soveltamalla tSIE /AEC menetelmällä. Tulokset ilmaistiin dpm. Kontrollina epäspesifistä sitova eluointi IP analysoitiin SDS-PAGE ja sen jälkeen värjättiin SYPRO-Ruby (Invitrogen). Samanaikaisesti, vastaavat vyöhykkeet havaittiin Western-blottauksella käyttämällä SS1-integriini-vasta-aine (Cell Signaling) (tuloksia ei ole esitetty). Pulssin-chase kokeessa soluja ympättiin ja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, pulssitettiin 72 h 1,11 MBq:

35S-L-metioniini /5 ml tuoretta väliainetta ja ne koottiin sitten talteen 5 eri ajankohtina (0h, 4h, 8h , 16h, 24h, Chase). Sen jälkeen solut lyysattiin, kuten edellä on kuvattu. 1,5 mg lysaattia inkuboitiin 1,3 ug SS1-integriini-vasta-aineen kokonaistilavuudessa 300 ui RIPA-puskuria ja pyöritettiin 2 tuntia 4 ° C: ssa. Kun oli lisätty proteiini A /G-agaroosin, näytteitä käsiteltiin, kuten edellä on kuvattu.

Tulokset

Generation of Doksisykliini-indusoituvan HCT116-mCherry kloonit

Tutkiakseen TGFBR2- riippuvia muutoksia proteiinin glykosylaation, pyrimme tuottamaan MSI peräsuolen syövän solulinja malli, joka mahdollistaa indusoituvaa käyttökuntoon TGFBR2 ilmaisun käytettäessä isogeenisestä taustalla. Yleensä tämä järjestelmä käänteisesti heijastaa tilannetta ensisijaisen MSI Kolorektaalituumorien jotka ovat menettäneet TGFBR2 ilmaisun aikana syövän etenemiseen. Ensimmäisessä vaiheessa, MSI solulinja HCT116-Tet-On joka ekspressoi konstitutiivisesti DOX-säännelty rtTA [33] oli muuntogeenisen transduktiolla itse inaktivoiva retrovirusten ilmentävien tet-ohjattu lusiferaasi ja mCherry (S2F-cLM2CG-FRT3) at alhainen infektiokertoimella (MOI) suosimiseksi yksi kopio integroitumista. Kvantitatiivinen analyysi stabiilien kloonien tunnistettu kaksi HCT116-mCherry klooneja (# 5 ja # 22), jossa on 40-70-kertainen DOX-säädellään induktio reportterigeenin ilmentymisen määritettynä Lusiferaasimäärityksiä. Tunnistaminen ja molekulaarinen retroviruksen integraation sivustot nrLAM-PCR ja sekvensointi vahvisti, että vain yksi kopio oli lisätty. Integrointi

lusiferaasia mCherry

ekspressiokasetin sijaitsi kromosomeissa 1 (

C1orf159) B varten klooni # 5 ja kromosomissa 5 (

ALDH1L1

) varten klooni # 22, (kuvio 1 B). Vielä tärkeämpää on, integroitu ekspressiokasetit ei muuta kasvua HCT116-mCherry kloonien verrattuna niiden HCT116-Tet-On esisolujen. Jotta suora paikoilleen ja DOX-indusoituva ilmentyminen

TGFBR2

siirtogeenin juuri nämä genomista sivustoja, me harjoittanut kaksivaiheinen strategia (kuvio 1A). Ensimmäisessä rekombinaation vaiheessa

lusiferaasi-mCherry

kasetti korvattiin ekspressiokasetti koodaa Hyg-TK-fuusioproteiinin jolloin syntyy kaksi master solulinjoja HCT116-HygTK # 5 ja # 22, jotka mahdollistavat integraation minkä tahansa geenin kiinnostava näitä kahta genomista loci. Näin ollen meidän korvattu

HygTK

ekspressiokasetin toisessa RMCE jonka

lusiferaasi-TGFBR2

ekspressiokasetin tuloksena HCT116-TGFBR2 kloonien # 5 ja # 22, jotka on karakterisoitu, ja käytetty seuraavien analysointien .

karakterisointi HCT116-TGFBR2 kloonit

Seuraavaksi analysoidaan ja HCT116-TGFBR2 solut tarkemmin. Lusiferaasin analyysi paljasti, että reportterigeeni induktio tasolla, alun perin saatu HCT116-mCherry soluja (40-70-kertainen), on havaittu myös HCT116-TGFBR2 soluja. Tämä sulkee pois vaikutukset RMCE perustuvan strategian tai ekspressiokasetin käytetään indusoituvuus mallimme järjestelmän. Lisäksi, kun käytetään transkriptio-spesifisiä alukkeita reaaliajassa RT-PCR-analyysi verrata ekspression endogeenisten A9 mutantti

TGFBR2

transkriptio, siirtogeenisten A10

TGFBR2

villityypin transkripti tai molemmat kopiot upon DOX altistuminen, ei muutosta endogeeninen

TGFBR2

transkripti taso havaittiin. Sen sijaan, DOX hoito johti vahvaan induktioon siirtogeenisten

TGFBR2

villityypin transkripti (kuvio 2A). Jos haluat jättää, että käyttövalmiin

TGFBR2

villityyppinen geeni ehkä saaneet samanlaisia ​​inaktivoivat mutaatiot puutteen vuoksi DNA MMR toiminto näissä soluissa, sekvensoimme transkriptio erityisiä

TGFBR2

cDNA ja tunnistaa yksinomaan A9 mutantti tai A10 villityypin toistojen endogeeninen tai siirtogeenisiä

TGFBR2

selostukset, vastaavasti. Näin mutaatiotutkimukset inaktivointi saatetun

TGFBR2

siirtogeenin näissä MSI ja MMR-puutteellisia HCT116-TGFBR2 klooneja voitaisiin sulkea. Näiden lisäksi transkriptio analyysejä, tutkimme myös indusoituvuus ja toimivuutta TGFBR2 proteiinin immunoblottauksella. Puuttuessa DOX, ei TGFBR2 proteiini havaittiin taas, kun läsnä on DOX, erityisiä TGFBR2 proteiinijuovat odotetun kokoisia (75 kDa) havaittiin. Kun aika tietenkin analyysi tehtiin, TGFBR2 proteiini tasoilla saavutti huippunsa 6 h mutta kieltäytyi myöhemmin 24 tunnista 48 h (kuvio 2B). Sillä todiste toimintakunnosta sekoitetun TGFBR2 proteiini, tutkimme sen signalointi kyky. Näin ollen, fosforylaatiota Smad2, ensimmäinen alavirran efektori TGFBR2 signaloinnin, tutkittiin Western blot -analyysillä (kuvio 3A). Puuttuessa TGFBR2 ilmentymisen (-dox), TGF-SS1 indusoi pohjapinta taso pSMAD2 sekä vanhempien HCT116-Tet-on ja HCT116-TGFBR2 soluja. Kuitenkin, kun TGFBR2 ilmentyminen indusoitiin (+ Dox) läsnä ollessa sen ligandin, TGF-SS1, merkittävää lisäystä pSMAD2 tasojen kaukana perustasoon havaittiin. Lisäksi olemme analysoineet ovatko nämä

TGFBR2

-reconstituted solut pystyvät säätelemään transkriptiota useita tunnettuja TGFBR2 kohdegeenien kuten

Smad7

ja

SERPINE

. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi paljasti Dox-riippuvainen

Smad7

ja

SERPINE

säätelyä ja näin ollen vahvisti normaalin signaloinnin aktiivisuutta (kuvio 3B). Lisäksi leviämisen pienenee, kun TGF-SS1 signalointi saavuteta HCT116-TGFBR2 soluja, kun DOX: n ja TGF-SS1 hoitoon verrattuna HCT116-TGFBR2 solut altistetaan TGF-SS1 puuttuessa DOX. Kuitenkin leviämisen pysyi ennallaan muun indusoimattomaan (-dox) ja indusoitiin (+ Dox) emo HCT116-Tet-soluihin tai HCT116-TGFBR2 (- /+ Dox) solujen puuttuessa TGF-SS1 ligandi (kuvio S1A). Mikään näistä soluista osoitti mitään morfologisia muutoksia (kuvio S1B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että molemmat TGFBR2 kloonit ilmentävät toiminnallisesti ehjiä TGFBR2 proteiinia ja joilla on asianmukainen TGFBR2-välitteistä signalointia.

(A) Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi endogeenisen mutantti (A9), siirtogeenisiä villityypin (A10 ) tai molemmat

TGFBR2

transkriptien poissa ja läsnä ollessa DOX (1 ug /ml) on esitetty. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta riippumattomien havaintojen ± S.D. (B) Western blot -analyysi, joka osoittaa läsnä DOX-indusoituvan (1 ug /ml) TGFBR2 ilmentymistä ajan riippuvalla tavalla. ß-Actin toimi latauskontrollina. Tiedot esitetään HCT116-TGFBR2 klooni # 5, mutta sovelletaan myös kloonata # 22 (tuloksia ei ole esitetty).

(A) fosforylaatio Smad2 (pSMAD2) havaittiin Western blot analyysillä. Käsittely DOX (1 ug /ml) ja TGF-SS1 (10 ng /ml) näytetään korkeampi pSMAD2 verrattuna soluihin, jotka oli kasvatettu ilman DOX. Vanhempien HCT116 solulinja toimi negatiivisena kontrollina, kun taas TGF-SS1 reagoiva HepG2-soluja käytettiin positiivisena kontrollina. Yhteensä Smad2 on käytetty latauskontrollina. (B) Kohdegeenin transkription TGFBR2 signalointi. Reaaliaikainen RT-PCR kokeet paljastivat DOX riippuva

Smad7

ja

SERPINE

säätelyä. Tiedot esitetään HCT116-TGFBR2 klooni # 5, mutta sovelletaan myös kloonata # 22 (tuloksia ei ole esitetty). Arvot edustavat keinot kolmen erillisen kokeen ± SD

TGFBR2 riippuva Glycan muutostyöt

Koska emme havaitse mitään muutoksia vakaan tilan tasoja solun pinnalla proteiinien lektiini-FACS analyysi (kuva S2) ja lektiini-Western-blottauksella (kuvio S3), suoritimme radioaktiivisen leimauskokeiden käyttämällä kahta itsenäistä

3H-leimattua monosakkarideja, ManNAc ja L-fukoosia. Tämä lähestymistapa fokusoimme mittauksia juuri syntetisoidun glykoproteiineja. Alustavissa kokeissa eri aikoina (24, 48h ja 72h) tutkittiin. Sisällyttäminen

3H-ManNAc, esiaste siaalihapon, lisääntynyt ajan mittaan, huippu noin 72 tuntia. Kun DOX altistuminen ja lisäksi TGF-SS1 72 tuntia, merkittävä väheneminen sisällytetty

3H-ManNAc esiintyi molemmissa TGFBR2 klooneja, mutta ei vanhempien Tet-On solulinjassa (kuvio 4A). Siksi olemme analysoineet kaikki 20 tiedossa sialyylitransferaaseista ja kaksi sialidases (Neu1 ja Neu3) reaaliajassa RT-PCR klo 24, 48h ja 72h induktion jälkeen (taulukko S2). Emme kuitenkaan pystyneet havaitsemaan muutoksia mRNA ekspressiotasot (kuva S4). Re-ilmentyminen TGFBR2 johti laski merkittävästi proteiinin fukosyloitu- yhdessä molempien kloonien avulla

3H-L-fukoosin (kuvio 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TGFBR2 säätelee sialylaatiota

de novo

proteiineja.

Radioaktiivisen merkintöjä kokeet suoritettiin läsnä ollessa ja puuttuessa DOX (0,5 ug /ml), ja altistuminen TGF-SS1 ( 10 ng /ml) 72 h. (A) Inkubointi

3H-ManNAc johti merkittävään vähentämiseen sisällytetty ManNAc että TGFBR2 kloonien # 5 ja # 22, mutta ei vanhempien HCT116-Tet-On solulinjassa. (B) liittäminen

3H-L-fukoosia on hieman vähennetty läsnäollessa DOX molemmissa TGFBR2 klooneja toisin HCT116-Tet-On-soluissa. Arvot edustavat keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SD

SS1-integriinin ilmentyminen ja Sialylaatio

Koska tiedetään, että SS1-integriini on erittäin sialyloidun proteiinia, jonka ilmentyminen on muuttunut TGF -ß1 [38], me seuraavaksi tutkittava, onko SS1-integriinin sialyloituminen saattaa vaikuttaa TGFBR2 ilmaisun ja signalointi. Perustuen havaintoon, että TGFBR2 näyttää moduloimaan ainoastaan ​​sialyloituminen

de novo

proteiineja, suoritimme radioaktiivisen dual leimauskokeiden (

3H-ManNAc ja

35S-L-metioniini) määrittää sisällyttäminen sialihappoa ja kontrollina synteesin SS1-integriini TGFBR2-indusoidun solujen (kuvio 5). Merkittyäsi 72 h, solut kerättiin ja SS1-integriini oli immunosaostettiin. Vaikka sekoitetun TGFBR2 signaloinnin lisäsi ekspressiota SS1-integriinin mRNA (2-kertainen) (ei esitetty), ja proteiinin määritettiin metabolinen leimaus (kuvio 5A), sisällyttäminen ManNAc osoitti TGFBR2 riippuvainen lasku (kuva 5B). Normalisoimalla siaalihapon liittäminen SS1-integriini synteesi vaikutus TGFBR2 on SS1-integriinin voitaisiin havainnollistaa paremmin silmiinpistävän, kuvassa 5C. Sen määrittämiseksi, onko vaikutus TGFBR2 on SS1-integriinin ilmentyminen johtuu vaikutuksesta muuttuneen sialylaatio- on SS1-integriini vakautta, pulssi-chase koe suoritettiin. Kuten kuviossa 5D puoliintumisaika SS1-integriinin proteiini oli noin 16 tuntia ja tämä kiertonopeus pysyi ennallaan läsnä tai poissa TGFBR2 ilmaisua. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että TGFBR2 signalointi säätelee sialylaatiota

de novo

proteiinit yleensä ja SS1-integriinin erityisesti vaikuttamatta liikevaihdostaan.

(A-C) Dual merkintöjä solujen jossa

3H-ManNAc ja

35S-L-metioniini suoritettiin läsnä ollessa ja puuttuessa DOX (0,5 ug /ml), ja, kun läsnä on TGF-SS1 (10 ng /ml) 72 tuntia. FSC, sirontamittari;