Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimen kehittymisen ja etenemisen vaikuttavat makrofagit ympäröivän microenvironment. Tutkia vaikutteita tulehduksellinen kasvain mikroympäristön kasvuun ja etäpesäkkeiden eturauhassyövän, esillä olevassa tutkimuksessa käytetty rinnakkaisviljelmätilanteessa malli eturauhassyövän (PCA) soluja kasvaimeen liittyvien makrofagi (TAM) -conditioned keskipitkän (MCM). MCM edistänyt PCa cell (LNCaP, DU145 ja PC-3) kasvua, ja ksenograftimallia nude-hiirissä johdonmukaisesti osoittaneet, että MCM voisi edistää kasvaimen kasvua. MCM myös stimuloi muuttoliikettä ja invaasiota

in vitro

. Somatostatiinin derivaatta (smsDX) vaimensi merkittävästi TAM stimuloimaa proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota eturauhassyövän. Immunohistokemia paljasti, että NF-KB oli yli-ilmentynyt PCA ja BPH joilla on krooninen tulehduksellinen kudosnäytteet ja korreloi positiivisesti makrofagien tunkeutuminen. Lisätutkimisesta oleva mekanismi paljasti, että NF-KB ollut tärkeä rooli makrofagien tunkeutuminen. SmsDX esti paracrine silmukan välillä TAM ja PCa soluja, ja se voi edustaa mahdolliseksi terapeuttiseksi aineeksi PCa.

Citation: Guo Z, Xing Z, Cheng X, Fang Z, Jiang C, Su J, et al. (2015) Somatostatiini Johdannaissopimukset (smsDX) vaimentaa TAM stimuloidun leviämisen, Migration and Invasion Eturauhassyöpä kautta NF-KB asetus. PLoS ONE 10 (5): e0124292. doi: 10,1371 /journal.pone.0124292

Academic Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, ITALIA

vastaanotettu: 30 elokuu 2014; Hyväksytty: 12 maaliskuu 2015; Julkaistu: toukokuu 26, 2015

Copyright: © 2015 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (nro 30772294). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä vaikuttaa miehiin ja edustaa toiseksi suurin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden länsimaissa [1]. Valtaosa eturauhassyöpä etenee eturauhasen intraepiteelisen neoplasia kautta paikallisesti invasiivisia adenokarsinooma on kastraatio kestävä eturauhassyövän (CRPC) [2], joka johtaa korkeaan kuolleisuuteen ja vähän hoito on tehokasta. Vaikka paljon tutkimusta, luontainen mekanismi noin CRPC on vielä epäselvä. Äskettäin Zhu et al havaitsivat, että sytokiinit kuten IL-1β tuottaman makrofagit osaltaan etenemistä CRPC [3].

Makrofageilla ovat yleensä runsaimmin immuuni väestö läsnä kasvain mikro-ympäristö [4-6 ]. Äskettäin kaksi erillistä valtioiden polarisoitunut makrofagien on tunnistettu: The ’klassisesti ”aktivoitu (M1) ja” vaihtoehtoisesti ”aktivoitu (M2) makrofagit. Ja se on nyt yleisesti hyväksyttyä, että TAM on M2 fenotyyppi ja voisi tuottaa sarjan sytokiinien /kemokiinien paikallisessa kasvaimen mikroympäristössä, jotka saattavat liittyä edistämisen kasvaimen kasvua, angiogeneesin ja metastaasin eturauhassyövässä [7-10]. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi on tuntematon.

Nuclear tekijä-KB (NF-KB) kuuluu perheen ekspressoituvat transkriptiotekijöiden joka osallistuu tulehdus, immuniteetti ja oncogenesis [11,12]. Se on laajalti läsnä useimmissa (ellei kaikissa) solut, kuten makrofagit. Ja sen poikkeava aktivaatio on havaittu useimmissa kasvaimia. Viime aikoina useat tutkimukset ovat osoittaneet, että sytokiinien (esimerkiksi IL-1 ja TNF) tuottama TAM voisi edistää NF-KB [13,14], sitten edistää kasvainsoluproliferaation, kasvaimen kehittymisen, muuttoliike ja invaasio [15,16]. Lisäksi NF-KB makrofageissa voisi pahentaa insuliinin sieto ja vaikuttavat sokeriaineenvaihduntaan, ja liittyy metabolisia häiriöitä kuten lihavuuden, insuliiniresistenssin, tyypin 2 diabetes ja ateroskleroosi [17-19]. Uskotaan, että NF-kB edistää solujen kasvua ja syövän synnyn, ainakin osittain, järjestämällä uudelleen metabolinen circuitries.

somatostatiini (SMS) on hapan polypeptidi, joka on laajalti koko keskushermostoon, eri oheislaitteiden kudoksia ja elimiä. Se on laaja valikoima biologisia toimintoja hormonitoimintaa, tulehduksen ja kasvaimen. Sms johdannainen (smsDX) perustuu luonnon sms14, ja voisi sitoa kaikki viisi somatostatiinireseptoripositiivisten alatyyppiä (SSTR) [20]. Aiemmat tutkimuksemme on löytänyt smsDX voisi edistää apoptoosia, tukahduttaa jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasio eturauhassyöpäsolujen [21]. Ja useat tutkimukset osoittivat somatostatiinireseptoripositiivisten oli läsnä makrofageissa, tekstiviesti ja analogisen pystyi mukauttamaan toimintaa makrofagien [22-24]. Kuitenkin mekanismi jää epäselväksi. Somatostatiini ja sen analogi on raportoitu useissa tutkimuksissa inhiboi NF-KB [25,26]. Kuitenkin myös smsDX voi säädellä NF-KB eturauhasen syöpä on edelleen tuntematon.

Tässä tutkimuksessa arvioitiin korrelaatio NF-KB ilmaisun ja TAM tunkeutuminen eturauhassyövässä (PCA), eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) ja BPH krooniseen tulehdukseen yksilöitä kautta immunohistokemiallisesti. Simuloida kasvain microenvironment, rinnakkaisviljelmätilanteessa malli Eturauhassyövän soluja (LNCaP, DU145 ja PC-3), jossa TAM-väliaine (MCM) perustettiin

in vitro

. MCM edisti proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota Eturauhassyövän soluja, ja tämä simulointi voitiin estää smsDX. Edelleen tutkimus osoitti, että NF-KB ollut tärkeä rooli tässä prosessissa, ja se voi olla mukana autokriini /parakriininen silmukka välillä TAMeja ja PCa soluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että tulehduksellinen mikroympäristön edistää PCa etenemistä, ja että smsDX voi edustaa avustavan lääke eturauhassyöpään, koska sen mahdollisia tulehdusta rooli.

Tulokset

P65 ilmentyminen korreloi positiivisesti makrofagien ihmisen eturauhasen kudosten

Immunoreaktiiviset värjäystä P65 alayksikköä NF-KB arvioitiin mallin 24 PCA 12 BPH krooniseen tulehdukseen ja 33 BPH yksilöitä. Kun laajuutta värjäytymisen kaikissa kudosnäytteitä kvantifioitiin 0-3 + mittakaavassa, havaitsimme porrastettu nousu keskuudessa BPH kudoksia, BPH krooniseen tulehdukseen yksilöitä, ja PCa. Mikään BPH kudosten värjätään kuten 3+, ja 87,8% näytteillä 0+ tai 1+ värjäystä. Määrä värjäytymistä BPH krooniseen tulehdukseen yksilöitä oli väli, jossa 75% näytteistä näytteille 1+ tai 2+ värjäystä ja 25% näytteille 3+. Sen sijaan kaikki syövän näytteet olivat 2+ ja 3+ (37,5 ja 62,5%, vastaavasti), kuten on esitetty taulukossa 1. Lisäksi, vain heikkoa P65 värjäytyminen havaittiin sytoplasmaan BPH kudoksissa, P65 värjäytymistä havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa kasvain ja tulehdussolujen.

edelleen välisen suhteen arvioimiseksi P65 ja makrofagien tunkeutuminen ihmisen eturauhasen kudosten, värjäämätön leikkeet immunomerkatut kanssa CD68. Kuten on esitetty kuviossa 1, CD68-positiivisten solujen ja P65 ovat koordinoidusti ilmentyy kohtalainen korkea BPH krooniseen tulehdukseen ja eturauhassyöpää vaurioita. Sitä vastoin minimaalinen CD68-värjäys havaittiin BPH. Lisäksi, suurin osa CD68-positiiviset solut osoittivat morfologisia ominaisuuksia makrofagien. Siksi P65 ilmentyminen korreloi positiivisesti makrofagien tiheyden.

(A) Vahva värjäys NF-KB sytoplasmassa ja tumassa Eturauhassyövän. (B) Kohtalainen tunkeutuminen makrofagien PCA. (C) Kohtalainen värjäys NF-KB: n sytoplasmassa ja tumassa eturauhastulehdus. (D) Korkea tunkeutuminen makrofagien krooninen eturauhastulehdus. (E) Heikko värjäytyminen NF-KB: n sytoplasmassa BPH. (F) Lievä tunkeutuminen makrofagien BPH. Kaikki kuvat ovat edustavia kuvia.

SmsDX esti MCM-edistänyt leviämisen ja pesäkkeiden muodostumista eturauhasen syöpäsolujen

vaikutusten tutkimiseen MCM ja smsDX proliferaatioon PCa solujen LNCaP, DU145 ja PC-3-solut erikseen altistettiin MCM ja smsDX 24, 48 ja 72 tunnin ajan CCK-8 määrityksessä. Niinpä MCM merkittävästi edistänyt leviämisen LNCaP, DU145 ja PC-3 solujen ajasta riippuva tavalla, kun taas smsDX heikentäisi vaikutusta MCM soluproliferaatioon (kuva 2). Elinkelpoisuuden LNCaP, DU145 ja PC-3-solujen määrä nousi 51,7%, 44,3% ja 57,6%, tässä järjestyksessä, altistumisen jälkeen MCM 72 tuntia, kuitenkin elinkelpoisuuden laski 44,8%, 44,1% ja 41,6%, tässä järjestyksessä, kun smsDX hoitoon.

vaikutus MCM ja /tai smsDX solujen elinkelpoisuus mitattiin kautta CCK-8-määrityksessä. (A) LNCaP-solut, (B) DU145-solujen ja (C) PC-3-soluja viljeltiin yhdessä MCM ja /tai käsitelty smsDX 24, 48 ja 96 h. Rinnakkaisviljelemällä MCM merkittävästi edistänyt leviämisen PCa solujen ajasta riippuva tavalla wheras smsdx voisi merkittävästi lieventää tätä vaikutusta. (D) vaikutus MCM ja smsDX kolonioiden muodostumista. (E) määrä pesäkkeiden, jotka on määritelty asclusters vähintään 50-soluja, laskettiin mikroskoopilla. Tulokset edustavat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD, * p 0,05, ** p 0,01.

tarkemmin tutkinut, mitä vaikutuksia MCM ja smsDX on pesäkkeenmuodostusta Eturauhassyövän soluja. MCM dramaattisesti helpotti pesäkkeiden muodostumista LNCaP, DU145 ja PC-3-solut. Kuitenkin siirtomaa määrä pieneni merkitsevästi hoidon jälkeen smsDX kuvion 2 (* P 0,05, ** P 0,01).

Vaikutukset MCM ja smsDX solun muuttoliikettä ja invaasiota

vuonna vitro

Scratch analyysit suoritettiin vaikutusten arvioimiseksi MCM ja smsDX siirtyvien Eturauhassyövän soluja. Migraatio valmiuksia LNCaP, DU145 ja PC-3 olivat huomattavasti suurentunut jälkeen rinnakkaisviljelemällä MCM 24 h (kuvio 3). Edelleen testaamiseksi vaikutuksen MCM ja smsDX solun muuttoliikettä ja invaasiota, siirtokuoppaan määritys suoritettiin. Tuloksemme osoittivat, että määrä vaeltavia ja invasiivisia soluja suodattimen läpi lisääntyi merkittävästi, kun makrofageja viljeltiin alemmassa kammiossa (Kuva 3) (# P 0,05, ## P 0,01). Kuitenkin smsDX (10 nM) voi dramaattisesti estää migraation ja invaasion Eturauhassyövän soluja.

(A, C, E) Yhdessä viljeleminen MCM tehosti solujen migraation LNCaP, DU145 ja PC-3-solut. SmsDX tukahdutti vaikutus MCM. (B, D, F) Siirtyminen muutos on esitetty prosentteina alkuperäisestä välinen etäisyys reunat. (G, I, L) TranswellTM maahanmuutto ja invaasiomääritys LNCaP, DU145 ja PC-3-solujen käsitelty MCM ja /tai smsDX. (H, J, M) LNCaP, DU145 ja PC-3-solut, jotka onnistuneesti siirretty ja hyökkäsi laskettiin. Data esitetään keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD, * p 0,05, ** p 0,01, # p 0,05, ## p 0,01.

SmsDX estää MCM-riippuvaisen tuumorin kasvua ksenograftimallia

Kun tehokkuuden osoittamiseksi smsDX estossa PCa solujen elinkelpoisuuden ja invaasiota

in vitro

, me tutki tarkemmin sen mahdollinen antituumorivaikutus hiirillä. PC-3-soluja (5 x 10

6) injektoitiin ihon alle kuhunkin kylkeen nude-hiirissä. Hoito MCM lisäsi merkittävästi keskimääräistä kasvaimen tilavuus. Kuitenkin kasvaimen kasvu inhiboituu käsittelyn jälkeen smsDX 1 mg /kg /d (kuvio 4) (* P 0,05, ** P 0,01). Lisäksi mitään merkittävää toksisuutta havaittiin hiirissä, joita käsiteltiin MCM ja smsDX (1 mg /kg /d), kuten arvioitiin käyttäen kunkin eläimen paino on 3 ryhmään (kuvio 4). Tutkia ilmentymistä NF-KB: n sekä makrofagien infiltraatiota

in vivo

, immunohistokemia suoritettiin parafiinileikkeitä PC-3 tuumoriksenografteja päässä nude-hiirissä. NF-KB: n ja CD68 olivat erittäin ilmaistaan ​​käsitellyillä hiirillä MCM, ja ne liittyvät positiivisesti kasvaimen tilavuus (kuvio 4).

Kuvia nude-hiirten (A) ja leikattiin kasvaimet (C) on otettu eri ryhmiin. (B) Paino käyrä kantavien nude-hiirten PC-3 kasvaimia eri ryhmiin. (D) Kuvaajat, jotka edustavat kasvaimen keskimääräinen määriä PC-3-ksenografteissa käsiteltiin MCM ja /tai smsDX. (E) Korrelaatio CD68 ja NF-KB PCA tuumoriksenograftien. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD, * p 0,05, ** p 0,01.

SmsDX estää tumaansiirtymiseen ja NF-KB: n aiheuttama kautta makrofagi-väliaine PCA soluissa

NF-KB voi edustaa kriittistä mekanistinen yhteys tulehduksen ja syövän, ja sen poikkeava aktivaatio voi edistää kasvainsoluproliferaation, kasvaimen kehittymisen, muuttoliike ja invaasio [15,16]. Ensin havaittu ilmentymistä fosforyloidun P65, joka moduloi NF-KB transkription aktiivisuus [27,28]. Kuten kuvassa 5, rinnakkaisviljelemällä MCM merkittävästi säädelty fosforyloidun P65 LNCaP-soluissa, joka voimakkaimmin julki näitä soluja inkuboitiin MCM 30 minuuttia. Myöhemmin selvitimme vaikutus smsDX on fosforylaatiota P65. Ylös-säädellään fosforylaation tasoja P65 toissijainen MCM käsittely oli ehkäistä tehokkaasti kautta smsDX kolmessa PCa solulinjoissa (kuvio 5).

(A) tasot fosforyloitua NF-KB on LNCaP altistuksen jälkeen MCM eri ajaksi. (B-D) tasot phosphory ja koko NF-KB analysoitiin kautta western blottauksella. Kvantifiointiin p-NF-KB /NF-KB-suhde määritettiin kautta densitometrialla analyysi.

edelleen vaikutusten arvioimiseksi MCM ja smsDX sen translokaatiota NF-KB, soluliman ja tumaproteiinit poimittiin, vastaavasti. Western blot -analyysi paljasti, että MCM vähentää runsaasti P65 sytoplasmassa LNCaP-soluja (kuvio 6). Lisäksi kohonnut P65 havaittiin tumassa (kuvio 6), mikä osoittaa, että NF-KB: n on aktivoitu. Kuitenkin hoito smsDX 24 tunnin dramaattisesti inhiboivat vaikutus MCM NF-KB: n aktivaation. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, että DU145 (kuvio 6) ja PC-3-solulinjojen (kuvio 6). Immunofluoresenssitutkimukset-tulokset kuviossa 7 vahvistivat lisäksi, että samanlainen kuin Western blot analyysissä merkittävästi lisätä ydinvoiman kertymistä P65 jälkeen havaittiin rinnakkaisviljelemällä MCM LNCaP-soluissa, ja että smsDX dramaattisesti esti P65 translokaatio. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin DU145 ja PC-3-solulinjojen (Kuva 7).

(A, C, E) ilmentymistä p65 sytoplasmassa pienennettiin jälkeen rinnakkaisviljelemällä MCM, smsDX heikennettyjä tämä vaikutus LNCaP, DU145 ja PC-3-solut. A-tubuliinia valittiin sytosoliproteiiniin kuormituksen valvonta. (B, D, F) Yhdessä viljeleminen MCM lisäsi ilmaisun ydinvoiman p65, ja hoito smsDX heikentynyt vaikutus MCM. Histonit valittiin ydin- proteiiniin latauskontrollina. Kvantifiointiin C-p65 /a-tubuliinia ja N-p65 /histoni-suhde suoritettiin densitometrian analyysi.

(A) Co-kulttuuri MCM merkittävästi edistänyt tumakertymään p65 LNCaP solut. Hoito smsDX esti p65 tumaansiirtymiseen. (B ja C) Ilmaisulla ja translokaation p65 altistuksen jälkeen MCM ja hoito smsDX in DU145 ja PC-3-soluissa, vastaavasti, analysoitiin kautta immunofluoresenssilla.

Keskustelu

läsnäolo leukosyyttien sisällä kasvainten havaittiin ensi 19th century Rudolf virchow, tämä havainto mikäli ensimmäinen osoitus yhteys tulehduksen ja syövän [29]. Epidemiologiset tutkimukset ovat viime aikoina osoittaneet, että makrofagit ovat tärkeä osa isännän leukosyyttien tunkeutuminen sisään useimmissa pahanlaatuisia kasvaimia [30]. Kuitenkin kliininen merkitys TAM suodattuu eturauhasen syöpä on edelleen kiistanalainen. Kiran el al raportoitu, että keskimääräinen määrä TAMeja oli korkeampi eturauhassyövän kuin hyvänlaatuinen kudoksessa [31], kun taas Norio et al raportoitu päinvastaiseen tulokseen [32]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme lisääntynyt makrofagien tunkeutuminen eturauhassyövän ja BPH krooniseen tulehdukseen verrattuna hyvänlaatuinen kudosta. Lisääntynyt TAM tunkeutuminen on myös raportoitu olevan yhteydessä huonoon PCa eteneminen [33]. Siksi TAMeja voi edustaa potentiaalisia ennustaja eturauhassyöpää. Jotkin aikaisemmat tutkimukset ovat myös paljastaneet, että M2-polarisoitunut THP-1 makrofagien voi edistää kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden [34,35]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että TAM-kuin M2-tyypin makrofagien lisäsi muuttoa ja hyökkäys syöpäsolujen. Lisäksi, MCM edistänyt tuumorigeenisyyden PC-3-solujen ksenograftimallia nude-hiirissä. Lisäksi hallinnon smsDX heikensi vaeltavia ja invasiivisia potentiaalia eturauhassyövän solut, jotka stimuloitiin M2-tyypin makrofagit.

Havaitsimme myös, että NF-KB ilmaisun PCA ja BPH krooniseen tulehdukseen yksilöitä oli merkitsevästi suurempi kuin että BPH, tämä ilmaus korreloi positiivisesti makrofagien tunkeutuminen. Siksi olemme keskittyneet rooliin NF-KB tässä prosessissa. Nuclear factor-KB: n (NF-KB) on indusoitavissa dimeerinen transkriptiotekijä, joka kuuluu Rel /NF-KB: n perheen. Yli-ilmentymistä koodaavien geenien RelA /NF-KB: n tekijöiden on havaittu monissa kasvaimissa [36-39], ja dysregulaatio NF-KB: n uskotaan edistävän solujen lisääntymistä, liikkuvuuteen, invaasio ja metastaasi useimmissa kasvaimia, mukaan lukien eturauhasen syöpä [40,41]. NF-KB: n katsotaan olevan tärkeä molekyyli tuottaja tulehduksen ja voi edistää immuniteetin säätelemällä geenien ilmentymistä mukana tulehdus [42]. Tämä tutkimus osoitti, että makrofagit aktivoituvat NF-KB PCA. Tämä johti etenemisen eturauhasen syöpäsolujen jälkeen rinnakkaisviljelemällä MCM. Kasvaimen mikroympäristössä, sytokiinien TAM voi aktivoida NF-KB: n tuumorisoluissa, mikä edistää tuumorigeneesiä. Kasvain solut puolestaan ​​ilmentävät CSF-1 ja voi edelleen edistää ja makrofagien [43]. Siksi on paracrine silmukka sisällä TAM-avusteinen syövän etenemiseen. Ja NF-KB on tärkeä rooli toimia tämän silmukan.

somatostatiini ja sen analogit ovat neuroendokrii- hormonit ja ovat tärkeitä välittäjiä välillä hermostunut ja immuunijärjestelmään. Meidän ja muut ryhmät ovat havainneet, että nämä hormonit voivat estää leviämisen ja invaasion useiden kasvaintyypeille [21,44]. Viime aikoina huomattavia koetulokset ovat osoittaneet, että SMS-analogit osoittavat anti-inflammatorista aktiivisuutta, koska niiden estävää vaikutusta eritykseen TNF-α, IL-8 ja IL-1β [45,46]. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan ei ole tehty tutkimuksia vaikutuksista SMS analogeja ilmenemistä NF-KB: n ja biologista käyttäytymistä Eturauhassyövän solujen tulehduksellinen mikroympäristön. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että smsDX merkittävästi heikennetty makrofagi-välitteistä stimulaatiota Eturauhassyövän solujen lisääntymisen ja invaasiota estämällä ilmentymistä ja aktiivisuutta NF-KB: n

in vitro

ja

in vivo

. Somatostatiinireseptorin alatyyppeihin 1 ja 2 on havaittu ihmisen makrofageissa [22], ja immunoreaktiivisia somatostatiini on havaittu sytoplasmassa makrofageissa. Siksi me spekuloida, että smsDX voisi sitoutua SSTR1 tai 2 pinnalla makrofagien ja murtaa parakriinisten silmukassa kasvain ja tulehduksellinen mikroympäristön, mikä lieventää makrofagi-stimuloidun etenemisen PCa.

Äskettäin, metaboliset häiriöt kuten lihavuus, tyypin 2 diabetes ja ateroskleroosi on histologisesti pidetty krooninen matala-asteista tulehdusta merkittäviä makrofagien infiltraatiota [47,48]. Makrofagien on havaittu olevan lähellä, joilla on metabolinen soluja ja havaittiin olevan laaja transkription allekirjoitus että säännelty aineenvaihduntaa adipocytessuch kuin pyruvaattikarboksylaasi, PPAR-γ, apolipoproteiini C1, jne [18]. Lihavilla yksilöitä, ylimääräistä energiaa, tuotteita, makrofageja voidaan aktivoida NF-KB: tä, edelleen liipaisu makrofagien rekrytointiin, aktivointi ja käynnistäminen ja ylläpito tulehdusreaktion, joka lopulta johtaa insuliiniresistenssiin [18]. Lisäksi pahentaa perifeerisen insuliinin ali-, NF-KB voi vaikuttaa myös glukoosiaineenvaihduntaan ja mitokondrion hengitystä, joka on tärkeä solujen kasvun ja kasvaimen synnyssä [49]. Aikaisemmat tutkimus kertoo, että smsDX voi vaikuttaa solujen aineenvaihduntaan ja mitokondrioiden toimintaa Eturauhassyövän soluja. Siksi me spekuloida, että smsDX voi heikentää vaikutusta MCM on PCa soluihin toimia heti solun aineenvaihduntaan lisäksi anti-tulehdus.

Yhdessä Tutkimuksemme osoittaa, että TAM voivat edistää ja etenemiseen PCa, ja että smsDX vaimentaa tätä vaikutusta alaspäin säätäminen NF-KB. Nämä tulokset osoittavat, että smsDX saattaa olla lupaava terapeuttinen lääke eturauhassyöpään potilaille.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki ihmisen näytteet saatiin aikana terapeuttinen leikkauksen. Tämä tutkimus tehtiin käyttämällä näytteitä yli hyllyt jälkeen patologisen diagnoosin. Me soitettiin kaikki potilaat ja saatu suullisesti tietoisen suostumuksen. Tämä on nimenomaan hyväksynyt Qilu sairaalan komitean Shan Dong University for Human Kokeilut. Kaikki eläinten hoito ja koemenettelyn noudattanut eläinten Management säännöt terveysministeriön kansantasavallan Kiinan (asiakirja nro 55, 2001). Kaikki eläimet pidettiin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Function Research at Qilu sairaalan Shandong University. Tutkimus hyväksyttiin Qilu sairaalan komitean Shan Dong yliopiston Human Kokeet ja jonka Animal Care komitean Shandongin yliopistossa.

Potilaat ja näytteet

Kaikkiaan 24 potilasta diagnosoitu PCa ja 45 potilaalla diagnosoitiin BPH käsitellään laitoksella urologian Kirurgian Qilu sairaalan Shandong University välillä lokakuussa 2010 ja heinäkuu 2012 otettiin tässä tutkimuksessa. Thereinto, kuusitoista PCA potilaista tehtiin transrectal eturauhasen koepala, ja 8 potilaalle tehtiin höyläysleikkaus eturauhasen. Kaksitoista 45 eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) potilailla diagnosoitiin histologinen krooninen eturauhasen tulehdus. Kliiniset parametrit ja patologinen luokituksia esitellään ja esitetään yhteenveto taulukossa 1. Kukaan potilaista oli saanut ennen leikkausta adjuvanttihoito. Diagnoosi kulloinkin vahvistettiin kaksi patologia.

PCa solulinjojen ja soluviljelmässä

Ihmisen PCa solulinjat (LNCaP, DU145 ja PC-3) ja THP-1-solut hankittiin tyyppi Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences. Kaikki solut kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Hyclone, Logan, UT), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa. Becasue TAM edustaa erillistä M2-polarisoitu rofagipopulaatio [50], THP-1-monosyyttejä erilaistuneet makrofagien RPMI-elatusaineeseen, joka sisälsi 5 ng /ml forboli-12-myristaatti-13-asetaattia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ja 48 h mukaan aikaisemmin vahvistettujen menettelyjen [51]. Sitten viljelmien supernatanteissa oli steriloitiin suodattamalla ja varastoitiin -20 ° C: ssa, kunnes valmis käytettäväksi.

immunohistokemiallinen analyysi

Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [52]. Lyhyesti parafinoidut kudokset parafiini ja nesteytyksestä. Sen jälkeen, kun antigeeni haku, kaikki näytteet altistettiin primaarista vasta-ainetta (CD68 01:50, P65 1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) yli yön 4 ° C: ssa, ja inkuboitiin sitten biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 30 min 37 ° C: ssa, mitä seurasi avidiini-biotinyloitu peroksidaasikompleksin 20 min ajan 37 ° C: ssa. Värjäys suoritettiin kanssa 3,3N-diaminobentsidiinillä tertrahydrochloride ja haematin. Proteiini ekspressiotaso arvioitiin mukaan prosenttia positiivisesti värjättyä kasvainsolujen ja värjäytymisen intensiteetti kahdella patologit kuten aiemmin on kuvattu [53]. Lyhyesti, prosenttiosuus positiivista värjäytymistä pisteytettiin 0 (0-9%, negatiivinen), 1 (10% -25%, satunnaisesti), 2 (26% -50%, polttoväli) ja 3 (51% -100%, diffuusi), ja intensiteetti kuin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäystä, nähtävissä korkealla suurennuksella), 2 (kohtalainen värjäytyminen, näkyvä alhaisella suurennus) ja 3 (tumma värjäys, silmiinpistävän positiivinen pieni suurennus). Yhteenlaskettu immunovärjäyksellä pisteet laskettiin arvoon prosentin positiivisuuden pisteet × värjäytymisen intensiteetti pisteet, jotka vaihtelivat 0 9. ekspressiotaso määriteltiin seuraavasti: ”0+” (negatiivinen, pisteet 0), ”1+” ( heikosti positiivinen, pisteet 1-3), ”2+” (positiivinen, pisteet 4-6), ja ”3+” (voimakkaasti positiivinen, score7-9).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin kautta CCK8 määrityksessä. Lyhyesti, LNCaP (6 x 10

3 solua /kuoppa), DU145 (4 x 10

3 solua /kuoppa) ja PC-3 (4 x 10

3 solua /kuoppa) solujen 200 pl väliaine ympättiin 96-kuoppaisille levyille. 12 tunnin jälkeen kiinnittyminen, väliaine korvattiin väliaine makrofaagien /ilman smsDX (10 nM). Jälkeen 24-72 tuntia, viljeltyjä soluja käsiteltiin 20 ui Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 4 tuntia ohjeiden mukaisesti valmistuksen. Absorbanssi määritettiin 450 nm: ssä.

Clone muodostumista määrityksessä

LNCaP, DU145 ja PC-3-solut tiheydellä 1 x 10

3 solua /kuoppa siirrostettiin 6- kuoppalevyille. Kun oli inkuboitu yön yli, väliaine /ilman smsDX (10 nM) lisättiin alustaan, ja soluja inkuboitiin 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa kahden kolmen viikon ajan. Kun näkyvä kloonit, jotka on muodostettu levyjen, solut pestiin kloonien PBS: llä ja kiinnitettiin Esijäähdytettyyn metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20 minuutin ajan. Pesäkkeet, jotka sisältävät yli 50 solut laskettiin mikroskoopin alla. Klooni muodostamisnopeudella = (kloonin numero /lukumäärän soluinokulaation) x 100%.

In vitro

naarmu määritys

Eturauhassyövän soluja ympättiin 24-kuoppaisille levyt. Kun oli inkuboitu 24 tunnin ajan, kukin kuoppa manuaalisesti raaputettiin 200 ul pipetin kärki, pestiin PBS: llä kolme kertaa ja inkuboitiin kunnostetun alustan kanssa /ilman 10 nM smsDX. Kuvat otettiin uudelleen 24 tunnin ajan. Etäisyys kahden solun reunaa analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa.

Transwell invaasiomääritys

Transwell invaasiomääritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [54]. Lyhyesti, yhteensä 5 x 10

4 solut suspensoitiin 100 ul seerumia lisättiin yläkammiot transwell-järjestelmän (24 kuopat, 8 mm: n huokoskoko, Corning Costar, Lowell, MA, USA) päällystetty 2 mg /ml matrigeeliin (BD Biosciences). TAM-väliaine kanssa /ilman 10 nM smsDX lisättiin sitten alempaan kammioon. 24 tunnin kuluttua ei-hyökkäsi solut ylemmässä kammiossa hellävaraisesti poistettiin vanupuikolla taas solujen kiinnittämiseksi alapintaan kiinnitettiin esijäähdytetylle metanolilla ja värjättiin 1% eosiinilla. Vähintään kymmenen kentät kunkin kammion valittiin sattumanvaraisesti ja solut laskettiin mikroskoopin alla.

migraatiokokeessa, solut ympättiin yläkammiot ilman päällystetyn Matrigel. Loput Määritys suoritettiin Transwell invaasiomääritys. 24 tunnin kuluttua solut on alapinnalla myös laskettiin vähintään kymmenen sattumanvaraisesti kentät, solu määrä analysoitiin tilastollisesti.

immunofluoresenssimäärityksellä

PCa maljattiin fibronektiinillä pinnoitettu lasi peitinlasit. 24 tunnin inkubaation jälkeen solut huuhdeltiin PBS: llä, kiinnitettiin Esijäähdytettyyn metanolia, ja tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100. Kiinnitetyt solut esi-inkuboitiin 1,5% normaalia vuohen seerumia ja inkuboitiin edelleen yön yli primaarisen vasta-aineen P65 (laimennus 1: 100) 4 ° C: ssa. Sen jälkeen kun inkubointi fluoreseiini-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG-vasta-aineen 37 ° C: ssa, peitelasit oli asennettu diat Permafluor vesiliuosta. Fluoresenssi havaittiin käyttäen Zeiss Axioplan Universal mikroskoopilla.

Western blotting

solut lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi 1%: proteaasi-inhibiittorit. Eristää sytoplasminen osa ydin- yksi PCA-soluja käsiteltiin tumaproteiini uuttamalla Kit (Beyotime Biotechnology, Wuhan, Kiina) ja sentrifugoitiin 3400 rpm 10 min 4 ° C: ssa. Sytoplasmisen ja ydin- komponentteja alistettiin sitten Western-blottaus. Yhtä suuret määrät proteiineja jokaisesta näytteestä erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle käyttäen märkää siirtolaitetta (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Kalvot jälkeen altistettiin piparjuuriperoksidaasi-leimatut sekundääriset vasta-aineet (1: 2000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja reaktiivisuus havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham, Pittsburg, PA). Proteiini tasot analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmistoa.

ksenograftimallissa

Patogeenittomia 4-5 viikon ikäiset BALB /c-nude-hiiriä (paino 19 ± 2 g, SPF laatu, todistus SCXK2011 -0012) ostettiin Department of Laboratory Animal Science Pekingin yliopisto (Beijing, Kiina). Kaikkiaan 5 x 10

6 PC-3-solut kerättiin, sekoitettiin matrigeelin ja ruiskutetaan ihon alle kylkeen nude-hiirten. Hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (5 ryhmää kohti). Hiirille annettiin MCM kanssa tai ilman smsDX annoksella 1 mg /kg /d intraperitoneaalisesti injektiona 4 viikkoa viikoittain seuranta kasvaimen koon ja painon, kun taas kontrolli-hiirille annettiin sama tilavuus fysiologista suolaliuosta. Kaikki hiiret lopetettiin käyttämällä natriumpentobarbitaalia 8 viikkoa ymppäyksen jälkeen syöpäsolujen ja kasvaimet kerättiin.

Tilastollinen analyysi

Data ovat enimmäkseen esitetään keskiarvona ± SD. SPSS ohjelmistopaketti (versio 13,0; SPSS, Chicago, IL) käytettiin kaikkiin tilastollista analyysiä. Merkittäviä eroja hoitoa ja valvontaa arvot analysoitiin käyttäen Studentin kaksisuuntaista t-testiä tai yksisuuntaista varianssianalyysiä tarpeen mukaan. Erot katsottiin olevan tilastollinen merkittävästi, kun p 0,05. Jokainen muuttuja testattiin kahdesti ja koe toistettiin kolme kertaa.

Kiitokset

American Journal Asiantuntijat muokata tämän käsikirjoituksen.