Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cell-tunkeutuva peptidejä (CPP) ovat osoittautuneet erittäin tehokas kuin solunsisäistä pakettiautoa eri terapeuttisten. On kuitenkin olemassa joitakin huolta epäspesifiset levinneisyys ja sytotoksisuuden CPP tehokkaan syöpähoitojen. Tässä perustuva solu-läpitunkeva motiivi syövän vastainen peptidin, buforin Hb, suunnittelimme useita CPP johdannaiset syöpäsolun spesifisyys. Niistä johdannaiset, 17 aminohapon peptidi (BR2) havaittiin olevan syöpää spesifisyys ilman toksisuutta normaaleille soluille. Sen jälkeen suunnattiin erityisesti syöpäsolujen vuorovaikutuksessa gangliosidien, BR2 tuli soluihin lipidivälitteiset macropinocytosis. Lisäksi BR2 osoitti korkeampi kalvo translokaation tehokkaammin kuin tunnetun CPP Tat (49-57). Kyky BR2 syövän-specific drug carrier osoitettiin fuusioimalla BR2 yhden ketjun vaihtelevaan fragmentti (scFv) suunnattu mutatoidun K-ras (G12V). BR2-fuusioitunut scFv indusoi korkeamman apoptoosin kuin Tat-fuusioitu scFv K-ras mutatoituja HCT116-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että uusi solu-tunkeutuva peptidi BR2 on suuri potentiaali käyttökelpoinen lääkeaineen kantoaine syöpäsolun spesifisyys.

Citation: Lim KJ, Sung BH, Shin JR, Lee YW, Kim DJ, Yang KS , et ai. (2013) Syöpä Erityiset Cell-Penetrating Peptide, BR2, että tehokas Delivery scFv osaksi syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (6): e66084. doi: 10,1371 /journal.pone.0066084

Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 marraskuu 2012; Hyväksytty: 06 toukokuu 2013; Julkaistu: 11 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Lim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Hanke rahoitetaan opetusministeriön, Science and Technology (2011-0031955). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suotuisia vaikutuksia monia äskettäin löydetyt mahdolliset terapeuttiset aineet, kuten proteiinit, nukleiinihapot, ja hydrofiilisten lääkkeiden, on rajallinen, koska niiden kyvyttömyydestä saavuttaa sopivan solunsisäisen tavoitteet [1], [2]. Siten lukuisia keinoja, kuten mikroinjektio, eletroporation, liposomimuodossa ja käyttö virusvektoreita on tutkittu tehostaakseen lääkeannostelun [3], [4]. Yksi suuri huoli näistä tekniikoista on niiden huono soluspesifisyys [4], [5]. Näin ollen, kehittäminen kohdespesifinen lääkkeenantojärjestelmä on ensisijainen huolenaihe parantaa terapeuttista tehokkuutta huumeiden ja vähentää niiden tehokasta annosta ja sivuvaikutuksia [6], [7].

Cell-tunkeutuva peptidit ( ankkurihinaajaan), jota kutsutaan myös proteiinia transduktiodomeeneja, ovat kiinnittäneet erityistä huomiota vaihtoehtona solunsisäinen lääkkeenantovälineeseen keksimisen jälkeen ensimmäisen CPP, Tat, vuonna 1988 [8]. Ankkurihinaajaan ovat lyhyitä peptidejä, jotka koostuvat alle 30 aminohappoa ja koostuu pääasiassa perus, positiivisesti varautuneita aminohappoja (esim Arg, Lys ja His), jotka on kyky translokoida solukalvon läpi ja toimittaa erilaisia ​​solun läpäisemättömän lasteja poikki solukalvon [9], mukaan lukien proteiinit [10], nukleiinihapot [11], siRNA [12], peptidi-nukleiinihapot (PNA: t) [13], pieni molekyyli, hoito [14], kvanttipisteiden [15], ja MRI aineet [16]. Vaikka tarkkaa mekanismia CPP on tuntematon, viime mekaaniset tutkimukset viittaavat siihen, että niiden soluunottoa tulokset alkuperäisestä nopea sähköstaattinen vuorovaikutus solukalvon seuraa endosomaalisen otto [17], [18].

käyttäminen CPP varten solunsisäisen toimituksen monenlaisia ​​makromolekyylien on voimakas lähestymistapa, koska niiden monipuolisuus pariksi helposti funktionalisointi liittyvät lastin ja korkea toimitus hyötysuhde erilaisiksi solulinjoihin, voittaminen haasteet kohtaavat usein muiden toimitustavat [19], [20]. Näin ollen, monet tutkimukset ovat keskittyneet kehittämään uusia CPP; käytettävissä olevien CPP ominaisuuksiltaan erilaisten, kuten lisääntynyt vakaus ja tehokas rahdin toimitus, kasvaa [17].

Vaikka mahdollisuudet CPP toimitus- aineina on suuri, niiden puute solun spesifisyyden, sytotoksiset vaikutukset ja odottamattomia sivuvaikutuksia ovat suuria huolenaiheita niiden kehityksen lääkeannostelun ajoneuvot [21]. Syövän hoito, CPP soluspesifisyys on erityisen tärkeää, jotta sivuvaikutukset normaaleihin soluihin minimoidaan [22], [23]. Sen vuoksi on olemassa voimakas tarve kehittää syövän-spesifisillä ja ei-myrkyllisiä CPP tehokkaan syövän hoitomuotoja.

Olemme aiemmin raportoitu, että voimakas antimikrobinen peptidi, buforin IIb (RAGLQFPVG [RLLR]

3), on vahva solu-läpitunkeva kyky ja syövänvastainen vaikutus erilaisia ​​syöpäsolulinjoja [24], [25]. Vaikka buforin Hb osoitti selektiivinen sytotoksisuus syöpäsoluja vastaan, se vaikutti myös elinkelpoisuus normaalien solujen suurilla pitoisuuksilla. Kehittää buforin IIb tehokkaana lääkkeenantovälineeseen, sen sytotoksisuus normaaleja soluja tulisi minimoida säilyttäen sen syöpäsolun spesifisyys.

Tässä tutkimuksessa, suunnittelimme uutta syöpää erityisiä ja myrkytön cell-tunkeutuva peptidi, BR2, joka perustuu solun läpäisevä motiivi buforin IIb ja tutkittu mahdollisuuksia tehokas lääkeaineen ajoneuvo syöpäsolujen fuusioimalla BR2 yhden ketjun vaihtelevaan fragmentti (scFv) vasta-aineen mutatoidun K-ras.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen kohdunkaulan syöpäsolu HeLa, ihmisen koolonisyöpäsolulinja HCT116, hiiri melanoomasolulinjalla B16 /F10, hiiren fibroblastisolulinjaa NIH3T3, ihmisen keratinosyyttisolulinja HaCat ja ihmisen fibroblastisolulinjan BJ olivat kaikki saatu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa [Dulbeccon Modified eagle Medium] (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) , 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin kostutetussa olosuhteissa 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Peptide Suunnittelu ja Synthesis

Olemme suunnitelleet useita johdannaisia ​​buforin Hb (BR3) mukaan vaiheittain poistaminen C-terminaalinen säännöllisesti α-kierteisen motiivi RLLR mallikertaa buforin IIb luoda syöpäsolun spesifisillä ja ei-myrkyllisiä CPP. Suunniteltu peptidit koostuivat eri määrä C-terminaalin säännöllistä α-kierteisen motiivi RLLR ja nimettiin BR1 ja BR2 (taulukko 1).

CPP Tat, BR1, BR2, ja BR3 syntetisoitiin kemiallisesti ( Anygen, Kwangju, Korea) MilliGen 9050 peptidi syntetisaattori. Fluoreseiini-ryhmä (FITC) on kiinnitetty N-päähän kautta aminoheksaanihappo spacer käsittelemällä hartsiin sidottu peptidi (0,1 mM), FITC: n kanssa (0,1 mM) ja di-isopropyylietyyliamiinia (0,5 mmol) N, N-Dimetyyliformamidi ( DMF: ssa) 12 tuntia. Kaikki raakapeptidit puhdistettiin ja analysoitiin käänteisfaasilla korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (RP-HPLC) C18 ja puhdistettu peptidejä karakterisoitiin sähkösumutus ionisaatiomassaspektrofotometrisesti (ESI-MS).

konfokaali Laser Skannaus Microscopy

tutkimiseksi solun läpäisevä kyky ja solunsisäisen jakautumisen internalized peptidien, elää konfokaalimikroskopia tehtiin kolmella syöpälinjojen (HeLa, HCT116 ja B16 /F10) ja kolme normaali solulinjoissa (HaCat, BJ ja NIH 3T3). Lyhyesti, soluja (2 x 10

5) maljattiin lasipeitinlevyn sijoitetaan 6-kuoppaiselle levylle, kasvatettiin yli yön, ja sitten inkuboitiin FITC-leimatun peptidit (5 uM kutakin solulinja) 30 min. Sitten solut huuhdeltiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, pH 7,4), ja joka on asennettu mikroskoopin fluoresenssi asennus liuoksella (Dako Corp., Carpinteria, CA). Rinnakkaispaikantumisen of BR2 kanssa lysosomeihin havaittiin käyttämällä LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probe, Eugene, OR). Jotta vaikutusten välttämiseksi kiinnityksen esineitä, joihin liittyy sekä metanolia ja paraformaldehydi, soluja ei kiinnitetty [26], [27]. Jakelu FITC-leimatun peptidit analysoitiin käyttäen konfokaalista skannaus laser Zeiss LSM 510 mikroskooppi (Jena, Saksa), joka oli varustettu 40 x 20 x tavoite. Fluoroforin olivat innoissaan argonlaser (488 nm) FITC ja HeNe laser (543 nm) LysoTracker Red.

In vitro

Sytotoksisuusmääritys

sytotoksisuus peptidit nisäkässoluille tutkittiin arvioimalla vapautumista laktaattidehydrogenaasin (LDH), syövän ja normaalit solut. LDH: n määrä vapautuu vaurioituneista solujen supernatantissa mitattiin käyttäen Cytotoxicity Detection Kit (Roche Applied Science, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppaisille mikrolevyille (1 x 10

4 solua per kuoppa) täydellisessä DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, jotta kiinnitys ja leviämistä soluja. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla peptidien (0-100 uM) ja inkuboitiin vielä 24 h 37 ° C: ssa. Solunulkoiseen kustakin kaivosta siirrettiin uuteen mikrolevylle ja inkuboitiin 10 minuutin ajan 100 ul: lla /kuoppa reaktioseosta, jota seurasi stop-liuosta. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijalla. LDH: n vapautuminen soluista lyysattiin 0,2% Triton X-100 PBS: ssä määriteltiin 100% vuoto ja LDH: n vapautuminen käsittelemättömästä soluista, kuten 0% vuoto.

Hemolyysi Pitoisuus

hemolyyttinen aktiivisuus määritettiin, kuten kuvannut Aboudy

et al.

pienin muutoksin [28]; 3 ml juuri valmistettua ihmisen erytrosyyttien pestiin isotonisella PBS, pH 7,4, kunnes väri supernatantin muuttui kirkkaaksi. Pestyt erytrosyytit laimennettiin sitten lopulliseen tilavuuteen 20 ml samalla puskurilla. Peptidinäytteet (10 ui), sarjalaimennettiin PBS: ään, lisättiin 190 ui solususpensiota mikrosentrifugiputkiin. Seuraavat varovaisesti sekoittaen, putkia inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan ja sitten sentrifugoitiin 4000 x g 5 minuutin ajan. Supernatantti (100 pl) poistettiin uuteen putkeen, ja absorbanssi 567 nm: ssä määritettiin. Suhteellinen optinen tiheys verrattuna, että solususpensiota käsiteltiin 0,2% Triton X-100, on määritelty hemolyysiprosentti. Hemolyysi prosenttiosuus laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: hemolyysiprosentti = [(Abs

567 nm peptidi ratkaisu – Abs

567 nm PBS) /(Abs

567 nm 0,2% Triton X-100 – Abs

567 nm PBS: ssä)] x 100.

Characterization of Peptide otto

arvioimiseksi FITC-leimatun peptidit, HeLa-solut ympättiin 12-kuoppalevyille tiheydellä 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti, ja inkuboitiin 24 tuntia. FITC-leimattu peptidejä, eri pitoisuuksina, jotka ovat 2-10 pM, inkuboitiin sitten solujen kanssa 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Verrata ottoa solun sisään peptidejä, syövän ja normaaleja soluja käsiteltiin FITC-leimatun peptidit (kukin 10 uM), ja inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä poistamaan ylimäärä solunulkoiseen komplekseja. Seuraavaksi soluja käsiteltiin trypsiinillä (1 mg /ml) 10 min poistaa mahdolliset jäljellä olevat peptidit sitoutunut solun pintaan. Jälkeen Trypsinisaation, solut kerättiin sentrifugoimalla (1000 x g 5 min), suspendoitiin uudelleen 500 ul: jääkylmää 2% FBS /PBS: ää, joka sisälsi propidiumjodidia (PI), ja sitten analysoitiin välittömästi (10000 tapahtumaa /näyte) fluoresenssiaktivoidulla cell (FACS).

Ymmärtääksemme edelleen solun läpitunkeva mekanismi peptidien, miten lämpötila ja metabolisen inhibiittorit tutkittiin. Selvittämiseksi riippuvuutta lämpötilasta, HeLa-soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan ennen lisäämistä peptidejä. Seuraavaksi soluja käsiteltiin FITC-leimatun peptidit (kukin 5 uM) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Jotta energiaa poistumista koskevassa tutkimuksessa, HeLa-soluja esi-inkuboitiin natriumatsidia (NaN

3, 10 mM) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin sitten FITC-leimattua peptidit (kukin 5 uM) 37 ° C: ssa 30 min.

roolin tutkimiseksi endosytoosin peptidin ottoa, soluja esikäsiteltiin useita endosytoosin estäjien 37 ° C: ssa 1 h: (i) amiloridi (5 mM), joka tiedetään estävän macropinocytosis by estämällä natrium- kanava; (Ii) nokodatsoli (100 ng /ml), joka estää clathrin-välitteisen reitin; ja (iii) metyyli-ß-syklodekstriiniä (MßCD, 5 mM), joka inhiboi lipidilautan-välitteisen prosessien heikentävien kolesterolin solukalvon [29]. Kaikki estäjät hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO).

vaikutusten tutkimiseksi negatiivisesti varautuneet komponenttien solun pinnalla peptidin sisäistämisen, HeLa-solut esikäsiteltiin gangliosidien (monosialoganglioside GM3 koirien veressä), hepariinisulfaatti, tai siaalihappoa (Neu5Ac, kaikki Sigmalta) (20 ug /ml) 30 minuutin ajan. Inhiboimiseksi gangliosidin biosynteesin solut esikäsiteltiin D-

treo

-1-fenyyli-2-heksadekanoyyli amino-3-morfolino-1-propanolia (PPMP, 5 uM) 48 tuntia.

kaikkien näiden koeolosuhteissa, virtaussytometria-analyysit tehtiin elävät solut käyttäen Becton Dickinson FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Diego, CA). Kussakin tapauksessa fluoresenssi 10000 eläviä soluja hankittiin. Elävät solut aidatulla perustuvat sivullepäin ja sirontamittari. Data-analyysin, WinMDI ohjelmisto (Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) käytettiin. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Studentin t-testiä 95%: n luottamusväli.

kloonaus ja ilmentäminen peptidi-fuusioproteiinien

käyttää BR2 keinona toimituksen terapeuttisten proteiinien, cDNA on Y13-259 yhden ketjun vaihtelevan fragmentti (scFv) -geeni syntetisoitiin Bioneer (Daejeon, Korea). Tat- tai BR2-fuusioitunut Y13-259 scFv-geenit saatiin yhdistelmä-DNA-PCR: llä. Yhdistelmä-DNA-cDNA: t, jotka koodaavat anti-Ras scFv, Tat-scFv ja BR2-scFv fuusiot pilkottiin

Nco

I ja

EcoRI

I (sekä New England Biolabs, Beverly, MA), ja kloonattiin

Nco

I ja

EcoRI

I-kohtiin pET21c, tuottaa pscFv, PTAT-scFv ja pBR2-scFv, vastaavasti. Anti-Ras scFv, Tat-scFv ja BR2-scFv fuusioproteiinien ilmaistaan ​​

E. coli

Origami (DE3) induktion jälkeen, jossa on 0,1 mM IPTG: llä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla 3000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletti suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskurissa (10 mM natriumfosfaatti, 150 mM NaCl, pH 7,4); Solut hajotettiin sonikoimalla 4 ° C: ssa (B. Braun välineitä, Allentown, PA). Proteaasinestäjä fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF, 1 mM) lisättiin ennen ultraäänen avulla. Liukoiset ja liukenemattomat fraktiot erotettiin sentrifugoimalla 14000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletti, joka sisältää inkluusiokappaleet suspendoitiin uudelleen pesupuskurilla (20 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA ja 1% Triton X-100, pH 8,0) ja sentrifugoitiin 8000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa.

pestiin inkluusiokappaleet denaturoitiin ja liuotetaan lyysipuskuria (0,3% N-layroyylisarkosiini 50 mM CAPS-puskuria, ja 0,3 M NaCl, pH 11,0), 3 tuntia ja sentrifugoitiin 14000 x g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa . Kaikki proteiinit Affinitettipuhdistettu käyttämällä Ni-IDA agaroosihartsi (ELPIS biotekniikka, Daejeon, Korea). Lyhyesti, Ni-IDA His-Bind Hartsi pakattiin pylvääseen, joka oli tasapainotettu sitomispuskurilla (identtinen lyysipuskuri). Supernatantti hitaasti pylvääseen, jonka jälkeen pestään puskurilla (0,3% N-layroyylisarkosiini 50 mM CAPS-puskuria, 150 mM NaCl, ja 30 mM imidatsoli, pH 11,0) levitettiin. Proteiinit eluoitiin eluutiopuskurilla (0,3% N-layroyylisarkosiini 50 mM CAPS-puskuria, 150 mM NaCl, ja 250 mM imidatsolia, pH 11,0), ja analysoitiin 10% SDS-PAGE. Eluoitu Proteiinit laskostettiin uudelleen dialyysillä PBS: ssä, joka sisälsi 200 mM NaCl: a, 10% glyserolia, 1 mM GSH, 0,2 mM GSSG ja 0,4 M arginiinia asteittain pH laskee (pH 10, pH 9, pH 8 ja pH 7,4). Kukin dialyysi vaihe suoritettiin 4 ° C: ssa 12 tuntia vastaan ​​20 x näytteen tilavuus Poista pesuaine kokonaan.

Western-blottaus

Voit seurata peptidi välittämää solunsisäistä ottoa scFv proteiinien sisäistetty fuusioproteiinit tutkittiin Western-blottauksella. HCT116-solut (1 x 10

6) käsiteltiin PBS: llä, puhdistetulla scFv, Tat-scFv tai BR2-scFv-fuusioproteiinit (kukin, 2 uM) 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä (4 ° C), kaavittiin 0,5 ml PBS: ää ja sentrifugoitiin 1000 x g: llä 4 ° C: ssa 5 min. Solupelletit suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan lyysipuskuria (20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na-

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM beeta glyserofosfaatti, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 ug /ml leupeptiiniä ja 1 mM PMSF: ää (Cell Signaling Tech., Danvers, MA) ja pidettiin jäillä 30 minuutin ajan. solulysaatit sentrifugoitiin 12000 x g 4 ° C: ssa 15 minuuttia ja supernatantit otettiin talteen. Proteiinikonsentraatiot solu-uutteissa määritettiin Bradfordin menetelmällä [30] (Bio-Rad, Hercules, CA). 50 ug proteiinia solu-uutteista fraktioitiin 10% SDS-PAGE-geelistä. elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle siirtopuskurissa (192 mM glysiini, 25 mM Tris-HCl, pH 8,8, ja 20% metanolia [v /v]) elektroforeesin avulla. Kun esto 5% rasvaton maito 1 h, membraania inkuboitiin 1:1,000-laimennettua anti-His-primäärinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), pestiin kolme kertaa TTBS: llä (50 mM Tris, 150 mM NaCl: a, ja 0,5% Tween-20), ja sen jälkeen inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi) on maitoa, joka sisältää TTBS: llä 1 tunnin ajan. Sen jälkeen lopullinen Pesun kalvo altistettiin sitten ja proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen Enhanced Chemiluminescence (WESTSAVE GOLD; AbFrontier, Seoul, Korea).

soluproliferaatiomäärityksissä (MTT-määritys) B

arvioimiseksi anti-proliferatiivista aktiivisuutta peptidien ja anti-Ras scFv fuusioproteiinien, HCT116-solut (K-ras mutatoituja soluja) siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

4 solua /kuoppa 100 ul: aan DMEM 10% FBS: ää ja viljeltiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut käsiteltiin scFv tai peptidi-scFv-fuusioproteiinit (0, 0,5, 1 ja 2 uM) ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) käyttämällä CellTiter 96® Ei-radioaktiivinen Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI) mukaan valmistajan ohjeiden. Absorbanssi liuosta mitattiin 570 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Bio-Rad). Solujen elinkelpoisuus ilmaistiin prosentteina elävien solujen käsitelty scFv tai peptidi-scFv-fuusioproteiinit verrattuna PBS-käsiteltyihin kontrollieläimiin (100%). Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina.

Detection of Apoptosis

HCT116-soluja (1 x 10

6 /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle) käsiteltiin peptidillä fuusioitu scFv: iden (kukin , 2 uM) tai tunnettu apoptoosin indusoija staurosporiini (0,5 uM) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja solu-uutteet valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Lohkaista poly (ADP riboosi) polymeraasin (PARP), joka on indikaattori apoptoosin, havaittiin Western-blottauksella, kuten on kuvattu edellä. Anti-PARP ja anti-α-tubuliinin vasta-aineita (Cell Signaling Tech.) Käytettiin yhdellä 1:1,000 laimennus ensisijaisena vasta-aineita, kun taas piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-IgG (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi): tä käytettiin 1:10,000 laimennus toissijaisena vasta-aineena.

lisäksi apoptoottiset solut tunnistettiin värjäämällä anneksiini V-FITC: tä (150 ng /ml), ja 7 amino-aktinomysiini D (7-AAD, BD Biosciences, San Diego, CA). 1 x 10

6 HCT116-soluja käsiteltiin PBS: llä, staurosporiini (0,5 uM), tai peptidin fuusioituna scFv: iden (kukin, 2 uM) kuten edellä on kuvattu. Määritettyyn aikaan, solut pestiin kahdesti PBS: llä (pH 7,4), otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan sitovaa puskuria, jota oli täydennetty anneksiini-V fluos (1:100 laimennettu, BioBud, Seoul, Korea), ja inkuboitiin 15 minuutin ajan 25 ° C: ssa pimeässä. Havaita kuolion, 7AAD lisättiin ennen mittausta. Näytteet välittömästi altistettiin FACS-analyysi, jossa FACSCalibur virtaussytometrillä (FL1 ja FL3) ja WinMDI ohjelmistot (Joe Trotter, Scripps Research Institute). 1 x 10

4 solua näytettä kohti analysoitiin virtaussytometrialla.

Ras aktivointi Pitoisuus

Tutkia peptidi-scFv-fuusioproteiinin riippuva tukahduttaminen Ras aktiivisuuden taso Ras -GTP (aktiivinen muoto) mitattiin käyttämällä Ras-aktivaation määritys kit (Millipore, Billecia, MA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä menetelmä perustuu selektiiviseen sitoutumiseen Ras-GTP avulla Ras sitovan domeenin (RBD) Raf-1 (a-kinaasin alavirtaan Ras), joka ei sido Ras-BKT (inaktiivinen muoto). Lyhyesti, 50 ui RBD-proteiinin fuusioituna glutationi-transferaasi (GST) päällystettiin 96-kuoppaisille glutationi-päällystetylle levylle 4 ° C: ssa 1 h ja pestiin TBST: llä (50 mM Tris, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween -20, pH 7,6). HCT116-soluja käsiteltiin scFv, Tat-scFv tai BR2-scFv 1 tai 2 tuntia, minkä jälkeen solut hajotettiin käyttämällä 1 x Mg

2+ Lysis /Wash Buffer (Millipore). Proteiinikonsentraatio laskettiin Bradfordin menetelmällä. Solulysaatit, jotka sisälsivät 50 ug proteiinia inkuboitiin 1 h RBD-GST-päällystettyihin kuoppiin 25 ° C: ssa. Kun oli pesty kolme kertaa TBST-liuoksella, primaarisen vasta-aineen liuosta lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 1 h. Pesun jälkeen TBST: llä, toisen HRP-konjugoitua anti-hiiri-vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin 25 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen, kun lopullinen pesu TBS: llä (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6), 50 ui Kemiluminesenssiin substraattien lisättiin kuhunkin kuoppaan. Kemiluminesenssin signaalit kustakin kuopasta seurattiin käyttäen Berthold luminometriä (MicroLumat LB96P; Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisena Ras aktiivisuutta.

Tulokset

BR2 Tehokkaasti sisäistää erilaisiksi Cancer Cell Lines ilman Sytotoksisuus normaalisoluille

soluunottokokeissa ja solunsisäisen jakautumisen suunniteltu peptidien , BR1 ja BR2, tutkittiin käyttäen konfokaalimikroskopia. BR2 oli helposti otetuksi syöpäsoluihin (HeLa, HCT116 ja B16 /F10) 30 minuutin kuluessa ja jaetaan koko sytoplasmassa ja tumassa syöpäsolujen (Fig. 1A). Kuitenkin se oli erittäin huonosti sisäistetty osaksi normaaleja soluja (HaCat, BJ ja NIH 3T3) samoissa koeolosuhteissa. Sen sijaan, BR1 näytetään vähäinen soluunottoa tasoilla sekä syövän ja normaaleja soluja, mikä osoittaa, että se ei voi translokoituvat solukalvon läpi (Fig. 1A). Fluoresenssia Tat-käsitellyistä soluista oli myös selvästi havaittiin sekä tumassa ja sytoplasmassa syövän ja normaalien solujen. Lisää Tat kertynyt tumassa kuin sytoplasmassa, kun taas useimmat BR2 on jakautunut tasaisesti solunsisäisten alueiden (Fig. 1A).

(A) solunsisäinen jakelu FITC-leimatun peptidejä tutkitaan konfokaalisella laser mikroskoopilla. Sekä syöpäsolut (HeLa, HCT116 ja B16 /F10) ja normaalit solut (HaCat, BJ ja NIH 3T3) ympättiin 6-kuoppaisille levyille 1 päivä ennen koetta, jotta 70% konfluenssiin. Soluja inkuboitiin FITC-leimatun peptidit (5 uM) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja pestiin kolme kertaa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Peptidi jakelu analysoitiin sitten käyttäen konfokaali skannaus LSM 510 laser mikroskooppi varustettu 40 × tavoite. (B, C)

In vitro

sytotoksisuuden peptidejä. (B) Membrane häiriön mitattiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) vuodon osoitetusta solulinjojen 24 tunnin kuluttua peptidin hoidon. LDH vuotoa soluista ympättiin 96-kuoppalevylle 10000 solua /kuoppa mitattiin altistuksen jälkeen 1, 2, 5, 10, 20, 50 tai 100 uM peptidien 24 tuntia. LDH: n vapautuminen PBS käsitellyistä soluista pidettiin 0% vuoto ja vapautuneen LDH: 0,2% Triton X-100 käsiteltyjä soluja kuin 100% vuotoa. (C) hemolyyttinen aktiivisuus kunkin peptidin vastaan ​​ihmisen erytrosyyttien analysoitiin luokiteltiin pitoisuuksina (0-200 uM) ja verrattuna 0,2% Triton X-100 positiivinen kontrolli, jonka hemolyysin määriteltiin 100%. Virhepalkkien kaikki luvut edustavat keskivirheet välineen (n = 3).

arvioimiseksi

in vitro

sytotoksisuus suunniteltu peptidien, LDH vuoto mitattiin syöpäsolun linjat (HeLa, HCT116 ja B16 /F10) ja normaali solulinjat (HaCat, BJ ja NIH 3T3). BR2 hoito (20-100 uM) liittyi LDH vuotoa syöpäsolujen; vuoto vähitellen lisääntyi BR2 pitoisuuksia, oli noin 40-60% 100 uM (Fig. 1 B

a-c

). Kuitenkin LDH vuoto BR2-käsiteltyjen normaalien solujen ei havaittu BR2 pitoisuuksina alle 70 uM, ja heikko vuoto (on noin 17%) havaittiin 100 uM (Fig. 1 B

d-f

). BR3 aiheuttama merkittävä LDH vuotoa molemmista syöpä (n. 80-90%) ja normaali solulinjat (n. 30%) jopa 50 uM (Fig. 1 B

a-f

).

tutkia sytotoksisuutta peptidien edelleen, hemolyyttinen aktiivisuus BR1, BR2, BR3 ja Tat vastaan ​​ihmisen erytrosyyttien tutkittiin myös. Mukaisesti LDH vuodon tuloksia, ei hemolyysiä indusoitiin jopa sen jälkeen, kun erytrosyytit käsiteltiin Tat, BR1 tai BR2 on ≥200 uM, kun taas BR3 laukeaa hemolyysin (≥5%) on ≥25 uM (Fig. 1 C). Myöhemmin noin 34,3% punasolujen hajotettiin jälkeen käsiteltiin 200 uM BR3. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että BR2 tehokkaasti tunkeutuu syöpäsoluja sytotoksisia vaikutuksia normaaleissa soluissa, kun taas Tat osoittivat samanlaisia ​​tunkeutuminen molempia solutyyppejä.

BR2 Tarkemmin Tunkeutuu syöpäsoluja pitoisuudesta riippuvasti

Jos haluat vertailla määrä sisäistetty peptidien eri solutyyppejä, suoritimme virtaussytometria-analyysiä. BR2 on sisäistänyt tehokkaammin osaksi syöpäsolujen (HeLa, HCT116 ja B16 /F10) kuin normaaliin soluihin (HaCat, BJ ja NIH 3T3); yli 95% BR2-käsiteltyjen syöpäsolujen sisäistetty BR2, kun taas vain 23-34% of BR2-käsiteltyjen normaalien solujen teki. Kuitenkin Tat tunkeutui sekä syövän ja normaalien solujen ilman paljon syrjintää (Fig. 2A). Erityisiä tunkeutuminen BR2 ja Tat osaksi syöpäsolujen analysoitiin myös läsnä sekä HeLa ja BJ fibroblastisolujen konfokaalisella laser mikroskoopilla. BR2 oli ensisijaisesti imeytymiskertoimeksi HeLa-solut, kun taas solun Tat oli samankaltainen molemmissa HeLa ja BJ fibroblastisolujen (Fig. S1). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että buforin-johdannainen BR2 on syöpäsolun spesifisyys, kun taas Tat ei.

(A) analyysi solun läpitunkeva tehokkuutta kunkin peptidin eri solutyyppejä virtaussytometrialla. FITC-leimattu Tat, BR1 ja BR2 peptidejä (10 uM) lisättiin erilaisia ​​solutyyppejä: HeLa, HCT116 ja B16 /F10-syöpäsoluja ja HaCat, BJ ja NIH 3T3 normaalit solut. 30 min inkubaation 37 ° C: ssa, FITC-positiiviset solut laskettiin virtaussytometrialla. Arvot edustavat prosenttiosuus fluoresenssi-positiivisten solujen koko solupopulaation. (B) Kvantitatiivinen arviointi solupenetraatio kunkin peptidin virtaussytometrialla. HeLa-soluja inkuboitiin FITC-leimatun peptidit pitoisuuksina 1, 2, 5 tai 10 uM 30 min ajan 37 ° C: ssa. Tämän jälkeen solut pestiin kylmällä PBS: llä ja kerättiin, ja solujen fluoresenssi analysoitiin virtaussytometrialla. Ohjaus solut eivät saaneet peptidi hoitoa. Ennen analysointia, solunulkoinen fluoresenssin pinta sitoo peptidejä poistettiin trypsiini käsittely (1 mg /ml 10 min).

fluoresenssin voimakkuus peptidillä käsitellyissä soluissa parannettu kasvavia konsentraatioita BR2 tai Tat. Pitoisuus on yli 5 uM, BR2 tuli yli 80% HeLa-solujen 30 min (Fig. 2B). BR2 tunkeutui soluja tehokkaammin kuin ei Tat peptidi kaikissa testattu pitoisuus. Lisäksi, BR2 sisäistämisen kaikkien syöpäsolulinjoista (HCT116 ja B16 /F10, tuloksia ei ole esitetty), näytti olevan homogeeninen koko solupopulaatio kuin yksittäinen piikki histogrammissa. Niistä peptidit, BR1 näkyy alin ottoa, mikä osoittaa sen kyvyttömyys tunkeutua solukalvon jopa 10 uM.

Initial Sähköstaattinen Vuorovaikutus positiivisesti varautuneet BR2 ja negatiivisesti varautuneet Gangliosidit on syöpäsolu kalvo on olennainen Energy -riippuvaisella Endocytosis of BR2

soluunottoa mekanismi BR2 analysoitiin HeLa, useimmat edustaja ja laajalti käytetty syövän solulinja, verrata muiden solujen tunkeutuva peptidejä. Ensin tutkittiin lämpötilan vaikutusta BR2 levinneisyys. Lämpötilan alentaminen vähentynyt voimakkaasti peptidin oton HeLa-soluissa (kuvio. 3A); ottoa solun sisään BR2 ja Tat 4 ° C: ssa laski 88,5% ja 31,6%, vastaavasti, verrattuna tilanteeseen, 37 ° C: ssa. Lisäksi energiariippuvainen ottoa peptidien havaittiin myös, kun solujen ATP allas oli tyhjentynyt esi-inkuboimalla soluja natriumatsidilla (NaN

3). ATP ehtyminen myös vähensi imeytymistä BR2 ja Tat HeLa-soluissa, mukaan 67,7% ja 42,5%, vastaavasti (Fig. 3A). Nämä tulokset tukevat osallistumista endosytoosin varten BR2 ja Tat ottoa.

(A) vaikutukset alhaisessa lämpötilassa ja energian ehtymisestä on FITC-leimatun peptidit HeLa- soluihin. HeLa-soluja joko esi-inkuboitiin 4 ° C: ssa tai esikäsitelty natriumatsidia (NaN

3) heikentävistä ATP 1 h, ja sitten inkuboitiin 5 uM Tat tai BR2 30 min samoissa olosuhteissa, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Peptidi sisäänotto määritettiin virtaussytometrialla. (B) vaikutukset endosyyttisissä estäjien tulon BR2 ja Tat. Vaikutusta inhiboivia lääkeaineita peptidin sisäänotto määritettiin esi-inkuboimalla HeLa-solujen kanssa endosytoosin estäjien nokodatsoli, amiloridi tai metyyli-ß-syklodekstriiniä 1 h ennen kuin lisättiin FITC-leimattua peptidejä. Sen jälkeen kun peptidi hoito 30 min 37 ° C, FITC-positiiviset solut laskettiin virtaussytometrialla. Arvot edustavat prosenttiosuus fluoresenssi-positiivisten solujen koko solupopulaation. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (C) rinnakkaispaikantumisen Br2 kanssa lysosomaalisen merkki LysoTracker punainen DND-99 elävissä HeLa-soluissa. 30 min inkubaation BR2 (5 uM) kanssa LysoTracker, eläviä HeLa-solujen kuvat saatiin konfokaalimikroskopialla. (D) vaikutukset negatiivisesti varautuneita molekyylejä (gangliosidit, hepariinit, ja siaalihappoa) peptidin oton. (A, b) HeLa-soluja käsiteltiin BR2 ja Tat: n läsnä ollessa gangliosidien, hepariinien tai siaalihappoa (kukin 20 ug /ml) 30 minuutin ajan. Kohdassa (c, d), HeLa-solut esikäsiteltiin PPMP (5 uM) ja heikentävistä gangliosidit. Soluunottoa BR2 ja Tat määritettiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa.