Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tehdas Flavonoidi luteolin osoittaa erilaisia ​​biologisia vaikutuksia, kuten syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Tiedetään vähän molekyylitason mekanismeista sen toimia peräsuolen syöpä (CRC). Täällä tutkimme vaikutuksia luteolin paksusuolen syöpäsoluissa, keskittyen tasapaino keramidin ja sfingosiini-1-fosfaatti (S1P), kaksi Sfingoidi- välittäjiä vastakkaiset roolit solun kohtalon. Käyttäen viljeltyjä soluja, olemme havainneet, että fysiologiset pitoisuudet luteolin aiheuttaa korkeus keramidin, minkä jälkeen apoptoottisen kuoleman paksusuolen syövän soluja, mutta ei eriytetyn enterosyyttien. Pulse tutkimukset paljastivat, että luteolin estää keramidiin anabolism monimutkaisiin sfingolipidejä. Lisäkokeita johti meidät osoittaa, että luteoliini indusoi muuttamista endoplasmakalvoston (ER) -Golgi virtaus keramidin, keskeinen sen metabolisen käsittely monimutkaisia ​​sfingolipidit. Me raportoimme että luteolin kykenee sen toimintaa estämällä sekä Akt aktivointia, ja sfingosiinikinaasin (SphK) 2, jossa alenevasta S1P, Akt stimulaattori. S1P anto suojattu paksusuolen syövän soluja luteoliini-indusoitua apoptoosia, todennäköisimmin solunsisäisen reseptorin riippumaton mekanismi. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että ruokavalion flavonoidien luteolin kiinnostavuus myrkyllisiä vaikutuksia koolonkarsinoomasoluissa estämällä sekä S1P biosynteesiä ja seramidiksi liikennettä, mikä viittaa sen ruokavalioon käyttöönotto /lisäravinteen mahdollisena strategia parantaa nykyisiä hoitoja CRC.

Citation: Abdel Hadi L, Di Vito C, Marfia G, Ferraretto A, TRINGALI C, Viani P, et al. (2015) sfingosiinikinaasin 2 ja Ceramide Transport pääkohteena Natural Flavonoidi Luteolin apoptoosin indusoimiseksi koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 10 (11): e0143384. doi: 10,1371 /journal.pone.0143384

Editor: Ashley Cowart, Medical University of South Carolina, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2015; Hyväksytty 4 marraskuuta 2015 Julkaistu: 18 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Abdel Hadi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CRC on yksi yleisimmistä neoplasia ja johtava kuolinsyy maailmassa. Tämä syöpä on tunnustettu, ja edelleen, ympäristön syövän, sen esiintyvyys on kasvanut rinnan taloudellisen kehityksen kanssa useimmissa tapauksissa esiintyy teollisuusmaissa, ja lähinnä ruokavalion [1, 2]. Lukuisat tutkimukset ovat sidoksissa runsas kulutus elintarvikkeita kasvin alkuperä on alentunut riski sairastua eri syöpiä, joka on kemiallis-estävä vaikutus, joka liittyy korkea pitoisuus useita fytokemikaalit kanssa tehokas syövän ominaisuuksia [3], mukaan lukien yhdisteet flavonoideihin [4 , 5]. Yksi yhteinen osa tämän perheen on luteolin (3 ’, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone), joka on läsnä suurina määrinä yhteistä hedelmiä, vihanneksia ja yrttejä, ja sillä on laaja kirjo vaikutuksia, kuten syöpälääkkeiden toimintaa [6, 7]. Luteoliini anti-karsinogeenisia ominaisuuksia laajentaa laajalla pahanlaatuisten kasvainten ja liittyy useita vaikutuksia, kuten soluproliferaation inhibointi, angiogeneesi, etäpesäke, apoptoosin induktion, ja herkistyminen kemoterapia [6, 7]. Huolimatta molekyylitason mekanismit luteolin toimia, ja erityisesti niitä, jotka liittyvät sen kemoterapeuttinen potentiaali, jäävät suurelta osin epäselviksi.

Eri kasvainsoluja, seramidi, keskeinen välituote sfingolipidi aineenvaihdunta, on todettu toimivan solun välittäjänä useiden syövän vastaisia ​​yhdisteistä, pystyy säätelemään eri signalointireittejä, ja johtaa solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin [8, 9]. Useat entsyymit eri subsellulaarisissa paikoissa osallistuvat valvontaan keramidiin taso [10]. Pro-apoptoottinen ja kasvaimen estävä vaikutus keramidin ovat antagonisoi S1P, pro-mitogeenisen ja eloonjäämistekijä erilaisia ​​solutyyppejä [11-13]. S1P aineenvaihdunta liittyy suoraan että seramiditasot, sen biosynteesi vaatii sfingosiiniä johdettu keramidin hydrolyysistä, ja SphKs (isoformi SphK1 tai SphK2). S1P näyttelyitä sekä solun sisäinen ja ulkoinen toimet, ensisijaisesti aktivointi pro-mitogeenisen ja pro-eloonjäämisen signalointi [11, 14]. Asianmukainen sääntely sfingolipidikeramidi säätövastuksen, että on tasapaino S1P ja seramidiksi, on välttämätöntä solun homeostaasin, ja on keskeinen rooli säätelyssä solujen ominaisuudet ja kohtalo [11, 13].

Seramiditasot ovat olleet raportoitu vähentää huomattavasti CRC verrattuna normaaliin paksusuolikudos [15], ja useat kemoterapeuttisia todettiin vaikuttaa seramidiksi aineenvaihduntaan ja edistää niiden kasaantumiseen koolonkarsinoomasoluissa (tarkistetaan [16]). Lisäksi S1P stimuloi kasvua, invaasio ja selviytymistä paksusuolen kasvainsolujen [17, 18], ja SphK1 ja S1 P lyase ovat ylä- ja alassäädetty, mikä S1P kerääntymistä CRC [19, 20]. Nämä todisteet viittaavat siihen, että epätasapaino on sfingolipidikeramidi säätövastuksen suosivat CRC.

Huolimatta luteolin näyttää lupaavalta kuten kemoterapeuttisia joissakin syöpäsoluissa [7], tiedetään hyvin vähän siitä roolista sfingolipidikeramidi säätövastuksen sen toimista, ja erityisesti CRC. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia mahdollista roolia sekä keramidin ja S1 P in luteolin sytotoksisuutta CRC. Käyttäen ihmisen Caco-2 soluja CRC malli, tutkimuksemme osoittaa ensimmäistä kertaa sfingolipidikeramidi säätövastuksen tavoitteeksi asetettiin luteolin sytotoksisten vaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

kaikki reagenssit olivat parasta saatavilla analyysilaatua. Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM), brefeldin A (BFA), vapaan rasvahapon-BSA: ta (FFA-BSA), N-asetyyli-D-erytro-sfingosiini (C2-Cer), N-heksanoyyli-D-erytro-sfingosiini ( C6-Cer), O-trisyklo [5.2.1.02,6] dek-9-yyli ditiokarbonaatti kaliumsuola (D609), Hoechst 33342, luteoliini, pertussis-toksiini (PTX), ja yhteinen kemikaalit olivat yhtiöltä Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). S1P ostettiin Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA), ja häkissä S1P Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA, USA). Korkea suorituskyky TLC (HPTLC) silikageelilevyt ja kaikki liuottimet olivat Merckiltä (Darmstadt, Saksa). Vasikan sikiön seerumia (FCS) oli peräisin EuroClone (Milano, Italia). LY294002, SEW2871, ja W123 olivat Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA), ja N- (4,4-difluori-5,7-dimetyyli-4-bora-3a, 4a-diatsa-

s

-indacene-3-pentanoyyli) -sphingosine (BODIPY-C

5-Cer) Life Technologiesin (Monza, Italia).

3H-seriini (30 Ci /mmol),

3H-D-erytro-sfingosiini (

3H-Sph) (20,0 Ci /mmol) ja D-erytro- [4,5

3H] dihydrosfingosiiniä (60,0 Ci /mmol) saatiin PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA, USA) ja amerikkalainen Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA).

Soluviljely

ihmisen koolonkarsinoomasolulinja Caco-2 (BS TCL 87) saatiin Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (Brescia, Italia), ja ylläpidetään EMEM täydennetty 15% FCS: ää, 2 mM L- glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 100 ug /ml streptomysiiniä, 100 U /ml penisilliiniä ja 0,25 ug /ml amfoterisiini-B: 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Caco-2-solut maljattiin 1,25 x 10

4 /cm

2, ja sitä voidaan käyttää joko paksusuolisyöpäsolulinjassa malli (CC-solut) (at yhtymäkohdassa, 3 päivää sen jälkeen, kun pinnoitus) tai eriytetty enterosyyteissä (DES) ( 21 päivän kuluttua yhtymäkohta) [21]. Suoliston erilaistumista vahvistettiin arvioimalla erityisiä morfologisia ominaisuuksia, ja biokemiallisia markkereita, kuten aiemmin on raportoitu [21].

Cell hoitoja

kantaliuokset annetaan molekyylejä valmistettiin liuottamalla ne uudelleen seuraavasti: luteoliini, SEW2871 , W123 ja häkissä S1P DMSO, C2-Cer ja BFA absoluuttiseen etanoliin, C6-Cer kuin 1: 1 kompleksi FFA-BSA, ja S1P in FFA-BSA (4 mg /ml PBS: ssä). Tuolloin kokeiden, kantaliuokset laimennettiin tuoreeseen elatusaineeseen sopivaan konsentraatioon ja annetaan soluihin. Samanaikaisesti kokeissa soluja inkuboitiin laimennettiin ajoneuvojen kontrollina. Kaikki liuottimet, käytetyissä lopulliset pitoisuudet havaittiin ilman vaikutusta joko sfingolipidikeramidi aineenvaihduntaan tai solujen selviytymistä. Kun käytetään, W123 ja PTX annettiin 1 tunti ennen ja sen aikana hoitoja. Solunsisäiseen S1P sukupolven, CC-solut ladattiin häkissä S1P (EMEM: issä, joka sisälsi 1 mg /ml FFA-BSA) 37 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten väliaine poistettiin ja fotolyysi suoritettiin 30 sekunnin UV-pulssin 360 nm maksimi-intensiteetti.

määritys solujen elinkelpoisuuden ja apoptoosin

Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT- määritys. Lyhyesti, sen jälkeen, kun hoidon osoitetun ajanjakson ajan, väliaine korvattiin MTT liuotettiin tuoreeseen elatusaineeseen (0,8 mg /ml) 4 tuntia. Formatsaanikitei- jälkeen kiteet liuotettiin isopropanoli /muurahaishappoa (95: 5 v /v) 10 minuutin ajan ja absorbanssi (570 nm) mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Wallack Multilabel Counter, Perkin Elmer, Boston, MA, USA).

arvioimiseksi apoptoosin, Hoechst värjäys ja analysointi kaspaasi 3 pilkkominen tehtiin. Erityisesti, solut kasvatetaan lasipeitinlevyille leimattiin 10 uM Hoechst 33342 väriaine 15 minuuttia 37 ° C: ssa, pimeässä. PBS-pesun jälkeen solut kiinnitettiin 0,5% glutaraldehydillä PBS: ssä (10 min, 4 ° C). Ydin- morfologia tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus BX-50), joka on varustettu nopeasti korkean resoluution CCD-kamera (ColorView 12) ja kuvan analyyttinen ohjelmisto (Analysis Soft Imaging System GmbH). Kaspaasi-3 lohkaisu arvioitiin western blotting (katso jäljempänä).

Ceramide määrällistä ja metabolisia tutkimuksia

Jotta voitaisiin arvioida seramidiksi sisältöä ja sfingolipidikeramidi aineenvaihdunta, solu sfingolipidejä leimattiin 25 nM

3H-Sph (0,5 uCi /ml) tai 200 nM L-

3H-seriini (6,0 uCi /ml), kuten aiemmin on raportoitu [22, 23], ja eri aikoina. Erityisesti varten seramidi kvantifiointiin, teimme 6 h pulssi, jota seuraa 24 h Chase, ehto oikeuttavat vakaan tilan metabolinen leimaus. Metabolisia tutkimuksia, pulssi kokeet suoritettiin 1-2 tuntia. Lopussa pulssi /chase ajan, väliaine kerättiin huolellisesti, solut kaavittiin irti levyn ja sfingolipidit ja S1P uutettiin ja osittain puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [22, 24]. Kun laskurin radioaktiivisuus nestetuikelaskennalla, lopullinen orgaaninen ja vesipitoinen faasi on jätetty HPTLC käyttäen kloroformi /metanoli /vesi 55: 20: 3 (tilavuuden mukaan.) Ja n-butanoli /etikkahappo /vesi 3: 1: 1 (by vol.) erottamiseen monimutkaisten sfingolipidit ja SLP, vastaavasti. HPTLC jälkeen levyt toimitettiin digitaalinen autoradiografia Beta-Imager 2000 instrumentti (Biospace, Paris, FR). Liittynyt radioaktiivisuus yksittäisten lipidien määritettiin M3-Vision ohjelmisto mukana instrumentin.

3H-sfingolipidit tunnistettiin yhteistyössä muuttoliike sisäisten standardien kromatografoitiin samalle levylle. Ceramide pitoisuus määritettiin laskemalla vakaan tilan

3H-keramidi /

3H-sfingomyeliiniä suhde, ja kertomalla sen endogeenisen sfmgomyeliini sisältöä (22, 23). Samanlaisia ​​Seramiditasojen (eri alle 12%) saatiin, kun solu merkintöjen tasapainossa

3H-Sph ja

3H-seriini.

3H-S1P hajoaminen arvioitiin tritiatoitua vesi jakotislaamalla vesifaasin viljelyalustasta, ja mittaamalla radioaktiivisuus nestetuikelaskennalla [22]. Ohjaus kokeilee lisätty

3 H

2O osoitti, että ei menetetä tritiumia haihduttamalla puhjennut silloin, kun käytetään koeolosuhteissa.

solunsisäinen lokalisaatio loisteputki seramidiksi

ER-Golgin kuljettaminen seramidi laadullisesti arvioitiin BODIPY-C

5-Cer kuten aiemmin raportoitu [25]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin lasipeitinlevyjä ladattiin 2,5 uM BODIPY-C

5-Cer 30 min, 4 ° C: ssa, ja sitten inkuboitiin kunnostetussa alustassa (30 min 37 ° C), poissa tai läsnä ollessa of luteolin. Sitten koekappaleet kiinnitettiin glutaraldehydillä ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla (katso edellä).

SphK aktiviteetti

Solut kerättiin SphK puskurissa (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, joka sisälsi 40 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM EDTA, 0,5 mM deoksipyridoksiinia, 15 mM NaF, 1 mM β-merkaptoetanolia, 1 mM Na

3Vo

4, 0,4 mM PMSF, 10% glyserolia, ja täydellinen proteaasi-inhibiittorit), ja hajotettiin jäädytys-sulatus. Yhtä suuret määrät proteiineja [26] määritettiin SphK aktiivisuus, käyttäen koeolosuhteissa tiedetään valikoivasti suosia SphK1 tai SphK2 toimintaa [27, 28]. Seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 15-30 min. Reaktio lopetettiin lisäämällä kloroformi /metanoli (2: 1, til.), Jonka jälkeen kaksinkertainen eristämistä, ensin alkali- ja sitten happamissa olosuhteissa. S1P viimeisessä orgaaninen faasi erotettiin HPTLC, ja kvantifioidaan digitaalisen autoradiografialla. Tausta-arvot määritettiin negatiivisina kontrolleina, jossa ATP ei lisätty reaktioseokseen.

Western blotting

Solut hajotettiin (20 min 4 ° C: ssa) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl), joka sisälsi 1% Nonidet P-40, 10 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4, 10 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM PMSF, ja proteaasi-inhibiittorit. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantit analysoitiin proteiinit [26], ja yhtä suuri määrä proteiineja (15-30 ug) jätettiin SDS-PAGE: lla 10% polyakryyliamidigeelillä. Siirron jälkeen nitroselluloosakalvoille, näytteitä inkuboitiin (yön yli, 4 ° C) seuraavilla vasta-aineilla: anti-SphK1 ja anti-SphK2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-fosfo-Akt, anti-kaspaasi-3-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), ja sitten anti-HRP-konjugoitu vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Anti-β-aktiini (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) ja anti-GAPDH-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käytettiin latauskontrollina. Immunoreaktiivisia signaaleja visualisoitiin SuperSignal West Femto (Thermo Scientific (Rockford, IL), ja altistuminen Kodak Biomax elokuva (Rochester, NY). Immunoreaktiivisen bändi tiheys määritettiin densitometrillä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; Määrä Yksi ohjelmisto ).

tilastollinen

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen kahtena. tiedot analysoitiin käyttäen StatMate ohjelmistoa, versio 4.0 (GraphPad). tilastollinen analyysi suoritettiin Studentin

t

-testissä. erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

p

0,05.

tulokset

Luteolin indusoi apoptoosia CC soluissa

ensin arvioitiin vaikutusta luteoliini- DES ja CC solujen elinkykyä. Kuten kuviossa 1A, jopa 100 uM luteolin ei kohdista selvää myrkkyvaikutuksia DES ja jopa korkein pitoisuus (200 uM), vaatimaton mahdollisesti sytotoksista vaikutusta ei havaittu. jos päinvastoin, samalla keskittymisen alueella, luteoliinia indusoi annoksesta riippuvan laskun CC solujen elinkelpoisuuden (kuvio 1A). Tällä luteolin suurempina pitoisuuksina 20 uM, muutoksia CC solujen morfologia ominaisuus apoptoottisten solujen, mukaan lukien kutistuminen ja laaja irtoaminen viljelmän kasvualusta, havaittiin (ei esitetty). 24 tunnin kuluttua hoidon sytotoksisten annoksilla luteolin, fluoresenssi mikroskooppisen analyyseja, Hoechst 33342 paljasti, että CC solut esitetään apoptoottisen morfologisia muutoksia, joissa tiivistyminen ja pirstoutumisen ytimet, ja näytteillä brilliant blue fluoresenssi (kuvio 1 B, oikealla). Sitä vastoin samoissa olosuhteissa Des havaittiin normaali ulkonäkö, ja fluoresoiva väriaine värjätään morfologisesti normaali ytimet, joissa hämärästi sininen fluoresenssi (kuvio 1 B, vasen). Lisäksi, immunovärjäystä kaspaasi-3 kävi ilmi, että luteoliini indusoi pro-kaspaasi-3-aktivaation CC-soluissa, mutta ei Des (kuvio 1C).

(A) CC-soluja (CC) ja DE on käsiteltiin eri pitoisuutta luteolin, ja sen jälkeen 48 h solujen elinkelpoisuuden määritettiin MTT. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta; *, P 0,05 ja **, p 0,01 vs. kontrolli. (B) edustaja mikroskooppiset kuvat DES sertiä Hoechstilla 33342 hoidon jälkeen 100gM luteolin 36 tuntia. (C) Western blot-analyysi Pro-kaspaasi-3 ja aktiivinen kaspaasi-3 solunsisäisiä tasoja DES sertit käsitelty tai ei ole 100 uM luteolin 36 tuntia.

kertyminen keramidin on mukana luteoliini indusoimaan apoptoosin

käyttää koeolosuhteissa, pohjapinta taso seramidiksi oli merkitsevästi pienempi CC soluja kuin Des (2,45 ± 0,38 ja 4,73 ± 0,59 nmol /mg proteiinia, vastaavasti). 24 tunnin kuluttua hoidon sytotoksisten annoksilla luteolin, huomasimme, että Keramidin taso CC solujen merkittävästi (yli 3-kertaisesti) luteolin klo myrkyllinen, mutta ei osa-toksisilla annoksilla (kuvio 2A). Luteolin aiheuttama keramidi kasvu oli mitattavissa CC soluissa ennen selvää morfologisia ja ydinvoiman muutoksia. Samassa olosuhteissa luteolin hoitoa, ei muuttunut merkittävästi seramidi sisällön havaittiin Des (kuvio 2A). Nämä tulokset sai meidät tutkimaan mekanismeista luteolin aiheuttama seramidi kasvua keskittyen CC soluissa.

(A) DES CC soluja käsiteltiin luteolin, ja sen jälkeen 24 h, solu seramidi määrällisesti. (B) ja (C) CC-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla C2-Cer (B, neliö), C6-Cer (B, kolmio) tai D609 (C), ja sen jälkeen 48 h solujen elinkykyisyys arvioitiin MTT. Kaikki tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. *, P 0,05; **, P 0,01 kontrolliryhmään verrattuna.

altistuminen CC solut kasvavat annokset solun läpäisevä C2 ja C6-Cer johti annoksesta riippuvainen sytotoksinen vaikutus (kuvio 2B). Teho Näiden seramidianalogit aiheuttaa CC solukuolemaa kääntäen verrannollinen niiden pituus niiden asyyliketju, kuten odotettua perusteella niiden solun läpäisevyyttä. Lisäksi solujen käsittely D609, estäjä Sfingomyeliinin syntaasin [29], aiheutti solumyrkkyvaikutuksessa liian (kuvio 2C). D609 hoito (0,5 mM 24 h), indusoi merkittävää kasvua (1,94-kertainen, p 0,01) seramiditasot (2,45 ± 0,38-4,76 ± 0,59), mikä osoittaa, että tämä hoito oli tehokas ylentävä solunsisäisen keramidi-. CC-soluja käsiteltiin seramideja tai D609 osoitti kromatiinin kondensaatio ja kaspaasi-3-aktivaation (ei esitetty), mikä osoittaa indusoidun solun seramidi pystyy jäljittelemään luteolin apoptoosin.

Luteolin estää keramidin aineenvaihduntaa monimutkaisia ​​sfingolipidit

tutkimiseksi mekanismia taustalla keramidin kertymistä aiheuttama luteolin, me sitten suoritetaan pulssi kokeiluja merkitty sfingosiini. Huomasimme, että

3H-Sph oli nopeasti osaksi CC soluihin, riippumatta luteolin hoitoa. Todellakin, yhteensä radioaktiivisuus oli 373 ± 20 ja 385 ± 25 nCi /astia ohjaus ja luteoliini käsiteltyjen CC soluissa, vastaavasti. Molemmissa tapauksissa, kun yksi tunti pulssin taso solunsisäisen

3H-Sph oli vähemmän kuin 5% koko radioaktiivisuus (ei esitetty), mikä osoittaa tehokkaan sfingosiini aineenvaihduntaa tapahtui CC-soluissa, ja ei vaikuttanut luteoliinia. Suurin osa sisällytetty radioaktiivisuus liittynyt N-asyloituja sfingosiini johdannaisia, lähinnä edustaa seramidiksi ja sfingomyeliini, sekä huomattavasti alhaisempia määriä, glykosfingolipidien. Luteolin hoito lisäsi merkittävästi radioaktiivisuuden määrä sisällyttää N-asyloidut aineenvaihduntatuotteiden (213,7 ± 17,3 ja 282,4 ± 24,9 nCi /astia, valvonta- ja luteoliini käsiteltyjä soluja), ja muutti jakautuminen eri sfingosiini aineenvaihduntatuotteita. Todellakin, luteoliini-käsitellyissä soluissa, radioaktiivisesti seramidi havaittiin yli 2 kertaa korkeampi kuin kontrolli-soluissa (kuvio 3A, ylempi paneeli), ja rinnastettiin merkittävä väheneminen monimutkaisia ​​sfingolipidit, mukaan lukien sekä sfingomyeliiniä ja glykosfingolipidit (kuvio 3A , yläpaneeli). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin pulssin kokeet leimatuilla seriinillä, käytetään esiasteena de novo sfingolipidi synteesiä (kuvio 3A, alempi paneeli). Kokonaisuutena nämä vaihtelut johtivat merkittävään kasvuun Keramidin /kompleksin sfingolipidikeramidi suhde luteolin käsiteltyjä soluja verrattuna ohjata niitä (yli 10- ja 7-kertaiseksi, kun

3H-Sph ja

3H-seriini pulssi, vastaavasti, p 0,001).

(A) CC soluja pulssitettiin 25 nM

3H-Sph (ylempi paneeli) tai 200 nM

3H-seriini (alempi paneeli) in puuttuessa (valkoinen palkki) tai läsnä ollessa (harmaa palkki) 100 uM luteolin 2 tuntia. Lopussa sisältö solun radioaktiivisesti keramidia (Cer), sfingomyeliini (SM) ja glykosfingolipidit (GSLs) mitattiin. **, P 0,01. (B) CC-soluja inkuboitiin ilman (CT) tai läsnä luteolin (LU), sitten BODIPY-C

5-Cer ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla (bar, 10 pm). (C) CC-soluja inkuboitiin ilman (a) tai (b) BFA (1 ug /ml) 30 minuutin ajan, ja sitten pulssitettiin

3H-Sph tai

3H-seriinin luteolin (100 uM) 2 h. Keramidin /kompleksi sfingolipidikeramidi suhde on raportoitu. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. Kahden itsenäisen kokeen. **, P 0.01.

Kun 2 tunnin pulssi L-

3H-seriini, ohjaus ja luteoliini käsiteltyjen solujen sisällytetty samankaltaisia ​​määriä radioaktiivisuutta yhteensä sfingolipidit (22,3 ± 2,7 ja 24,9 ± 3,0 nCi /malja). Kun käytetään koeolosuhteissa,

3H-seramidi edustivat suurinta merkitty sfingolipidi, ja sen todettiin merkittävästi lisääntynyt luteoliini-käsitellyissä soluissa (kuvio 3A, alempi paneeli). Kuten on

3H-Sph pulssi, seramidi korkeus oli mukana merkittävä väheneminen sekä sfingomyeliiniä ja glykosfingolipidit (kuvio 3A, alempi paneeli).

Luteolin heikentää ER-Golgin liikenne seramiditasot

pohjat edellä olevien tulosten oli kiinnostavaa tutkia, onko lasku seramiditasot aineenvaihdunnan monimutkaisiin sfingolipidit johtuu muutoksista sen kuljetuksen ER: sta Golgin laitteeseen. Tätä varten tutkimme ensin vaikutus luteoliinia on solunsisäistä kuljetusta BODIPY-C

5-Cer, fluoresoiva seramidin analoginen pystyy jäljittelemään ER-Golgin liikenteen luonnon keramidin elävissä soluissa [30]. Merkittyäsi ohjaus solujen BODIPY-C

5-Cer, erittäin loisteputki solunsisäinen rakkuloiden kertynyt kompakti perinuclear rakenteiden edustaja Golgin laitteeseen (kuvio 3B, vasemmalla), joka osoittaa normaalia poistumista seramidi päässä ER. Sitä vastoin luteolin käsiteltyjä soluja fluoresenssi leviää solujen kanssa diffuusi reticular kuvio, ja mukana on väheneminen perinuclear fluoresenssin näkyi (kuvio 3B, oikealla). Nämä vaihtelut, sekä tulokset pulssin tutkimuksen, ovat sopusoinnussa hypoteesin, että sytotoksiset annokset luteolin heikentää Keramidin kuljetuksen ER Golgin. Edelleen Väitteensä, tutkimme vaikutus BFA, joka häiritsee Golgin indusoimalla sen fuusio ER [31], on luteolin heikentävä seramiditasot aineenvaihduntaa. Huomasimme, että talousarvioennustevaroituksen vähensi luteolin aiheuttamaa keramidi kertymistä, ja tämä rinnastettiin korkeus sekä sfingomyeliiniä ja glukosyyliseramidi. Näin ollen, kun läsnä on BFA, The luteoliini-indusoidun kohoamisen Keramidin /kompleksin sfingolipidit suhde oli huomattavasti pienempi (kuvio 3C).

Akt on mukana luteoliini heikentävä keramidin liikenteen

Koska aktivoinnin seriini-treoniinikinaasi Akt (proteiinikinaasi B) on ratkaisevasti osallisena selviytymisen signaloinnin eri solutyypeissä [32], tutkimme seuraavaksi, onko Akt on mukana luteoliinia myrkyllisyys. Olemme havainneet, että luteoliini hoito aiheutti annoksesta riippuvaa vähentäminen fosforyloidun Akt: CC-soluissa (kuvio 4A). Lisäksi LY294002, spesifinen inhibiittori PI3K /Akt, pystyi matkimaan luteolin vaikutuksia seramidin aineenvaihduntaan, lisäämällä keramidin ja vähentämällä kompleksin sfingolipidit (kuvio 4B).

(A) sertit käsiteltiin 50 ja 100 uM luteolin 2 tuntia ja annetaan immunoblottauksella anti-Pakt vasta-aineita. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) Soluja toimitettiin pulssi

3H-Sph puuttuessa (CT) tai läsnä LY294002 2 h. Tasot seramiditasot (Cer) Sfingomyeliini (SM) ja glykosfingolipidit (GSLs) ilmoitetaan keskiarvona ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen kokeen. **, P 0,01 vs. CT soluja.

Luteolin epätasapainoon sfingolipidikeramidi säätövastuksen estämällä SphK2

analyysien 1-fosforylaation aineenvaihduntatuotteiden

3H-Sph (mukaan lukien

3H- S1P ja

3H-vesi, sen hajoamistuote) paljasti, että sekä S1P- ja vettä liittyvä radioaktiivisuus oli merkitsevästi pienempi luteolin (kuvio 5A ja 5B). Havainto, että luteolin aiheuttama lasku sekä S1P ja sen hajoamistuote sai meidät arvioimaan mahdollisia vaikutuksia solumyrkyllisyyspitoisuutta of luteolin on SphK ilmaisun ja toimintaa. Western blotit eivät paljastaneet merkittäviä eroja ilmaisua sekä SphK1 ja SphK2 proteiineja (kuvio 5C). Kiinnostaa, huomasimme, että 50-100 uM luteolin estivät merkittävästi SphK2 aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla, mutta oli tehoton SphK1 (kuvio 5D).

(A) ja (B) CC soluja pulssitettiin

3H-Sph 2 h puuttuessa (valkoinen pylväs) tai läsnä oli 100 uM luteolin (harmaa palkki). Lopussa, leimattu S1P (A) ja vettä (B) arvioitiin solujen ja väliaineen, vastaavasti. (C) CC-soluja käsiteltiin 50-100 uM luteolin 2 tuntia, ja yhtä suuret määrät proteiineja analysoitiin sitten SphK1 ja SphK2 proteiinien immunoblottauksella. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (D) SphK1 ja SphK2 toimintaa testattiin puuttuessa tai läsnä luteoliini, käyttäen CC soluhomogenaatti entsyymin lähteenä. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. kolmesta kokeesta kahtena kappaleena. **, P 0,01 vs. kontrolli.

luteolin inhiboivan vaikutuksen molempien seramidiksi anaboliaa ja SphK2 toimintaa johti merkittävään kasvuun Keramidin /S1 P-suhde (yli 6-kertainen, p 0,01), joka on relevantti epätasapainoa sfingolipidikeramidi säätövastuksen.

S1P vähentäminen on toiminnallinen luteolin myrkyllisyys

luteolin aiheuttama väheneminen solunsisäisen S1P johti meidät arvioimaan, S1P hallinto vaikuttaa luteolin sytotoksisuutta. Ensin todettiin, että S1P hoito lisäsi merkittävästi Akt: n fosforylaation CC soluissa (kuvio 6A, ylös). Lisäksi samanaikainen antaminen S1P ja luteoliini johti merkittävään kasvuun elävien solujen (kuvio 6A, alas), ja vähensi luteolin eston Akt-fosforylaation (kuvio 6B).

(A) Ylähavas: CC-soluja käsiteltiin 0,5-1 uM S1P 2 tuntia. Yhtä suuret määrät solu-proteiinit analysoitiin sitten fosforyloidun Akt (Pakt) immunoblottauksella. Alempi paneeli: CC-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla S1P: n läsnä ollessa 50 uM luteoliinia, ja sen jälkeen 48 h solujen elinkelpoisuuden analysoitiin MTT-määrityksellä. (B) P-Akt /β-aktiini-suhde (keskiarvo ± S.D) ennen hoitoa ja sen jälkeen CC-solujen kanssa 1 uM S1P ja /tai 50 uM luteolin 2 tuntia. *, P 0,05 ja **, p 0,01 vs. käsittelemättömät solut; #, P 0,05 vs. luteolin käsiteltyjä soluja. Edustava Western blot raportoidaan alaosassa. (C) CC-soluja inkuboitiin luteolin yksinään (Lu), tai kun läsnä on 1 uM S1P ja /tai 1 uM SEW2871; 5 uM W123; tai 100 ng /ml PTX. (D) CC soluja inkuboitiin luteolin puuttuessa tai läsnä on 1 uM caged S1P ilman tai 100 ng /ml PTX 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin ilman (tummanharmaa) tai (vaaleanharmaa) UV-säteilyllä 30 s. In (C) ja (D), solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä, ja elinkelpoisuus luteoliini-käsiteltyjä soluja pidettiin 100%. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. ainakin kahden itsenäisen kokeen. **, P 0.01.

Voit selvittää S1P kiinnostavuus suojaavia vaikutuksia luteolin aiheuttama kuolema mekanismin kautta, joka sisältää S1PRs kaksi farmakologinen estäjiä, joilla on erilaiset vaikutusmekanismit hyödynnettiin. Koska sitoutuminen S1P on S1P1 reseptorin on osoitettu olevan osallisena paksusuolen tulehdus aiheuttama syöpä [33], ensin arvioida mahdollista roolia S1P1 reseptorin S1P vaikutus CC soluihin. Erityinen S1P1 agonisti SEW2871 voinut matkia S1P suojaava-vaikutus luteolin myrkyllisyys (kuvio 6C), ja S1P antagonisti W123 eteen merkittävää vaikutusta S1P välittämän eloonjäämistä CC-soluissa (kuvio 6C, kaistat 3 ja 4, tässä järjestyksessä). Sen kysymyksen siitä S1P indusoi pro-eloonjääminen vaikutukset olivat riippuvaisia ​​sen erityisen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien, me testattiin solujen eloonjäänti läsnäollessa PTX, koska kaikki tunnetut S1P-reseptorit ovat, ainakin osittain, yhdistettynä Gi /o-proteiinia [34]. Kuten on esitetty kuviossa 6C, PTX pystynyt vaikuttamaan stimuloivaa vaikutusta S1P solun eloonjäämistä, mikä viittaa siihen, että PTX-herkän G-proteiinit eivät ole mukana signalointireittien S1P parantamiseksi solun eloonjäämisen. Lopuksi tutkia kykyä S1P toimia solunsisäisiä välittäjänä, me ladattu CC solut fotolysoitava (häkissä) johdannainen S1P. Kuten on esitetty kuviossa 6D, kun fotolyysi, häkissä S1P osoitti merkitysarvo, suojaava vaikutus luteoliini-solukuolema, ja tämä vaikutus säilyi unmodified.in läsnä PTX.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme alun perin ilmoittamaan, että luteoliinia näyttää annoksesta riippuvainen apoptoottinen vaikutus CC-solujen välillä 50-200 uM, tunnettu fysiologinen pitoisuus ravinnon polyfenolit maha-suolikanavan [35]. Merkitystä, samalla Pitoisuusalueen flavoni- ei todettu myrkyllisyyttä lääkeainestenttejä, käytettiin mallina normaalien suolen epiteelisolujen. Näin käy ilmi, että luteolin sytotoksista aktiivisuutta ihmisen CC soluja, joilla on vähän tai ei lainkaan vaikutusta normaaleihin soluihin, mikä viittaa siihen, se voisi edustaa ihanteellinen ehdokas uusien terapeuttisten.

Tutkimuksessa paljastui myös ensimmäistä kertaa, että lisääntynyt pitoisuus solun seramidi on ruorissa eri herkkyyden DES CC solujen luteolin myrkyllisyys. Alussa havaittu, että käytetty viljelyolosuhteet, CC solut osoittivat suunnilleen puolet seramiditasot verrattuna DES. Kiinnostaa, samanlainen lasku solun sisällön seramidi löydetty ihmisen paksusuolen syövän verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvo (15), mikä viittaa siihen, että CC-solut ovat erityisen herkkiä korkeus keramidin. Lisäksi olemme havainneet, että luteolin hoito tehostetun keramidiin tasolla CC soluissa, mutta ei Des.