Krooninen sairaus

tiivistelmä

aktivointi Wnt signaloinnin takia kyvyttömyys hajota β-kateniinin löytyy 85% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. Noin puolet koolonsyöpien ilmaista konstitutiivisesti aktiivinen KRAS proteiinia. Merkittävä osa potilaista näyttää sekä poikkeavuuksia. Olemme aiemmin raportoitu, että samanaikaisesti alas-säätely sekä β-kateniinin ja KRAS oli tarpeen saada aikaan merkittäviä solukuoleman ja kasvaimen kasvun inhibition paksusuolisyövän soluja. Vaikka houkutteleva, joka on RNAi-pohjainen terapeuttinen lähestymistapa on vielä läheskään käytetty kliinisessä ympäristössä. Siksi pyrimme kerrata meidän aiempia havaintoja käyttämällä pienimolekyylisiä estäjiä β-kateniinin ja KRAS. Osoitamme tässä, että β-kateniinin estäjien PKF115-584 ja pyrviini pamoaatti lohko β-kateniinin riippuva transkriptionaalisen aktiivisuuden ja synergisesti KRAS estäjän

S-trans, trans

-farnesylthiosalicylic happoa (FTS, salirasib) paksusuolen syöpäsolut ohjaavat Wnt ja KRAS onkogeeniset signaaleja, mutta ei soluissa kuljettavat BRAF mutaatioita. Yhdistetty Näiden yhdisteiden käyttö oli ylivoimainen minkä tahansa lääkkeen yksin indusoimaan solujen kasvun pysähtymisen, solukuolemaa, MYC ja surviviiniperäistä alas-modulaatio, ja esto kiinnittymisestä riippumatonta kasvua. Expression analyysin valittu syöpä-asiaa geenien paljasti alas-säätely CD44 yhteisenä vastauksena yhdistetyn hoitoja. Nämä tiedot tarjoavat todiste periaate yhdistelmän terapeuttinen strategia kolorektaalisyövässä.

Citation: Mologni L, Brussolo S, CECCON M, Gambacorti-Passerini C (2012) synergiavaikutuksen Yhdistetty Wnt /KRAS esto kolorektaalisyövän syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (12): e51449. doi: 10,1371 /journal.pone.0051449

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 16 elokuu 2012; Hyväksytty: 31 lokakuu 2012; Julkaistu: 05 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Mologni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Italian Association for Cancer Research (AIRC), Cariplo Foundation, Italian terveysministeriön ja Lombardian aluehallituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset edistysaskeleet ymmärrystämme tuumoribiologiassa ovat osoittaneet, että vaikka heidän suuri heterogeenisyys, syöpäsolut usein jäävät riippuvaisia ​​rajalliset geneettisiä vaurioita niiden säilymistä. Onnistuminen kohdennettujen hoitomuotojen KML, GIST ja alaryhmissä NSCLC osoittaa selvästi, että vaikka kehittyneen taudin tarvitsee funktio sen perustajien onkogeenien kasvaa ja hengissä [1], [2]. Tämä ilmiö, jota kutsutaan ”onkogeenin riippuvuus”, tarjoaa perustan kohdennettujen syöpähoidon, joka olisi parasta vailla toivottuja sivuvaikutuksia normaaleihin soluihin [3].

peräsuolen syöpä (CRC) on ominaista hyvin -known geenivirheitä: suurin osa (70-95%) satunnaista kulutustarviketta mutaatioita että hyper-aktivoida Wnt reitissä lopulta johtaa epänormaali β-kateniinin riippuvaisen geeniekspression [4], [5], [6], [7]. Nämä muutokset tapahtuvat varhaisessa vaiheessa kasvainten kehittymiseen [8] ja edustavat todennäköisesti addicting vaurioille kasvain. Todellakin, alas-säätely β-kateniinin indusoi kasvun pysähtymisen ja eriyttäminen CRC soluissa [9]. Kuitenkin β-kateniinin kohdistaminen ei solujen tappamiseksi [9], [10], [11]. Tämä saattaa liittyä siihen, että CRC kuljettaa erilaisia ​​muita mutaatioita, jotka myös mielekästä hengissä. Esimerkiksi KRAS aktivoivat mutaatiot ovat läsnä noin 35-50% paksusuolen syövistä [4], [6], [12], [13], [14]. Jos täysi Ras-reitin jäsenten otetaan huomioon, mukaan lukien sääntelyviranomaisten, BRAF, NF1, RASSF1A ja ylävirran reseptorityrosiinikinaasit, sitten 60-80% tuumoreista osoittaa muuttamista polun [7], [15], [16 ]. Genomikartoituksen data paljasti, että noin 30-60% CRC näytteistä satama sekä Wnt ja Ras polku mutaatiot samanaikaisesti [6], [7], [16]. Viimeaikaiset siirtogeenisen hiiren mallia CRC korosti molempien Wnt ja KRAS signalointia paksusuolen tuumorigeneesiä [15], [17], [18]. Siksi kaksinkertainen kohdentaminen saattaisi olla tarpeen, jotta saavutetaan merkittäviä terapeuttisia vaikutuksia.

Meidän edellinen työ, osoitimme, että yhdistetty shRNA välittämää vaiennettu β-kateniinin ja KRAS CRC soluissa johti massiivista apoptoosin induktioon

in vitro

ja kasvaimen kasvun estoa

in vivo

, kun taas erikseen kumman tahansa kahden reitin osoitettua pieniä vaikutuksia [19]. Täällä yritämme kääntää havaintomme osaksi farmakologinen lähestymistapa. Kaksi etuyhteydetöntä yhdisteitä, joilla on erilaiset vaikutusmekanismit, PKF115-584 ja pyrviini pamoaatti, käytettiin estämään β-kateniinin-riippuvaisen transkription. PKF115-584 on tehokas ja spesifinen pienimolekyylinen inhibiittori β-kateniinin /TCF4 vuorovaikutus, ja se on validoitu estäjänä Wnt signaloinnin eri syövän malleissa [20], [21], [22], [23]. Pyrviini on matolääkettä huumeiden [24], joka on osoitettu indusoivan hajoamista β-kateniinin ja sen kofaktorin pygopus, aktivoimalla kaseiinikinaasi 1α [25].

S

–

trans

,

trans

-farnesylthiosalicylic happoa (FTS, salirasib) on kuvattu erityinen RAS estäjä [26]. FTS jäljittelee karboksipään

S

-farnesylcysteine ​​välittämisessä rekrytointia RAS-proteiinien solukalvoon. Tämän seurauksena FTS selektiivisesti häiritsee yhdistys kroonisesti aktiivinen RAS kalvoineen, mikä estää sen toiminta [27], [28], [29].

Havaitsimme, että yhdistelmä β-kateniinin estäjät PKF115 -584 ja pyrviini pamoaatti kanssa RAS estäjän FTS synergistisesti indusoi kasvun pysähtymisen ja apoptoosin CRC soluissa kätkeminen sekä Wnt ja KRAS poikkeava aktivointi. Nämä tiedot vastaavat periaatteen todiste yhdistetyn Wnt /RAS esto kolorektaalisyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, vasta-aineet ja inhibiittorit

SW837 olivat ystävällinen lahja Dr. Manuela Gariboldi (IFOM, Milano, Italia), joka alun perin on saatu niitä ATCC. IFOM Cell Biology Unit vahvistaneet henkilöllisyytensä Mikrosatelliittimarkkerien genotyypitys. Kaikki muut solulinjat hankittiin American Type Culture Collection, jossa ne rutiininomaisesti varmennetaan genotyypin ja fenotyypin testauksen vahvistaa henkilöllisyytensä. LS174T ja HCT-116 solut kantavat mutaatioita CTNNB1 geeni vakauttaa β-kateniinin proteiini [30]. DLD-1, SW480, LoVo ja SW837-solut ovat katkaistun APC-geenin [31], [32]. Nämä kuusi solulinjat ilmentävät konstitutiivisesti aktivoitua KRAS-proteiini [33], [34], [35]. HT-29 ja Colo-201 solulinjaa on villin tyypin KRAS mutta satama mutantti BRAF

V600E alleeli [33], [36]. Full merkintä näistä mutaatioista on esitetty taulukossa S1. LS174T pysyvästi transfektoitujen solujen doksisykliini-indusoituvan shRNA konstruktit aiemmin on kuvattu [19]. Kaikki soluja pidettiin RPMI 1640-alustassa (paitsi DLD-1, jotka oli kasvatettu DMEM ja LoVo Hamin F12 ravinteiden), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 2 mmol /l L -glutamine, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. LS174T solujen indusoitavissa β-kateniinin ja KRAS shRNA kuvattiin aiemmin [19]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa: anti-KRAS (Abnova, klooni 4F3, laimennettu 1:1000), anti-pygopus (Santa Cruz Biotechnology, H-216, 1:200), anti-myc (Santa Cruz Biotechnology, 9E10 , 1:200), anti-aktiini (Sigma-Aldrich, 1:2000), anti-surviviini (Santa Cruz Biotechnology, D-8, 1:200), anti-β-kateniinin (Millipore, 2H4A7, 1:1000) . PKF115-584 oli ystävällisesti Novartis, Inc. (Basel, Sveitsi).

S

–

trans

,

trans

-farnesylthiosalicylic happo (FTS) syntetisoitiin, kuten on kuvattu [26]. Pyrviini pamoaatti ostettiin Sigma-Aldrich. Kaikki inhibiittorit liuotettiin DMSO: hon ja säilytetään pienissä erissä -20 ° C: ssa.

Solun kasvua ja solun kuolemaan määritykset

Solun kasvun ja kannattavuuden arvioitiin osoitetussa kertaa käyttäen CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay System (Promega Corporation) seuraavat ohjeet, kuten aiemmin on raportoitu [37]. Arvioida apoptoosin induktio, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille yön yli ja sitten sitä käsiteltiin n estäjien tai ajoneuvon. 72 tunnin kuluttua solut irrotettiin trypsiinillä, pestiin, ja apoptoosi määritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bender MedSystems), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kuvaajat ja IC

50-arvot on luotu käyttäen GraphPad-ohjelmisto.

Dual lusiferaasianalyysissä

soluja 6-kuoppalevyllä käsiteltiin estäjien tai ajoneuvon ja transfektoitiin 2 ug: TOPflash tai FOPflash plasmidit ja 0,1 ug phRL-CMV (koodaus

Renilla lusiferaasia

, käytettiin sisäisenä kontrollina transfektion tehokkuus) käyttämällä 3 ui FuGENE

TM 6 reagenssia. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen, pestiin ja hajotettiin. Luciferase signaaleja havaittiin käyttäen Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Tulikärpäsen lusiferaasi intensiteetti normalisoitui yli Renilla lusiferaasisignaaliin.

Aktiivinen KRAS avattavasta määritys

Soluja käsiteltiin FTS tai DMSO: ssa 15 tunnin ajan ja sitten hajotettiin Magnesium Lysis Buffer (MLB: 25 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 10% glyserolia), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (10 umol /l bentsamidiini-HCl: ää ja 10 ug /ml kutakin aprotiniinin, leupeptiiniä ja pepstatiini A). Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla maksiminopeudella ja kvantifioidaan Bradfordin menetelmällä. Sama määrä yhteensä proteiinit (1 mg), inkuboitiin sitten 10 ug Raf-1 RBD-agaroosihelmillä (Millipore) 45 minuuttia 4 ° C: pyörivän kiekon päällä. 3 pesun jälkeen kanssa MLB, helmet suspendoitiin uudelleen 2 x Laemmli-näytepuskuriin, keitettiin ja ladattiin SDS-PAGE. Aktiivinen, veti alas KRAS paljastui anti-KRAS vasta-aine. Yhteensä KRAS (input) arvioitiin päässä raakalysaatista.

Synergia analyysi

Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai inhibiittorit, yksittäinen tai yhdistetty eri pitoisuuksina ja eri suhteissa. 3 päivän kuluttua solut jaettiin suhteessa 1:10 ja siirrostettiin uudelleen estoaineiden läsnäollessa. Päivänä 6, soluviljelmän kasvun /elinkelpoisuus seurattiin MTS-määrityksellä. Suhteellinen kasvu, verrattuna vehikkelillä hoidettuihin kontrolleihin, käytettiin laskettaessa osa vaikuttaa ja yhdistelmä indeksin kunkin kokeellisen yhdistelmän käyttäen CalcuSyn ohjelmistoa.

Western blotting

Solut kerättiin, pestiin jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, kuten on kuvattu [19]. Kokosolu-uutteet ladattiin SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja koetettiin ilmoitettu primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Proteiinit paljastui kemiluminesenssimittauksella inkuboinnin jälkeen HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (GE Healthcare, laimennettu 1:2500).

Soft-agar -pesäkemääritys

Kymmenen tuhannen solut upotettiin RPMI, joka sisälsi osoitetut yhdisteitä ja 0,3% matalassa lämpötilassa sulavaa agaroosia tyypin VII (Sigma-Aldrich) ja ympättiin päälle 0,5% agaroosi /RPMI tukikerros 6-kuoppaisille levyille. Tuore inhibiittorit lisättiin joka 7. päivä alkuun agarkerroksen. Pesäkkeet laskettiin 20 päivän jälkeen.

Quantitative real-time PCR

Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai estäjiä 24 tai 72 tuntia ja kerättiin. Kokonais-RNA uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen) ja retro- transskriboidun satunnaisia ​​heksameerejä käyttäen tavanomaista menettelyä. Sillä 96-array geeniperimä, eteen ja taakse nalliseoksesta (5 pmol kutakin) nähtiin vastaavassa hyvin kohde-geeniä, ja maljoja pidettiin jäädytettyinä -80 ° C: ssa, kunnes niitä tarvitaan. Reaktioseoksen (2 ui cDNA, 10 ui Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix ja 7 ui vettä, kuoppaa kohti) lisättiin valmiista levyille ja kvantitatiivinen PCR ajettiin Stratagene MX3000P tunnistusjärjestelmä, alle seuraavat ehdot: 95 ° C, 3 min (1 sykli); 95 ° C, 10 sek, 60 ° C, 20 sekuntia (40 sykliä). Vahvistuksen ajo suoritettiin kolmena kappaleena käyttämällä tavallista reaaliaikaista PCR valmistajan suosittelemia. GAPDH taloudenhoito geeni aina käytettiin sisäisenä viitteenä. Alukkeet GAPDH olivat TGCACCACCAACTGCTTAGC (eteenpäin) ja GGCATGGACTGTGGTCATGAG (reverse). Alukkeet kaikki muut geenit on lueteltu taulukossa S2.

Tulokset

PKF115-584 (kuvio 1A) ja pyrviini pamoaatti (kuvio 1 B) on osoitettu häiritsevän β-kateniinin -associated transkription monimutkainen erilaisten mekanismien kautta. Sen tarkistamiseksi aktiivisuuden kaksi huumeiden CRC soluissa, me tunnusomaista niiden vaikutuksia LS174T solulinjassa kantaen β-kateniinin ja KRAS aktivoivia mutaatioita [30], [33]. Tämä solulinja perin valittiin malli, koska se oli aikaisemmin käytetty kuvaamaan vaikutuksia siRNA-välitteisen geenien [19]. Kuten on raportoitu kuviossa 1D-E, molemmat lääkkeet estivät solujen kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla. Vastaavia kasvun inhibitio saatiin DLD-1-solut, jotka ilmentävät katkaistua APC-alleelin (kuva S1A-B). Samanaikaisesti kaksi yhdisteet estivät transkription β-kateniinin /TCF4 reagoiva reportteriplasmidilla TOPflash (kuvio 1G-H). IC

50-arvot havaittiin solujen lisääntymisen ja TOPflash käyrät ovat yksimielisiä, mikä viittaa siihen, että kasvun pysähtymisen välittyy β-kateniinin esto. Kuten odotettua, pyrviini aiheuttama menetys pygopus ilmaisun (kuvio 1K). Sama tulos saatiin DLD-1-soluissa (kuvio S1E). Lisäksi, pyrviini on raportoitu pakottaa β-kateniinin hajoamiseen [25]. Yllättäen, β-kateniinin ilmentyminen oli ennallaan pyrviini saaneilla DLD-1-soluissa (kuvio S1E), kun se laski hieman LS174T-soluja (kuvio 1K). Sekvenssianalyysin β-kateniinin geenin vahvisti läsnäolo S45F substituutio LS174T-soluissa ja villin tyypin sekvenssin DLD-1-solujen sisällä N-pään fosfory- alue (kuva S2). Molemmat lääkkeet estetty endogeenisen ilmentymisen MYC, tunnettu β-kateniinin transkription kohde- ja vahvan promoottorin solukasvun (kuvio 1J-K ja kuva S1D-E). Vahvista estämällä Wnt koulutusjakson, ilmaus kaksi ylimääräistä tunnettu kohdegeenien analysoitiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä. Sekä AXIN2 ja CCND1 (koodaus sykliini D1) geenit alassäädetty käsittelemällä PKF115-584 ja pyrviini (kuvio 1 M-N).

(A-C) Kemialliset rakenteet PKF115-584, pyrviini ja FTS, kuten aiemmin on kuvattu (katso viite. 20-29) (D-F) annos-vaste-vaikutukset PKF115-584, pyrviini ja FTS on LS174T-solujen kasvuun. Soluja altistettiin lisäämään annosta kutakin inhibiittoria 72 tuntia. MTS-määritystä käytettiin arvioimaan yhdisteiden vaikutus soluproliferaatioon. IC

50-arvot on esitetty kunkin yhdisteen. (G-H) Lusiferaasiaktiivisuutta päässä TOPflash plasmidi määritettiin inkuboinnin jälkeen 24 tuntia PKF115-584 tai pyrviini. Arvot ovat Relative Light Units (RLU) kanssa DMSO-käsiteltyjä soluja asetettu 1,00. (I) Western blot-analyysi aktiivisen GTP-ladattu KRAS avattavan (ylempi paneeli) ja yhteensä KRAS (alhaalla) peräisin LS174T käsiteltyjä soluja FTS. (J-L) Western blot-analyysi osoittaa c-myc ekspressiota LS174T-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla kutakin yhdistettä 48 tunnin ajan. Alkaen pyrviini-käsiteltyjä soluja, pygopus ja β-kateniinin ilmentymistä on myös esitetty (K). Actin esitetään aina latauskontrollina. (M-N) Kvantitatiivinen PCR-analyysi AXIN2 ja CCND1 /sykliini D1 ilmentymisen käsittelyn jälkeen kasvavina annoksina (0,125-1,0 uM) PKF115-584 (M) ja pyrviini (N). (O) Western blot-analyysi MEK fosforylaation FTS-käsitellyissä soluissa. Yhteensä MEK ja aktiini esitetään valvontaa. (P-Q) Annos-vaste-käyrät PKF115-584 ja pyrviini puuttuessa (tyhjät ympyrät) tai läsnä ollessa (umpinaiset ympyrät) 100 uM FTS. Jokainen yksittäinen käyrä on normalisoitu vastaava näyte ilman β-kateniinin estäjä.

RAS estäjä FTS (kuvio 1 C) esti solun kasvua korkeissa mikromolaarisella pitoisuuksina (kuvio 1 F ja selvittää S1C), linjassa aiempien raporttien kanssa [38], [39], [40]. FTS köyhdytettyä GTP-ladattu (aktiivinen) KRAS-allas, jättäen yhteensä KRAS määrän ennallaan (kuvio 1 i). Tämä anti-KRAS aktiivisuus käännetty merkittävä lasku MYC-proteiinin tasoja (kuvio 1) ja MEK-fosforylaation (kuvio 1O), mutta ei FOS ilmaisun (tietoja ei esitetty) LS174T-soluja. Kuitenkin FTS hoito johtanut erilaisiin molekyyli- vasteita DLD-1-soluissa: fosfo-MEK signaali oli muuttunut ja MYC oli vain vähän vaikutusta, kun taas FOS ilmaisu vähentynyt merkittävästi (kuvio S1F). Sen arvioimiseksi, onko antiproliferatiivista aktiivisuutta β-kateniinin estäjät voivat voimistua FTS, annos-vaste käyrät muodostettiin valottamalla LS174T solut kasvavat annokset PKF115-584 (kuvio 1P) ja pyrviini pamoaatti (kuvio 1Q) puuttuessa tai läsnä oli 100 uM FTS. Molemmissa tapauksissa, lisäämällä FTS siirtynyt käyrän merkittävästi. Erityisesti herkkyys pyrviini kasvoi noin 10-kertainen (IC

50 pyrviini, 0,1 uM; IC

50 pyrviini + FTS, 0,01 uM). Nämä tulokset yhteensä osoittavat, että anti-proliferatiivisia vaikutuksia kahdessa β-kateniinin inhibiittorit ja RAS-estäjän FTS korreloivat spesifinen esto β-kateniinin ja KRAS toimintaa, vastaavasti LS174T-soluja. Lisäksi FTS lisää sytotoksisuus β-kateniinin estäjät näissä soluissa.

Jotta voidaan paremmin määritellä yhteistyötä β-kateniinin ja KRAS eston CRC soluissa, aktiivisuus PKF115-584 ja pyrviini, yksin ja erilaisina yhdistelminä FTS, testattiin MTS määrityksellä paneelissa CRC solulinjojen kuljettaa eri onkogeeniset mutaatiot (taulukko S1). Saadut tulokset kiinteään pitoisuudet on esitetty kuviossa 2 pylväskuvaajia (PKF115-584: 125 tai 250 nM; pyrviini: 50 nM; FTS: 100 uM). Mielenkiintoista on, että samalla kun herkkyys yksittäisinä aineina erosivat joukossa erilaisia ​​solulinjoja, kaikki KRAS-mutatoituja soluja yhdistetyn hoitojen aiheuttamat merkittävästi korkeampi kasvun estämistä verrattuna yhden hoitoja. Synergia Sitten tutkittiin laajemmin yli eri estäjien pitoisuuksia käyttäen menetelmää ovat kuvanneet Chou ja Talalay, perustuen massaan-action oikeuden periaatteesta [41]. Combination Index arvot (CI) laskettiin kokeelliset tiedot pitkin koko joukon murto vaikutuksista ja esitetään XY tontteja kuvassa 2. Erityiset CI arvoilla ED50, ED75 ja ED90 on esitetty taulukossa 1. Kuten ennustaa onkogeenin mutaatiostatus, kaikki solulinjat mutaatioita kummassakin Wnt reittiin (APC tai β-kateniinin) ja KRAS osoittivat synergististä vuorovaikutusta (CI 1) paitsi äärimmäisen kiinnostavia vahingoittuneiden fraktio, jossa vaikutukset ovat joko vähäisiä tai liian voimakas. Sen sijaan, HT-29-soluja (kuljettavat villityypin KRAS ja mutatoitunut BRAF

V600E alleeli) eivät osoittaneet synergiaa. Pikemminkin antagonistisia vaikutuksia (CI 1) havaittiin. Kuitenkin yhdistelmä PKF115-584 kanssa BRAF estäjän (PLX-4032) osoitti heikkoa synergistisyyttä HT-29-solut suurilla annoksilla (kuva S3). Muihin saadut tiedot pyrviini /FTS kaksi KRAS- ja yksi BRAF-mutatoitua solulinjoja on esitetty kuviossa S4. Kaiken kaikkiaan analyysi CI arvojen ED50 (pyrviini /FTS) osoittaa korrelaatio KRAS /BRAF mutaatiostatuksesta riippumatta ja yhteisvaikutukset vuorovaikutuksen (p = 0,0021): kaikki KRAS mutanttisoluja osoitti synergiaa, kun taas kumpikaan kahdesta BRAF mutantti solulinjoista teki (kuva S5) vaikka rajoitettu määrä BRAF mutantti testatuista solulinjoista ei salli tehdä lopullisia päätelmiä. Sen sijaan, vaikutukset eivät korreloineet p53 tai MSI tila (taulukko 1). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että PKF115-584 ja pyrviini voidaan yhdistää FTS CRC -solut samanaikainen Wnt /KRAS geneettisiä poikkeavuuksia, saavuttaa parempia terapeuttisia vaikutuksia.

ilmoitettu solulinjoja viljeltiin 6 päivää vuonna inhibiittoreiden läsnäolo yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä, tai pelkästään vehikkeliä. MTS määritystä käytettiin vaikutusten arvioimiseksi kunkin hoidon soluviljelmissä kasvun ja kannattavuuden. (A) PKF115-584 /FTS ja (B) pyrviini /FTS yhdistelmä. Kutakin solulinjaa, palkkigrafiikka (vasemmalla) esittää vaikutuksen yhdellä annoksella (PKF115-584, 0,25 uM [LS174T ja DLD-1] tai 0,125 uM [SW480 ja HCT-116]; pyrviini, 50 nM; FTS, 100 uM). XY kaavio (oikealla) näyttää yhdistelmä indeksit funktiona osa vaikuttaa (katso materiaalit ja menetelmät). Kutakin solulinjaa, geenit, jotka mutatoituvat, vaikuttavat Wnt ja Ras reitit ovat suluissa. CTRL = kontrolli; Pyrv = pyrviini. Kaikkiaan paneelit, numero symboleja (#) osoittavat merkitys verrattuna β-kateniinin estäjä (PKF115-584 tai pyrviini); tähdellä (*) osoittaa merkitys versus FTS; yksi symboli, p 0,05; kaksi merkkiä, p 0,01; kolme symbolia p 0,001.

sitten edelleen tunnettu synergistisen yhdistelmiä käyttää muita riippumattomia määrityksiä (kuva 3 ja kuva S6). Solujen kasvua seurattiin aikana useita päiviä sen jälkeen, kun altistaa LS174T ja DLD-1-solujen kolmen lääkeaineen, yksin tai yhdistelmänä, joka osoittaa, että FTS voimistua PKF115-584 ja pyrviini myrkyllisyyttä jo jälkeen 3-4 päivää (kuvio 3A ja kuvio S6A). Kasvun estäminen oli mukana apoptoosin induktio: useita varhaisen apoptoottisten solujen oli huomattavasti korkeampi yhdistelmä näytteissä verrattuna kummallakaan lääkkeellä yksin (kuvio 3B ja kuvio S6b). Vertailun vuoksi apoptoosin LS174T soluissa arvioitiin rinnakkain induktion jälkeen anti-β-kateniinin ja anti-KRAS shRNAs, saavuttaen samantasoinen varhaisen apoptoosin kaksinkertaisen vaiennettu näyte (kuvio 3B). Hiljentäminen Kohdeproteiinien kuvassa S7. Seuraavaksi, kuten kaikki kolme yhdisteet pystyvät estämään MYC ilmentymisen LS174T-soluja (kuvio 1J-L), me määrittää, onko yhdistäminen optimaalinen pitoisuudet lääkitys saattaa aiheuttaa paremman tukos MYC transkription. Edellinen raportit ovat osoittaneet, että sekä KRAS ja β-kateniinin kykenevät säätelemään MYC ilmentymisen paksusuolen syöpäsoluissa [19], [42], [43]. Todellakin, yhdistelmähoitoja 24 tuntia osoitti merkittävää parannusta MYC ilmaisun eston verrattuna yhden hoitoihin (kuvio 3C). Tämä tulos viittaa siihen, että MYC on yhteinen efektori kahden reitin ja sen säätely alaspäin korreloi solujen kasvun ja elinkelpoisuuden inhibition näissä soluissa. Sen sijaan havaitsimme ei vaikutusta yhdistelmien MYC tasoilla DLD-1-soluissa (kuvio S6c) mukaisesti puute MYC alassäätöä FTS näissä soluissa. Lisäksi yhdistetty esto aiheutti voimakasta alas-modulaatio surviviinispesifisten ilmaisun, kun taas vähän tai ei lainkaan muutoksia saatiin yksittäinen hoidot (kuva 3D ja kuva S6D). Surviviini on transkriptionaalinen tavoite sekä Wnt ja KRAS reittejä [19], [44], [45] ja on keskeinen rooli selviytymisen KRAS-ajettu syöpä [46]. Lopuksi tutkia pitkän aikavälin vaikutukset β-kateniinin ja KRAS yhdistettynä esto ankkurista riippumaton kasvu arvioitiin kerta lisäyksen subletaalisia annokset PKF115-584 tai pyrviini, ja FTS. Kuten kuviossa 3E-F ja kuvassa S6E-F, yhdistelmä kunkin β-kateniinin estäjän kanssa FTS oli syvällinen vaikutus pehmeässä agarissa kasvua LS174T ja DLD-1-soluissa.

(A) Cells hoidettiin 100 uM FTS, 0,25 uM PKF115-584 tai 50 nM pyrviini, yksinään tai yhdistelminä, tai vehikkeli, 6 päivää. Soluviljely elinkelpoisuus arvioitiin päivinä 3, 4 ja 6 MTS. Suhteellinen OD verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään solujen kirjattiin eloonjääntifraktio. (B) LS174T-soluja viljeltiin 3 päivää, kun läsnä on ilmoitettua yhdisteiden (samoina pitoisuuksina kuin [A]); rinnakkain, LS174T, jotka kantavat indusoituvia siRNA: t (sint, ei-kohdentamiseen; siBC, anti-β-kateniinin, siKR, anti-KRAS) käsiteltiin doksisykliiniä samaan aikaan. Apoptoosi määritettiin anneksiini V /propidiumjodidi kaksinkertainen värjäys. Prosenttiosuus alussa apoptoottisten solujen (anneksiini V-positiivisia /propidiumjodidia-negatiivinen) on raportoitu kaaviossa. (C) LS174T-soluja käsiteltiin PKF115-584 (0,5 uM), pyrviini (50 nM) ja FTS (100 uM), yksin tai yhdistelmänä, 24 tuntia ja c-myc ekspressiota arvioitiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttämällä GAPDH referenssinä geeni. Expression normalisoitui ajoneuvon hoidettuun kontrolliryhmään soluissa. (D) Soluja inkuboitiin 72 tuntia estäjien ja solulysaateista tutkittiin anti-surviviiniperäisten ja β-aktiini-vasta-aineita. (E-F) Kymmenen tuhatta LS174T-soluja kasvatettiin pehmeässä agarissa läsnä ollessa PKF115-584 (0,1 uM), pyrviini (25 nM), FTS (50 uM), yksin tai yhdessä. Suuret pesäkkeet laskettiin 20 päivää myöhemmin. Pesäkkeiden lukumäärä muodostuu käsittelemättömän verrokin solut on asetettu 100% (E). Edustavia kuvia on esitetty paneelissa (F). Tilastollinen analyysi: ks legenda kuvioon 2.

Jotta saataisiin tarkempi käsitys transkription muutokset aiheuttama yhdistetyn hoitoja, ilmaus valittuja liittyvien geenien Wnt ja KRAS signalointi, paksusuoli syöpä ja apoptoosin, tutkittiin käyttäen kotitekoisia kvantitatiivinen PCR array. Heatmap kuviossa 4A on esitetty suhteelliset muutokset ilmentymisen 72 tunnin jälkeen hoidon tai yhdistettyjä lääkkeitä, verrattuna vehikkelillä käsiteltyyn kontrolliryhmään soluissa. Kuten odotettua, yksittäisillä aineilla eniten vasemmalla geenit ennallaan, kun taas yhdistelmät aiheuttama yleinen tukahduttamisesta valitun geenin asetettu. Erityisesti CD44, COX2, CTBP2, Sykliinit D1 ja D2, ITF2, p70S6K2 ja RASSF7 olivat vahvasti alaspäin säätelevät sekä yhdistelmiä, verrattuna yhden hoitoja. Lisäksi pyrviini /FTS yhdistelmä aiheutti alas-modulaatio muita geenejä, kuten BCL2, BCL2L1 (koodaa Bcl-X

L anti-apoptoottisen tekijän), BCL9L, KRAS, CDKN1A (p21

WAF1) ja PRKCA. Jotta kiinni varhain transkription tapahtuvat muutokset ennen mitään merkkejä solustressiä, 24 tunnin pulssi ajettiin kanssa pyrviini /FTS yhdistelmä. Tämä yhdistelmä on edullisempi kuin yksi PKF115-584 tähän analyysiin, sillä pyrviini osoitti suurempaa geenin alassäätöä. Tiedot raportoidaan oikeanpuoleisen sarakkeen lämpökartta. Huolimatta joistakin eroista pidemmän lääkeainealtistukseen monet muutokset säilytetty, kuten alas-säätely CD44, COX2, BCL2 ja Sykliinit D. Lisäksi säätely ylöspäin pro-apoptoottinen proteiini APAF1 todettiin. Mielenkiintoista, p21

WAF1 oli ohimenevästi säädelty 24 tuntia ennen kuin alassäädetty 72 tuntia. Edelleen vahvistaa nämä tiedot, muutaman geenit analysoitiin itsenäisesti standardin real-time PCR neljän solulinjoissa. Kuvio 4B esittää tuloksia LS174T soluista vahvistaen geenisäätelyssä havaittiin alkuperäisessä keräämiseen. Tiedot kaikista neljästä solulinjoissa analysoitiin edelleen tunnistaa synergistinen geeniekspression modulointia, joka määritellään 2-kertainen muutos ilmentymisen yhdistelmä verrattuna yhden hoitoja (kuvio 4C). Mielenkiintoista, BCL2 ilme oli synergistisesti alassäädetty kaikissa neljässä solulinjoissa pyrviini /FTS yhdistelmä (täytetty harmaat laatikot). Sykliini D1 ja CD44 sai synergistinen kolmessa neljästä solulinjoissa. CD44 myös säädellä vähentävästi DLD-1-soluissa, mutta laajuus modulaatio ei saavuttanut kynnystä synergistinen vaikutus (kuvio S8). PKF115-584 /FTS yhdistelmä osoittautui vähemmän tehokas tässä analyysissä, jossa vain CD44 osoittaa synergististä alassäätöä ainakin kahdessa solulinjoista (LS174T ja SW480). Nämä tulokset osoittavat CD44 yhteisenä vastauksena kaksinkertainen β-kateniinin /KRAS kohdistamista.

LS174T soluja käsiteltiin 24 tai 72 tuntia estäjien ja paneelin geenien keskittyi Wnt, Ras ja apoptoosin reittejä tutkittiin by QPCR käyttämällä 96-kuoppaista array (A) tai standardin reaaliaikainen PCR (B). Käyriä (B) esittävät ilmaisu kertainen muutos verrattuna vehikkelillä hoidettuihin kontrolleihin. (C) Yhteenveto raportointi reaaliaikainen PCR data-analyysi kaikista solulinjoista. Täytetyt laatikot osoittavat synergististä vaikutusta geenien ilmentymisen ( 2-kertainen muutos versus jokainen hoito). PY = pyrviini.

Kun osoittautunut tehoa double Wnt /KRAS esto

in vitro

, yritimme kääntää nämä havainnot osaksi uusia terapeuttisia strategia

in vivo

. Kuitenkin PKF115-584 ei enää valmisteta Novartis ja sen synteesi laajamittaisesti osoittautunut erittäin haastavaa ja aikaa vievää. Kuten pyrviini pamoaatti, on raportoitu imeytyvän huonosti [47]. Kuitenkin suun kautta pyrviini kuvattiin kahdella ryhmällä [48], [49]. Siksi on kokeilu ajettiin tarkistaa, onko lääke voisi saavuttaa tavoitteen nude-hiirissä, katsomalla pygopus ilmentymisen LS174T ksenografteissa kolmen päivässä suun kautta hallinnon 10 mg /kg pyrviini. Tulokset olivat negatiivisia (kuvio S9), siksi emme yritä edelleen

in vivo

analyyseissä.

Keskustelu

Lähes kaikki kolorektaalisyövissä osoittavat muuttaminen Wnt polku, joka ohjaa p-kateniinin aktivointi. Siksi esto β-kateniinin voi johtaa merkittävää edistystä hallintaan tämän taudin. Kuitenkin viime aikoina tietojen mukaan enemmän kuin yksi ”ajuri” kasvaimia synnyttävän polku on usein aktivoidaan yhdessä kasvaimeen [50], [51]. Siksi useat onkogeeni kohdistaminen on todennäköisesti tarvitaan taudin hävittämiseksi. Vuonna merkittävä osa Kolorektaalituumorien, Wnt ja KRAS koulutusjakson muutokset rinnakkain [6], [13], [14]. Huolimatta siitä, että se on tunnettu lähes 30 vuotta, KRAS onkogeeni on ollut vaikeasti kohde toistaiseksi. Aineet, jotka estävät KRAS translaation jälkeiset modifikaatiot ovat olleet tehottomia kliinisissä kokeissa [52]. Strategiat kohdistaa alavirtaan efektoreita KRAS [53], [54], [55] tai perustaa synteettisten tappava vuorovaikutusta [56], [57], [58] ovat osoittaneet erilaisia ​​vastauksia tapauskohtaisesti, mahdollisesti johtuen monimutkaisuudesta KRAS polku. Tätä korostetaan myös, että eri molekyyli- tulos KRAS eston havaittiin kaksi CRC solulinjoissa tutkimuksessamme. Kun erilaisen lähestymistavan, FTS nimenomaan häiritsee KRAS telakka solukalvoon, matkimalla sen farnesylcysteine ​​osaan [29].

Tässä työssä vaikutukset yhdistetyn β-kateniinin ja KRAS inhibition pienet molekyylit tutkittiin . Synergismi näkyi paneelissa CRC solulinjojen kuljettavat erityyppisiä vaikuttavia mutaatioita kohde reittejä, käyttämällä useita riippumattomia määrityksiä. Yhdistämällä optimaalinen annokset β-kateniinin ja KRAS estäjät havaitsimme merkittävää kasvun hidastumisen ja apoptoosin, jotka heijastuu voimakas säätely alaspäin surviviinispesifisten ilmaisua. Surviviinispesifisiä estää aktivaatio efek- caspases ja on säädelty monissa syövissä. Lyömällä kaksi polkuja, jotka ohjaavat sen ilmentymistä CRC soluissa, saimme täydellinen poistaminen sen anti-apoptoottista aktiivisuutta ja siten apoptoosin induktion.