Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

miR-630 on raportoitu olevan modulaattori useiden syöpien, mutta mekanismi, jolla se vaikuttaa radioresistance edelleen tuntematon. Meidän tavoitteena oli tunnistaa molekyylitasolla funktio miR-630 ja sen sääntelymekanismi kolorektaalisyövässä (CRC) solulinjat.

Menetelmät

yli-ilmentyminen ja menettämisestä toiminta analyysit miR-630 oli suoritetaan CRC solulinjoissa mittaamalla niiden kasvua ja apoptoosin jälkeen ionista säteilyä (IR). Kohdegeenien havaittiin kautta dual-lusiferaasianalyysissä ja Western blot. Kromatiinin immunosaostus määritys suoritettiin tunnistaa transkription säätelee miR-630, ja demetylointi koe suoritettiin myös.

Tulokset

miR-630 ilmentyminen havaittiin positiivinen korrelaatio radioherkkyyttä in CRC solulinjoja (

p

0,05). Sen jälkeen IR hoito, miR-630 aiheuttaman apoptoosin soluissa; kuitenkin päinvastainen havaittiin, kun miR-630 säädeltiin vähentävästi (

p

0,05). BCL2L2 ja TP53RK tunnistettiin kohdegeenien miR-630, ja toiminta miR-630: n havaittiin riippuu näiden kahden geenejä (

p

0,05). Lisäksi todisteet osoittivat, että CREB säätelee tasoa miR-630, ja demetylaatio voi nostaa miR-630 tasot (

p

0,05).

Johtopäätös

CREB -miR-630-BCL2L2 ja TP53RK käsittävät uudenlainen signalointiryöpyn säätelevä radioherkkyyttä CRC solulinjoissa indusoimalla apoptoosia ja kuolema.

Citation: Zhang Y, Yu J, Liu H, Ma W, Yan L, Wang J, et al. (2015) Novel Epigeneettiset CREB-miR-630 Signaling Axis säätelee radioherkkyyttä sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (8): e0133870. doi: 10,1371 /journal.pone.0133870

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, SAKSA

vastaanotettu: toukokuu 25, 2015; Hyväksytty: 3. heinäkuuta 2015 Julkaistu: 11 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Major Program of Science and Technology Program Guangzhou (nro 201300000087), Research Fund of Public hyvinvoinnin Health Industry of National Health ja perhesuunnittelu komission Kiinan (No.201402015 ja nro 201502039), National Key Technology R 0,05.

Tulokset

Expression tasoja miR-630 vähenivät CRC soluissa säteilytyksen jälkeen

Ensimmäinen tasot asennuspalveli- 630 ja proliferatiivista kapasiteettia sarja CRC solulinjojen määritettiin onko miR-630 voi toiminnallisesti vaikuttaa ionisia radioherkkyyttä. Näennäinen estävä vaikutus solujen lisääntymistä jälkeen ionista säteilyä havaittiin SW837, LS174T, ja HR8348 soluja, mikä osoitti erittäin endogeenisen miR-630 ilmaisu; sen sijaan, heikko inhibitio hinnat havaittiin HT29, SW480, ja HCT116-solut, jotka oli lieviä miR-630 ilmentymistä (kuvio 1A ja 1 B). Merkittävä positiivinen korrelaatio miR-630 ja radioherkkyyttä todettiin kaikissa kuudessa testatuissa solulinjoissa.

(A ja B) Endogeeninen miR-630 ilmaisun ja IR inhiboivan nopeus serial CRC solulinjojen (C) asennuspalveli- 630 pinnan lasku jälkeen säteily verrattuna niiden lähtötaso. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Tähti osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia: * (P 0,05), ** (P 0,01).

Solulinjat SW837 ja LS174T, joka osoitti korkeimman ekspressiotasoja, valittiin sitten säteilytys . Sädehoitoa toistettiin kolmesti, jossa kukin mittainen 3 Gy IR. Elävät solut jatkoviljeltiin 5 d säteilytyksen jälkeen, jonka jälkeen miR-630 ekspressiotason tutkittiin (kuvio 1 C). Merkittävä väheneminen miR-630 tasot havaittiin säteilytyksen jälkeen molemmissa solulinjoissa verrattuna niiden alkuperäisestä tasosta.

ektooppinen ilmentyminen miR-630 tehostetun ioniset säteilyn aiheuttamista sytotoksisuutta CRC solulinjoissa

tutkia roolia miR-630 moduloinnissa CRC radioherkkyyttä, miR-630 yliekspressoitiin HT29 ja SW480-soluissa käyttämällä miR-630 jäljittelee. Myöhemmin miR-630-transfektoituja soluja säteilytettiin 3 Gy IR ja alistettiin CCK-8 määrityksessä sekä niiden ohjaus kollegansa. Transfektio miR-630 johti merkittävään kasvuun soluproliferaation inhibointi jälkeen IR altistuksen verrattuna kontrolliryhmiin (kuvio 2A) in SW480 ja HT29. Kaspaasi 3/6 toiminta miR-630-transfektoitujen solujen ja kontrollisolujen 24 tunnin kuluttua tai ilman 3 Gy IR mitattiin myös.

(A) miR-630 lisäsi merkittävästi IR-indusoidun inhibition määrä (B ja C) miR-630 voimakkaasti lisääntynyt kaspaasi 3 ja kaspaasi 6 toimintaa seuraava IR altistuksen (D ja E) miR-630 huomattavasti apoptoosia korko jälkeen IR altistuksen. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Tähti osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia: * (P 0,05), ** (P 0,01).

kaspaasi 3/6 toiminta oli voimakkaasti kasvanut miR-630 seuraava IR altistus HT29 ja SW480-soluissa verrattuna NC-soluissa (kuvio 2B ja 2C), mikä on merkittävä rooli miR-630 IR-välitteisen apoptoosin aktivoitumisen. Lisäksi apoptoosimäärityksessä kuvitettu että miR-630 voi johtaa huomattavasti apoptoosin korko kahden solun säteilytyksen jälkeen (kuvio 2D ja 2E). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-630 herkistää CRC solujen IR tehostamalla IR-indusoitua apoptoosia ja inhiboimalla solujen eloonjäämistä, kun IR.

inhibitio miR-630 vähensivät IR herkkyys CRC solulinjoissa

menettämisestä toiminnon määritys suoritettiin SW837-soluissa käyttämällä miR-630 estäjiä. Proliferaationopeus oli lisääntynyt SW837 transfektoitu miR-630 estäjä verrattuna ohjaus SW837-solujen käsiteltiin IR (kuvio 3A). Esto miR-630 myös merkittävästi vähentynyt kaspaasi 3/6 toimintaa SW837 solulinjoissa jälkeen IR altistuksen (kuvio 3B ja 3C). Nämä tulokset osoittivat, että menetys miR-630 toiminto vähentää radioherkkyyttä CRC solulinjoissa.

(A) esto miR-630 vähensi merkittävästi IR aiheuttama esto (B ja C) estäminen miR-630 voimakkaasti vähentynyt kaspaasi 3 ja kaspaasi 6 toimintaa seuraavien IR altistumista. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Tähti osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia: * (P 0,05), ** (P 0,01).

TP53RK ja BCL2L2 ovat kohdistu suoraa miR-630

Tutkitaan molekyylitason mekanismeja, joilla miR-630 kasvaa solujen herkkyys IR, mahdollisia kohteita miR-630 etsittiin bioinformatiikan tietokantoihin Target-Scan ja Miranda. 3′-UTR TP53RK ja BCL2L2, mahdollisia sitoutumiskohtia Mir-630 ennustettiin (kuvio 4A). Vahvistaa, onko miR-630 suoraan kohdistuu 3′-UTR näistä geeneistä, rakensimme dual-lusiferaasireportteri plasmideja 200-bp: n fragmentin mutantti tai villityypin 3′-UTR-sekvenssin, joka sisälsi ennustetun miR-630 tunnistuskohdan. Dual-Luciferase Reporter Assay System sitten hyväksyttiin sen määrittämiseksi miR-630 säätelee ilmentymistä ennustetun ehdokkaiden SW480 ja SW837-soluissa. Normalisoitu fluoresenssi voimakkuus toimittaja oli merkittävästi pienempi syöpäsoluissa kotransfektoitiin miR-630 jäljittelee ja villin tyypin 3′-UTR verrattuna kontrolliryhmään. Sen sijaan ei ole merkittävää eroa ei havaittu välillä kontrolliryhmän ja solut ko-transfektoitiin miR-630 matkii ja mutantti-3′-UTR (kuvio 4B ja 4C).

(A) Ennustettu sitoutumiskohdat miR -630 3′-UTR of TP53RK ja BCL2L2 (B ja C) Fluoresenssi vähenee merkittävästi miR-630 jäljittelee ja villin tyypin dual-lusiferaasireportteriplasmidin transfektoituja ryhmä, vaikka se ei osoittanut merkittävää muutosta luki- 630 jäljittelee ja mutantti dual-lusiferaasireportteriplasmidin-transfektoiduissa ryhmä (D) TP53RK ja BCL2L2 proteiinin ekspressiotasot laskivat miR-630-transfektoiduissa soluissa. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Tähti osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia: * (P 0,05), ** (P 0,01).

Edellä olevat tulokset tukivat lisäksi Western blot-analyysit. Proteiinin ilmentymisen analyysi paljasti jyrkkään laskuun TP53RK ja BCL2L2 Mir-630-transfektoiduissa HT29 ja SW480-soluissa verrattuna negatiivisen kontrollin soluissa (kuvio 4D). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että miR-630 voi sitoutua suoraan 3′-UTR TP53RK ja BCL2L2 tukahduttaa geenin ilmentymistä.

Jos vaikutus miR-630 on erityinen vaikutus miR-630 yliekspressio olisi tukahdutti koekspressio TP53RK ja BCL2L2 proteiineja. Plasmidit pcDNA3.1 /TP53RK ja pcDNA3.1 /BCL2L2, joka voi nopeasti nostaa tasoa TP53RK ja BCL2L2, vastaavasti, ko-transfektoitiin miR-630 jäljittelee osaksi HT29 ja SW480-soluissa. Sitten caspase3 /6: n aktiivisuuden määritykset suoritettiin. CCK-8-määritys osoitti, että co-ilmentyminen TP53RK tai BCL2L2 proteiinin miR-630 jäljittelee vähensi esto, kun IR molemmissa solulinjoissa (kuvio 5A). Caspase3 /6 kertaluokkamuutos jälkisäteilytys in miR-630-transfektoitujen SW480 ja LS174T solujen väheni merkittävästi transfektion jälkeen pcDNA3.1 /TP53RK ja pcDNA3.1 /BCL2L2 (kuvio 5B ja 5C).

(A ) TP53RK tai BCL2L2 proteiini aiheutti merkittävästi vähentynyt IR inhiboivan korko miR-630 transfektoituja solulinjoja. (B ja C) TP53RK tai BCL2L2 proteiinin vähentynyt taitteen kaspaasi 3 ja kaspaasi 6 toimintaa seuraava IR altistuminen miR-630 transfektoituja solulinjoja. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Tähti osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia: * (P 0,05), ** (P 0,01).

Solun metylaatiostatuksen ja transkriptiotekijä CREB säädellä miR-630 ilmaisu

DNA: n metylaatio voi säädellä ilmentymistä miRNA [11, 12]. Tässä tutkimuksessa, miR-630 ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut käsittelemällä 5-atsa-CDR HT29 ja SW480-soluissa (kuvio 6A). Tämä tulos osoittaa, että DNA: n metylaatio korreloi muutoksiin miR-630 ilmentymisen aikana CRC-etenemisen.

(A) 5-atsa-CdR merkittävästi voimistunut miR-630 lauseke (B) CREB ennustettiin sitoutuvan 5′-UTR miR-630 isäntä geenin ARIH1 (C) CREB sisällä ARIH1 promoottorialueen aiheuttama lusiferaasiaktiivisuus ja mutaatio ennustettujen CREB sitoutumiskohtien päinvastainen sen vaikutus (D) pelimerkin vahvisti sitoutumisen CREB on ARIH1 promoottori. Virhepalkit edustavat keskiarvoa kolmesta erillisestä määrityksestä ± keskihajonta (SD). Tähti osoittaa tilastollisesti merkittäviä muutoksia: * (P 0,05), ** (P 0,01).

ARIH1, proteiinia koodaavan geenin, joka sisältää miR-630-geenin sen eksonissa, on suuri CpG saari. Tämä viittaa siihen, että miR-630 ilme riippuu sääntelyn ARIH1 geenin. Kolme eri ohjelmia käytettiin ennustamaan TF: ille säätelevä miR-630. Meidän tiedot osoittivat, että CREB voi sitoutua 5′-UTR ARIH1 (kuvio 6B). Voit selvittää CREB voi moduloida taso miR-630, tutkittiin vaikutusta CREB mutanttien ja villityypin ARIH1 promoottorisekvenssin sisältävä ennustettu CREB-sitoutumiskohtia. Vuonna SW480-soluissa, havaitsimme, että CREB-indusoidun lusiferaasiaktiivisuus väheni ryhmässä, jossa ARIH1 promoottorialue oli mutatoitunut (kuvio 6C). Lisäksi ChIP määrityksiä vahvisti, että CREB voi sitoutua suoraan ARIH1 promoottorin (kuvio 6D).

Keskustelu

Huolimatta todisteita siitä miR-630 syövän, vain harvat tutkimukset ovat tutkineet sen toimintaa yksityiskohta. miR-630 on tunnistettu aiheuttavan solukuolemaa haimasyövän ja säännellä HER-huumeita herkkyyttä HER2-yliekspressoivassa rintasyövän soluja vaikka IGF- 1 R [12, 13]. miR-630 inhiboi solun kasvua, vaikka Cdc7 kinaasin ihmisen keuhkosyövän soluja [14]. Lisäksi kasvun pysähtymisen eturauhassyövän gefitinibin ja luteoliini osittain aiheuttamien miR-630 [15]. Kuitenkin rooli ja ekspressiokuviota miR-630 radioherkkyyttä CRC ei ole kuvattu tähän mennessä.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet mekanismi, jonka miR-630 säätelee radioherkkyyttä CRC solulinjoissa. Ensinnäkin ilmaus miR-630 ja radioherkkyyttä kuusi CRC solulinjojen havaittiin. Tulokset osoittivat positiivista korrelaatiota miR-630 ilmaisun ja radioherkkyyttä. Lisäksi miR-630 tason havaittiin olevan merkittävästi vähentynyt toistuvan IR, paljastaen että miR-630 voi olla keskeinen rooli säätelyssä radioherkkyyttä.

Seuraavaksi mahdollinen toiminta miR-630 IR vastauksena CRC solulinjojen tutkittiin. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-630 HT29 ja SW480-solujen määrä nousi syöpäsolun apoptoosin ja kuolema

in vitro

. Ehtyminen miR-630 SW837-soluissa oli päinvastainen vaikutus. Näin ollen, nämä tulokset tarjoavat todisteita siitä, että miR-630 edistää radioherkkyyttä CRC.

molekyylitason mekanismia, jonka miR-630 moduloi CRC radioherkkyyttä tutkittiin tarkemmin. miR-630: n havaittiin negatiivisesti säätelemään BCL2L2 ja TP53RK suoraan kohdistamalla 3′-UTR. BCL2L2, jota kutsutaan myös BCL-w, kuuluu perheeseen BCL-2-proteiineja. Yli-ilmentyminen tämän proteiinin on havaittu useissa syövissä, mukaan lukien CRC [16, 17]. BCL2L2 myös edistää solujen eloonjäämistä ja vähentää apoptoosin alla apoptoottinen stressi [18, 19]. TP53RK on kinaasi, joka hillitsee apoptoosia mitoosi stressi [20]. Nämä havainnot osoittavat, että miR-630 moduloi radioherkkyyttä kautta signalointikaskadin, johon BCL2L2 ja TP53RK.

Äskettäin E2F1 säädelty ribonukleaasi DROSHA on havaittu edistävän miR-630 biosynteesin sisplatiini-altistetaan syöpäsoluja [21] . Esillä olevassa tutkimuksessa, lusiferaasianalyysissä tulokset osoittivat, että CREB voi sitoutua 5′-UTR ARIH1, joka on isäntä geenin miR-630, ja poistetaan CREB-sitoutumiskohdat voivat kumota tämän toiminnon. Lisäksi ChIP määrityksessä osoitti, että CREB voi spesifisesti sitoutua promoottorialueen miR-630, mikä viittaa siihen, että CREB voi olla TF vastaa aloittamista miR-630 ilmentymistä. CREB on proteiini, joka sitoutuu DNA-sekvenssi cAMP-vaste-elementti. CREB välittää kohdegeenin transkription kautta cAMP signaali aktivaation [22]. Lisäksi CREB on tarpeen lisääntymistä, kasvua, selviytymistä, ja erilaistumista monissa solutyypeissä [23]. Viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että CREB-Ser133 fosforylaatio johtaa tukahduttaminen anti-apoptoottisen geenejä, aiheuttaen siten solu- kuoleman [24, 25]. Tässä tutkimuksessa, alhainen DNA: n metylaatio myös lisää merkittävästi miR-630 ilmentyminen CRC solulinjoissa.

Yhteenvetona, meidän tutkimus osoittaa uuden signalointireitin välillä CREB ja BCL2L2 ja TP53RK. Tämänhetkiset tulokset tarjoavat tärkeitä oivalluksia mekanismeja, joilla TF: ien ja miRNA moduloida syöpäsolun radioresistance. Meidän havainnot korostavat myös terapeuttista potentiaalia näiden molekyylien CRC hoidossa.

tukeminen Information

S1 Data. Raakadataa sarja on ”Data.zip”, alkuperäiset tiedot Tämän kokeen saa sitä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0133870.s001

(ZIP) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Li Liang varten käsikirjoituksen tarkistamista.