Krooninen sairaus

tiivistelmä

Riittävä arginiinia kudoksessa mikroympäristössä on välttämätön T-solujen aktiivisuuden ja eloonjääminen . Arginiini tasot säätelevät arginiini-catabolizing entsyymi, arginase (ARG). On raportoitu, että arginase II (ARG2), yksi kahdesta argumenteille, on poikkeavasti ilmaistaan ​​eturauhassyövän soluissa, jotka muuttavat arginiinin ornitiini, mikä puute arginiini, joka heikentää kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja tekee ne huonosti. Kuitenkin immunosuppressio välittämä ARG2 ilmentäviä syöpäsoluja keuhkosyöpä ei ole havaittu. Täällä tutkimme ilmentymistä ARG2 haiman duktaalikarsinooma (PDC) kudos clinicopathologically tutkimalla yli 200 tapausta PDC. Toisin kuin eturauhasen syöpä, ARG2 ilmentymistä harvoin osoitettiin PDC soluissa immunohistokemiallisesti, ja sen sijaan ARG2 oli tyypillisesti ilmaistu α-sileän lihaksen aktiini-positiivisia syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin), etenkin sijaitsevat ja noin nekroottisen alueilla PDC. Läsnäolo ARG2 ilmentävien valuuttalisiin läheisesti korreloi lyhyempi kokonaiselossaoloaika (OS;

P

= 0,003) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS;

P

= 0,0006). Coxin monimuuttuja regressio analyysi osoitti, että läsnä oli ARG2 ilmentävien valuuttalisiin PDC kudoksessa oli itsenäinen ennustaja huonompi OS (riskisuhde [HR] = 1,582,

P

= 0,007) ja DFS (HR = 1.715,

P

= 0,001) PDC potilailla. Sen lisäksi, että ominaisuus jakelun ARG2 ilmentävien valuuttalisiin, kuten valuuttalisiin koekspressoi hiilihappoanhydraasin IX, SLC2A1, tai HIF-1α, markkereita hypoksia, PDC kudosta. Lisäksi

in vitro

kokeet paljastivat, että viljellyt fibroblastit uutettu PDC kudoksesta ilmaisi ARG2 transkriptin altistumisen jälkeen hypoksiaa, joka oli arginase aktiivisuutta. Nämä tulokset osoittavat, että syöpä soluvälitteinen immunosuppression kautta ARG2 ilmaisu ei ole yleinen tapahtuma, ja että läsnä ARG2 ilmentävien valuuttalisiin on osoitus huono ennuste, sekä hypoksia, PDC kudoksessa.

Johdanto-osan : Ino Y, Yamazaki-Itoh R, Oguro S, Shimada K, Kosuge T, Zavada J, et al. (2013) Arginase II Ilmaistuna syöpään liittyvän Sidekudosmuodostussolujen Osoittaa kudoshypoksia ja ennustaa Huono tulos potilailla, joilla Haimasyöpä. PLoS ONE 8 (2): e55146. doi: 10,1371 /journal.pone.0055146

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 19 joulukuu 2012; Julkaistu: 12 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Ino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in-tuki kolmannen Term Kattava 10-vuotisen strategian Cancer Control terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan (NH), joka on Grant-in-tuki Scientific Research opetusministeriön, Culture, Sports, Science and Technology of Japan (NH), prinsessa Takamatsu Foundation (10-24216) (NH), ja Cancer Research ja kehitysrahasto (NH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimen mikroympäris- on merkittäviä rooleja biologista käyttäytymistä tahansa kasvain, joka sisältää isännän immuunivastetta, kudosten hapen paine, ja syöpään liittyvä fibroblasteissa (valuuttalisiin) [1].

riittävä tasot arginiinin solunulkoiseen ympäristöön ovat ratkaisevan tärkeitä T-solujen proliferaatiota ja toimintaa. [2], [3], arginiini on yksi semi-välttämättömiä aminohappoja ja arginiini tasot säätelevät arginase (ARG), [4], joka hydrolysoi arginiinia ornitiini ja urea. On kaksi isotsyymien ARG, ARG1 ja ARG2. ARG1, sytoplasminen entsyymi, saadaan pääasiassa maksassa ja puhdistavat ammoniakkia. ARG2 ilmentyy mitokondrion proteiinia erilaisissa kudoksissa, kuten munuaisten, eturauhasen ja ohutsuolessa. Arginiini toimii myös substraattina typpioksidisyntaasin (NOS), jolloin saatiin typpioksidin (NO) ja muiden reaktiivisen typen välituotteita.

On raportoitu, että ARG2 on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​eturauhassyövän soluissa, on mukana kasvaimen immuuni paeta välittämiä arginiini kulutusta, mikä puute arginiini heikentävää kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä ja tekee ne huonosti. [5] Eturauhassyöpä samanaikaisesti ilmaisee NOS2, mikä vähentää arginiini vähitellen ja muodostavat peroksinitriitti joka laukaisee T-solujen apoptoosin inhiboimalla signaalitransduktion tarvittavat soluaktivaation. [5] Nämä immunosuppressiiviset vaikutukset läpi ARG2 ilmentymistä syöpäsoluissa eivät olleet ilmeisiä seuraavan keuhkosyövän tutkimus. Yli 80% (99/120 tapausta) keuhkosyövässä ilmaistuna ARG2 muuttuvia astetta, vaikka ilmentyminen ARG2 ei ollut vaikutusta kliinis ominaisuudet, mukaan lukien isännän kasvaimen immuunivasteen. [6] Nyt on kiistanalainen, vaikutus ARG2 kliinisestä piirteitä ihmisen syövistä.

Haimasyöpä [haiman duktaalikarsinooma (PDC)] on neljäs ja viides suurin syy syöpään liittyvien kuolemaan Yhdysvalloissa ja Japanissa, vastaavasti. [7], [8] Yleisenä 5 vuoden eloonjäämisaste potilaiden haimasyöpä on 3-5%, [7], [9], [10], [11] kun otetaan huomioon sen aggressiivinen kasvu ja varhainen metastaattisen levittäminen . Kuolleisuuden vuoksi tämä syöpä on osoittanut mitään selvää parannusta vuosikymmeniä. Kehittäminen ennakoivan biomarkkereiden valitsemisen helpottamiseksi potilaiden alaryhmissä on hyödyllinen tutkimuksia, joilla pyritään vähentämään kuolleisuutta PDC erityisesti kun potilaalla vaiheen kliinisissä tutkimuksissa on suunniteltu arvioimaan eri hoitomenetelmät [12].

Tässä tutkimuksessa, tutkimme ilmaisun ja kliinis merkitys ARG2 in PDC. Huomasimme, että vain muutama PDC-solut ekspressoivat ARG2, mutta huomannut, että ARG2 ilmaistiin tiettyjen strooman solujen läsnä PDC kudoksessa. Olemme myös havainneet, että läsnäolo ARG2 ilmentävien strooman solujen PDC kudoksessa oli clinicopathologically merkittävä muuttuja, olla mukana huonomman tuloksen sekä indikaattorina hypoksian.

Tulokset

ARG2 Expression on harvinainen PDC Solut, mutta Luonteenomaisesti ilmaistuna Karan muotoinen stroomassoluihin sisällä ja ympärillä Necrotic alueet PDC Tissue

immunohistokemiallinen analyysi paljasti, että ARG2 ilmentyminen oli läsnä pieni määrä PDC tapauksissa, joissa se ilmentyi fokaalisesti in PDC soluissa. Sen sijaan, ARG2 on ilmaistu kara-muotoinen strooman solujen ja noin nekroottinen alueilla (kuvio 1A). ARG2 värjättiin pistemäisiä tai karkean rakeinen kuvio sytoplasmassa karan soluja, joka on yhteensopiva sen kanssa, että ARG2 on lokalisoitu mitokondrioissa (kuvio 1 B). ARG2 myös ilmaistu Langerhansin saarekesolujen ja gangliosolujen haiman kudoksen ei-sairauksiin. Expression of ARG1 havaittiin vain sytoplasmassa neutrofiilien immunohistokemiallisesti, eikä syöpäsoluissa (kuvio 1C).

(A) histologia PDC kudoksen matalan (ylempi pylväät) ja korkean tehon näkymä ( alempi pylväät). HE värjäystä (vasen pylväät) ja immunohistokemia varten ARG2 (keskellä pylväät) ja sytokeratiineja (oikea pylväät) sarjaan kudosleikkeiden. Nekroottinen alueet ympäröivät tähti markkaa (suuri alue kuolion sijaitsee alhaalla oikealla) ylemmässä HE valokuvan ja suorakulmion (vaaleansininen) vastaa aluetta alemman sarakkeeseen. (B) immunohistokemiaallisesti ARG2 (vasen ylempi palsta) ja mitokondrioita (vasen alempi palsta) korkean tehon näkemyksiä. Positiivinen värjäys ARG2 visualisoidaan kuin pistemäisiä tai karkean rakeinen kuvio sytoplasmassa karan soluja. Tämä myönteinen värjäytymistyyppi soveltuu mitokondrioiden antigeenin. Double immunofluoresenssilla (oikea sarake) esittää ARG2 (vihreä), mitokondrioita (punainen), ja ytimet (valkoinen). Lähes kaikki ARG2-positiivista värjäytymistä on yhteistyössä paikallistaa mitokondrioita (keltainen). (C) immunohistokemiallinen ilmentymistä ARG1 havaittiin vain neutrofiilien. Ylempi ja alempi pylväät ovat keski- ja suuritehoiset näkymät, vastaavasti.

Prognostic merkitys ARG2 ilmentäminen stroomassoluihin

Survival analyysi osoitti yhdistyksen välillä läsnäolo ARG2 ilmentävien stroomasolujen ja lyhyempi OS (

P

= 0,003) ja DFS (

P

= 0,0006) (kuvio 2), vaikka mitään assosioitunut läsnä ARG2 ilmentävien syöpäsolujen ja mahdolliset elossaololuku parametri. Kun keskimääräinen lukumäärä positiivisten solujen oli nolla, 1-80, ja enemmän kuin 80, värjäytyminen laadut osoitettu olivat nolla (ei ole), yksi (alempi ilmentyminen), ja 2 (korkeampi ilmentyminen), vastaavasti. Kuten ARG2 ilme lisääntynyt, selviytyminen tuli huomattavasti lyhyempi kannalta sekä käyttöjärjestelmän ja DFS (kuva 2).

(A, C) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä vertailun kokonaiselinaika välillä läsnäollessa (asteet 1 ja 2) ja ilman sitä (arvosana 0) on ARG2 ilmentymisen stroomasoluissa (

P

= 0,003) A ja että joukossa ilmaisun laadut (asteet 0-2) ja ARG2 in stroomasoluissa (arvosana 0 vs. luokka 1 , log-rank testi,

P

= 2,08; arvosana 0 vs. luokka 2,

P

0,0001; arvosana 1 vs. luokka 2,

P

= 0,0009 ) C. (B, D) Kaplan-Meier selviytymisen käyrä vertailun taudista vapaan eloonjäämisen välillä läsnäollessa (asteet 1 ja 2) ja ilman sitä (arvosana 0) on ARG2 ilmentymisen stroomasoluissa (

P

= 0,0006) B ja että joukossa ilmaisun laadut (asteet 0-2) ja ARG2 in stroomasoluissa (arvosana 0 vs. luokka 1,

P

= 0,069; arvosana 0 vs. luokka 2,

P

0,0001; arvosana 1 vs. luokka 2,

P

= 0,013) D. musta ympyrä ja valkoinen ympyrä esittävät sensuroinnin ja epäonnistuminen, vastaavasti.

keskimääräinen jäänteitä potilailla, joilla on PDC tai ilman ARG2 ilmentäviä stromasoluja oli 22,71 ± 1,77 kuukautta ja 37,13 ± 2,41 kuukautta, vastaavasti. Yhden vuoden eloonjäämisluvut potilaille, joilla on PDC tai ilman ARG2 ilmentäviä stromasoluja olivat 66,9 ± 5,2% ja 78,7 ± 3,7%, tässä järjestyksessä; 2 vuoden eloonjäämisluvut olivat 36,1 ± 5,4% ja 51,6 ± 4,6%, ja 5-vuoden eloonjäämisluvut 17,1 ± 4,4% ja 34,5 ± 4,5%, vastaavasti.

monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä kuten kasvaimen koko, solmu tila, etäpesäke tila, kasvaimen histologinen luokka, marginaali tila, hermo plexus invaasio, imusuonten invaasio, laskimoiden invaasio, haimansisäisen hermo invaasio, ja ilmaus ARG2 vuonna stroomasoluissa osoittivat, että ilmentyminen ARG2 vuonna stroomasolujen, metastaattinen tila, imusuonten invaasio, ja laskimoiden invaasio olivat riippumattomia ennustajia OS (taulukko 1), ja että ilmentyminen ARG2 vuonna stroomasolujen, metastaattinen tila, hermo plexus invaasio, ja laskimoiden invaasio olivat riippumattomia ennustajia DFS (taulukko 2). Kun ilmaus ARG2 vuonna stroomasoluissa luokiteltiin ei ja alempaan ilmentymistä verrattuna korkeampi lauseke (katso materiaalit ja menetelmät), yhden muuttujan analyysi käyttöjärjestelmän ja DFS osoittivat (

P

0,0001; riskisuhde [HR] = 2,505; 95%: n luottamusväli [CI], 1,649-3,804) ja (

P

0,0001; riskisuhde = 2,519; 95% CI, 1,658-3,827), tässä järjestyksessä. Monimuuttujamenetelmin OS ja DFS osoittivat (

P

0,0001; riskisuhde = 2,687; 95% CI, 1,759-4,103) ja (

P

0,0001; riskisuhde = 2,451; 95% CI, 1,608-3,736), tässä järjestyksessä.

Korrelaatio läsnäolo ARG2 ilmentävien stroomakasvaimet Solut ja muut kliinispatologiset muuttujat

taulukossa 3 luetellaan kliinis-potilailla, joilla on PDC. Kun nämä ominaisuudet analysoitiin korrelaatioita, läsnäolo ARG2 ilmentävien stromasoluja todettiin olevan todennäköisempää tapauksissa huonompi kasvain erilaistaa histologinen luokka, läsnäolo kuolion, ja läsnäolo stroomasolujen ilmentävien Caix ja SLC2A1 (vaihtoehtoisesti tiedossa glukoosi transporter tyypin 1, GLUT1), jotka ovat merkkiaineita hypoksian. Lisäksi, läsnä ARG2 ilmentävien stroomasolujen läheisesti korreloi korkeamman kasvainta infiltroivien CD68

+ makrofagien ja CD66b

+ neutrofiilejä, ja alempi kasvaimeen infiltroivien CD4

+ T-solujen ja CD8

+ T-soluja. Mitään merkittävää korrelaatio löytyi läsnäolo ARG2 ilmentävien syöpäsolujen ja mitä tahansa näistä kliinis parametrien.

Suurin osa ARG2 ilmentävien stroomakasvaimet Solut syöpään liittyvän fibroblastit (valuuttalisiin) happiniukkaan valtiossa

millainen stroomasolujen ilmaisi ARG2 teimme kaksinkertainen immunohistokemia ja kolminkertainen immunofluoresenssimenetelmällä. ARG2 ilmentäviä karan solut olivat usein positiivisia α-SMA, vimentiinin, ja I-tyyppisen kollageenin, harvoin positiivinen CD31 ja CD68 (aineistoa ei esitetty), ja negatiivinen desmiini, sytokeratiineja, ja D2-40 (kuvio 3), mikä osoittaa, että suurin osa ARG2 ilmentävien strooman solut valuuttalisiin ja vähemmistö oli endoteelisolujen tai makrofagit. Kuitenkin suurin osa valuuttalisiin PDC kudoksessa ei ilmaista ARG2, lukuun ottamatta niitä läsnä ja ympärillä nekroottisen ja myxoid rappeuttavat alueilla. Yllättäen ARG2 ei ilmeisesti ilmaistu strooman tai epiteelisolut ympäröivän nekroottisen kudoksen tai myxoid rappeuttavia alueilla intraduktaalisissa papillaarinen-mucinous kasvaimet haiman ja nekroottisen kudoksen mahahaava (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Kolmen immunofluoresenssilla osoittavat, että suurin osa pistemäisiä värjäys ARG2 (punainen) on läsnä α-SMA-positiivisia fibroblasteissa (vihreä). Syöpäsolut ovat positiivisia sytokeratiineja (sininen). Ytimet värjätään DAPI (valkoinen). (B) histologia ja immunohistokemia PDC kudoksen matala- (ylempi-kuvan kunkin parin kuvia) ja suuritehoiset view (alempi kuva kunkin parin kuvia). HE värjäystä ja immunohistokemiallisesti useita antigeenejä sarja kudosleikkeiden. Nekroottinen alueet ympäröivät tähti merkkien pienitehoisia HE valokuva ja suorakulmion (vaaleansininen) vastaa alueen suuritehoisia näkymä.

Koska ARG2 ilmentävien valuuttalisiin olivat läsnä ja noin nekroottinen alueet, tutkimme seuraavaksi suhdetta ARG2 ilmaisun ja hypoksiaa syöpäkudoksen käyttäen immunohistokemiallisen. Expression of Caix, SLC2A1 tai HIF-1α havaittiin valuuttalisiin noin alueilla kuolion. ARG2 ekspressio havaittiin näissä CAIX-, SLC2A1-, tai HIF-1α-ilmentävien valuuttalisiin itseään, tai valuuttalisiin vieressä CAIX-, SLC2A1-, tai HIF-1α-ilmentäviä soluja (kuvio 4). ARG2 ilmentymistä syöpäsoluissa ei rajoitu alueilla ympäri kuolion tai lähellä CAIX-, SLC2A1-, tai HIF-1α-ilmentäviä soluja (tietoja ei esitetty). Nämä havainnot ehdottivat, että ilmentyminen ARG2 indusoitui valuuttalisiin hypoksisissa olosuhteissa, ja että ei ollut ilmeistä korrelaatiota hypoksia ja ilmentymistä ARG2 syöpäsoluissa.

histologia PDC kudoksen niukassa (ylempi pylväät) ja suuritehoiset näkymä (alempi pylväät). HE värjäystä ja immunohistokemiaa ARG2, Caix, ja SLC2A1 sarja- kudosleikkeiden. Nekroottinen alueet ympäröivät tähti merkkejä ylemmässä HE valokuvan ja suorakulmion (vaaleansininen) vastaa aluetta alemman sarakkeeseen. Double Immunovärjäyksen (äärimmäisenä oikealla saraketta) paljastaa, että suurin osa rakeista ARG2 värjäytymistä (ruskea) on läsnä kara-muotoinen solut värjätään Caix (violetti). Upotettavat on hyvin suuritehoinen näkymä.

Hypoksia indusoi ilmentäminen ARG2 sisään valuuttalisiin Ote PDC Kudokset

Vahvista jos ilmentymisen

ARG2

geeni on aiheuttama hypoksia valuuttalisiin, toteutimme

in vitro

kokeellisesti valuuttalisiin uutettu PDC kudoksista. Induktio

ARG2

geeniekspressiota hypoksinen stressi löytyi valuuttalisiin sekä transkription ja proteiinin tasot, ja aiheuttama ARG2 oli arginase aktiivisuus (kuviot 5A-C). Expression of ARG2 jatkui hypoksisissa olosuhteissa, ja induktio ARG2 mukaan hypoksinen stressi oli palautuva. Re-hapetus vähensi sääteli ilmentymä

ARG2

geenin vastaavalle tasolle, että valuuttalisiin viljeltiin normoxic olosuhteissa (kuvio 5A). Hypoksinen stressin aiheuttama kertyminen HIF-1α in valuuttalisiin (kuvio 5D). Mukaan geenin tietokantaan, 5 ’reunustavan alueen ensimmäisen eksonin ARG2 geenin on potentiaalia sitoutumiskohtia HIF-1 (5′-RCGTG-3’) [13]: ACGTG at -425–421 ja GCGTG at -234–230. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ilmentyminen ARG2 indusoituu kautta HIF-1-signalointireitin.

(A) Suhteellinen geenin ilmentymisen mitataan reaaliaikaisesti RT-PCR-fibroblasteissa on uutettu PDC kudoksesta sen jälkeen, kun 48 tuntia altistuksen hypoksia (hapenpuute) tai kulttuurinedistämistoimintaa normoxic ohjaus olosuhteissa (normoksia). Ilmentäminen geenien fibroblasteissa jälkeen 48 tunnin viljelyn hypoksisissa olosuhteissa seuraa 48 tunnin kulttuurin mukaisesti happiolosuhteissa (Re-hapetus) analysoitiin myös. Kukin data sarake edustaa keskimääräinen suhteellinen ilmaisu standardoida 18SrRNA ± SE kolmen rinnakkaisen määrityksen.

SLC2A1

(tunnetaan vaihtoehtoisesti glukoosin kuljettajan tyypin 1 tai GLUT1) geeni on hypoksia-indusoituva. Merkitys arvo (Opiskelijan

t

testi) on

P

0,01 (*). Jotkut geenit ilmentyvät valuuttalisiin on erittäin alemmalla tasolla kuin normaalissa kudoksessa, joka on tärkeä kudos ilmentämään geeniä. Tällaisissa tapauksissa, vertailu-geenin ilmentyminen on esitetty sisäkkeet kanssa 1/50 1/10000 mittakaavoissa. (B) Western blot analyysi (ylempi palsta) paljastaa, että ARG2 proteiinin ilmentyminen indusoituu valuuttalisiin käytetään (A), kun altistuminen hypoksia. N ja H osoittavat soluja viljellään normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa, tässä järjestyksessä. ARG2 proteiini indusoitiin valuuttalisiin on arginase aktiivisuutta (alempi palsta). Yksi yksikkö arginase muuttaa 1 mikromoolin L-arginiinia ornitiini ja urean per minuutti pH: ssa 9,5 ja 37 ° C: ssa. Kukin data pylväs edustaa keskiarvon aktiivisuus ± SE kolmen rinnakkaisen määrityksen. Merkitys arvo (Opiskelijan

t

testi) on

P

0,05 (*) ja

P

0,01 (**). (C) geenien ilmentymistä valuuttalisiin PDC kudoksesta viljelyn aikana hypoksisissa olosuhteissa havaitaan reaaliaikaisen RT-PCR: llä. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitys arvo (Opiskelijan

t

testi) on

P

0,01 (*) ja

P

0,001 (**). (D) Western blot analyysi HIF-1α-proteiinia. Kertyminen HIF-1α-proteiini havaitaan valuuttalisiin jälkeen 6 tuntia altistumisen hypoksinen olosuhteet. N ja H osoittavat soluja viljellään normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa, vastaavasti.

ilmoittaminen

ARG1

,

NOS1, NOS2

, ja

NOS3

geenejä ei merkittävästi aiheuttama hypoksia (kuviot 5A). Ilmaus

ARG1

ja

NOS3

geenejä näytti aiheuttama hypoksia, vaikka niiden ekspressiotasot olivat hyvin alhaiset, lähes 1/1000 1/10000 näiden normaalissa kudoksessa, joka on yksi tärkeimmistä kudoksia, jotka ekspressoivat geeniä. Koska kaikki nämä geenit koodaavat entsyymiä molekyylejä, on epätodennäköistä, että tällaiset pienet määrät indusoidun transkriptien olisi biologisesti tärkeä. Pikemminkin se on spekuloitu, että pieniä määriä kontaminoivia solujen, kuten endoteelisolujen ehkä ovat vastanneet hypoksisissa olosuhteissa. Peroksinitriittiä on reaktiivinen typen väli- tuotetaan kun sekä NOS ja ARG ovat läsnä. Koska nämä solut eivät näihin nitrotyrosiini tutkinut immunohistokemialla (tuloksia ei ole esitetty), joka syntyy nitraus Tyrosiinitähteiden peroksinitriitin,

NOS2

ilmentymistä ei todettu valuuttalisiin sisällä ja ympärillä nekroottisen alueilla PDC kudoksessa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että

NOS2

ei indusoituu

ARG2

ilmentävä valuuttalisiin.

ARG2 ilmentävien valuuttalisiin saattavat vaikuttaa immuunireaktion

normaali fysiologinen pitoisuus L-arginiini seerumissa on noin 100 uM (50-150 uM). Olemme todenneet, että 12-15 uM L-arginiini olisi tarpeen T-solujen proliferaatiota indusoimaa T-solureseptorin stimulaation koeolosuhteissa käytimme (kuviot 6A ja 6B). Seuraavaksi yritimme tutkia jos ARG2 aiheuttama altistuminen hypoksia vaikuttaa T-solujen lisääntymiseen

in vitro

. In vastoin odotuksia, vakioitu väliaine, jota oli käytetty viljelemiseksi valuuttalisiin hypoksisissa olosuhteissa ei tukahduttaa T-soluproliferaatiota merkittävästi verrattuna väliaineessa, jota oli käytetty viljelemiseksi valuuttalisiin mukaisesti happiolosuhteissa (kuvio 6A ja B). Ero havaintojen meidän tulokset induktion ARG2 proteiinin tietyllä entsyymiaktiivisuus valuuttalisiin by hypoksinen altistuminen saattaa johtua eritystä määrittelemätön molekyylejä, jotka voivat tukea T-soluproliferaatiota päässä valuuttalisiin.

( A) T-solujen lisääntymisen määrityksessä. CFSE-leimattua CD3

+ T-soluja stimuloitiin anti-CD3 /CD28-vasta-aine-konjugoitujen helmien tuoreeseen kasvualustaan, johon oli lisätty osoittaa L-arginiini (kontrolli) tai kunnostetussa alustassa viljelyn jälkeen valuuttalisiin mukaisesti happiolosuhteissa (normoksia), tai hypoksinen olosuhteet (hypoksia) keskipitkällä kanssa osoittaa L-arginiini (sisältäen 2,0 uM arginiini seerumin sisällön) neljä päivää, ja niiden leviäminen profiilit analysoitiin virtaussytometrialla. Ei-lisääntyneet solut osoittivat korkeimman fluoresenssin intensiteetti ja voimakkuus leimattu T-solujen puolittaa jokaisen solun jakautumista. Luvut edustavat suhde määrä soluja, jotka ovat läpikäyneet useita osastoja, suhteessa alkuperäiseen solujen määrä. Data edustaa yksi kuudesta itsenäisestä kokeesta. (B) Prosenttiosuudet soluista, joille on tehty solunjakautuminen. Data edustaa yksi kuudesta itsenäisestä kokeesta. (C, D) vertailu absoluuttinen määrä kasvaimeen infiltroivien CD3

+ T-solut (C), jossa niiden lisääntyvä indeksi (osuus Ki-67-positiivisia lisääntyvien solujen joukossa CD3

+ T-solut) (D ) välinen ympärillä ARG2 ilmentävien valuuttalisiin (valkoinen) ja alueen sisällä kasvaimen paitsi nekroottista kudosta (pilkullinen). Laskimme kasvainta infiltroituneen CD3

+ T-solut ja niiden Ki-67 positiivisuus kussakin kaksikymmentä eri suuritehoisia kentät aluetta kohti luokkien kahdella PDC tapausta. Kukin datan sarake edustaa keskiarvoa ± SE kolmen rinnakkaisen määrityksen. Merkitys arvo (Opiskelijan

t

testi) on

P

0,05 (*) ja

P

0,001 (**).

sen määrittämiseksi, onko CD3

+ T-solut lisääntyvät noin ARG2 ilmentäviä valuuttalisiin in PDC kudoksessa, suoritimme kaksinkertainen immunohistokemiallisesti CD3- ja Ki-67 ja verrattiin kasvaimen infiltroituneen CD3

+ T-solujen kanssa lisääntyvän indeksi ympärillä ARG2 ilmentävien valuuttalisiin alueen sisällä kasvaimen paitsi nekroottista kudosta. Se oli yllättynyt, että siellä oli muutamia CD3

+ T-solujen ympärille ARG2 ilmentäviä valuuttalisien. Sekä absoluuttinen määrä kasvainta infiltroituneen CD3

+ T-solut (kuvio 6C) ja osuus Ki-67-positiivisia lisääntyvien solujen joukossa CD3

+ T-solut (kuvio 6D) havaitaan alueella noin ARG2- ilmentävät valuuttalisiin olivat merkittävästi alhaisemmat kuin havaittu muissa alueella. Nämä havainnot viittaavat siihen, että adaptiivista immuunivastetta vaimennetaan alueilla ympäri ARG2 ilmentäviä valuuttalisiin.

välitön ARG2 aiheuttama altistuminen hypoksia valuuttalisiin syöpäsoluja vastaan ​​tutkittiin käyttäen

in vitro

järjestelmä, jossa valuuttalisiin uutettu PDC kudokset viljeltiin yhdessä haimasyöpä MiaPaca-2-soluissa. Leviämisen syöpäsolujen ei merkittävästi vaikuta ARG2 aiheuttama hypoksia (kuvio 7A), ja oksidatiivisen stressin aiheuttaman apoptoosin syöpäsoluissa, mutta valuuttalisiin itse eivät estäneet polyamiini tuotettu ARG2 vasteena hypoksialle (kuvio 7C).

(A) ARG2 ilmentävien valuuttalisiin eivät tue leviämisen haimasyövän soluja. Valuuttalisiin uutettu PDC kudoksista ja MiaPaca-2-soluja viljellään yhdessä väliaineessa tai ilman 2 mM DFMO alle normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia ja numerot elävien solujen laskettiin tietojen perusteella saadaan virtaussytometrialla. Absoluuttinen määrä MiaPaca-2-soluissa viljelty hypoksisissa olosuhteissa vähentynyt merkittävästi verrattuna happiolosuhteissa, vaikka tämä vaikutus ei merkittävästi vaikuttanut läsnäolo DFMO kasvualustaan. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitys arvo (Opiskelijan

t

testi) on

P

0,05 (*) ja

P

0,01 (**). (B) oksidatiivisen stressin indusoiman apoptoosin indusoitiin MiaPaca-2-solujen altistuksella eri pitoisuuksia (0-500 uM) H

2O

2 7 tuntia. Kuolleita soluja ja eläviä soluja havaittiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen anneksiini V: n ja PI. (C) ARG2 ilmentävien valuuttalisiin ei suojannut haimasyövän soluja oksidatiivista: n indusoiman apoptoosin. 48 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuurin valuuttalisiin uutetaan PDC kudosten ja MiaPaca-2-solujen väliaineessa tai ilman 2 mM DFMO mukaisesti normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa, kaikki soluja viljeltiin vielä 4 tunnin ajan alle oksidatiivista stressiä (50 uM H

2O

2) käyttäen samoja olosuhteita kuin ennen. Prosenttiosuudet elävien solujen mitattiin virtaussytometrialla (vasen sarake). Jotta voitaisiin arvioida vaikutusta oksidatiivisen stressin, prosenttiosuudet elävien solujen altistuksen jälkeen oksidatiivista stressiä jaettiin prosenttiosuudet elävien solujen viljelty samoissa olosuhteissa ennen oksidatiivista stressiä (oikea sarake). Suhde elävien solujen ennen ja jälkeen oksidatiivisen stressin väheni merkittävästi sekä MiaPaca-2-soluissa ja valuuttalisiin viljelty hypoksinen olosuhteissa. Tukkiminen synteesi polyamiinien kanssa DFMO kasvoi merkittävästi aste oksidatiivisen stressin aiheuttaman apoptoosin valuuttalisien. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkitys arvo (Opiskelijan

t

testi) on

P

0,05 (*) ja

P

0,01 (**).

keskustelu

ARG pelaa tärkeitä tehtäviä säätelyssä useimmissa näkökohtia arginiinia aineenvaihdunnan terveys ja sairaus, kuten arginiini on esiaste useita molekyylien pohjimmiltaan tärkeitä biologisia toimintoja, kuten urean, typpioksidi, polyamiinit, proliini, kreatiini, glutamaatti, ja agmatiini. [2], [4] Vaikka ARG2 on tiettävästi mukana kasvain immuuni purkumekanismeja, [5] sen rooleja ihmisen syövässä on vielä täysin selvitetty. Tässä olemme osoittaneet, että suurin osa pdCs ei ilmaista ARG2 ja että läsnäolo ARG2 ilmentävien pdCs ei korreloi merkitsevästi potilaan lopputulokseen. Sen sijaan läsnäolo ARG2 ilmentävien valuuttalisiin todettiin olevan itsenäinen ennustaja huonompi OS (HR = 1,582,

P

= 0,007) ja DFS (HR = 1.715,

P

= 0,001 ) in PDC potilailla. Läsnäolo ARG2 valuuttalisiin PDC kudos korreloi läheisesti korkeampi kasvaimen läsnäolo histologista kuolion, läsnäolo Caix ilmentävien stroomasolujen, ja läsnäolo SLC2A1-ilmentävien strooman solujen PDC kudoksessa. ARG2 ilmentäviä valuuttalisiin olivat paikallisia sisällä ja ympärillä nekroottisen alueilla PDC kudokseen ja koekspressoi Caix, SLC2A1 ja HIF-1α. Lisäksi

in vitro

kokeet paljastivat, että viljellyt fibroblastit uutettu PDC kudoksesta ilmaisi ARG2 altistumisen jälkeen hypoksia. Nämä tulokset osoittavat, että syöpä soluvälitteinen immunosuppression kautta ARG2 ilmaisu ei ole yleinen tapahtuma, ja että läsnä ARG2 ilmentävien valuuttalisiin on riippumaton ennustetekijä PDC potilailla, ja myös heijastaa kudoshypoksia.

alennetulla hapen kireys on raportoitu vaikuttavan ARG aktiivisuutta useissa kudoksissa ja solutyypeissä, mukaan lukien keuhko-, aivo-, endoteelisolut ja makrofagit, [14], [15], [16], vaikka vaikutukset ARGs erilaisia ​​eri kudokset, solut, ja lajeja. Ihmisillä on osoitettu, että hypoksia indusoi ilmentymisen ARG2 keuhkovaltimon sileän lihaksen soluissa (PASMC) [17] ja keuhkon mikrovaskulaarisia endoteelisoluja. [18], [19] Tietääksemme vaikutukset hypoksia ARG ilmentyminen syövän kudoksissa tai fibroblastit ei ole osoitettu aikaisemmin. Tutkimuksemme yhdessä tutkimuksessa, että hypoksian indusoima ARG2 muttei ARG1 sisään PASMCs viittaa siihen, että ARG2 on hypoksia-indusoituva isoformi. [17] Se on johdonmukainen havaintojen että kertyminen HIF-1α löydettiin valuuttalisiin hypoksisissa olosuhteissa ja että 5 ’reunustavan alueen ensimmäisen eksonin ARG2 geenillä on potentiaalia sitoutumiskohtia HIF-1.

ornitiini tuottamat ARG voidaan edelleen metaboloituu polyamiinit ja proliini, jotka ovat kriittisiä solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja kudosten korjaamiseen, mikä saattaa estää solukuolemaa. [20], [21], [22] Siksi induktio ARG2 voisi olla puolustava vastaus valuuttalisiin PDC kudoksessa ankarissa hypoksisissa stressi saattaa johtaa solukuolemaan. Itse asiassa tuloksemme osoittivat, että ARG2 ilmentävien valuuttalisiin lievittää oksidatiivisen stressin aiheuttama apoptoosin valuuttalisiin itse (kuva 7C). Tämä on johdonmukaista, että se, että nämä valuuttalisiin osoitti korkeaa ARG ja alhainen NOS, viittaa laajaan sukupolven polyamiinit ja proliinin niihin. Nämä valuuttalisiin voivat myös aiheuttaa fibroosia, koska proliini on olennainen osa kollageenia. Kuten on havaittu, että nekroottisen kudoksen usein uusittu sidekudoksen muotona parantavaa vastetta, [23], on ehdotettu, että ARG2 induktio on mukana fibroosia hypoksinen alueilla helpottamiseksi post-nekroottisen fibroosia. Vaikka on vielä epäselvää, ARG2 ilmentäviä valuuttalisiin edistää syövän etenemiseen, ei merkittäviä vaikutuksia syöpäsolujen lisääntymistä ja suojelu oksidatiivisen stressin aiheuttama apoptoosin syöpäsoluissa havaittiin meidän

in vitro

kokeissa (kuviot 7A ja 7C).

Suurin osa PDC solut eivät ilmaista ARG2. Keuhkosyöpä ilmaisee ARG2, vaikka immunosuppressiota välittämä ARG2 ilmentäviä syöpäsolut ei ole havaittu. [6] Näin ollen on ehdotettu, että syöpä soluvälitteisen immuunivasteen tukahduttamisen ARG2 (ja NOS2) eturauhassyövän [5] on luultavasti kudos-riippuvainen, ja ei ole yleinen tapahtuma syövän mikroympäristössä. Meidän tutkinta Kasvaimen infiltroituneen immuunisolut pdCs osoitti, että läsnäolo ARG2 ilmentävien valuuttalisiin korreloi merkitsevästi korkeampi soluttautumista CD68

+ makrofageja (

P

= 0,05) ja CD66b

+ neutrofiilejä (

P

0,0001), ja alemman soluttautuminen CD4

+ T-solut (

P

= 0,003) ja CD8

+ T-solut (

P

= 0,036). Lisäksi kasvaimeen infiltroivien CD3

+ T-solujen ympärille ARG2 ilmentäviä valuuttalisiin oli vähän ja osoittivat vähemmän proliferaatiota (kuvio 6). Nämä havainnot viittaavat siihen, että läsnä on ARG2 ilmentävien valuuttalisiin liittyy läheisesti immunosuppressiivisen mikroympäristössä. Tämä tilanne voidaan selittää kannalta kudoshypoksia [24], vaikka siitä, missä määrin paikallinen ilmentyminen ARG2 vuonna valuuttalisiin vaikuttaa tähän immunosuppressio on vielä epäselvä.