Krooninen sairaus

tiivistelmä

Special AT-rikas sekvenssi-sitova proteiini-1 (SATB1) on tunnistettu genomin järjestäjä, joka ohjelmoi chromatin organisaatio ja transkription profiilit. SATB1 edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden rintasyövän ja liittyy huonon ennusteen useissa syöpätyypeissä. Yhdistyksen välinen SATB1 ja peräsuolen syöpä (CRC) ei ole tutkittu intensiivisesti. Siksi tämä Tutkimuksessa tarkasteltiin vaikutusta SATB1 CRC kasvuun ja etäpesäkkeiden in vitro ja in vivo ja sen korrelaatio eloonjäämiseen ja kliinis tekijöitä CRC potilailla. Vakaa SATB1 Knockdown ja SATB1-yliekspressoivassa solulinjat perustettiin. SATB1 Knockdown vähentynyt solujen kasvua, pesäkkeiden muodostumista, muuttoliikkeen ja invaasio ja lisääntynyt apoptoosia CRC soluissa in vitro (p 0,05), kun taas SATB1 yli-ilmentyminen oli päinvastainen vaikutus. SATB1 yliekspressio lisäsi kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden keuhkojen ja maksan in vivo käyttämällä ksenograftin eläinmalleissa (p 0,05). Siten SATB1 edistänyt aggressiivinen CRC fenotyyppi in vitro ja in vivo. Immunohistokemiallinen analyysi 560 CRC yksilöiden osoitti, että SATB1 ekspressio oli merkittävästi suurempi CRC kudoksissa kuin täsmäsi ei-kasvain limakalvon (p 0,001). Lisäksi SATB1 ilme oli merkittävästi suurempi potilailla, joilla huonosti eriytetty kasvaimia, korkeampi invaasio syvyys, etäinen etäpesäke, ja kehittyneet TNM. SATB1 positiivisten potilaiden oli huonompi ennuste kuin SATB1-negatiivisilla potilailla, ja SATB1 todettiin riippumattomaksi ennustetekijä CRC (p = 0,009). Silmiinpistävän, me arvioitiin myös SATB2 ilmaisun CRC ja totesi, että SATB2 oli runsaammin ilmaistu ei-syöpä limakalvon verrattuna peräsuolen syöpä kudoksiin (p 0,001). Kuitenkin SATB2 ilme ei ollut vaikutusta ennusteeseen CRC potilaista (p = 0,836). SATB1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä lyhyempi elinaika joko SATB2-positiivisilla potilailla tai SATB2-negatiivisilla potilailla (p 0,001). Lopuksi todettakoon, että havaintojen mukaan tärkeä rooli SATB1 CRC kasvainten synnyssä ja etäpesäke. Näin ollen, SATB1 voi olla tärkeä prognostisia biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde CRC.

Citation: Zhang Y, Tian X, Ji H, Guan X, Xu W, Dong B, et ai. (2014) Expression of SATB1 edistää kasvua ja metastaasin peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (6): e100413. doi: 10,1371 /journal.pone.0100413

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 15 syyskuu 2013; Hyväksytty: 28 toukokuu 2014; Julkaistu: 27 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science rahoitus (nro: 81272765), Capital Tyypilliset Clinical Application Research (nro: Z121107001012083), Key Project Capital Medical kehitysrahaston (nro: 2009-2095), Peking Municipal Natural Science Foundation (nro: 7122030) Pekingin erinomaisena Talents tukijärjestelmää (215 Program, No: 18.02.2009), Special Project of Beijing ”Kymmeniä, satoja ja tuhansia” Health Talentsand rahoitusta Peking Cancer Hospital (nro: 10-04). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemaan Yhdysvalloissa [1] ja toiseksi yleisin syöpä Kiinassa [2]. Noin 15-25% CRC potilailla esiintyy synkroninen maksametastaaseja, ja 80-90% näistä potilaista on leikkaushoitoon metastasoitunut maksasairaus [3]. Metastaattinen maksasairaus on merkittävä kuolinsyy CRC potilailla [4]. Siksi on kiireesti tunnistaa herkkä ja spesifinen molekyylimarkkereita ennustaa CRC etäpesäkkeitä. Edelleen ymmärrystä taustalla olevien mekanismien CRC etäpesäkkeiden on olennaista tunnistaa biomarkkereita metastasoineeseen etenemiseen CRC.

Special AT-rikas sekvenssi-sitova proteiini-1 (SATB1) on kudosspesifinen ydin- proteiiniin, joka on pääasiassa ilmaistaan ​​tymosyyteissä [5] ja alun perin tunnustettu sen keskeinen rooli asianmukainen T-solujen kehitystä [6] – [8]. SATB1 sitoo erityinen AT-rikas ankkuri sivustoja ympäröivästä heterochromatin muodostaa ”häkki-like” toiminnallisia ydin- arkkitehtuuri, joka toimii lasku alustan kromatiiniin remontin tekijöitä. Siksi SATB1 verkko voi säädellä geeniekspressiota muuttamalla organisaatiosta DNA-sekvenssin [9], [10]. SATB1 on äskettäin raportoitu olevan genomin järjestäjä. SATB1 ilmentymistä merkittävästi muuttunut ilmentyminen yli 1000 rintasyövän geenejä, mukaan lukien metastaasi liittyvien geenien ja tuumorisuppressorigeeneille kasvun ja metastaasin rintasyöpäsolujen [11]. Lisäksi monimuuttuja selviytyminen analyysi osoitti, että SATB1 oli itsenäinen ennustetekijä rintasyövän [11]. SATB1 yli-ilmentyminen on myös yhteydessä huonoon ennusteeseen kurkunpään okasolusyöpä [12], mahasyöpä [13], [14], ja pahanlaatuisen ihomelanooman [15]. Yhdistyksen välinen SATB1 ja peräsuolen syöpä (CRC) jää epäselväksi.

Tässä tutkimuksessa osoitimme osallistuminen SATB1 CRC kasvua ja etäpesäkkeiden perustuu seuraaviin todisteet: (a) SATB1 yliekspressio havaittiin molemmissa CRC solulinjat ja CRC kasvaimet, (b) osalta ja pesäkkeiden muodostumista hinnat olivat alas säännelty SATB1-pudotus soluissa, mutta jopa säännellään SATB1 yli-ilmentäviä soluja, (c) maahanmuutto- ja invaasio-ominaisuudet olivat paljon köyhempi SATB1-pudotus soluissa, kun taas aggressiivisempia in SATB1 yli-ilmentäviä soluja, (d) SATB1 yliekspressio edistää syövän synnyn ja etäpesäkkeiden in vivo käyttämällä eläinmalleissa, (e) ilmentymistä SATB1 proteiini oli runsaampaa CRC kudoksissa kuin sovitetun ei-syöpä kudoksiin, ja (f) SATB1 lauseke todettiin olevan riippumaton ennustetekijä CRC potilaille.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Solulinjat ja Cell Culture

SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO ja LoVo CRC solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja Kiinan Academy of Medical Sciences Peking unionin Medical College, ja kaikki solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja penisilliini (100 ug /ml). Kaikkia solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2.

2.2 vakaiden SATB1-Knockdown Cell Lines

Kolme lyhyttä-hiusneula-RNA (shRNA) sekvenssit suunniteltiin joka perustuu SATB1 sekvenssi (NM_002971) tunnistetaan shRNA Target Finder (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia): shRNA1 (2566), 5′-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3 ’; shRNA2 (2364), 5’-AAGGACAATTCCGGTTTAGAG-3 ’; ja shRNA3 (2797), 5’-AAAGTGTGTACCCCGTAAGCA-3 ’. Oligoduplexes kloonattiin pSilencer3.1 vektoriin (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia). Saatu rakenteet transfektoitiin LoVo-soluja tai RKO-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla (pSilencer3.1) käytettiin kontrolleina. Vakaa shRNA transfektantit valitaan viljelemällä 600 ug /ml G418: aa (GibcoBRL) ja 3 viikkoa. RT-PCR, western blot, ja immunofluoresenssivärjäyksen käytettiin vahvistamaan alas säätely SATB1 ilmaisun.

2.3 vakaiden SATB1-yliekspressoivassa Cell Lines

Täyspitkä ihmisen SATB1 cDNA kloonattiin pcDNA3.1 ekspressiovektoriin (Ambion, Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia). SW480-solut transfektoitiin SATB1-pcDNA3.1 tai tyhjän vektorin (pcDNA3.1) kontrollina. Transfektantit, joilla on stabiili SATB1 yliekspressio valittiin viljelemällä 600 ug /ml G418: aa ja 3 viikkoa. RT-PCR, western blot, ja immunofluoresenssivärjäyksen käytettiin vahvistamaan säätelyn SATB1 ilmaisun.

2.4 Potilaat ja näytteet

CRC kasvainten kudokset saatiin 560 potilasta, joilla oli diagnosoitu ja käsiteltiin in Department of Surgery, Pekingin yliopiston School of Oncology vuosina 2005 ja 2008. kukaan potilaista sai kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Viiden neljäkymmentä kaksi näistä potilaista seurattiin leikkauksen jälkeen, ajan, joka on vähintään 3 vuotta. Ja yksityiskohtaiset kliinis tiedot on saatu 520 potilasta. Tuore peräsuolen kasvain ja vastaaviin normaaleihin peräsuolen limakalvo näytteet saatiin 21 potilasta. Näytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Histopatologisia analyysit tehtiin itsenäisesti kaksi patologia. Jotta käyttö kliinisen materiaalien tutkimustarkoituksiin, hyväksynnän Regional Ethical komiteoiden Peking Cancer sairaala, Kiina saatiin. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus on saatu kaikille osallistujille. Kliinisen tutkimuksen suorittanut periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

2.5 uutto Kokonais-RNA ja käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio

SATB1 mRNA ilmentyminen määritettiin käänteistranskriptio-polymeraasia ketjureaktio (RT-PCR). Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin uutetusta RNA: sta (4 ug) käyttämällä EasyScript Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi SuperMix (Invitrogen). PCR-monistus suoritettiin käyttäen seuraavia SATB1 ja beeta-aktiini-geenin-spesifisiä alukkeita: SATB1, 5′-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3 ’(sense) ja 5′-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3′ (antisense); ja beeta-aktiini, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ’(sense) ja 5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’ (antisense). Beeta-aktiini normalisointiin käytettiin SATB1 geenin ilmentymistä. Kaksikymmentäkahdeksan PCR sykliä, jossa kukin sykli koostui ennalta denaturointi 94 ° C: ssa 3 min, denaturaatio 94 ° C: ssa 45 s, pariutuminen 55 ° C: ssa 45 s ja pidennys 72 ° C: ssa 45 s , ja sen jälkeen 28 sykliä on lopullinen venymä 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet erotettiin geelielektroforeesilla 2% agaroosigeelissä, värjättiin etidiumbromidilla. Band intensiteetti mitattiin suoraan Alpha Imager 2200 analyysijärjestelmää (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

2.6 Western Blot analyysi

Solut ja raikas kudoksia lyysattiin 1 × natriumia (SDS) lyysipuskurissa. Yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin sähkön päälle polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Pall Corporation, Mexico City, Meksiko), ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa SATB1 kanin polyklonaalinen vasta-aine (1:500 laimennus, PRS4631; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). Beeta-aktiini (1:10000, Sigma-Aldrich) käytettiin latauskontrollina. Proteiinivyöhykkeet arvioitiin tehostetun kemiluminesenssin (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).

2,7 Immunofluoresenssivärjäys ja Laser-skannaus konfokaalimikroskopia

Soluja viljeltiin lasipeitinlevyille, kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä, permeabilisoitiin 0,1% Triton X-100, pestiin ja blokattiin 5% naudan seerumialbumiinia. Soluja inkuboitiin SATB1 primaarisen vasta-aineen (1:100, PRS4631, Sigma-Aldrich), jota seurasi inkubointi rodamiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:50; Zhongshan Golden Bridge Biotechnology, Peking, Kiina). Peitinlasit asennettu Vectashieldissä kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), joka sisälsi diamino-2-fenyyli (DAPI) ydin- värillä ja tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla, sitten kuvat muodostettiin käyttäen ohjelmistoa (LAS AF 2.2.1 versio , TCSSP5, Leica, Saksa).

2,8 Cell Growth

Solujen kasvua evaluoitiin 3- (4,5-methylthiozol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT). -Soluja (3 x 10

3 solua /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin 24, 48, 72, ja 96 h. MTT (10 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja viljeltiin vielä 4 tuntia. Elatusaineet poistettiin ja 200 ui DMSO: ta (Amresco Inc., Solon, OH, USA) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin mikrolevylukijalla (iMark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Solujen kasvu konstruoitiin piirtämällä absorbanssi (tyhjänä DMSO) aikaa.

2,9 Apoptoosi ja virtaussytometria analyysi

Stable SATB1-yliekspressoivassa, SATB1-knockdovvn, ja tyhjät vektorisäätö soluja (1 × 10

6 solua) viljeltiin 60-mm astiat 48 tuntia ja korjattu. Solut leimattiin propidiumjodidilla ja anneksiiniV. Negatiiviset kontrollit koostuivat leimaamattoman solujen ja asianmukaiset isotyyppikontrolleja. Vähintään 10000 tapahtumien jokaisesta näytteestä kerättiin ja analysoitiin käyttäen virtaussytometrillä (FACSAria, BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

2,10 Cell Cycle Analysis virtaussytometrialla

Stable SATB1 yli-ilmentyvä, SATB1-pudotus, ja tyhjän vektorin kontrolli-soluja viljeltiin 60 mm: n annoksia ja ilman seerumia 24 tuntia. Soluja viljeltiin sitten DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää 48 tuntia. Elävät solut otettiin talteen, kiinnitettiin 70% etanolilla ja analysoitiin virtaussytometrialla.

2,11 Soft Agar Pesäkkeenmuodostusta

Stable SATB1 yliekspressoivia, SATB1-knockdovvn, ja tyhjät vektorisäätö soluja (3 x 10

3) suspendoitiin uudelleen DMEM: iin, joka sisälsi 3 ml 0,4% agaroosia, 20% FBS: ää, 0,5 mM natriumpyruvaattia, 10 m MHEPES, ja 1% penisilliini /streptomysiiniä ja kerrostettiin 4 ml 0,8%: isessa DMEM: ssä on 60-mm astiat. 3 viikon kuluttua, pesäkkeitä laskettiin ja valokuvattiin.

2,12 haavan paraneminen Määritys

Stable SATB1 yli-ilmentyvä, SATB1-pudotus, ja tyhjän vektorin kontrolli-soluja viljeltiin 60 mm: n annoksia kunnes solu tiheys saavutti 90% konfluenssin. Vaakasuora haava luotiin käyttäen steriiliä 10-ul mikrokärjellä. Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) solujätteen poistamiseksi. Kolme eri alueet kussakin lautasen valittiin vertaamaan etäisyys vaeltavien solujen haavan alkuperää. Kuvat otettiin 0 ja 24 tuntia arvioida haavan sulkeutumisen.

2,13 TranswellTM Migration and Invasion Analyysit

Stable SATB1 yliekspressoivia, SATB1-knockdovvn, ja tyhjät vektorisäätö soluja (1 x 10

5) suspendoitiin 200 ui seerumia ja kylvetään saliin on siirtokuoppaan insertin, jossa on 8-um huokoskoko (Corning Costar Corp., Cambridge, MA, USA). DMEM, joka sisälsi 10% FBS pantiin alempaan kammioon kuin kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 24 h, ei-siirretyn solut ylemmässä kammiossa transwell-insertin poistettiin vanupuikolla, ja siirtynyt solujen alapuolella suodattimen kalvon kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Lukumäärä siirtynyt solujen laskettiin 5 satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs- ja valokuvattiin. Protokolla käytetty invaasiomääritys oli sama kuin se, jota migraatiokokeessa, paitsi että siirtokuoppaan insertti päällystettiin matrigeelin (BD Biosciences, Heidelberg, Saksa).

2.14 In vivo Carcinogenesis

Stable SATB1 yli-ilmentyvä ja tyhjän vektorin kontrolli-soluja (2 x 10

6) 100 ul: aan Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS; GibcoBRL, Life Technologies) injektoitiin 5 naarasta 4 viikkoa vanhoja BALB /c-kateenkorvattomissa hiirissä . SATB1 yli-ilmentyvä ja tyhjän vektorin kontrolli solut injektoitiin subkutaanisesti vasemman ja oikean selän kylki kunkin hiiren, vastaavasti. Tuumoritilavuudet mitattiin kahdesti viikossa ja hiiret tapettiin 4 viikkoa. Kasvaimet leikattiin, mitattiin, ja punnitaan. Kasvaimet kiinnitettiin 10% formaliinilla histopatologista analyysiä tai säilytettiin -80 ° C: ssa RT-PCR ja western blot. Kaikki eläinkokeet tehtiin ottaen huomioon kansalliset ja kansainväliset ohjeet. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden Pekingin yliopiston School of Oncology (Luvan numero: 2012-07). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

2,15 Vieraslajisiirteen eläinmallissa Lung ja maksametastaasin

määritti SATB1 ilmentymisen CRC etäpesäke ksenografti hiiri malleja keuhkojen ja maksan etäpesäke. Maksassa etäpesäke malli, yksisoluiset suspensiot vakaa SATB1 yli-ilmentyvä ja tyhjän vektorin kontrolli-soluja (2 x 10

6) 100 ul: aan HBSS: ssä tehtiin hitaasti injektoitiin perna BALB /c-kateenkorvattomissa hiirissä nukutuksessa. Keuhkoissa metastaasin malli, yksisoluiset suspensiot SATB1 yli-ilmentyvä ja tyhjän vektorin kontrolli-soluja (2 x 10

6) 100 ul: aan HBSS: ssä injektoitiin sivusuunnassa häntälaskimoon. Viisi hiiriä Jokaisessa hoitoryhmässä. Hiiret tapettiin 8 viikkoa injektion jälkeen, ja perna, maksa ja keuhkot kirurgisesti poistettu. Lukumäärä ja koko metastaasipesäkkeiden maksassa ja keuhkoissa dokumentoitiin. Näytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla tai säilytettiin -80 ° C: ssa tulevaa analyysia.

2,16 immunohistokemiallinen analyysi kudossiruina

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut peräsuolen kasvain ja vieressä normaali peräsuolen limakalvo näytteet konstruoida kudossiruina (TMA). TMA suojaväleistä (4 pm) poistettiin parafiini ja niihin lisätään arvostellaan alkoholia. Antigeeni haku suoritettiin mikroaaltouunissa EDTA-puskuria. Soluja inkuboitiin 3% vetyperoksidia 15 minuutin ajan endogeenisen peroksidaasi- aktiivisuuden peittämiseksi ja sitten 5% rasvatonta maitoa estää ei-spesifinen sitoutuminen. TMA estää leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa tietyn SATB1 kanin monoklonaalista vasta-ainetta (1:50, ab92307; Abcam, Cambridge, CA, USA) tai kanin monoklonaalinen vasta-aine SATB2 (1:200, TA307098; Origene Technologies, Inc .). Jotta negatiiviset kontrollit, ensisijainen vasta korvattiin PBS: llä. Kaikki leikkeet tutkittiin mikroskooppisesti ja tekee kaksi riippumatonta patologia jotka sokaisi kliinisen tiedon aiheista. Toisin kuin tavalliset osiot, SATB1 tai SATB2 immunohistokemiallisella värjäyksellä kudokseen microarray sirut oli lähes 100% ydin–värjätty tai ei-värjätty varten kasvainkudoksessa tai normaali peräsuolen limakalvon, joten arvioitaessa niiden värjäys, me otettiin huomioon vain värjäytymisen intensiteetti positiivisesti värjättyä ydin. Nuclear intensiteettiä merkitään negatiiviseksi, heikosti positiivinen, kohtalaisen positiivisia tai voimakkaasti positiivinen. Ja suorittaessaan tilastollinen analyysi, yhdistimme potilaiden heikosti positiivinen, kohtalaisen positiivisia ja vahvasti positiivista värjäytymistä yhtenä positiivista värjäytymistä ryhmä.

2,17 Tilastollinen analyysi

SPSS 16.0 ohjelmistolla (SPSS Inc. , Chicago, IL, USA) käytettiin suorittaa tilastolliset analyysit. Kaikki in vitro kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin 3 kertaa. Parittomia 2-tailed

t

testejä käytettiin ryhmää vertailussa varmistettuaan normaaliuden ja varianssin homogeenisuudesta. Tiedot kuvioissa ja tekstissä esitetään keskiarvoina ± keskihajonta. Kaksisuuntainen khiin neliö -testi (χ

2) tai Fisherin tarkkaa testiä käytettiin arvioimaan suhdetta SATB1 ilmaisun ja kliinis tekijät tai SATB2 ilmaisua. Kaplan-Meier selviytymisen analyysiä käytettiin arvioimaan potilaan ennustetta, ja p-arvot laskettiin log rank -testi. Monimuuttujamenetelmin Coxin suhteellisten riskien regressiomallia käytettiin määrittämään vaikutuksen SATB1 ilmaisun ja kliinis tekijöiden potilaiden selviytymistä. P-arvo on 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

3.1 ilmentäminen SATB1 CRC Cell Lines

mRNA ja proteiini ilmentymistä SATB1 6 ihmisen CRC cell linjat, SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, ja LoVo on esitetty kuvassa. 1A. SATB1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen ei ole havaittu SW480, SW620, HT-29, ja HCT116-solut. SATB1 mRNA havaittiin erittäin metastaattinen RKO ja LoVo-solulinjoissa. Lisäksi, SATB1 proteiini ilmentyy suuresti RKO ja LoVo-soluihin. Joten LoVo ja RKO solulinjat valittiin sarjan SATB1 Knockdown kokeita, ja SW480 solulinjoja varten SATB1 yli-ilmentymisen kokeita.

(A) SATB1 mRNA ja proteiini ilmaisuja määritettiin (A) 6 CRC solulinjat , SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, ja LoVo; (B) edustava Kolorektaalituumorien ja vastaaviin normaaleihin limakalvon; (C) kohtuullisesti ja huonosti eriytetty kasvaimet ja normaali limakalvo; ja (D) edustava Kolorektaalituumorien ja Hyväksytty synkronoitu maksan etäpesäkkeiden pesäkkeitä kasvaimia. SATB1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen määritettiin RT-PCR: llä ja western blot, vastaavasti, ja normalisoidaan P-aktiini. T, Kolorektaalituumorien; N, vastaaviin normaaleihin limakalvon; M, synkroninen maksan etäpesäkkeiden pesäkkeitä kasvaimia.

3,2 ilmentäminen SATB1 Alkeisyhdistyksessä CRC ja Maksan metastaasin Foci

Ilmaisu taso SATB1 mRNA ja proteiini määritettiin ensisijainen CRC kasvain ja Hyväksytty ei-kasvain limakalvon yksilöitä. Niistä 21 sovitetun tapauksissa SATB1 mRNA: ta ja proteiinia havaittiin 17 Tuumorinäytteissä mutta ei ei-kasvain limakalvon näytettä (Fig. 1 B). Lisäksi SATB1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen olivat korkeammat huonosti eriytetty Tuumorinäytteissä kuin kohtuullisesti erilaistunut kasvain näytteissä (kuvio. 1 C). SATB1 mRNA ja proteiini ilmaisun ensisijainen CRC oli samanlainen kuin Hyväksytty synkroninen maksan etäpesäkkeiden pesäkkeitä (Fig. 1 D).

3,3 tukahduttaminen SATB1 Expression Vähentää Cell Proliferation, Colony Formation, Migration, ja Invasion in vitro

arvioimiseksi roolin SATB1 CRC etenemisen kolme vakaa SATB1-pudotus LoVo solulinjat perustettiin käyttäen shRNA. SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, ja SATB1-shRNA3 solulinjat olivat tehokkaita vähen- tämisessä SATB1 mRNA ja proteiinin ilmentymisen (Fig. 2A). Proteiinin ilmentyminen SATB1 oli tuskin havaittavissa SATB1-shRNA1 ja SATB1-shRNA2 soluissa. SATB1 mRNA: n ekspressio väheni lähes 90%: in SATB1-shRNA1 soluja ja 70% ja 60% SATB1-shRNA2 ja SATB1-shRNA3 soluja, vastaavasti (Fig. 2A). Kasvuvauhti kaikkien SATB1-shRNA solulinjoissa oli hitaampaa kuin tyhjän vektorin ohjaus soluja (p 0,05, Fig. 2B). Kuten on esitetty kuviossa. 2C, SATB1-shRNA1 soluilla oli huomattavasti suurempi prosenttimäärä apoptoottisten solujen kuin kontrolli solut (45,1% V.S. 20,3%, p 0,01). Kuitenkin prosentuaalinen apoptoottisten solujen ei ollut merkitsevästi erilainen SATB1-shRNA2, SATB1-shRNA3, ja valvonta-solut (tuloksia ei ole esitetty). SATB1 pudotus indusoi G1-vaiheen solusyklin pysähtymisen: prosenttiosuus solujen G0 /G1 vaihe oli korkeampi SATB1-shRNA1 (46,4%) ja SATB1-shRNA2 soluja (45,6%) kuin vertailuryhmässä soluissa (36,8%) (p 0,01; Fig. 2D). Sen sijaan, prosenttiosuus soluja G2 /M: n ja S vaiheissa oli merkitsevästi pienempi shRNA1 ja shRNA2 soluja kuin kontrollisoluissa (p 0,01; Fig. 2D). Solusyklin muutoksia ei havaittu SATB1-shRNA3 soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot osoittivat, että SATB1 voi olla tärkeä rooli edistettäessä kasvua ja selviytymistä CRC soluja.

(A) Kolme stabiili SATB1-Knockdown LoVo solulinjat perustettiin käyttäen shRNA. Solut transfektoitu tyhjällä vektorilla toimivat vertailuryhmänä. Tehoa SATB1 Knockdown varmistettiin RT-PCR (top vasen paneeli), western blot (alhaalla vasemmalla paneeli), ja immunofluoresenssilla (oikea paneeli). β-aktiini käytettiin yhdenvertaista lastaus. (B) Solujen proliferaatio tyhjän vektorin ohjaus, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, ja SATB1-shRNA3 solut määritettiin MTT-määrityksellä. (C) apoptoosi SATB1-shRNA1 ja tyhjän vektorin kontrolli solut määritettiin virtaussytometrialla analysointia PI ja anneksiini V-värjäyksellä. (D) Virtaussytometrianalyysi solusykliaktiivisuuden tyhjiin vektorisäätö, SATB1-shRNA1, ja SATB1-shRNA2 soluissa. (E) Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista tyhjän vektorin ohjaus, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, ja SATB1-shRNA3 soluissa 3 viikon kuluttua. * P 0,001. (F) Migration tyhjien vektorisäädössä SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, ja SATB1-shRNA3 soluista määritettiin haavan paranemista määrityksellä (vasen paneeli) ja transwell migraatiokokeessa (ylhäällä oikealla paneeli). Määrä siirtynyt solujen transwell migraatiokokeessa kvantifioitiin laskemalla solujen alapuolella suodattimen kalvon 5 satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs- (alempi oikea paneeli). * P 0,001, kuinka monen solujen verrattuna kontrolliin. (G) Cell hyökkäys tyhjän vektorin ohjaus, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, ja SATB1-shRNA3 soluista määritettiin Matrigel siirtokuoppaan invaasiomääritys. Määrä tunkeutuu soluihin kvantitoitiin laskemalla solujen alapuolella suodattimen kalvon 5 satunnaisesti valitun mikroskooppikentästä. * P 0,001, määrä hyökkäsi solujen verrattuna kontrolliin.

knockdovvn SATB1 ilmaisun vähensi pesäkkeiden muodostumista korko ja pesäkkeen koko (Fig. 2E). Kontrollisoluissa, lähes 100-120 pesäkkeitä voitiin havaita satunnaisesti valittu mikroskooppikentästä. Sen sijaan pesäkkeiden muodostuminen oli paljon vähemmän kolmen SATB1-shRNA solut (shRNA1: 28,75 ± 8,5; shRNA2: 34,5 ± 7,8, shRNA3: 40,5 ± 4,5). Knockdovvn SATB1 vähensi soluliikkuvuus osoituksena laajemman haavan sulkemiset 3 SATB1-shRNA solulinjojen verrattuna niihin kontrollisoluissa (Fig. 2F). Invasiivisen kyky oli merkitsevästi pienempi SATB1-shRNA1, shRNA2, ja shRNA3 soluja kuin kontrolliryhmässä soluissa (p 0,001; Kuva. 2G). Nämä tulokset olivat yhtäpitäviä Transvvell- migraatiokokeessa (Fig. 2F).

Lisäksi testasimme kasvunopeus ja muuttoliike /invaasion kyky RKO solulinjoissa. SATB1-knockdovvn RKO solulinjoissa määritettiin käyttäen shRNA1 (nimeltään SATB1-shRNA1 RKO solulinjoilla). Molemmat mRNA: ta ja proteiinia tasot SATB1 oli tehokkaasti vaimentua mukaan shRNA1 (Fig. 3A). Yhdenmukainen SATB1 Knockdown kokeita LoVo solulinjoissa, kasvuvauhti SATB1-shRNA1 RKO solulinjoissa oli hitaampaa kuin tyhjän vektorin ohjaus soluja (p 0,05, Fig. 3B), ja SATB1-shRNA1 RKO solulinjat osoittivat myös G1-vaiheen solusyklin pysähtymiseen (Fig. 3C). Migraatiokokeessa kunhan näyttöä siitä knockdovvn SATB1 geeni voisi vähentää solun liikkuvuus (p 0,001 Fig. 3d). Ja RKO solulinjoissa, invasiivista kyky heikkeni huomattavasti alaspäin säätäminen SATB1 ilmaisu, kuten on esitetty kuvion. 3E (p 0,001).

(A) SATB1-Knockdown RKO solulinjoissa määritettiin käyttäen shRNA1. Solut transfektoitu tyhjällä vektorilla toimivat vertailuryhmänä. Teho SATB1 pudotus varmistettiin RT-PCR: llä ja western blot. β-aktiini käytettiin yhdenvertaista lastaus. (B) Solujen lisääntyminen tyhjän vektorin ohjaus, ja SATB1-shRNA1 RKO soluihin määritettiin MTT: llä. (C) Virtaussytometrianalyysi solusykliaktiivisuuden tyhjiin vektorisäätö, SATB1-shRNA1 RKO soluissa. (D) Migration tyhjien vektorisäädössä SATB1-shRNA1 RKO soluihin määritettiin siirtokuoppaan migraatiokokeessa. * P 0,001, kuinka monen solujen verrattuna kontrolliin. (E) Cell hyökkäys tyhjän vektorin ohjaus, SATB1-shRNA1 RKO soluihin määritettiin Matrigel TranswellTM invaasiomääritys. * P 0,001, määrä hyökkäsi solujen verrattuna kontrolliin.

3.4 yliekspressio SATB1 Edistää Cell Proliferation, Colony Formation, Migration, ja Invasion in vitro

varmistamiseksi edelleen rooli of SATB1 CRC eteneminen, joka on SATB1-yliekspressoivassa solulinjan määritettiin käyttämällä huonosti metastaattinen SW480-soluissa. SATB1 yliekspressio varmistettiin western blot, RT-PCR, ja immunofluoresenssivärjäyksen (Fig. 4A). Kasvuvauhti oli suurempi SATB1 yli-ilmentäviä soluja kuin tyhjän vektorisäätö soluja (p 0,05; Fig. 4B). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen oli pienempi SATB1 yli-ilmentäviä soluja kuin kontrolliryhmän solujen (28,7% V.S. 36,1%, p 0,01; Fig. 4C). Yliekspressio SATB1 edistetään solusyklin etenemistä G0 /G1 vaiheessa G2 /M ja S vaiheet (56,3% G0 /G1 vaihe SATB1-yliekspressoivassa solulinjoissa vs. 63,6% G0 /G1 vaiheeseen säätökennoja) (Fig. 4D). Colony muodostamisnopeudella ja pesäkkeen koko oli suurempi SATB1 yli-ilmentäviä soluja (67,5 ± 9,5) kuin vertailuryhmässä soluissa (24,75 ± 2,75) (kuvio. 4E). SATB1 yliekspressio lisäsi migraatiota osoituksena täydellisen haavan sulkeutumisen ja muuttivat soluja SATB1 yli-ilmentäviä soluja (Fig. 4F). Lisäksi, invaasio kyky oli suurempi SATB1 yli-ilmentäviä soluja (109 ± 8,7) kuin kontrolli-soluissa (12,75 ± 4,5) (Fig. 4G).

(A) SW480-soluja, jotka oli transfektoitu pcDNA3: lla 0,1-SATB1 ilmentämisvektoriin tai tyhjän vektorin. Säätelyä SATB1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen varmistettiin RT-PCR (top vasen paneeli), western blot (alhaalla vasemmalla paneeli), ja immunofluoresenssilla (oikea paneeli). β-aktiini käytettiin yhdenvertaista lastaus. (B) Solulisääntyminen tyhjien vektorisäädön ja pcDNA3.1-SATB1 soluista määritettiin MTT: llä. (C) apoptoosi tyhjän vektorin ohjaus ja pcDNA3.1-SATB1 solut määritettiin virtaussytometrialla analysointia PI ja anneksiini V-värjäyksellä. (D) Virtaussytometrianalyysi solusykliaktiivisuuden tyhjiin vektorisäädön ja pcDNA3.1-SATB1 soluissa. (E) Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumista tyhjän vektorin ohjaus ja pcDNA3.1-SATB1 soluissa 3 viikon kuluttua. (F) Migration tyhjien vektorisäädön ja pcDNA3.1-SATB1 soluista määritettiin haavan paranemista määrityksellä (vasen paneeli) ja transwell migraatiokokeessa (oikea paneeli). * P 0,001, kuinka monen solujen verrattuna kontrolleihin. (G) Cell hyökkäys tyhjän vektorin ohjaus ja pcDNA3.1-SATB1 soluista määritettiin Matrigel transwell invaasiomääritys (* p 0,001).

3.5 SATB1 edistää kasvua ja metastaasin CRC Solut vivo

Seuraavaksi arvioitiin vaikutus SATB1 ilmentymisen vaikutus CRC karsinogeneesin in vivo, mRNA ja proteiini ilmentymistä SATB1 olivat suurempia kasvainten SATB1 yli-ilmentäviä soluja kuin kasvainten tyhjän vektorin solut (Fig. 5A). Kasvaimet alkaen SATB1 yli-ilmentäviä soluja oli nopeamman kasvun kasvaimia ohjauspaneelista soluista, mikä oli yhdenmukainen in vitro kasvu (p 0,01, Fig. 5A, yläpaneeli). Kasvaimen painot SATB1 yli-ilmentäviä soluja oli noin 5-6 kertaa painavampi kuin niillä, tyhjän vektorin soluihin, mikä osoittaa, että SATB1 voisi edistää kasvua ja peräsuolen kasvaimia in vivo (Fig. 5A, alapaneeli).

(A) mRNA ja proteiini ilmauksia SATB1 inxenograft kasvainten tyhjän vektorin ohjaus ja pcDNA3.1-SATB1 solut määritettiin RT-PCR ja western blot, vastaavasti (ylhäällä vasen paneeli). Sitten kasvaimen kasvua määritettiin in vivo ksenograftimallissa. Vakaa SATB1-yliekspressoivassa ja tyhjät vektorisäätö soluja (2 x 10

6) injektoitiin subkutaanisesti vasempaan ja oikeaan selkä kylki, vastaavasti, 5 BALB /c kateenkorvattomissa hiirissä. Kasvainten koot mitattiin kahdesti viikossa ja hiiret tapettiin 4 viikkoa.