Krooninen sairaus

tiivistelmä

Luontaistuotteet ovat runsas säiliö mahdollisten pienten kemiallisten molekyylejä, joilla antiproliferatiivisia ja chemopreventive ominaisuuksia. Tässä osoitamme, että hoito haiman adenokarsinooma (PDAC) soluja (PANC-1, MiaPaca-2) kanssa, isokinoliini alkaloidi berberiini (0,3-6 pM) esti DNA-synteesiä ja näiden solujen ja viivästyttää etenemistä niiden solusyklin G1. Berberiini hoito vähensi myös (70%) kasvu MiaPaca-2 solujen kasvun, kun istutetaan kyljet nu /nu-hiirissä. Mekaaniset tutkimukset paljastivat, että Berberiini laskivat mitokondrion kalvon potentiaalia ja solunsisäisten ATP-tasot ja aiheuttama voimakas AMPK aktivointi, kuten fosforylaatio AMPK α-alayksikköä at Thr-172 ja asetyyli-CoA karboksylaasi (ACC) Ser

79. Lisäksi berberiini annosriippuvaisesti esti mTORC1 (fosforylaatio S6K at Thr

389 ja S6 Pa

240/244) ja ERK-aktivaation PDAC soluissa insuliinin stimuloimaan ja neuro- tai sikiön seerumia. Knockdovvn α

1 ja α

2 katalyyttinen alayksikkö ilmaus AMPK kumosi estävä vaikutus tuotetaan käsittelemällä pieninä pitoisuuksina Berberiini on mTORC1, ERK ja DNA-synteesiin PDAC soluissa. Kuitenkin suurempina pitoisuuksina, berberiini esti solusignaalivälitysteitä (mTORC1 ja ERK) ja DNA-synteesin kautta AMPK-riippumaton mekanismi. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin metformiinia käytetään annoksilla, jotka indusoi joko vaatimaton tai huomattava vähennykset solunsisäisten ATP-tasot, jotka olivat lähes identtisiä laskua ATP-tasot vasteena saadun berberine. Ehdotamme, että Berberiini ja metformiini estävät solusignaalivälitysteitä in PDAC soluihin annoksesta riippuvaa AMPK riippuvia ja riippumattomia polkuja.

Citation: Ming M, Sinnettin-Smith J, Wang J, Soares HP, Young SH, Eibl G , et ai. (2014) annoksesta riippuvainen AMPK-Dependent ja itsenäiset mekanismit Berberiini ja metformiinin esto mTORC1, ERK, DNA Synthesis ja leviämisen haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (12): e114573. doi: 10,1371 /journal.pone.0114573

Editor: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia

vastaanotettu: 01 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 11 marraskuu 2014; Julkaistu: 10 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Ming et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health Avustukset P01 CA163200, P30 DK4130, R01 DK100405, Department of Veterans Affair Grant 1I01BX001473 ja varoja suotu Ronald S. Hirschberg puheenjohtaja Haimasyöpä Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on tuhoisa sairaus, jossa yleinen 5 vuoden pysyvyys on vain 6% [1]. Ilmaantuvuus tämän taudin Yhdysvalloissa arvioidaan kasvavan yli 44000 uutta tapausta vuonna 2014 ja on nyt neljänneksi suurin syy syövän kuolleisuus sekä miehillä että naisilla [2]. Yhteensä kuolemista johtuu PDAC ennustetaan kasvavan dramaattisesti tulla toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien ennen 2030 [1] Koska nykyinen hoitoja tarjoavat hyvin rajallinen selviytymisen etuja, uusia strategioita hoitoon ja ehkäisyyn tämä aggressiivinen tauti tarvitaan pikaisesti [3 ].

G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) ja niihin kuuluvan agonistit ovat yhä osallisina autokriininen /parakriininen kasvutekijöitä useita kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien pienisoluinen keuhkosyöpä, paksusuolisyöpä, eturauhas-, rinta- ja haima [4] – [8]. Olemme osoittaneet, että haimasyövän solulinjoissa ilmaista useita GPCR: [9] ja erilaisia ​​GPCR-agonistit, mukaan lukien neurotensiini, angiotensiini II ja bradykiniinin, stimuloi DNA-synteesiä haimasyövän solulinjoissa, mukaan lukien PANC-1 ja MiaPaca-2 [9] – [ ,,,0],12]. Lisäksi laajakirjoinen GPCR antagonisti [13], [14], esti kasvua haimasyöpäsoluissa joko

in vitro

tai ksenosiirrettyjä osaksi nu /nu -hiirten [15]. Muut tutkimukset osoittivat, voimistunutta ilmentymistä GPCR: ien haimasyövän kudoksissa [16] – [19]. Myöhemmin tunnistimme positiivinen ylikuulumisen välillä insuliini /IGFI reseptoreihin ja GPCR opastinjärjestelmät haiman syöpäsoluja, mikä johtaa mTORC1 signalointi ja ERK: aktivointi, ja synergistinen stimulaatio DNA-synteesiä ja solujen lisääntymistä [20] – [22]. Nämä havainnot oletetaan myös huomattavasti, kun otetaan huomioon suuri määrä epidemiologisia tutkimuksia yhdistää pitkäaikainen tyypin 2 diabetes (tyypin 2 diabetekseen), lihavuuden ja metabolisen oireyhtymän, jolle on ominaista perifeerinen insuliiniresistenssi ja korvaavia ylituotantoa insuliini, lisääntynyt riski kehittää haimasyövän [23] – [32].

biguanidi metformiini (1,1-dimetyylibiguanidi hydrokloridi) johdettu galegine, joka on phytochemical alkaen

rohtovuohenherne,

on yleisimmin määrätty lääke hoitoon Tyypin 2 diabeteksen,

maailmanlaajuisesti

[33], [34]. Systeemisesti, metformiini alentaa veren glukoosipitoisuus vähentyneen maksan glukoneogeneesiä, lisää glukoosin sisäänottoa luustolihaksiin ja rasvakudoksessa [34], [35] ja vähentää verenkierrossa insuliinin ja IGF-1 [36], [37]. Solutasolla, metformiini epäsuorasti stimuloi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) aktivointi [38] eston kautta mitokondrioiden toimintaa, vaikka muita mekanismeja metformiinin toiminta on myös ehdotettu suurina annoksina [39]. Suurimmat alavirtaan tavoitteet AMPK kuuluvat TSC2 ja Raptor [40] – [43]. AMPK-välitteisen fosforylaation nämä tavoitteet estää mTOR kompleksi 1 (mTORC1) aktiivisuus erilaisissa solutyypeissä, mukaan lukien PDAC soluihin [44], [45] ja häiritsee positiivinen välinen ylikuuluminen insuliini /IGFI reseptoreihin ja GPCR opastinjärjestelmät [21], [46]. Mielenkiintoista, useat havaintoihin tutkimusten mukaan metformiini alentaa esiintymistiheys ja parannettu ennusteeseen erilaisia ​​syöpiä potilaalla on tyypin 2 diabetekseen [47], [48], vaikka tämä tämä johtopäätös on tutkittavana [49]. Kun asetus PDAC, diabeetikoilla, jotka olivat saaneet metformiini näyttää olevan matalammat mukautettu esiintymistiheys ja paremmin eloonjääminen verrattuna niihin, jotka eivät olleet metformiini tai niitä käytetään muihin diabeteslääke [47], [50] – [52]. Oletimme, että rakenteellisesti etuyhteydettömän luonnollisia tai synteettisiä yhdisteitä, jotka häiritsevät mitokondrio-välitteisen ATP synteesi ja kohde mTORC1 ja ERK polkuja, voisi tarjota uusia anti-PDAC aineina.

Luontaistuotteet ovat runsas säiliö mahdollisia pieniä kemiallisia molekyylejä näytteille monipuolinen farmakologisia ominaisuuksia. Isokinoliini alkaloidi berberiini [53] – [55], joka on phytochemical uutetaan eri lääkekasveja, mukaan lukien kasvit, että

berberis

lajien indusoi useita biologisia vaikutuksia, mukaan lukien liikalihavuuden, diabeteksen, anti- syöpä ja kalori-rajoitus vaikutuksia [55] – [62]. Solumekanismin (t) mukana, on kuitenkin edelleen puutteellisesti. Berberiini on raportoitu estävän mitokondrioiden toimintaa ja aiheuttaa AMPK aktivointi [63], mutta muiden mekanismien toimintaa tämän alkaloidi on ehdotettu, kun lisätään suurina pitoisuuksina [64], [65]. Huolimatta potentiaali kliininen merkitys ei ole ymmärrystä tarkkaa mekanismia (t), jolla Berberiini estää syöpäsolujen lisääntymistä ja sitä ei tiedetä, onko tämä aine on suoraa vaikutusta signalointi ja leviämisen PDAC solujen kätkeminen

KRAS

mutaatiot ominainen 90% ductal haiman karsinoomat.

tässä tutkimuksessa osoitamme, että berberiini estää DNA-synteesiä, solusyklin etenemisen ja proliferaation PANC-1 ja MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa . Lisäksi berberiini hallinto estää niiden kasvun PDAC tuumoriksenograftien

in vivo

yhtä tehokkaasti kuin metformiini. Mekanistisissa tutkimuksissa osoitamme, että berberiini, kuten metformiini pienentää mitokondrion kalvon potentiaalia ja ATP-tasot ja samanaikaisesti indusoi AMPK aktivointia. Perustuen tuloksia käyttämällä siRNA-välitteisen knockdovvn AMPK, ehdotamme, että estäviä vaikutuksia Berberiini ja metformiinin välittyvät AMPK riippuvia ja AMPK riippumattomia reittejä annoksesta riippuen kunkin aineen. Tämä johtopäätös tarjoaa todennäköinen selitys näennäisesti ristiriitaista raportteja roolista AMPK että vaikutusmekanismi Berberiini ja metformiinin muu malli järjestelmissä.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Dulbeccon modifioidussa Eagle Medium (DMEM) saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensiini, insuliini, berberiini ja metformiinin saatiin Sigma Chemical (St. Louis, MO). Kaikki vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-IgG ja anti-hiiri-IgG oli GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Kaikki muut reagenssit olivat korkein arvosana käytettävissä.

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa PANC-1 ja MiaPaca-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Nämä solulinjat valittiin, koska ne satama mutaatioita tyypillisiä ihmisen haimasyövän [66], mukaan lukien aktivoivat mutaatiot KRAS, TP53 (joka koodaa p53-proteiinin) ja CDKN2A (tunnetaan myös nimellä p16 tai p16INK4a). Todellakin, on erinomainen korrelaatio pistemutaatio taajuuksien PDAC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia [67]. Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 2 mM glutamiinia, 1 mM Na-pyruvaattia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 10% CO2 . Kokeissa, glukoosipitoisuus DMEM säädettiin 5 mM, fysiologinen taso ihmisen seerumissa.

[

3H] -tymidiinin DNA:

PANC-1 ja MiaPaca -2-soluja (1 x 10

5) maljattiin ja kasvatettiin 3,5 cm kudosviljelylevyissä 5 päivää DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Solut pestiin kahdesti ja inkuboitiin 24 tuntia DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 1% FBS: ää. Kokeen käynnistämiseksi, tuoretta elatusainetta, joka sisälsi määritetyn pitoisuuden agonistin ja /tai inhibiittori, lisättiin pesun jälkeen kahdesti DMEM (4 viljelmiä käytetään kunkin kunnossa), ja sitten soluja inkuboitiin 17 tuntia ja sitten pulssi leimattiin 6 h [

3H] -tymidiinin (0,25 uCi /ml). Solut kiinnitettiin 5% trikloorietikkahappoa ja pestiin kahdesti etanolilla. Happoon liukenematon altaat liuotettiin 0,1 N NaOH, 1% SDS, ja radioaktiivisuus laskettiin nestetuikelaskijalla.

Mitokondrioiden kalvojännite

solun läpäisevä JC-1 väriaine ( Invitrogen), joka osoittaa mahdolliset riippuvainen kertymistä mitokondrioissa, käytettiin indikaattorina mitokondrion kalvon potentiaalia. Hoidon jälkeen ilman tai berberiini tai metformiinin, JC-1 lisättiin viljelmiin PANC-1 tai MIA PaCa-2 solujen 1 ug /ml 30 minuutin ajan. Sitten alustat vaihdettiin Hanks Buffered Saline Solution, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja solut heti kuvattiin käyttäen rodamiini ja fluoreseiini optiikka. Kuvat säilytettiin useista näkökentän. Histogrammi analyysi ominaisuus Photoshop (Adobe) käytettiin mittaamaan keskimääräistä punaisen ja keskimääräinen vihreän fluoresenssin voimakkuus noin 50 solujen näkökentässä. Vähintään 5 riippumatonta kentät mitattiin jokaisessa kunnossa. Tulokset ilmaistaan ​​keskimääräinen suhde punainen /vihreä loisteputki intensiteettiä yhdessä näkökentässä (keskiarvo ± SEM). Suhde punainen /vihreä fluoresenssin voimakkuus ilmaisee mitokondrion kalvon potentiaali vähentynyt suhde osoittaa tappiota mahdollisia.

ATP määritys

PANC-1 ja MiaPaca-2-solut (5 x 10

4) maljattiin ja kasvatettiin 24 kuoppaviljelylevyillä varten 5 päivää DMEM: ssä ja 10% FBS: ää. Sitten soluja inkuboitiin 24 tuntia DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 1% FBS: ää. Solut pestiin kahdesti DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja inkuboitiin seerumivapaassa alustassa 17 tuntia poissa tai läsnä ollessa, berberiini tai metformiinia. ATP-tasot määritettiin käyttämällä tulikärpäsen lusiferaasi /D-lusiferiini ATP määritys Kit mukaan valmistajan protokollan (Life Technologies Grand Island, NY).

knockdovvn AMPK tasojen kautta siRNA transfektion

Äänenvaimennin Valitse siRNA: t hankittiin Life Technologies (Grand Island, NY) ja suunniteltu kohdistamaan joko ihmisen AMPK

α1 tai ihmisen AMPK

α2. Solut transfektoitiin käyttäen käännetyn transfektion menetelmällä. Joko Äänenvaimennin Valitse ei-kohdistettu negatiivinen kontrolli tai seoksesta 10 nM AMPK

α1 ja 10 nM AMPK

α2 siRNA (AMPKα1, α2 siRNA) sekoitettiin Lipofectamine RNAi MAX (Life Technologies Grand Island, NY) mukaan valmistajan protokollan ja lisättiin 24-kuoppaisille levyille. PANC-1-solut maljattiin sitten päälle siRNA /Lipofectamine RNAiMAX kompleksin, jonka tiheys on 10

5 solua /well.in DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 10% FBS: ää. Kolme päivää transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 24 tuntia DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 1% FBS: ää. Solut pestiin kahdesti DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja inkuboitiin seerumivapaassa alustassa 17 tuntia poissa tai läsnä ollessa, berberiini tai metformiinin ja käsiteltiin sitten, kuten on kuvattu vastaava luku legendoja.

virtaussytometrinen /solusyklin analyysi

osuus solujen G

0 /G

1, S, G

2, ja M vaiheet solusyklin määritettiin virtaussytometria-analyysillä. PANC-1-soluja (2 x 10

4-solut) ympättiin DMEM, joka sisälsi 2,5% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua viljelmiä käsiteltiin ilman tai berberiini kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 2,5% FBS: ää ja 3 päivää. Sitten solut otettiin talteen trypsinoimalla, sentrifugoitiin 1000

g

5 min ja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 10

6 solua /ml hypotoniseen propidiumjodidi (PI), joka sisälsi 0,1% natriumsitraatti, 0,3 % Trixon-X 100, 0,01% PI: n ja 0,002% ribonukleaasi A. Soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 min ja analysoitiin FACScan (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) käyttäen ohjelmistoa CellQuest. Satatuhatta solut kerättiin jokaisesta näytteestä. Heräte tapahtui 488 nm ja kerättiin käyttämällä FL2-kanavalla ja analysoitiin FCS ExpressV3.

Western Blot analyysi

Konfluentteja viljelmiä PANC-1 tai Mia PaCa-2-soluja kasvatettiin 3,5 cm astiat pestiin ja inkuboitiin sitten 24 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 1% FBS: ää. Sitten solut pestiin kahdesti DMEM: llä, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa läsnä ollessa tai ilman berberiini, metformiini tai A-769662 kuvatulla tavalla yksittäisten kokeissa. Sitten viljelmät suoraan hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria [200 mM Tris-HCI (pH 6,8), 2 mM EDTA, 0,1 M Na

3Vo

4, 6% SDS, 10% glyserolia, ja 4% 2-merkaptoetanolia] ja sen jälkeen SDS-PAGE: lla 10% geelit ja siirto Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Billerica, MA). Western blotit suoritettiin sitten kalvoja inkuboitiin yön yli vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), joka sisälsi 0,1% Tween-20. Immunoreaktiivinen vyöhykkeet havaittiin ECL (tehostettu kemiluminesenssi) reagenssit (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Käytetyt vasta-aineet havaittiin fosforyloidun tilasta S6K at Thr

389, S6 Ser

240/244 ja ERK1 /2 klo Thr

202 ja Tyr

204, AMPKα at Thr

172, ACC on Ser

79 ja Raptor Ser

792. Lisäksi kokonaistaso näiden proteiinien arvioitiin myös. Rutiininomaisesti kalvoja käytetään fosfo-spesifisten vasta-aineiden irrotettiin ja uudelleen blotattiin vasta-aineiden kanssa, jotka tunnistavat koko tason vastaavan proteiinin. Joskus, strippaus ja uudelleen blottaus saman kalvo ei ollut tyydyttävä saamiseksi sekä lastaus- ja ilme valvontaa. Näissä tapauksissa käytimme erillisen blot arvioimiseksi koko proteiinin ilmentymisen ja immunoblotattiin alkuperäisen kalvon muita proteiineja (esim aktiini, S6K, S6, ERK), jotka vaeltavat on eri asemassa alkuperäisessä geelin tarkastaa yhtä suuri kuormitus.

Cell Proliferation

viljelmät PANC-1 ja MiaPaca-2-solut, 3-5 päivää läpikulun jälkeen, pestiin ja suspendoitiin DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia. Sitten solut eriteltynä kaksi läpäisee 19-guage neulalla olennaisesti yksisoluiset jousitus arvioituna mikroskoopilla. Solujen lukumäärä määritettiin käyttäen Coulter Counter, ja 2 x 10

4-solut ympättiin 35 mm: n kudosviljelylevyillä DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 10% FBS: ää. 24 tunnin inkubaation jälkeen väliaine poistettiin ja viljelmät siirretään DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ilman tai 3% FBS: ää. Viljelmiä inkuboitiin sitten kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 10% CO

2 37 ° C: ssa 4 päivää ja solujen kokonaismäärään määritettiin vähintään neljä ruokia per ehto käyttäen Coulter-laskimella sen jälkeen, kun solu kokkareita eriteltynä kulkee solususpension kymmenen kertaa läpi 19- ja myöhemmin 21-neula.

Hiiret ksenografteissa

Early-passage MiaPaca-2-solut kerättiin, ja 2 x 10

6 solut istutettiin oikean kylkiin uros

nu /nu

hiirissä. Miespuolinen

nu /nu

hiiriä yllä erityisillä patogeenittomassa laitokseen University of California at Los Angeles (UCLA). UCLA Kanslerin Animal tutkimuskomitea hyväksyi kaikki eläinkokeet. Eläimiä satunnaistettiin kontrolli- ja testiryhmään (10 hiirtä ryhmää kohden) ja annettiin lävistettyjä korvamerkit voidaan tunnistaa. Hoito aloitettiin, kun kasvaimet saavuttivat keskimääräinen halkaisija on 2 mm, ja 1. päivänä hoidon molemmissa tapauksissa nimettiin päivänä 0. injektointia eläimiin, metformiinia (250 mg /kg), berberiini (5 mg /kg) tai kantajaa (kontrolli) annettiin intraperitoneaalisesti kerran vuorokaudessa intraperitoneaalisesti (50 ul /hiiri). Kasvaimen tilavuus (

V

) mitattiin ulkoinen paksuus 4 päivän välein, ja se laskettiin

V

= 0,52 (pituus x leveys

2). Lopussa kokeen kasvaimet leikeltiin painotettu ja mitataan. Tilavuus poistettu kasvainten laskettiin

V

= 0,52 (pituus x leveys x syvyys).

Tilastollinen

Arvot ovat keskiarvoja ± SE. Erot ryhmien välillä analysoitiin parittomia Studentin

t

-testissä.

Tulokset

Berberiini estää DNA-synteesiä, solusykliä ja solujen lisääntymistä in PDAC soluissa

Aluksi määritimme vaikutus isokinoliini alkaloidi berberiini DNA-synteesiin in PANC-1 ja MiaPaca-2-solut, joita on käytetty laajasti malleja PDAC soluja. Näiden solujen viljelmiä kasvatettiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia pestiin ja siirrettiin seerumittomaan elatusaineeseen 24 tuntia. Sitten solut vaihdetaan väliaine, joka sisältää fysiologisen pitoisuuden glukoosia (5 mM), kasvavia annoksia berberiini ja yhdistelmä insuliinin (10 ng /ml), ja GPCR-agonistin neurotensiini (5 nM) saamaan aikaan voimakas mitogeeninen ylikuulumisen signalointi [ ,,,0],20], [21], [46]. Hoidon berberiini esti stimulaatio DNA-synteesin annoksesta riippuvaisella tavalla sekä PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa. Pitoisuutena 3 uM, berberiini esti DNA-synteesin 82% vuonna MiaPaca-2-soluissa ja 76% vuonna PANC-1-soluissa. Sisällyttäminen [

3H] -tymidiinin esti 97% vuonna MiaPaca-2-soluissa ja 94% vuonna PANC-1-solujen vastauksena 6 uM Berberiini (Fig. 1 A).

Mia PaCa-2 tai PANC-1-soluja inkuboitiin ilman (

avoimet pylväät

) tai 5 nM neuro- ja 10 ng /ml insuliinia (

umpinaiset pylväät

) läsnäollessa konsentraatio kasvaa Berberiini 17 h 37 ° C: ssa ennen lisäämistä [

3H] -tymidiinillä 6 tuntia. Radioaktiivisuus sisällytetty happo liukenematon altaat mitattiin tuikelaskimella, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät. Esitetyt arvot ovat keskiarvo ± SEM saatu 3 itsenäisestä kokeesta; B, PANC-1-soluja käsiteltiin ilman (kontrolli) tai berberiini 1,5 uM tai 3 uM kasvatusliuoksessa, joka sisälsi 2,5% FBS: 3 päivää (merkitty jatk., FBS, FBS 1,5 Ber ja FBS +3 Ber). Solukierron analysoitiin PI-värjäys ja virtaussytometria. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 3 itsenäisestä kokeesta. C, Single-solususpensiota Mia PaCa-2 tai PANC-1-soluja maljattiin kudosviljelymaljoille tiheydeksi 2 x 10

4 solua per malja. 24 tunnin inkuboinnin väliaine poistettiin ja viljelmät siirtynyt keskipitkällä ilman tai 3% FBS puuttuessa (avoimet pylväät) tai läsnä ollessa (umpinaiset pylväät) 3 uM berberiini. Viljelmiä inkuboitiin 4 päivää kuvatulla ”Materiaalit ja menetelmät”. Solujen määrä määritettiin 4-6 maljat per ehto käyttäen Coulter Counter. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM 3 biologisten toistojen.

määrityksissä [

3H] -tymidiinin täydennettiin virtaussytometrianalyysillä määrittää osuuden PDAC solujen eri vaiheissa solusyklin. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, altistuminen PANC-1 solut Berberiini (1,5-3 pM) aiheuttama merkittävä osuuden kasvu solujen G

1 (61 ± 0,2% solujen FBS 79 ± 2% solujen FBS ja Berberiini) sekä vastaavan vähennyksen solujen osuus, jotka olivat S ja G

2 /M vaiheessa solusyklin (36 ± 0,1%: sta 19 ± 0,7%). Nämä tulokset osoittavat, että berberiini viivästyttää etenemistä PDAC solusyklin G

1.

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus berberiini proliferaatioon haiman syöpäsoluja. Yhden solun suspensiot joko PANC-1 tai MiaPaca-2-solut maljattiin ja niitä inkuboitiin väliaineessa täydennettynä kanssa tai ilman 3% FBS: ää puuttuessa tai läsnä on 3 uM berberiini. Hoidon berberiini inhiboi merkittävästi proliferaatiota sekä PDAC soluissa (Fig. 1 C) ilman, että vaikutetaan solujen elinkykyä tutkituilla annoksilla (tuloksia ei esitetty). Yhdessä tulokset kuvassa. 1 osoittavat, että berberiini estää DNA-synteesiä, solusyklin etenemisen ja lisääntymistä haiman syöpäsoluja.

Berberiini ja metformiinin estävät kasvua PDAC ksenograftin nude-hiirissä

Koska tuloksemme osoittavat estovaikutus Berberiini on PDAC soluproliferaatioon

in vitro

, me jälkeen määritettiin, onko tämä yhdiste estää haimasyövän kasvua

in vivo

käyttäen MiaPaca-2 kasvain nude-hiirissä. -ksenografteja Johdettu istuttaminen 2 x 10

6 solua oikeaan kylkiin mies

nu /nu

hiirillä. Eläimiä satunnaistettiin ohjaus ja berberiini hoidetuissa ryhmissä (10 hiirtä ryhmässä). Berberiini annettiin kerran vuorokaudessa intraperitoneaalisesti 5 mg /kg kokeen keston ajan. Kuten on esitetty kuviossa. 2, anto Berberiini vähensi kasvua MiaPaca-2-solujen ksenosiirrettyjä nude-hiirissä 70%. Kasvain volyymit lopussa kokeen (päivä 29) oli 781 mm

3 kontrolliryhmässä ja 240 mm

3. berberiinin hoidetussa ryhmässä (p 0,001). Annos Berberiini käyttää (5 mg /kg) on ​​12 kertaa pienempi kuin LD

50, joka perustuu Alustava pitoisuusalueen tutkimuksia ja aikaisemman työn julkaissut toisten [53], [68], [69]. Berberiini oli hyvin siedetty eikä vaikuta merkittävästi hiirten painoa hoidon aikana (Fig. 2, B). Inhiboivaa vaikutusta berberiini oli verrattavissa aiheuttama metformiinia annetaan 250 mg /kg (Fig. 2), joka on annos, joka indusoi maksimaalisen estävää vaikutusta PDAC kasvaimen kasvua [70]. Itse asiassa, käyrät vastaavat kasvua MiaPaca-2 hiirissä, käsiteltiin berberiini tai metformiinin olivat lähes päällekkäisiä ensimmäisten 24 päivä (Fig. 2, A). Päivänä 29, metformiinin oli hieman tehokkaampi kuin berberine arvioimana kasvaimen tilavuus (p 0,05), mutta vaikutukset eivät tilastollisesti merkitsevä (p 0,07), kun tekee kasvaimen paino (Fig. 2, B). Nämä tulokset osoittavat, että berberiini estää niiden kasvun ihmisen haimasyövän soluja ksenosiirrettyjä nude-hiirissä, joilla on verrattavissa oleva tehokkuus, joka saavutetaan maksimaalinen annos metformiinia.

vierassiirrännäisiä MiaPaca-2 muodostettiin istuttamalla 2 x 10

6 solua oikeaan kylkiin mies

nu /nu

hiirillä. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimääräinen halkaisija on 2 mm eläimet satunnaistettiin kontrolli- ja testiryhmään (10 hiirtä ryhmää kohti). Berberiini annettiin kerran vuorokaudessa intraperitoneaalisesti 5 mg /kg kokeen keston ajan. Vertailun, metformiinia annettiin intraperitoneaalisesti toinen ryhmä hiiriä 250 mg /kg. 1

st hoitopäivänä nimettiin päivä 0. Kontrollieläimet saivat vastaavan määrän suolaliuosta. A, Tuumoritilavuudet mitattiin 4 päivän välein, kuten kappaleessa ”Materiaalit ja menetelmät”. Lopussa kokeen (päivä 29, tuumorit poistettiin, punnittiin ja mitattiin ja kasvainten arvioituna

V

= 0,52 (pituus x leveys x syvyys). Tulokset on esitetty paneeli B (keskiarvo ± SEM). hiirten käsittely berberiini vähensi merkittävästi tilavuuden ja painon kasvainten verrattuna kasvainten kontrolliryhmään (p 0,001), kuten on osoitettu. samanlainen kasvaimen kasvun inhibitiota saatiin antamalla metformiinin (p 0,001). käyrät vastaava kasvu MiaPaca-2 hiirissä, käsiteltiin berberiini tai metformiinin ovat päällekkäin ensimmäisen 24 päivää. päivänä 29, metformiini oli hieman tehokkaampi kuin berberiini, jota arvioidaan kasvaimen tilavuus (p 0,05) mutta ero vaikutuksista näiden lääkkeiden ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p 0,07), kun tekee kasvaimen paino (Fig. 2, B). käytetyillä pitoisuuksilla, berberiini ja metformiinin olivat hyvin siedetty eikä ilmeistä myrkyllisyyttä perustuen kehon painon muutokset.

Berberiini indusoi mitokondrion kalvon depolarisaatio, alentaa veren ATP ja stimuloi AMPK haiman syöpäsoluissa

Todettuaan, että berberiini estää PDAC soluproliferaatiota

in vitro

ja

in vivo

, me seuraavaksi tutkitaan liittyvistä mekanismeista. Muissa solutyypeissä, berberiini ajatellaan estävän kompleksin I mitokondrioiden Hengitysketjun [71], [72], mikä vähentää ATP synteesissä ja samanaikainen kasvu solujen AMP ja ADP jotka ovat tehokkaita allosteerinen aktivaattoreita AMPK [73] – [ ,,,0],75]. Koska se ei ole tiedossa, onko berberiini on mitään vaikutusta mitokondrioiden toimintaan haiman syöpäsoluissa, me ensin tutkittava, onko tämä phytochemical häiritsee mitokondrion kalvon potentiaalia näissä soluissa. Viljelmät MiaPaca-2 ja PANC-1-soluja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä ollessa 3 uM berberiini tai 1 mM metformiini, mukaan vertailun vuoksi. Sitten, mitokondrion kalvon potentiaalia, avaintekijä ajo ATP synteesi, arvioitiin käyttäen mitokondrioiden fluoresoiva koetin JC-1 [76]. Kuten on esitetty kuviossa. 3 A, berberiini aiheutti merkittävän laskun mitokondrion kalvon potentiaalia MiaPaca-2 ja PANC-1-soluissa. Vaikutus oli verrattavissa aiheuttama metformiini (Fig. 3 A). Nämä tulokset osoittavat, että berberiini, kuten metformiini, tavoitteet mitokondrioiden toimintaan in PDAC soluissa. Niinpä altistuminen kasvavien pitoisuuksien Berberiini tai metformiini tuottanut merkittävää, annoksesta riippuvaa laskua solunsisäisessä ATP-tasot sekä PANC-1 ja MiaPaCa- 2 solut (Fig. 3 B).

, Cultures of PANC -1 ja MiaPaca-2-soluja inkuboitiin ilman tai, kun läsnä on 3 uM berberiini (Berb) tai 1 mM metformiini (Met) 17 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia. Muutos mitokondrion kalvon potentiaali mitattiin käyttäen mitokondrion kalvon mahdollisena indikaattorina JC-1. Tulokset ilmaistaan ​​keskimääräinen suhde punainen /vihreä loisteputki intensiteettiä yhdessä näkökentässä (keskiarvo ± SEM). Vähintään 5 kenttää tutkittiin jokaisessa kunnossa. P-arvot määritettiin käyttäen t-testiä (SigmaPlot 12.); * P 0,002. B, viljelmät PANC-1 ja MiaPaca-2-soluja inkuboitiin ilman tai, kun läsnä on berberiini tai metformiinin ilmoitettuina pitoisuuksina 17 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 2,5% FBS: ää. C, viljelmät PANC-1 (ylempi paneeli) ja MiaPaca-2 (alempi paneeli) inkuboitiin ilman tai, kun läsnä on berberiini osoitetussa annoksilla 17 tuntia. Sitten soluja stimuloitiin 1 tunnin ajan 5 nM neurotensiini ja 10 ng /ml insuliinia ja hajotettiin 2X SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan asetyyli-CoA Carboxylase (ACC) Ser

79. Western blot aktiinin käytettiin tarkistaa yhtä suuri lastaus samalla membraanin ja erillinen geeli vahvisti, että ilmentyminen yhteensä ACC-proteiinia ei muuttunut millään näistä käsittelyistä. D, Kvantifiointi suoritettiin käyttämällä Multi mittari V3.0. Arvot edustavat keskiarvoa ± SEM; n = 3, kertaiseksi ACC fosforylaation Pa

79. Inset, fosforyloitu tila AMPK at Thr

172 ilmoitettuina pitoisuuksina Berberiini (uM).

Seuraava ratkaistava, onko berberiini stimuloi AMPK toimintaa ehjä MiaPaca-2 ja PANC-1-soluissa. Lysaatit nämä solut analysoitiin immunoblottauksella käyttämällä vasta-aineita, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan asetyyli-CoA-karboksylaasi (ACC) Ser

79, jäännös suoraan fosforyloitiin AMPK ja käytetään biomarkkeri AMPK toimintaa ehjien solujen [75] . Hoito Berberiini indusoi selvästi lisääntynyt fosforylaation ACC Ser

79 annoksesta riippuvalla tavalla sekä PANC-1 ja MiaPaca-2-solut (Fig. 3, C, kvantifiointiin Fig. 3 D). Maksimaalinen vaikutus aikaansaama annoksilla 2 uM molemmissa PDAC soluissa (Fig. 3 D). Lisäksi hoito MiaPaca-2 tai PANC-1 solujen berberine indusoi silmiinpistävää lisääntymistä fosforylaation AMPK at Thr

172, jäännöksen kinaasidomeeni katalyyttisen alayksikön (α) on AMPK kriittisten aktivointia varten (lisäosien kuvassa. 3 D). Yhdessä tulokset osoittavat, että berberiini vähentää mitokondrion kalvon potentiaalia ja alentaa solunsisäisiä tasoja ATP edistää näin AMPK aktiivisuutta PDAC soluja viljeltiin väliaineessa, joka sisältää fysiologisen pitoisuuden glukoosia (5 mM).

berberine estää mTORC1 ja ERK aktivointi vuonna PDAC soluissa

aktivoituminen PI3K /Akt /mTORC1 ja MEK /ERK reitit on keskeinen rooli edistämisessä DNA-synteesiä, solusykliä ja leviämisen PDAC solujen ja negatiivisesti säännellään AMPK [21]. Näin ollen meillä selvitettävä, Berberiini estää mTORC1 ja ERK aktivaatio PDAC soluissa. Viljelmät MiaPaca-2-soluja käsiteltiin kasvavia annoksia berberiini ja stimuloitiin sitten yhdistelmä insuliinin ja neuro- saamaan aikaan positiivisen ylikuulumisen (Fig. 4). Kuten on esitetty kuviossa.