Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan terapeuttista potentiaalia tukahduttaa MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reittejä ja histonideasetylaasi (HDAC) indusoimaan ilmentyminen natrium /jodidia symporter (NIS) ja radiojodin ottoa ei-kilpirauhasen syöpäsoluja.

Methods

Testasimme vaikutuksia MEK-inhibiittorin RDEA119, Akt estäjä perifosine, ja HDAC-inhibiittori SAHA NIS ilmentymistä kolmetoista ihmisen syövän johdetut solulinjat melanooma, maksan karsinooma, mahasyöpä, paksusuolen syöpä, rintasyöpä, ja aivojen syövät. Tutkimme myös radiojodin otto ja histoni asetylointi NIS promoottori valituissa soluissa.

Tulokset

Kaiken kolme estäjät voivat aiheuttaa NIS ilmaisun, eri laajuudessa, melanooman ja kaikki epiteelikarsinooman -johdannainen soluissa, mutta ei aivosyövän peräisin olevat solut. SAHA oli tehokkainta ja sen vaikutus voitaisiin merkittävästi tehostaa RDEA119 ja perifosine. Ilmaisu NIS, sekä mRNA ja proteiini tasoilla, oli vahvinta melanoomasolulinjalla M14, maksakarsinooma solu HepG2, ja mahalaukun karsinooma solu MKN-7 cell. Radiojodin otto vastaavasti aiheuttama, mukana vankka kasvu histoni asetylointi NIS promoottori, näissä soluissa, kun niitä käsitellään kolmea estäjien.

Johtopäätökset

Tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että samanaikaisesti tukahduttaa MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC voivat aiheuttaa vankka NIS ilmaisun ja radiojodin otto tietyissä ei-kilpirauhasen ihmisen syöpäsoluja, jotka tarjoavat uusia terapeuttisia vaikutuksia lisänä radiojodin näiden syöpien hoidossa.

Citation: Liu Z, Xing M (2012) induktio Natrium /Iodide Symporter (NIS) Expression ja Radiojodi otto Non-kilpirauhassyöpä Cells. PLoS ONE 7 (2): e31729. doi: 10,1371 /journal.pone.0031729

Editor: Marian Ludgate, Cardiff University, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 12 syyskuu 2011; Hyväksytty: 12 tammikuu 2012; Julkaistu: 16 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Liu, Xing. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institute of Health R01 avustuksen CA134225 tohtori Xing. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska läpäisevä glykoproteiini ilmentyy pääasiallisesti follikulaarinen epiteelisolujen kilpirauhassoluja natriumjodidia symporter (NIS) on keskeinen rooli kuljetettaessa jodidia ekstrasellulaaritilan osaksi kilpirauhasen soluun synteesissä kilpirauhashormonien kilpirauhasessa [1] – [4]. Tämä on biologinen perusta kliininen käyttö radiojodin diagnosointiin ja hoitoon erilaisia ​​hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset kilpirauhasen sairaudet. Tyypillinen esimerkki hyödyntää tätä toimintoa NIS on radiojodia ablaatio laajasti sovellettu hoitoon kilpirauhassyövän [5], [6]. Radiojodin hoito on yleensä tehokas kilpirauhassyöpä potilailla, mutta se on tehoton, kun kilpirauhasen syöpäsolut ovat menettäneet ilmaus NIS ja voi enää ryhtyä radiojodia kuten yleensä nähty huonosti eriytetty ja erilaistumaton kilpirauhassyövän [7] – [10]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että inhibiittorit histonideasetylaasi- (HDAC) voisi indusoida NIS kilpirauhassyövän syöpäsoluissa [11], [12]. Olemme äskettäin osoittaneet, että yhdistelmä HDAC estäjä SAHA estäjien MAP kinaasi ja PI3K /Akt reitit saattavat aiheuttaa vankka ja yhteisvaikutukset ilmaus NIS ja radiojodin kertymä kilpirauhasen syöpäsoluja [13]. Tämä avasi mahdollisuuden uusille tehokkaan hoidon kilpirauhassyövän käyttää Radiojodin, joka muuten ei-innokas tähän radioisotooppi.

Koska ainutlaatuinen tehtävä NIS kuljettaa jodidi osaksi kilpirauhassoluja ja kliininen menestys käyttää radiojodin kilpirauhasen syövän ablaatiohoidon, se on jo pitkään ehdotettu ja testattu että eksogeenisesti aiheuttama NIS ilmaisun käyttämällä kohdistettuja geeninsiirto voidaan antaa ei-kilpirauhasen syöpäsoluja radiojodia aviditeetti radiojodin ablaatiohoidon [2] – [4], [14]. Tällaiset tutkimukset ovat lupaavia, mutta eivät ole vielä johtaneet luotettavia kliinisiä sovelluksia. Merkittäviä ponnisteluja tarvitaan vielä parantaa useita keskeisiä näkökohtia tämän lähestymistavan, kuten terapeuttinen teho, spesifisyys, turvallisuus ja tekninen monimutkaisuus. NIS voidaan ilmaista erilaisissa normaaleissa ei-kilpirauhasen kudoksissa, vaikkakin matalalla tasolla, mukaan lukien esimerkiksi, syljen, kyynel, rinta-, maha-, suoli, keuhko ja munuainen kudoksissa [15] – [19]. Matalan tason ilmentymistä NIS raportoitiin myös joitakin ei-kilpirauhassyövän kuten rintasyöpä [20]. Olemme äskettäin osoittaneet, että tukahduttaminen MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä voisi indusoi NIS ja radiojodin kertymä melanoomasoluissa [21]. Koska synergistisyyttä voimakkaasti indusoiva kilpirauhasen geenien ilmentyminen ja radiojodin kertymä kilpirauhasen syöpäsoluja samanaikaisesti estämällä HDAC ja MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reitit [13], esillä olevassa tutkimuksessa testasimme mahdollisuuksia tämän Uusi terapeuttinen strategia aiheuttaa NIS ilmaisun radiojodin kertymä laajennettu paneeli ei-kilpirauhasen syöpäsoluja.

tulokset

induktio NIS geeniekspression kuin kilpirauhasen syöpäsoluja estämällä MAP-kinaasin ja PI3K /AKT reittejä ja HDAC

Testasimme vaikutuksia MEK-inhibiittorin RDEA119, Akt estäjä perifosine, ja HDAC-inhibiittori SAHA sen ilmentymisen

NIS

geenin 13 ihmisen syöpäsoluja (taulukko 1). Näitä olivat melanoomasoluja ja epiteelikarsinooma peräisin olevien solujen maksasyöpä, mahasyöpä, paksusuolen syöpä, rintasyöpä, sekä glioblastoomasolulinjan T98G ja astrosytooma solun SNB-78. Osoittaa suunnattu lääkkeen vaikutuksia kolmen estäjien näissä soluissa, ensin testattu niiden vaikutukset niiden kohdemolekyylien signalointireittien. Kuten on esitetty kuviossa. 1, 30 tunnin jälkeen hoidon, RDEA119 0,5 uM ja perifosine 5 uM voisi merkittävästi estää fosforylaatiota ERK (p-ERK) ja fosforylaatio AKT (p-AKT), vastaavasti, lähes kaikki solut lukuun ottamatta SNB-78 solu. SAHA 0,5 uM 30 tuntia voi dramaattisesti parantaa asetylointi histoni H3 näissä soluissa lukuun ottamatta muutamia soluja, kuten T98G ja SNB78, jossa ei ollut mitään tai vain pientä kasvua histoni asetylaatio. Nämä tulokset, kaiken kaikkiaan, osoitti odotetun tavoitteen vaikutuksia nämä inhibiittorit.

MEK estäjä RDEA119, Akt estäjä perifosine, ja HDAC estäjä SAHA käytettiin vastaavasti kohdistaa näihin signalointireittejä tai molekyylejä. Soluja käsiteltiin 30 tuntia 0,5 uM RDEA119, 5 uM perifosine tai 0,5 uM SAHA kuten on osoitettu. DMSO: ssa tai PBS: ää käytettiin rinnakkain vehikkelikontrollina. Solut lysoitiin Western blotting käsittelyjen jälkeen paljastaa tasot fosforyloidun ERK (p-ERK), fosforyloitu Akt (p-Akt), ja asetyloitua histoni (Ac-His) spesifisten vasta-aineiden. ”+”, Hoito ilmoitetuilla estäjä; ”-”, Käsittelyyn kuljettimella.

kokeiltiin vaikutukset kolmen estäjien näissä pitoisuuksissa, yksittäin tai yhdistelminä, on ilmaus

NIS

-geenin 13-soluissa käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Kuten on esitetty taulukossa 1,

NIS

ekspressio lisääntyi eriasteisesti kaikissa soluissa, lukuun ottamatta kahta ei-epiteelisyöpäsolujen T98G ja SNB78, joka ei ole vastaus näihin lääkehoitoon. Indusoituneen

NIS

ilme oli vahvinta melanoomasolulinjalla M14, The maksasyöpä solu HepG2, ja mahalaukun karsinooma solu MKN-7, joita käytettiin lisätutkimuksiin kuten esitetään seuraavissa kohdissa. Yksilöllisesti, RDEA119 ja perifosine kukin oli pienempi vaikutus ja SAHA näytetään selvin vaikutuksia ilmaus

NIS

. Synergistinen vaikutus havaittiin, kun MEK estäjää tai Akt inhibiittoria kunkin yhdistettiin SAHA ja synergiavaikutuksen olivat vieläkin vankka, kun kolmen lääkeaineen yhdistettiin, jossa poikkeus että HepG2-soluissa perifosine ei lisännyt entisestään vahvaa vaikutusta SAHA .

jälkeen osoittaminen mRNA ilmentymisen NIS kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR melanooman ja epiteelikarsinooman soluja, me vieressä pyrittiin ekspression tutkimiseksi NIS proteiinitasolla näissä soluissa, käyttämällä melanoomasolulinjaa M14 , maksasyöpä solu HepG2, ja mahalaukun karsinooma solu MKN-7 edustajina joka näytetään vahvin ilmentymä NIS (taulukko 1). Kuten on esitetty kuviossa. 2, yhdistelmä hoito näiden solujen kanssa RDEA119, perifosine ja SAHA huomattavasti NIS-proteiinin ilmentymisen havaittuna Western blottauksella. Verrattuna M14 ja HepG2-soluissa, MKN-7 soluilla lievän nousun ilmentymistä NIS proteiinin vastauksena yhdistelmähoito kolmella estäjien, joka oli samanlainen kuin kuvio NIS-mRNA ilmaisun näissä soluissa tämän lääkehoidon ehto (Pöytä 1). Siten tukahduttaa MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC voivat aiheuttaa vankka ilmentymisen NIS näissä soluissa sekä transkriptiota ja translaatiota tasolla.

Soluja käsiteltiin 30 tuntia yhdistelmällä käyttämällä RDEA119, perifosine, ja SAHA pitoisuuksina kuvattu kuvassa. 1, jonka jälkeen standardi Western blotting-analyysi solulysaateista käyttäen erityinen ensisijainen vasta-aine NIS. Ilmaisu taso beta-aktiini analysoitiin rinnakkain laadunvalvontaan. ”Control”, solujen käsittely ajoneuvon ”R + P + S”, solujen käsittely yhdistettyä käyttöä RDEA119, perifosine ja SAHA.

Cellular radiojodidia oton aiheuttama tukahduttamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC

Kun osoitus vankka NIS ilmentymisen kuin kilpirauhasen syöpäsoluja estämällä MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC, käytimme M14, HepG2 ja MKN-7-solujen testaamiseksi perimmäinen toiminnallinen tämän löydöksen tutkimalla kyky nämä solut ottamaan radiojodidia induktion jälkeen NIS. Kuten on esitetty kuviossa. 3, radiojodidia sisäänotto selvästi indusoitiin näissä soluissa yhdistelmällä käsittelemällä RDEA119, perifosine ja SAHA. Niistä kolme solua, merkitään radiojodidia sisäänotto erityisesti nähtävissä M14 solussa, yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että NIS ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasoilla oli vahvin tässä solussa.

Soluja käsiteltiin RDEA119, perifosine ja SAHA kuvatulla kuvassa. 2, jonka jälkeen inkuboitiin Na

125I 1 tunnin ajan. Parallel solut käsiteltiin lisäksi NIS esto NaClO

4 saamiseksi epäspesifisen radiojodin otto /sitoutumisen solujen kanssa. Sitten solut pestiin, lyysattiin, ja mitattiin radioaktiivisuus. Cell radiojodin otto on esitetty cpm /10

6 solua (y-akseli kuvassa) korjauksen jälkeen epäspesifinen radiojodin sitova. Yksityiskohtaiset kokeellisia menettelytapoja, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. ”Control”, solujen käsittely ajoneuvon ”R + P + S”, solujen käsittely yhdistelmällä käyttämällä RDEA119, perifosine ja SAHA. ** Verrattuna ohjaus, p 0,01.

Enhancement histonien asetylointi NIS promoottorin tukahduttamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC

histoni asetylaatio klo promoottorialueen edistää geenin ilmentymistä [22]. Tutkia, onko tämä mekanismi osallistuu ilmaus NIS aiheuttama lääkehoitojen kuin kilpirauhasen syöpäsoluja Tässä työssä me seuraavaksi suoritetaan ChIP analyysi histoni asetylointi NIS promoottori. Tutkimme kolmea eri alueilla NIS promoottorin histoni H3 ja H4 asetylointi in M14, HepG2 ja MKN-7-soluissa. Nämä alueet edustavat minimaalinen olennainen NIS promoottori [23]. Huomasimme, että histoni asetylaatio näillä alueilla NIS promoottorin nostettiin eri tasoilla käsittelemällä SAHA näissä soluissa (Kuva. 4a-c). Yhdistelmähoito kanssa MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC-inhibiittorit kasvoi edelleen histoni asetylointi NIS promoottori. Kaiken kaikkiaan tämä histoni asetylaatio nähtiin sekä H3 ja H4 on kolme solua lukuunottamatta MKN-7-soluissa, joissa ei ole merkittävää asetylointi muutosta nähtiin H3 (Fig. 4c). Kaikki kolme alueet minimal essential NIS-promoottorin näytetään histoni asetylaatio lukuun ottamatta P1 alueella M14-solut, jotka eivät osoittaneet mitään muutosta asetylaatio H3 jälkeen lääkehoitojen (Fig. 4a). Jopa noin 50 taittuu kasvusta histoni H4 asetylointi P2 alueella NIS promoottorin M14 soluissa (Kuva. 4a) ja noin 20 taittuu kasvusta histoni H4 asetylointi P1 alueen HepG2-soluissa (kuvio. 4b) olivat havaittu. Nämä tiedot viittaavat siihen, että histoni asetylaatio on mekanismi, joka osallistuu NIS ilmaisun aiheuttama tukahduttamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC näissä ei-kilpirauhasen syöpäsoluja. M14 solut osoittivat vahvin histoni asetylointi NIS promoottori ja toiseksi eniten HepG2-soluissa. MKN-7 soluilla on suhteellisen vaatimaton histoni asetylointi NIS promoottori. On mielenkiintoista huomata, että tämä malli laajuudesta histoni asetylaatio on kolme solua heijastuu hyvin kuviot laajuus NIS ilmentymisen (taulukko 1, Fig. 2) ja radiojodin oton (Fig. 3) näissä soluissa, mikä edelleen tukee tärkeä rooli histoni asetylointi UIV ilmaisun aiheuttama kohdentamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC. Tämä ei näytä sovelleta T98G solu, joka osoitti jonkin verran histoni asetylaatio alle hoidon SAHA (Fig. 1), kun taas ei ollut kasvua NIS ilmentyminen tässä solussa (taulukko 1). Kuitenkin tämä Asetylaationopeus histoni oli minimaalinen verrattuna, että monissa muissa soluissa (Kuva. 1). Siksi korrelaatio NIS ilmaisun kanssa histoni asetylaatio oli kokonaisuudessaan selvä erilaisissa soluissa testataan.

Soluja käsiteltiin SAHA yksin tai SAHA yhdistettynä RDEA119 ja perifosine kuvatulla kuvassa. 2. Histoni asetylointi tasoilla kolmen alueen (P1, P2 ja P3), jotka käsittävät minimal essential promoottori

NIS

geenin analysoitiin kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) analyysi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Asetylaatio asema sekä histoni H3 ja H4 tutkittiin käyttämällä spesifisiä vasta-aineita siru. Ei-spesifisiä IgG-vasta-aineita käytettiin kontrollina. Tulokset M14, HepG2 ja MKN-7-soluissa on esitetty kuvioissa. 4a, 4b ja 4c, vastaavasti. Kunkin solun, ylempi paneeli näyttää todelliset tulokset PCR DNA-fragmentit saatiin sirun avulla epäspesifinen kontrolli IgG, anti-asetyloitu H3 (Anti Ac-H3) vasta-aine tai anti-asetyloitu H4 (Anti Ac-H4) vasta-aine . Identtiset määrät ennalta immunosaostus solulysaateista eri kohtelu olosuhteita käytettiin aloittamaan immunosaostusmenetelmiä. Osajaetta ennalta immunosaostus solu- lysaattia suoraan käytettiin eristämään DNA ”Input” ohjaus. PCR tulokset heijastavat histoni asetylaatio tasoa. Esitetty alapaneeli kunkin solun on pylväsdiagrammi, joka esittää määrällisesti asetylointi tasot H3 ja H4 kolmessa alueet

NIS

promoottori perustuu densitometristä mittauksiin Ylemmän levyn. Tulokset on normalisoitu jakamalla vastaava tulo signaalit ja esitetään suhde osoitetun hoidon kontrolliin verrattuna. ”Control”, solujen käsittely ajoneuvon ”SAHA”, solujen käsittely SAHA yksin ”R + P + S”, solujen käsittely yhdistettyä käyttöä RDEA119, perifosine ja SAHA.

Keskustelu

Radiojodi ablaatio ja adjuvanttihoito ovat klassisia ja vakio hoitoja kilpirauhassyöpä , joka hyödyntää ainutlaatuisia jodidi-kuljettavat toiminto NIS kilpirauhasen solukalvon. Koska NIS on myös normaalisti ilmaistu, vaihtelevassa määrin useissa kuin kilpirauhasen kudoksia, esillä olevassa tutkimuksessa testasimme

NIS

ilmaisun ja radiojodin otto syöpäsoluissa peräisin ei-kilpirauhasen kudoksia samanaikaisesti tukahduttamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC. Vaikka rooli MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reittejä ilmaus NIS tutkittiin melanooman meidän aiemmissa tutkimuksissa [21], rooli HDAC ja histoni asetylointi ilmaus

NIS

melanooman ei ole tutkittu. Siksi myös melanoomasolujen tässä tutkimuksessa.

kykenivät indusoimaan ekspressiota NIS, eri laajuudessa, melanoomasoluissa ja maksan, mahan, paksusuolen ja rintasyöpäsoluihin, mutta ei ei-epiteelisolujen aivokasvain peräisin olevia soluja, mikä viittaa siihen, että tämä indusoituva NIS ilmentyminen voidaan rajoittaa ihon syöpäsoluja ja syöpäsoluja epiteelisolujen alkuperää. Tämä on mielenkiintoisesti sopusoinnussa jakautumiskuvion fysiologisten olevaa radiojodin kertymistä kudoksiin ihon (elpymisen vaihe polttaa), maksa, vatsa, paksusuoli, ja rinta (imettävän vaihe) kehoon scan kilpirauhassyövän potilaiden jälkeen radiojodia hoidon [24 ] – [27]. Merkillistä, me myös osoittaneet radiojodin otto jälkeen indusoima NIS, sopusoinnussa NIS toiminnallisuus nämä ei-kilpirauhasen syöpäsoluja. Tuloksemme myös ensimmäistä kertaa osoitti, että lisääntynyt histoni asetylaatio on

NIS

promoottori oli tärkeä mekanismi, joka osallistuu ilmentymistä NIS näissä ei-kilpirauhasen syöpäsoluja.

HDAC estäjän aiheuttama NIS ilmentyminen oli aiemmin osoitettiin HeLa-soluissa ja, kuten samassa tutkimuksessa, HepG2-soluissa [28]. Ottaa askel, olemme viime aikoina osoittaneet synergistisen vaikutuksen HDAC estäjä SAHA NIS ilmaisun aiheuttama tukahduttamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä kilpirauhasen syöpäsoluja vaikka tässä tutkimuksessa, histoni asetylaatio ei tutkittu [13]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäistä kertaa suoraan osoitettu, että tukahduttaminen MAP kinaasi ja PI3K /Akt reitit tehostettu histoni asetylointi

NIS

promoottori mekanismina ilmaus NIS aiheuttama samanaikaisesti kohdistamalla kaksi reittejä ja HDAC ihmisen syöpäsoluja.

osoittaminen NIS ilmaisun sekä mRNA ja proteiini tasolla sekä radiojodidia kertymä näissä soluissa perustettu toiminnallista merkitystä indusoituvan ilmentymisen

NIS

geeni näissä ei-kilpirauhasen syöpäsoluja. Taso aiheuttama NIS ilmaisun vaihteli solujen testattu, melanooma solujen M14, maksakarsinooma solu HepG2, ja mahalaukun karsinooma solu MKN-7 osoittaa vahvin ilmentymä NIS, mikä viittaa siihen, että NIS ilmaisun ja radiojodin ottoa voidaan indusoida ensisijaisesti tietyissä erityistapauksissa näistä syövistä varten epäselvä syistä. Muita tekijöitä todennäköisesti ole olemassa, jotka määrittävät indusoituvuus NIS ilmentymisen näissä syöpäsoluissa, josta esimerkkinä on estrogeenireseptori tila, joka määrittää indusoituvuus NIS ilmentymisen all-trans-retinoiinihapon rintasyöpäsoluissa [29]. Tulokset Tämän tutkimuksen ovat tärkeitä kliinisiä seurauksia. Melanooma, maksan karsinooma, ja mahalaukun karsinooma ovat yleisiä ihmisen syövissä, joissa kaikissa on korkea kuolleisuus, erityisesti metastaattisen ja kehittynyt tapauksissa. Koska jälkimmäinen tapaukset ovat yleensä kirurgisesti käyttökelvottomaksi, uusia tehokkaita lääkehoidot ovat tällä hetkellä tarvitaan kiireellisesti. Kun indusoituvuus NIS ilmaisun ja radiojodin otto näissä syöpäsoluissa osoitettu tässä tutkimuksessa, se voi olla mahdollista hoitaa syöpien käyttäen lisänä radiojodia kuin hoidettaessa kilpirauhasen syöpä. Se, että aiheuttama NIS ilmentyminen oli erityisen voimakasta joissakin solulinjoissa, mutta ei muita johdettu näistä syövistä viittaa siihen, että tämä radiojodia hoito voi olla tehokas potilaiden alaryhmässä näitä syöpiä.

Terapeuttiset aineet kohdistuvat suuret signalointireittejä, kuten MEK ja BRAF estäjät MAP-kinaasireitin ja Akt ja mTOR-inhibiittorit, että PI3K /Akt-reitin, sekä HDAC-inhibiittorit, parhaillaan kehitetään aktiivisesti kliinisesti [30] – [33]. Monet heistä ovat osoittaneet vahvaa terapeuttista potentiaalia erilaisissa ihmisen syövissä ja jotkut on hyväksytty kliiniseen käyttöön. Siksi on kliinisesti mahdollista käyttää näitä estäjiä kohdistaa MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja jotkut niistä yhdistelmänä kaksoiskäynnistys tukahduttaa kahden reitin aikaansaamiseksi NIS ilme. HDAC-inhibiittori SAHA, joka on myös hyväksytty tiettyjen syöpien hoidossa [34], voidaan sisällyttää tämän lääkkeen yhdistelmähoito parantaa NIS ilmentymisen radiojodin syöpien hoidossa. Koska nämä lääkkeet ovat itse terapeuttisia suoraan estämällä syöpäsolujen kasvua, niiden käyttö yhdessä radiojodikuvauksen käyttää edelleen tappaa syöpäsoluja voisi hoitoon entistäkin tehokkaamman kemoterapiaa. Tämä voi osoittautua uusi ja erityisen tehokas terapeuttinen strategia melanooman ja karsinoomat maksan ja ruoansulatuskanavan. Tämä teknisesti helppo strategia käyttää kliinisesti todistettu huumeiden aiheuttamaan NIS ilmaisun ja radiojodin otto ei-kilpirauhasen syöpäsoluja, jos on todettu tehokkaiksi tulevissa tutkimuksissa, saattaa olla parempi NIS ilmentymisen aikaan geenisiirron lähestymistapoja, koska se voi välttää tiettyjä turvallisuus, spesifisyys, tehoa, ja tekninen monimutkaisuus liittyviä kysymyksiä laajasti tutkittu plasmidi- tai virus-välitteistä elin kohdistettuja NIS geeninsiirto [4], [14].

Mielenkiintoista, aiemmat tutkimukset osoittivat perusilmennystä kilpirauhasen geenejä ihon ja melanoomasoluja [35], [36]. Tämä tarjoaa perustan voimakkaasti indusoima kilpirauhasen geenien ja radiojodin otto melanoomasoluissa kohdistamalla MAP kinaasi ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC tämänhetkiseen ja aiemmat tutkimukset [21]. On myös mahdollista, mutta vielä tutkittava, että alhainen perusilmennystä tilasta kilpirauhasen geenien samalla olemassa maksan ja mahakarsinoomat ja muiden syöpien tarkasteltu tässä tutkimuksessa, josta tulee voimakkaasti aktiivinen kun tukahduttaminen suurten signalointireittien.

Yhteenvetona tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa osoittaa vahvaa NIS ilmaisun ja radiojodin otto useisiin ei-kilpirauhasen syöpäsoluja samanaikaisesti kohdistamalla MAP-kinaasin ja PI3K /Akt reittejä ja HDAC käyttävät estäjiä. Koska monet näistä estäjien ovat jo osoittautuneet kliinisesti toteutettavissa ja lupaavia estämisessä erilaisiin syöpiin, niiden käyttö aiheuttaa myös NIS lauseke liitännäishoitona radiojodin hoito lisäksi niiden suora esto syöpäsolujen voi osoittautua uusi ja tehokas terapeuttinen strategia valittujen ei-kilpirauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

ihmisen syöpäsolulinjoissa

Kolmetoista ihmisen syöpäsolulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa, mukaan lukien melanooma-solut M14, UACC- 62 ja A375; maksakarsinooma solut HepG2 ja SK-Hep-1; mahasyöpä solut MKN-7 ja NUGC-4; koolonkarsinoomasoluja HT-29 ja RKO; -rintakarsinoomasolujen BT-20 ja MDA-MB-231; glioblastoomasolulinjan T98G; ja astrosytooman solu SNB-78. Nämä solut olivat American Type Culture Collection (Manassas, VA) ja NCI-Frederick Cancer DCTD Kasvain /Cell Line Repository (Frederick, MD). M14, UACC-62, MKN-7, NUGC-4 ja SNB-78-soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Mediatech, Inc., Manassas, VA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). RKO, BT-20, MDA-MB-231, HepG2, SK-Hep-1, ja T98G soluja viljeltiin Eaglen Minimum Essential Medium (ATCC, Manassas, VA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. HT-29-soluja viljeltiin McCoyn 5a Medium (ATCC, Manassas, VA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. A375-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (ATCC, Manassas, VA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Näissä viljelyolosuhteissa, solut käsiteltiin, jossa ilmoitetaan, jossa MEK inhibiittorin RDEA119, Akt estäjä perifosine, ja HDAC estäjä SAHA yksittäin tai yhdistelminä. DMSO ja PBS käytettiin rinnakkain ajoneuvon ohjaus.

Western blotting

Solut lyysattiin RIPA-puskurissa standardin proteaasinestäjät (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja standardi Western blotting analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [37] käyttämällä primaarisilla vasta-aineilla, mukaan lukien anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-Akt, anti-Ac-histoni H3, tai anti-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-Ac-histoni H4 (Cell Signaling, Danvers, MA); tai anti-NIS-vasta-aineita (Millipore Corp., Billerica, MA).

RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

jälkeen 30 h solujen käsittely ilmoitettu inhibiittorit, kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraavat valmistajan ohjeiden. Kolme ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä oligo-dT-alukkeita, ja yläindeksi III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR esimuotoillut analysoida ilmaus

NIS

geeni käyttäen iTaq SYBR Green Supermixiä kanssa ROX (Bio-rad, Hercules, CA) ABI 7900HT PCR -järjestelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA). p-aktiini ajettiin rinnakkain standardoida tuloon cDNA. Alukkeet suunniteltu

NIS

ja

β-aktiini

geenien ja laskentamenetelmät suhteellisia ekspressiotasoja

NIS

olivat kuten aiemmin on kuvattu [13].

radioaktiivisen jodidi oton määritystä

radioaktiivinen jodidi sisäänoton määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun 30-h hoito, jossa on esitetty inhibiittorit, soluja inkuboitiin 1 uCi Na

125I ja 5 uM ei-radioaktiivista Nal 2 ml: ssa alustaa 6-kuoppalevyille 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Määrittää NIS-erityisiä sisäänoton, rinnan soluja vastaavalla tavalla käsitelty estäjien kanssa käsiteltiin lisäksi 200 uM NaClO

4 30 minuuttia ennen Na

125I hoitoa. Elatusaine imettiin pois ja solut pestiin nopeasti kolme kertaa Hankin tasapainotetulla suolaliuoksella (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sitten solut trypsinoitiin ja hajotettiin 1 ml: lla 0,33 M NaOH. Rinnakkaisten levyjen solujen identtisesti käsitelty estäjien mutta ilman radiojodin inkubaation käytettiin määrittämään solujen lukumäärä lopussa kokeen. Liittynyt radioaktiivisuus solujen laskettiin gamma-laskurilla ja esitetty cpm /10

6 solua korjauksen jälkeen epäspesifisen radiojodidia sitoutumisen solujen läsnäollessa NaClO

4.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP määritys suoritettiin käyttäen EZ-Magna ChIP pakkaus (Millipore Corp., Billerica, MA) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, kun lääkehoidot, 1 x 10

7 solut silloitettu 37% formaldehydin 10 minuuttia, minkä jälkeen inkuboitiin kanssa glysiiniliuosta annetaan pakki 5 min. Sen jälkeen 2 pesut PBS, solut hajotettiin ja sonikoitiin 12 kertaa 10 sekuntia 20% pulssin teho käyttämällä Sonifier Cell haitta Malli Micros-150D (Branson, Danbury, CT). Silloitetut proteiini /DNA: ta sen jälkeen inkuboitiin yön yli anti-asetyloitu histoni H3, anti-asetyloitu histoni H4-vasta-aineita tai kontrolloida ei-spesifisiä IgG, ja puhdistettiin käyttäen proteiini-A-helmiä. Kun oli pesty puskurien sarjasta järjestyksessä kohti edellyttäen protokollan, proteiini A helmiä proteiini /DNA-kompleksit inkuboitiin proteinaasi K: lla 62 ° C: ssa 2 tuntia ravistellen. DNA-fragmentit erotettiin myöhemmin sentrifugoimalla ja puhdistaa spin sarakkeita. Kolme paria alukkeita ulottuu minimal essential promoottori-alue NIS-geenin, käytettiin analyysissä kuten aiemmin on kuvattu [23]. Standard päätepiste PCR suoritettiin seuraavasti: sen jälkeen 3 min denaturointia 95 ° C: ssa, reaktioseosta ajettiin 32 sykliä 94 ° C: ssa, 60 ° C: ssa, ja 72 ° C ° kukin 30 sekunnin ajan, minkä jälkeen tehdään pidennys 72 ° C ° C: ssa 8 min (kaikki kolme paria alukkeita).

tilastollinen analyysi

tässä esitetyt tiedot ovat edustajia ainakin kaksi samanlaista kokeet suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena. Erot ryhmien välillä analysoitiin

t

testi ja

P

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.