Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

nestiinifenotyypin liittyy neoplastisen transformaation, mutta mekanismit jolla nestiinifenotyypin myötävaikuttaa invaasion ja pahanlaatuisuuden keuhkosyöpään ei vielä tunneta. Ottaen huomioon, että nopea lisääntyminen on välttämätöntä pahanlaatuinen käyttäytymistä, tutkimme mekanismi nestiinifenotyypin toimia yhdessä proliferatiivinen ominaisuuksia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Methods

nestiinifenotyypin ilmentymistä tutkittiin NSCLC yksilöt ja solulinjoissa. Yhdistysten kliinis ominaisuuksia, kuten ennustetta ja proliferatiivinen markkereita, arvioitiin. Vaikutukset nestiinifenotyypin Knockdown proliferaatioon ja signalointireitteihin mukana tutkittiin tarkemmin.

Tulokset

nestiinifenotyypin ilmaistiin useimmissa syöpä yksilöitä ja kaikki kasvainsolulinjat analysoitu. Korkea nestiinifenotyypin ilmentyminen pahanlaatuinen kudos liittyy korkea Ki-67 tai PCNA tasoa ja huono hoitotuloksia. Kääntäen, knockdovvn nestiinifenotyypin ilmaisun johtanut merkittäviin eston kasvainsoluproliferaation laski pesäkkeenmuodostuskyvyn, ja solusyklin G1 pidätykseen. Lisäksi nestiinifenotyypin knockdown johti estoon Akt ja GSK3p aktivointi.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että nestiinifenotyypin ilmentyminen NSCLC soluissa liittyy huonoon ennusteeseen potilaiden ja kasvainsolujen proliferaatioreitillä. Downregulation nestiinifenotyypin estää tehokkaasti keuhkosyövän solujen lisääntymistä, mikä saattaa olla kautta vaikuttavia solusyklin pysähtymiseen ja Akt-GSK3p-Rb signalointireitistä.

Citation: Chen Z, Wang J, Cai L, Zhong B, Luo H, Hao Y, et ai. (2014) rooli Stem Cell-Associated Intermediate Filament nestiinifenotyypin pahanlaatuisessa leviämisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (2): e85584. doi: 10,1371 /journal.pone.0085584

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 29, 2013; Hyväksytty: 29 marraskuu 2013; Julkaistu: 03 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Basic Research Program of China (nro 2009CB522100 ja 2010CB945400), National Natural Science Foundation of China (nro 30971675, 30900729, ja 31171398), ja Key tieteen ja teknologian hankkeita Guangdong (nro . 2007A032100003). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on nyt johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jonka osuus 80% kaikista keuhkosyöpää, etäispesäkkeitä kehittyä jopa 70%: lla varhaisen vaiheen tauti [1], [2]. Huolimatta uusien kemoterapeuttisten aineiden ja parantaa kirurgisia menetelmiä, NSCLC edelleen huomattava terapeuttinen haaste. Eloonjäämisaste on tällä hetkellä huono, jossa vain 15% elossaololuku 5 vuotta diagnoosin [3]. Pahanlaatuinen ominaisuudet NSCLC liittyy useita tärkeitä tapahtumia, kuten solujen lisääntymisen ja hyökkäys primaarituumorin, jatkuva angiogeneesi, kiertämisen ja apoptoosin. Leviämisen ensisijainen kasvain on olennainen osa molekyyli- ja solutason synnyssä, kehitys, ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpään [4].

nestiinifenotyypin, jäsen väli hehkulampun (IF) perhe, on tunnistettu potentiaaliseksi proliferatiivisia ja multipotenttisuus ilmaisin useilla kantasolujen [5] – [10]. Viimeaikaiset selvitykset tukevat välisen yhteyden nestiinifenotyypin ja pahanlaatuisten ominaisuudet [11] – [19], ja viittaavat siihen, että runsas nestiinifenotyypin ilmentyminen korreloi suuremman pahanlaatuisen ja huonompi ennuste eri syöpiä [11], [18] – [21]. Kuitenkin tietty toiminto nestiinifenotyypin vuonna invasiivisen ja metastaattisen käyttäytymisen keuhkosyöpään solujen jää epäselväksi. Havainnot että nestiinifenotyypin Knockdown vähentää viljellyt neuroblastoomasoluviljelmissä ja astrosytooma solujen kasvua, kun taas sen yliekspressio on cytoprotective vaikutus vastaan ​​H

2O

2 vamma viittaavat rooli edistämisessä solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [22] – [24]. Sen sijaan toinen tutkimus osoitti, että nestiinifenotyypin downregulation ei muuta

in vitro

tai

in vivo

kasvuominaisuudet kahden erillisen haimasyövän solulinjoissa [25]. Siten nestiinifenotyypin ei saa pelkästään toimia rakenteellisena proteiinia, mutta voivat osallistua aktiivisesti valvonnassa tärkeisiin solun prosesseja. Kuitenkin tarkka mekanismit nestiinifenotyypin toiminnan leviämisen vaativat vielä selvennystä.

edellinen tutkimus vahvisti nestiinifenotyypin ilmentymistä NSCLC kudosnäytteistä, jotka näyttivät korreloivan vastasyntyneen imusuonten kanavassa aiheuttama tuumorisolujen [21]. Toisaalta, Ryuge S oli kuvattu nestiinifenotyypin ilme on prognostinen indikaattori huonompi eloonjäämistä potilailla, joilla resektoitiin NSCLC [26]. Kuitenkin suhde nestiinifenotyypin ilmaisun ja proliferatiivista käyttäytymistä NSCLC-solujen ei ole suoraan tutkittu tähän mennessä. Koska rajallisten tietojen patofysiologisia roolista nestiinifenotyypin in NSCLC soluissa [21], [26], emme ole vain vahvisti, että ilmaus nestiinifenotyypin NSCLC näytteistä näytti korreloivan kliinisen toimenpiteiden kasvaimen pahanlaatuisuuden, mutta myös tutkinut yhdistyksen of nestiinifenotyypin ilmaisun on proliferatiivinen ominaisuuksiin keuhkosyöpään solujen ja sen toiminnallinen rooli kasvainsoluproliferaation nykyisessä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteiden

yhteensä 71 NSCLC näytteitä ja kasvaimen viereisten kudosten (kauimpana reuna resektio kasvain) valittiin satunnaisesti meidän kudoksesta tietokannasta. Näytteet saatiin potilailta käsitellään osasto Torakaaliikirurgia ensimmäiseltä Affiliated sairaala Sun Yat-sen University touko 2003-heinäkuu 2004 Kukaan potilaista ei ollut saanut neoadjuvanttikemoterapian tai sädehoitoa. Kliiniset tiedot saatiin tarkastelemalla leikkausta edeltävän ja leikkauksiin potilastiedot tai puhelimitse tai kirjeenvaihdon. Tapauksia lavastettu perustuu kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) luokittelu International Union Against Cancer, tarkistettu vuonna 2002 [27], [28]. Ihmisillä materiaalien hyväksyi Medical eettinen komitea The First Affiliated sairaala, Sun Yat-sen University (koko nimi hallitus /valiokunta: lääketieteellisen eettisen komitean The First Affiliated sairaala, Sun Yat-sen University. No. 2008-7). Vahvistamme, että kirjallinen suostumus luovuttajalta tai lähiomaisen saatiin käyttöön Tämän näytteen tutkimukseen. Kliiniset ominaisuudet potilaista on esitetty taulukossa 1.

Cell Lines

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat, A549, H1299 ja H460, saatiin Cell Bank Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), ja viljeltiin mukaan erityisen Cell Bank protokollaa.

immunohistokemiallinen värjäys

Immuunihistokemialliset oli samanlainen aiemmin raportoitu protokollat ​​[21], [29] . Anti-nestiinin (AB5922, Millipore, Temecula, CA; 1:500 laimennus) ja anti-Ki-67 (sc-15402, Santa Cruz, CA, USA; 1:200 laimennus) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita.

Plasmidit

knockdovvn nestiinifenotyypin ilmaisun, retrovirusvektorit (pSM2) koodaavat lyhyitä hiusneula-RNA: ita (shRNAs), nimetty shRNA1 (5′-TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG CAG ACA TCA TTG GTG TTA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAA CAC CAA TGA TGT CTG CCC TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ’) ja shRNA2 (5’-TGC TGT TGA CAG TGA GCG CGG CTA GTC CCT GCC TGA ATA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAT TCA GGC AGG GAC TAG CCA TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ’), ostettiin Open Biosystems (Huntsville, AL, USA). Nämä retrovirus tai konstruktiin, joka sisältää salatun shRNA sekvenssin (kontrolli shRNA, Open Biosystems) oli transdusoitu stabiilisti kasvainsoluihin kautta antibioottiselektiota.

Immunofluoresenssivärjäys

Soluja inkuboitiin ensisijaisen anti-nestiinin ( AB5922, Millipore, Temecula, CA; 1:500 laimennus), anti-Ki-67 (Santa Cruz, 1:200 laimennus) tai anti-PCNA-vasta-ainetta (2586; Cell Signaling Tech, Beverly, MA; 1:2000 laimennus). Näytteet asennettu Vectashield sisältävien Hoechst 33342, ja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla.

RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin, ja seuraavat alukesekvenssit palveluksessa: nestiinifenotyypin, 5-GAG GAC CAG AGT ATT GTG AGA C-3 ja 5-CAC AGT GGT GCT TGA GTT TC-3 (368 emäsparia) ja β-aktiini (sisäinen kontrolli), 5-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3 ja 5-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 (540 bp).

Immunoblottaus analyysi

proteiinit erotettiin, sähköllä, blokattiin liuoksella, jossa oli TBS /0,1% Tween-20, inkuboitiin hiiren anti- nestiinifenotyypin-vasta-aine (AB5922, Millipore, Temecula, CA; 1:500 laimennus) yön yli, ja havaitaan piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-ainetta (Cell Signaling Tech, Beverly, MA, USA). GAPDH (SC-81545, Santa Cruz, CA, USA) käytettiin sisäisenä kontrollina, ja Image-Pro Express (MediaCybernrtics, USA) järjestelmää käytettiin.

Colony Formation ja CCK-8 soluproliferaatiomäärityksissä

Solun pesäkkeiden muodostumisen määritettiin käyttäen kristalliviolettia värjäystä. Solujen lisäkasvua tutkittiin kanssa Cell Counting Kit (CCK) -8 (Dojindo, Kumamoto, Japani), ja määritetään mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä.

Arvio DNA Synthesis kautta edu Incorporation

-solut leimattiin 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinin (edu). Nuclear sisällyttäminen määritettiin havaitseminen Alexa Fluor 488 käyttämällä Click-IT edu kuvansiirtopaketti (Invitrogen).

virtaussytometria

Pesun jälkeen PBS: llä, viisikymmentätuhatta solut analysoitiin FACS Calibur instrumentti (BD Biosciences, San Jose, CA) varustettu CellQuest 3.3 ohjelmiston. ModFit LT 3,1 tutkimus solusyklin analyysi ohjelmisto on käyttää määrittämään prosenttiosuudet solujen eri vaiheissa solusyklin.

Expression of Cell Cycle Proteins

Immunoblottausta, seuraavat käytetyt vasta-aineet: kanin anti-Akt (# 9272), anti-GSK3p (# 9332), anti-fosfo (Ser21 /9) -GSK3β (# 9331), anti-fosfo (Ser780) Rb (# 9307), anti-fosfo (Ser795) Rb (# 9301), anti-fosfo (Ser870 /811) Rb (# 9308), hiiren anti-fosfo (Ser473) -Akt (# 4051) ja anti-retinoblastooma (Rb) proteiinia (# 9309), sekä kuten HRP-konjugoitua anti-kani sekundääristä vasta-ainetta. Kaikki vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Kvantitatiivista analyysit, kaikki data normalisoitiin GAPDH ilmaisua.

Tilastollinen analyysi

Kaikki laskelmat suoritettiin käyttäen SPSS V.14.0 tilasto-ohjelmalla (Chicago, IL, USA). Spearmanin korrelaatiokerroin, Chi-neliö testi, ja ANOVA sovellettiin asianmukaisesti. Kokonaiselinaika (OS) laskettiin alkaen leikkauksen asti viimeinen seurannan, ja yhdistys nestiinifenotyypin ilmaisun kanssa OS esitetään Kaplan-Meier tontteja. Yhden ja usean analyysit suoritettiin käyttäen Coxin suhteellista riskiregressioanalyysiä määrittämiseksi ennustetekijöiden vaikutuksia nestiinifenotyypin ilmaisun ja mahdollinen kliininen muuttujia OS.

Tulokset

Basic Clinical Information ja seurantatutkimukset

Kaikkiaan 51 mies- ja 20 naispotilasta NSCLC alistettiin rantavaan kirurginen resektio otettiin tutkimukseen. Keski-ikä potilailla oli 57,6 ± 9,8 vuotta (vaihteluväli 35-77 vuotta). Tutkimme 35 keuhkoadenokarsinooma, 34 okasolusyöpä ja kaksi suurta cell carcinoma tapauksissa. Tapaukset luokiteltiin vaiheen I (n = 32), vaihe II (n = 17), vaiheen III (n = 15) ja vaihe IV (n = 7).

27, 28 Vaihe IV tapauksissa mukana T

1-2 N

0 ja resektoitiin yksinäinen aivometastaasi. Potilaan tiedot analysoitiin 5 vuoden seurannan, ja saatuja tietoja 95,8% (68 71) potilaista. Keskimääräinen eloonjäämisaika oli 25,2 ± 1,9 kuukautta (95% CI: 21,4-29,0 kuukautta) ja keskimääräinen kokonaiselossaoloaika oli 24,0 ± 2,3 kuukautta (95% CI: +19,4-+28,6kuukausi).

Association of nestiinifenotyypin Expression kanssa huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää

perustason ominaisuudet tutkimusväestöstä osalta nestiinifenotyyppiä ja tulokset monimuuttuja analyysit on esitetty taulukoissa 1 ja 2, vastaavasti. Nestiinifenotyypin ilmaistiin 88,7% (63/71) tapauksissa, lähes ilman ilmentymistä keuhkorakkuloiden ja keuhkoputkien epiteelisolujen kasvaimen viereisiin kudoksiin (kuviot 1A, B). Nestiinifenotyypin asema korreloi huonosti eriytetty fenotyyppiin (

χ

2 = 17,776,

P =

0,006), histologinen syöpä kudostyypin (

χ

2 = 8,215,

P =

0,002), N luokittelu (

χ

2 = 12,093,

P =

0,001), ja elintärkeä asema (

χ

2 = 9,003,

P =

0,003). Havaitsimme merkittävä ero eloonjäämisennusteet potilaiden välillä ja ilman nestiinifenotyyppiä (kuvio 1 D). Kohonnut nestiinifenotyypin ilmaisu (käyttäen cut-off-arvo, joka perustuu mediaani nestiinifenotyypin histoscore) liittyi lyhyempi kumulatiivisen eloonjäämisen (30,8 ± 3,3

vs

20,2 ± 1,7 kuukautta riskisuhde 3,366;

P =

0,006).

Strong nestiinivärjäys näkyi NSCLC kudoksessa, kun taas värjäämällä kasvaimen viereiseen kudokseen oli heikko (A, B). Nestiinifenotyypin oli lisäksi havaittu huonosti eriytetty adenokarsinooma ja okasolusyöpä kudoksen (C). Kaplan-Meier juoni kuvaa eroja selviytymisen korkean ja matalan nestiinifenotyypin ilmaisun ryhmien kaksijakoinen perustuvat mediaani nestiinifenotyypin ilmaisun tuumorileesioissa (D). Scale Bar, 100 m; *

p

0,01; ANOVA.

Association of nestiinifenotyypin kanssa Kasvain soluproliferatiivisen merkkiaineet

nestiinifenotyypin ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä kuin proliferatiivinen markkereita, Ki-67 (r = 0,795,

P

0,001; kuvio 2A, B ja C) ja PCNA (r = 0,764,

P

0,001; kuvio S1A ja B), joka ilmaisee rooli kasvainsolujen proliferaatiota.

Värjäys nestiinifenotyypin ja Ki-67 in NSCLC yksilöitä. (A) IHC värjäys nestiinifenotyypin ja Ki-67 in NSCLC kudoksissa. (B) Merkittävä korrelaatiota nestiinifenotyypin ja Ki-67 tasot (r = 0,795;

P

0,001). Jokainen piste edustaa yhtä NSCLC näyte. (C) Ki-67 histoscores kohosi adnocarcinoma (adeno) ja okasolusyöpä (SCC) korkeammat nestiinifenotyypin ilme. Scale Bar, 100 m; *

p

0,01, ANOVA.

nestiinifenotyypin Expression NSCLC Cell Lines

selkeyttämiseksi ilmentymisen aseman nestiinifenotyypin NSCLC, tutkimme sen ilmentymistä kuvioita NSCLC solulinjoissa, A549 ja H460. Erityisesti, nestiinin mRNA: ta ja proteiinia havaittiin kaikissa solulinjoissa (kuvio 3). Ekspression nestiinifenotyypin proteiinin välillä kasvainsolujen ja normaalien solujen myös osoitti laserilla capture mikrodissektion (kuva S2).

nestiinin ilmentyminen havaittiin A549, H1299and H460-soluissa käyttämällä immunofluoresenssivärjäyksen (A) RT-PCR (B) ja immunoblot-analyysi (C). β-aktiini tai GAPDH käytettiin latauskontrollina. Scale Bar, 100 pm.

rooli nestiinifenotyypin vuonna kasvainsoluproliferaation

Sen arvioimiseksi nestiinifenotyypin on rooli keuhkosyövän solujen lisääntymisen, me vakaasti transfektoitu A549 ja H460-solujen plasmideilla koodaavat shRNAs kohdistaminen nestiinifenotyypin transkriptio tai sekoitetun shRNA ohjaus plasmideja, ja mitataan muutokset leviämisen liittyviä määritteitä. Immunofluoresenssivärjäyksen ja immunoblottaus osoitti, että kaksi nestiinifenotyypin shRNA sekvenssit (shRNA1 ja shRNA2) vähentynyt voimakkaasti ilmentymistä nestiinifenotyypin-proteiinin (kuvio 4A). Kuten kuviossa 4B, nestiinifenotyypin knockdown kasvainsoluissa johti näkyvästi pieneneminen pesäkkeenmuodostusyksi- kyky (23%: sta 11,8% ja 12,3% ja shRNA1 ja shRNA2 A549-soluissa, ja 39,6%: sta 20,9% ja 22,8% ja shRNA1 ja shRNA2 A549-soluissa, vastaavasti). Leviämisen määrä oli myös merkittävästi vähentynyt kussakin nestiinifenotyypin-knockdown-soluja verrattuna ohjaamaan vektori soluihin, mitattuna lasku elävien solujen (kuvio 4C). Yhdenmukainen suhde kohonnut nestiinifenotyypin ilmaisun ja Ki-67 tai PCNA ilmentymistä NSCLC Tuumorinäytteet, nestiinifenotyypin knockdown kasvainsoluissa aiheutti huomattavan määrän väheneminen Ki-67-positiivisia soluja verrattuna ohjata kasvainsoluihin (kuvio 4D). Lisäksi DNA-synteesi nestiinifenotyypin pudotus tuumorisoluissa oli esti merkittävästi verrattuna valvonta kasvainsoluissa (kuvio 5A).

(A) A549 tai H460-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti shRNA vastaan ​​nestiinin (shRNA1, shRNA2) perustettiin ja nestiinifenotyypin knockdown verrattuna A549 tai H460-solut transfektoitu salattu shRNA sekvenssin (kontrollivektorille), vahvisti immunofluoresenssivärjäyksen (vasen paneeli) ja immunoblottaus (oikea paneeli). Erot nestiinifenotyypin Knockdown ja ohjaus A549 tai H460-solujen suhteen solujen pesäkkeiden muodostumisen osoitettiin edustavaa micrographs kristalliviolettiliuokseen värjäys (B, vasen paneeli) ja kvantifiointiin solujen pesäkkeiden (B, oikea paneeli). Suppression solujen kasvun seurauksena nestiinifenotyypin Knockdown perustettiin kanssa CCK-8 Kit määritys (C). Immunofluoresenssivärjäyksen (D) osoitti positiivisen immunoreaktiivisuus Ki-67-vasta-ainetta (punainen), ja tumat vastavärjättiin Hoechst 33342 (sininen). Scale Bar, 100 m; *

p

0,01, ANOVA.

Erot DNA-synteesissä hinnat välillä nestiinifenotyypin Knockdown ja ohjaus A549 tai H460-solut määritettiin käyttäen edu sisällyttäminen määrityksiä (A). Virtaussytometria käytettiin analysoimaan solu- syklin nestiinifenotyypin Knockdown ja ohjaus A549 tai H460-solut (B). Scale Bar, 100 m; *

p

0,01, ANOVA.

nestiinifenotyypin shRNA kloonit Display solukierron pysähtymisen klo G1 /S-vaiheen

Voit selvittää kasvaimen soluproliferatiivisen esto liittyy solukierron säätelyssä, tutkimme vaikutuksia nestiinifenotyypin knockdown solusyklin etenemisen syöpäsoluissa. Huomattavaa on, että solujen määrä S-vaiheen solusyklin väheni huomattavasti seuraavat nestiinifenotyypin pudotus (kuvio 5B).

nestiinifenotyypin shRNA kloonit näyttö Vähentynyt fosforylaatio Akt Ser 473 ja GSK3α /β Ser 21 /9

Seuraavaksi määritellään signalointi profiilit nestiinifenotyypin shRNA klooneja. Koska siirtyminen G1 S vaihe on tärkeä tarkistuspiste aikana solujen lisääntymistä, me edelleen todentaa signalointireittien mukana G1 S etenemistä. Nestiinifenotyypin pudotus näkyy suhteellisen vähentynyt fosforylaatio keskeisten proteiineja, jotka liittyvät leviämisen ja metastaasin, mukaan lukien Akt Ser 473, GSK3α /β Ser 21/9, ja Rb on Ser 780, 795, ja 807/811 (kuvio 6A). Määrällinen analyysi ilmoitti myös, että lasku fosfo-Akt ja fosfo-GSK3α /β-proteiinien oli erityisen kasvainsoluissa transdusoitu shRNA2 järjestyksessä, kun taas fosfo- Rb ilmentyminen lisää merkittävästi vähentynyt kasvainsoluissa transdusoitu shRNA1 sekvenssin (kuvio 6B -F). Siksi suuret fosforylaatiotapahtumien muuttunut upon nestiinifenotyypin downregulation ovat ne keskeiset välittäjinä fosfatidyyli 3-kinaasireittiä.

(A) Expression malleja sarjasta solusyklin liittyvien proteiinien nestiinifenotyypin Knockdown ja ohjaus A549 solut. (B-D) kvantitatiivinen analyysi Rb ja fosfo-Rb, (B) AKT ja fosfo (Ser473) -AKT (C), ja GSK3p ja fosfo-GSK3α /β (D). *

p

0,01; ANOVA.

Keskustelu

nestiinifenotyypin ilmaistaan ​​monenlaisia ​​alkion ja aikuisen progenitorisolupopulaatioilla, ja pidetään markkeri erottamiseksi esiastesolujen muista erilaistuneet solut [30], [ ,,,0],31]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmentyminen nestiinifenotyypin rinta-, eturauhas-, ja haimasyövän korreloi positiivisesti kasvaimen pahanlaatuisuuden [16] – [18]. Nämä havainnot ovat saaneet lisääntynyt tutkimus kiinnostusta ilmentyminen malleja nestiinifenotyypin erilaisissa kasvaimissa ja sen suhdetta proliferatiivinen ja metastaattinen ominaisuudet.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että nestiinifenotyypin ilmentyminen merkitsevästi liittyy pahanlaatuinen piirteitä NSCLC kudoksen , erityisesti huonosti eriytetty fenotyyppi ja histologia luokitus. Lisäksi nestiinifenotyypin mRNA ja proteiini ilmennettiin kaikissa NSCLC solulinjoissa tutkittiin. Tilastolliset analyysit paljastivat merkittävän kasvun riskisuhde (riski kuolla) potilailla, joilla on korkea nestiinifenotyypin ilme, verrattuna ilmentävät alhainen nestiinifenotyypin. Korkea nestiinifenotyypin ilmentyminen NSCLC Kudos useimmin liittyvä sairaus on uusiutunut ja kuolema. Meidän havainnot vahvistavat edelleen edellisen raportteja positiivinen suhde nestiinifenotyypin ilmaisun ja kasvaimen pahanlaatuisuuden [11], [18] – [21].

Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat raportoineet, että knockdovvn nestiinifenotyypin siRNA vähentää tehokkaasti leviämisen ja kasvu C6 astrosytoomasoluihin [23] ja sen downregulation aktivoi cdk5 /p35-riippuvaista apoptoottista reittien [24], [32], tarkka rooli nestiinifenotyypin tuumorimetastaasissa on epäselvä tällä hetkellä. Täällä, havaitsimme positiivinen suhde nestiinifenotyypin ja Ki-67 ilmentyminen NSCLC kudosten ja solujen. Havainto, että Ki-67-proteiini ilmentyy kaikissa aktiivisen vaiheet solusyklin (G1, S, G2 ja mitoosi), mutta puuttuu leposoluissa edelleen tukee teoriaa, että nestiinifenotyypin voi liittyä kasvainsolujen proliferaatiota. Koska yhdistyksen välillä korkea nestiinifenotyypin ilmaisun ja kohonnut värjäystä proliferatiivisen solun markkereita, Ki-67 ja PCNA, olemme keskittyneet roolista nestiinifenotyypin vuonna kasvainsoluproliferaation käyttämällä retroviruksia esitellä shRNA vektorien nestiinifenotyypin kohdistaminen (tai kontrolli) sekvenssit NSCLC solut. Merkittävästi, proliferatiivinen ominaisuuksia, kuten pesäkkeitä muodostavat kyky ja solujen kasvu, määrä väheni nestiinifenotyypin shRNA klooneja. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy alustavaa näyttöä rooli nestiinifenotyypin keuhkosyövässä solujen lisääntymisen.

Yksi mahdollinen mekanismi tilille välisen yhteyden nestiinifenotyypin ilmaisun ja leviämisen ehdotetaan pohjalta tulosten analyysimme solusyklin sääntelyn kasvainsoluja. Erityisesti koko S-vaiheen solupopulaatio dramaattisesti vähentynyt nestiinifenotyypin pudotus soluissa. Tämän mukaisesti havainnon, DNA-synteesi, joka tapahtuu aikana S-vaihe, vähennettiin nestiinifenotyypin shRNA klooneja. Siirtyminen G1 S-vaiheeseen on tärkeä tarkistuspisteenä solusyklin. Meidän tutkimuksen keskeisistä jotka säätelevät tämän tarkistuspisteen, kuten RB-proteiini, myönnettiin lisätukea rooli nestiinin proliferaatiossa moduloimalla solusyklin. Yhteisvaikutuksia Rb sykliini D-CDK4 /6 ja sykliini E-CDK2 kompleksit edistää Rb fosforylaation ja geenien ilmentymistä tarpeen syöttää S-vaiheeseen [33], [34]. Meidän kokeet osoittivat, että nestiinifenotyypin shRNA kloonit näyttää vähentynyt suhteellinen taso fosforylaation useissa sivustoja Rb. Näin ollen ehdotetaan, että edistäminen Rb-fosforylaation on yksi molekyylitason mekanismeja, joiden kautta nestiinifenotyypin indusoi kasvainsolun proliferaatiota. Olemme lisäksi tutkineet tiettyjä proteiineja Akt signalointireitin. Poikkeavuuksia seriini /treoniini proteiinikinaasi, Akt, jotka liittyvät läheisesti proliferatiivisen tilan solujen ja aiheuttaa fosforylaatio GSK3p: n [35], [36]. Sen aktivoitu defosforyloitu muoto, GSK3p edistää hajoamista sykliini D, ja fosforyloitumaton GSK3p tukahduttaa Rb fosforylaation ja estää solusyklin etenemisen [37], [38]. Tiedot Tässä tutkimuksessa osoittavat, että solujen proliferaatio on nestiinifenotyypin shRNA klooneja riippuu vaimennussäätely Akt-GSK3p-Rb signalointireittiä. Laajemmassa nämä tiedot viittaavat siihen, että kohonnut nestiinifenotyypin tasot keuhko- syöpäsoluja stimuloivat lisääntymistä ja etäpesäkkeiden lisäämällä aktiivisuutta tämän reitin. Useat tutkijat uskovat, että nestiinifenotyypin ensisijaisesti on solun tukirangan toiminto, joka tarjoaa reaktiopaikka erilaisia ​​signalointipolkujen [39], [40], ja siten solun tukirangan muutosten odotetaan vaikuttavan kinaasien liittyvät ja metastaasit. Vielä tärkeämpää on, koska A549 ja H460 solulinjat ovat p53 villityyppisen ja p53-säännelty MDM2 proteiini on tunnettu säätelijä Rb toiminnon välinen ylikuuluminen nestiinifenotyypin ja p53-reitin näyttää otettava huomioon, ja mTOR aktiivisuuden p53, joka puolestaan ​​säätelee fosfo-Akt-S473 tasolla, voidaan myös antaa mahdollisen yhteyden p53 ja nestiinifenotyypin [41], [42]. Näin ollen yhteys nestiinifenotyypin ilmaisun ja sääntelyn Rb-proteiinin taso on vielä selvennettävä.

Verrattaessa edellisen koskevia raportteja nestiinin ilmentyminen keuhkosyövän [21], [26], meidän havainnot paitsi vahvistanut että ilmaus nestiinifenotyypin NSCLC näytteistä näytti korreloivan kliinisen toimenpiteiden kasvaimen pahanlaatuisuuden ja huono histologinen luokitus, mutta ehdotti myös, että nestiinifenotyypin voisi edistää proliferatiivisia ja invasiivisen käyttäytymisen NSCLC soluja. Lisäksi työmme myös ensin tutkittu biologista suhdetta nestiinifenotyypin korkea ilmaisun ja pahanlaatuinen ominaisuudet NSCLC käyttäen RNA pudotus tekniikoita, solusyklin analyysi ja arviointi sarjan solusyklin liittyvien proteiinien keuhkosyöpään solulinjassa malleja. Näiden tulosten perusteella, me edellyttäen ensimmäinen osoitus siitä nestiinifenotyyppiä osoittivat parannettu proliferatiiviset ominaisuudet, ja selitti tieteellisesti tärkeimpiin kysymyksiin mahdollisista mekanismi nestiinifenotyypin toiminnan kasvainsoluproliferaation. Siten ilmiöitä nestiinifenotyypin ilmentäviä tuumorisoluja ovat tärkeitä solujen lisääntymisen, migraation ja etäpesäkkeiden keuhkosyövässä.

Vaikka tuloksemme osoittavat, että nestiinifenotyypin säädösten kautta Akt-GSK3p-Rb signalointireitistä edistää proliferaation keuhkosyöpä solut, muita näkökohtia kasvain maligniteetin, kuten angiogeneesin, imusuonten ja kasvain aineenvaihdunta, ovat vielä suoraan tutkittava. Kuitenkin ottaen nämä havainnot, rooli nestiinifenotyypin on tarkasteltava meneillään kliininen diagnoosi tai uutena kohteena syövän hoidossa.

Johtopäätökset

Havaitsimme nestiinifenotyypin-positiivisia kasvainsoluja suurin osa NSCLC näytteitä ja merkittävä yhdistys nestiinifenotyypin ilmaisun kanssa alijoukon NSCLC potilaat, joilla on huono tuloksia ja korkea proliferatiivisen markkereita. Lisäksi nestiinifenotyypin knockdown esti solujen lisääntymistä ja G1 /S pidätys ihmisen NSCLC soluissa, mahdollisesti kautta downregulation AKT-GSK 3β-sykliini D signalointi. Tuloksemme viittaavat yhdessä siihen, että kasvainsolut ilmentävät nestiinifenotyypin edistää lisääntymistä NSCLC, jotka voivat muodostaa avainmekanismi nestiinifenotyypin välittämää maligniteetti keuhkojen syöpäsoluja. Kohdennettu sääntely nestiinifenotyypin voi siis olla terapeuttista sovelluksiin ihmisten keuhkosyövän hoidossa.

tukeminen Information

Kuva S1.

värjäys nestiinifenotyypin ja PCNA in NSCLC yksilöitä. (A) IHC värjäys nestiinifenotyypin ja PCNA in NSCLC kudoksissa. (B) PCNA histoscores kohosi adnocarcinoma (adeno) ja okasolusyöpä (SCC) korkeammat nestiinifenotyypin ilme. Scale Bar, 100 m; *

P

0,01, ANOVA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085584.s001

(TIF) B Kuva S2.

ilmentyminen nestiinifenotyypin proteiinin välillä kasvainsolujen ja normaalien solujen laserilla talteenotto mikrodissektion. (A) Laser capture mikrodissektion kasvainsolujen ja normaalien solujen. H & E-värjättyjen solujen leikkaus, joka esittää kasvaimen solut (a) ja normaalit solut (d) ennen mikrodissektion. Samassa osiossa näytetään kasvainsolujen (b) ja normaalit solut (e) jälkeen mikrodissektion. Kasvainsoluja (c) ja normaalit solut (f) seuraavat mikrodissektion korkki. (B) tulokset Western blotting kaksi paria mikropaloitelluista tuumorisolujen ja normaalien solujen. Scale Bar, 100 pm.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085584.s002

(TIF) B

Kiitokset

Tämä tutkimus on esitelty 2

nd Euroopan Lung Cancer Conference (2010, Geneve).