Krooninen sairaus

tiivistelmä

β, β-Dimethylacrylshikonin, yksi aktiivisten komponenttien juureen otteita Lithospermum erythrorhizon, omaavansa antituumorivaikutus. Tässä tutkimuksessa olemme keskustelleet molekyylimekanismeihin β, β-dimethylacrylshikonin että apoptoosin SGC-7901-soluissa. β, β-Dimethylacrylshikonin vähensi solujen elinkelpoisuuden SGC-7901-solujen annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla ja indusoi apoptoosia. β, β-Dimethylacrylshikonin hoidon SGC-7901-solujen alassäädetty ilmaisua XIAP, CIAP-2, ja Bcl-2 ja sääteli ilmaus Bak ja Bax ja aiheutti mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapauttamaan sytokromi c: . Lisäksi, β, β-dimethylacrylshikonin hoito johti kaspaasien aktivaatio-9, 8 ja 3, ja lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), joka poisti esikäsittely yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK . β, β-Dimethylacrylshikonin aiheuttama fosforylaation ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (ERK) in SGC-7901-soluissa. U0126, tietyn MEK-inhibiittori, esti ERK aktivointi β, β-dimethylacrylshikonin ja kumottu β, β-dimethylacrylshikonin-indusoitua apoptoosia. Tuloksemme osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin esti kasvun mahasyövän SGC-7901-solujen aiheuttamalla ERK signalointireitin ja tarjosi vihjeen prekliininen ja kliininen arviointi β, β-dimethylacrylshikonin mahasyövän hoidossa.

Citation: Shen XJ, Wang HB, Ma XQ, Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin indusoi Mitochondria riippuvaista apoptoosia kautta ERK Pathway in Human mahasyövän SGC-7901 solut. PLoS ONE 7 (7): e41773. doi: 10,1371 /journal.pone.0041773

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 27 heinäkuu 2012

Copyright: © Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China X-QM (LY12H28005), ja tiedesäätiö Zhejiangin Kiinan Medical University H-BW (2011ZY05). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on yksi aggressiivinen pahanlaatuisia kasvaimia, vaikka kehittämiseen sädehoidon, kemoterapian ja biotherapy, vakavat sivuvaikutukset ovat väistämättömiä [1], siis tehokkaampia syöpälääkkeiden joilla on vähemmän sivuvaikutuksia hoitoon mahasyövän tarvitaan.

Lithospermum erythrorhizon on tärkeä kiinalainen yrtti. Se on joitakin aktiivisia komponentteja: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (Fig. 1A) ja shikonin [2]. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen, sillä on useita biologisia toimintoja, kuten antimikrobisia, tulehdusta, anti-kasvain, immuuni asetus ja HIV-ominaisuudet [3] – [6]. Anti-kasvain vaikutus shikonin ja sen johdannaiset ensin todistaa toimintaansa vastaan ​​kasvaimen kasvua hiiren sarkooma-180 [7]. Shikonin esittelee vaikutus ei ole pelkästään tappamalla kasvainsolut suoraan, vaan myös estämällä kasvaimen angiogeneesiä [8]. Tutkimukset paljastivat, että shikonin indusoi apoptoosia ihmisen pahanlaatuinen melanooma, virtsarakon syöpä, kohdunkaulan syöpä, keuhkosyöpä ja maksasyöpä, ja niin edelleen [9] – [13]. Kuitenkin se on vähemmän sivuvaikutuksia, ja suojaavia vaikutuksia ihmisen normaaleissa soluissa [14], [15]. Hsu PC et ai osoittivat shikonin johti apoptoosin kautta ylössäätöä p27, p53, Bax ja alas-säätely Bcl-2 ja Bcl-x L ihmisen kolorektaalikarsinoomasta COLO 205 soluja [16]. Kasvain invaasio estyy shikonin joissakin syöpäsoluissa voi kautta alas-säätely NF-KB: n välittämää MMP-9 ilmaisun [17]. Shikonin myös indusoi apoptoosin kautta ROS tuotanto maksasolukarsinoomassa [12]. Singh F et al havaitsivat myös, että shikonin laski fosforyloitua tasot EGFR, ERK ja proteiinityrosiinikinaaseja ja lisääntynyt solunsisäisiä tasoja apoptoosiin liittyviä proteiineja, mikä aiheutti epidermoidikarsinooma solujen apoptoosin [18].

(A) kemiallinen rakenne β, β-dimethylacrylshikonin (MW. 370,4). (B) Effects of β, β-dimethylacrylshikonin solujen elinkelpoisuuden esto SGC-7901-soluja. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla β, β-dimethylacrylshikonin 24 h ja 48 h. Tähän liittyvä solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä. Elinkelpoisuus kontrolliryhmässä (0,1% DMSO) asetettiin 100%. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Osoitti p 0,05 verrattuna kontrolliin ryhmään vastaavasti.

Viimeaikaiset todisteet osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin ollut merkittäviä anti-kasvain vaikutus maksasyövän aktivoimalla kaspaasi-3 [19]. Tällainen vaikutus β, β-dimethylacrylshikonin ihmisen mahasyövän soluja ei ole raportoitu, ja molekyylitason mekanismeja ei ole vielä täysin ymmärretty. Niinpä tässä tutkimuksessa, Keskustelemme vaikutus β, β-dimethylacrylshikonin ihmisen mahalaukun syöpäsolu SGC-7901 ja siihen liittyvä signalointi paremmin ymmärtää mekanismia β, β-dimethylacrylshikonin on mahasyövän.

materiaalit ja menetelmät

materiaalit ja reagenssit

SGC-7901-solut hankittiin Kiinan tiedeakatemia Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, Kiina). β, β-Dimethylacrylshikonin hankittiin Tokio Chemical Industry (Tokio, Japani). MTT: n ja DAPI hankittiin Calbiochem (San Diego, CA, USA). U0126 ostettiin Cell Signaling (Boston, MA, USA). Pan-kaspaasiestäjä (Z-VAD-FMK) ostettiin Beyotime Biotekniikan instituutti (Shanghai, Kiina). Vasta-aine sytokromi c ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineita ERK, fosfo-ERK: n, Bcl-2, Bcl-xl, XIAP, CIAP-2, survivn, Bax, Bak, pilkottiin kaspaasi-9, pilkottiin kaspaasi-3, pilkotaan PARP ja β-aktiini ostettiin Cell Signaling ( Boston, MA, USA). FITC-anneksiini V: Apoptosis Detection Kit hankittiin Becton Dickinson (San Diego, CA, USA).

Soluviljely ja solujen lisääntymisen määrityksessä

SGC-7901-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jossa 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, UT), ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Sitten solut ympättiin 96-kuoppaisella alustalla lopulliseen pitoisuuteen 5 x 10

3 solua /kuoppa ja inkuboitiin RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 10% FCS: ää 24 tuntia, jonka jälkeen solut käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden β, β-dimethylacrylshikonin 24 h ja 48 h. Väliaine poistettiin ja tuoretta väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan yhdessä 20 pl MTT-liuosta (5 mg /ml). 4 tunnin kuluttua inkuboinnin 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyt luettiin aallonpituudella 570 nm käyttäen Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific, USA). Neljä kahdentaa kaivoja käytettiin kussakin käsittelyssä, ja kokeet toistettiin kolme kertaa.

Morfologiset muutokset

SGC-7901-solut sijoitettiin hyvin ja kuuden kuoppalevylle. 24 tunnin kuluttua soluviljelyn, niitä käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin varten osoitetun ajanjaksoja. Solu morfologia havaittiin käyttämällä käänteisen mikroskopia (malli IX70, Olympus, Tokio, Japani).

DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) värjäys

SGC-7901-soluissa sijoitettiin hyvin ja kuuden kuoppalevylle. 24 tunnin kuluttua soluviljelyn, niitä käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin varten osoitetun ajanjaksojen jälkeen solut kiinnitettiin kylmässä asetonissa 30 minuutin ajan, ja inkuboitiin DAPI (1 mg /ml) 30 minuutin ajan. Apoptoottiset ytimien luonnehtia intensiivisesti värjätään todettiin käyttäen fluoresenssimikroskopian (malli IX71, Olympus, Tokio, Japani).

anneksiini V /PI määritykset apoptoosin

anneksiini V /PI määritykset, solut värjättiin anneksiiniV-FITC ja PI, ja arvioidaan apoptoosin virtaussytometrialla mukaan mannufacturer protokollan (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Lyhyesti, 1 x 10

5 solut pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin 5 ui anneksiiniV-FITC ja 5 ui PI 500 ul sitomispuskurissa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Apoptoottisten solujen määritettiin käyttämällä BD FACS Diva ohjelmisto (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Anneksiini V: värjäys toimii mittana fosfatidyyliseriinin ulkoistamista ja solut, jotka ovat anneksiini V:

+ /PI

– edustavat alussa apoptoottisia soluja.

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia

Cells ( 5 x 10

5 solua /ml) käsiteltiin kanssa tai ilman β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) 24 tuntia ja värjättiin JC-1 (BD MitoScreen JC-1 Kit, Becton Dickinson, USA) 15 min 37 ° C: ssa. Mitokondrioiden kalvojännite havaittiin virtaussytometrialla (FACSCanto II, Becton Dickinson, USA).

Western Bloting analyysi

Soluja käsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden β, β-dimethylacrylshikonin varten ilmoitettuina ajankohtina RPMI 1640-väliaineessa, jossa oli 10% FCS: ää. Solut kerättiin jääkylmään PBS: ään, ja solu-uutteet valmistettiin RIPA-puskurissa proteinaasi inhibiittoricocktailia Calbiochem (San Diego, CA). Proteiinipitoisuudet solulysaateista määritettiin ja keitetään geeli-latauspuskuria 10 minuuttia 100 ° C: ssa. Näytteet, jotka sisälsivät 30 ug kokonaisproteiinia ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore, Temecula, CA). Siirron jälkeen kalvo blokattiin TBST (TBS, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä), joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa 2 h, mitä seurasi inkubointi yön yli 4 ° C: ssa sopivan primaarisen vasta-aineita. Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa TBST: ssä, kalvoja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa 1:5000 piparjuuriperoksidaasikonjugoitua sopivan sekundäärisen vasta-aineita. Lopuksi kalvot visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (Immun-Star WesternC Kit, Bio-Rad, USA).

immunofluoresenssi

Immunofluorescene värjäystä käytettiin analysoimaan solunsisäisen jakautumisen sytokromi c: in SGC-7901-soluissa indusoiman β, β-dimethylacrylshikonin. Soluja viljeltiin steriilin lasi coverlips kiinnitettiin kylmässä asetonissa 10 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun oli kyllästetty 0,3% Triton X-100: ssa 20 min ajan huoneenlämpötilassa, solut estettiin 3% naudan seerumin albumiinia 30 minuuttia ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-sytokromi-c-vasta-aineella (1:30). Sen jälkeen kun oli pesty kolme kertaa PBS: ssä, SGC-7901-solut leimattiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. DAPI myöhemmin lisätty tumavärjäystä. Mikroskooppinen analyysi suoritettiin käyttäen fluoresenssimikroskopialla (malli IX71, Olympus, Tokio, Japani).

Tilastollinen

Data raportoitu ovat keskiarvo ± keskihajonta (SD) on kolmen erillisen kokeen. Ne arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Merkittäviä eroja oli vahvistettu p 0,05.

Tulokset

β, β-Dimethylacrylshikonin estää elinkelpoisuus SGC-7901-solujen

Sen määrittämiseksi sytotoksista vaikutusta β, β-dimethylacrylshikonin mahalaukun syövän soluissa. SGC-7901-soluja käsiteltiin 2,5, 5, 7,5, 10 umol /l β, β-dimethylacrylshikonin 24 h ja 48 h, alennettua Solujen elinkelpoisuus käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin oli 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82%, ja 61,76 ± 0,18%: lla 24 tunnin verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (kuvio. 1 B). Sillä 48 h hoidon solujen elinkelpoisuus oli 52.03 ± 9,45%, 38,99 ± 1,43%, 30.70 ± 1,58%, ja 27,4 ± 0,31% (Fig. 1 B). Puoli maksimaalinen inhiboiva konsentraatio (IC

50) β, β-dimethylacrylshikonin varten SGC-7901-soluissa oli 11,04 uM ja 2,89 uM 24 tunnin ja 48 tunnin vastaavasti.

β, β-Dimethylacrylshikonin indusoi SGC -7901 solujen apoptoosin

SGC-7901-soluja käsiteltiin ensin β, β-dimethylacrylshikonin, tulokset osoittivat, solut tehtiin merkitty morfologisia muutoksia käsittelemällä 10 umol /l β, β-dimethylacrylshikonin verrattuna käsittelemättömään kontrolliin varten 24 h. Läsnäollessa β, β-dimethylacrylshikonin, SGC-7901 solujen määrä pienenee ja solujen tuli pyöreä ylös ja pieni muodoltaan, ja irtoavat levystä verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (Fig. 2A). β, β-dimethylacrylshikonin indusoi myös ydin- tiivistyminen intensiivinen DAPI-värjäyksellä verrattuna ydin- valvonnan SGC-7901-solujen 24 h (Fig. 2B).

(A) Cell morfologia havaittiin käyttämällä käänteismikroskoopilla 200-kertainen suurennus. (B) DNA tiivistyminen (valkoinen nuoli) mitattiin DAPI tahra ja analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla 200 x suurennus. (C) apoptoottiset tila arvioitiin anneksiini V-FITC sitoutumisen määrityksessä. Oikeassa alareunassa (anneksiini V-FITC

+ /PI

-) katsottiin alkuvaiheessa apoptoottisten solujen ja oikeassa yläkulmassa osa (anneksiini V-FITC

+ /PI

+) katsottiin koska myöhäisessä vaiheessa apoptoottisia soluja. Näytön vasemmassa alakulmassa (anneksiini V-FITC

– /PI

-) katsottiin eläviä soluja ja vasempaan ylänurkkaan (anneksiini V-FITC

– /PI

+) pidettiin nekroottisena soluja.

Sen määrittämiseksi, onko cytotoxity ja β, β-dimethylacrylshikonin mukana apoptoosin, arvioimme apoptoottisen vaikutuksen β, β-dimethylacrylshikonin in SGC-7901-solujen virtaussytometrialla anneksiini V: n ja propidiumjodidin ( PI) värjäys. Prosenttiosuus alussa apoptoottisten solujen (anneksiini V

+ /PI

-) oli 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3%, ja 24,4% vasteena ajoneuvon, 2,5, 5, 7,5, ja 10 umol /l β, β-dimethylacrylshikonin vastaavasti 24 h (Fig. 2C). Mielenkiintoista, Myöhään apoptoottiset solut (anneksiini V

+ /PI

+) lisättiin merkittävästi SGC-7901-solujen (29,7% 7,5 mikromol /l ja 33,6% 10 mikromol /l β, β-dimethylacrylshikonin hoito ) (Fig. 2C).

β, β-dimethylacrylshikonin indusoi mitokondrioiden liittyvät tapahtumat apoptoosin SGC-7901-solujen

Bcl-2-perheen proteiinit ovat pro-apoptoottisia proteiineja (Bax, Bak ja bid) ja anti-apoptoottiset proteiinit (Bcl-2, Bcl-x L, CIAP-2, XIAP ja surviviini). Ne voivat aktivoida tai inhiboida loppupään tekijöitä, jotka johtavat kaspaasi-3 ja PARP suorittaessaan apoptoosin [20]. Jotta voidaan havaita apoptoosin liittyvät proteiinit, pro-apoptoottiset proteiinit (Bax, Bak) ja anti-apoptoottiset proteiinit (XIAP, CIAP-2, Bcl-2, Bcl-x L, surviviini) havaittiin Western-blottauksella jälkeen SGC-7901 -soluja käsiteltiin eri pitoisuus β, β-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5 ja 10 umol /l) 24 tuntia. Tulokset osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin vähentää ilmentymistä XIAP, CIAP-2, Bcl-2 (Fig. 3A). Kuitenkin alas-säätely XIAP ja Bcl-2 oli vähäisempi, kun säätely alaspäin CIAP-2 oli varsin dramaattinen ja annoksesta riippuvaa. Ei ollut merkittävää muutosta Bcl-xL: n ja survivn in SGC-7901-soluja. Onko β, β-dimethylacrylshikonin voi ilmentymisen moduloimiseksi pro-apoptoottisten proteiinien (Bax, Bak) tutkittiin myös. Olemme havainneet, että β, β-dimethylacrylshikonin lisääntynyt ekspressio Bak annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta oli vähän vaikutusta Bax (Fig. 3B).

Western blotting-analyysi anti-apoptoottiset proteiinit: Bcl-2, Bcl-x L, CIAP-2, XIAP ja surviviini (A), ja pro-apoptoottisten proteiinien: Bax, Bak (B), ja pilkotaan PARP, pilkottiin kaspaasi-9, pilkottiin kaspaasi-8, pilkotaan kaspaasi-3 (C) kokosoluekstraktien jälkeen SGC-7901-soluja käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin 24 tuntia. Proteiini tasot aktiini mitattiin myös kontrolleina. (D) havaitseminen mitokondrion kalvon potentiaalia virtaussytometrialla. SGC-7901-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) 24 tuntia ja värjättiin JC-1 15 min ajan 37 ° C: ssa ja alistettiin virtaussytometria. (E) SGC-7901 solut kiinnitettiin ja leimattiin sytokromi c (vihreä) ja DNA (sininen). (F) SGC-7901-soluja käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin läsnä ollessa tai poissa ollessa Z-VAD-FMK (10 umol /l) 24 tuntia. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​katkaistun kaspaasi-3, pilkotaan PARP. Proteiini tasot aktiini mitattiin myös kontrolleina. (G) SGC-7901-soluja käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin läsnä ollessa tai poissa ollessa Z-VAD-FMK (10 umol /l) 24 tuntia. Apoptoottiset tila määritettiin anneksiini V-FITC sitoutumisen määrityksessä. Oikeassa alareunassa (anneksiini V-FITC

+ /PI

-) katsottiin alkuvaiheessa apoptoottisten solujen ja oikeassa yläkulmassa osa (anneksiini V-FITC

+ /PI

+) katsottiin koska myöhäisessä vaiheessa apoptoottisia soluja. Näytön vasemmassa alakulmassa (anneksiini V-FITC

– /PI

-) katsottiin eläviä soluja ja vasempaan ylänurkkaan (anneksiini V-FITC

– /PI

+) pidettiin nekroottisena soluja.

Caspase proteiinit ovat kriittisiä entsyymejä suorittamaan apoptoosin. Niistä kaspaasi perheenjäseniä, kaspaasi-3 on keskeinen teloittaja nisäkässolujen apoptoosin [21]. Se voidaan aktivoida kuoleman kautta reseptorivälitteisen ulkoisten kaspaasi-8-reitin ja mitokondriot riippuvan kaspaasi-9 sisäisen reaktiotien [22], [23]. Jotta edelleen ymmärtää molekyylimekanismi apoptoosin, SGC-7901-soluja käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin ja havaitaan Western blotting-analyysi ilmentymisen muutoksen kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9, tulokset osoittivat annoksesta riippuvainen kohoaminen katkaistun kaspaasi-3, pilkotaan kaspaasi-8 ja pilkottiin kaspaasi-9 β, β-dimethylacrylshikonin käsitellyt solut. PARP pilkkominen, toinen tunnettu ominaisuus apoptoosin, löydettiin myös β, β-dimethylacrylshikonin käsitellyt solut (Fig. 3C). Mitokondriovauriot aiheuttaman apoptoosin, joka on usein seurausta laskua mitokondrion kalvon potentiaalia. Sen on osoitettu olevan keskeinen apoptoottisen reitin. SGC-7901-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) 24 tuntia, tulokset osoittivat, mitokondriot kalvon potentiaali laski 98,6%: sta 56,9% sen jälkeen, kun β, β-dimethylacrylshikonin käsiteltiin sen SGC- 7901-solut (Fig. 3d). Tutkimme seuraavaksi jakeluun ja solunosasijaintia sytokromi c: löytää onko mitokondriot reitti on mukana β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttamaa apoptoosia. Jälkeen SGC-7901-soluja käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) 24 tuntia, jakelu sytokromi c: visualisoitiin konfokaalisella laser mikroskoopilla, se β, β-dimethylacrylshikonin käsitellyt solut osoittivat näön morfologia (kuvio. 3E) vastakohtana tietenkin selvää ulkonäkö kontrollisoluissa, mikä osoittaa translokaatiota sytokromi c: n päässä mitokondrioista sytoplasmaan β, β-dimethylacrylshikonin käsitellyt solut.

edelleen merkityksen määrittämiseksi kaspaasin aktivaation β, β-dimethylacrylshikonin- indusoitua apoptoosia, käsittelimme SGC-7901-solujen pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-FMK (10 umol /l) ennen β, β-dimethylacrylshikonin hoitoon. Pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-FMK esikäsittely laski ilmentymisen pilkottiin kaspaasi-3, pilkotaan PARP ja vähentää β, β-dimethylacrylshikonin indusoiman apoptoosin (Fig. 3F G). Nämä tulokset osoittivat, että mitokondrio-välitteisen kaspaasi Cascade polku on erittäin tärkeä rooli β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttama apoptoosin.

β, β-Dimethylacrylshikonin indusoi jatkuvan ERK-aktivaation SGC-7901-solujen

on osoitettu, että MAPK signalointi osallistuu useisiin tapahtumiin solujen jännitykset ja ärsykkeitä indusoi apoptoosin [24], [25]. Siksi tutkittiin aktivointi ERK, JNK: n ja p38 jälkeen β, β-dimethylacrylshikonin hoitoon. Kuten on esitetty kuviossa. 4A B, fosforylaatio tasot ERK ja JNK ilmeisesti lisääntyi vastauksena β, β-dimethylacrylshikonin hoito 2 h, ja fosforylaatio tasolla osoitti annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi fosfory- tasot ERK viime kaksikymmentäneljä tuntia. Ei kuitenkaan ole merkittäviä muutoksia fosforylaation tasoja p38 havaittiin sen jälkeen, kun β, β-dimethylacrylshikonin hoidon (Fig. 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että jatkuva aktivointi ERK on mukana β, β-dimethylacrylshikonin-indusoitua apoptoosia in SGC-7901-soluissa.

SGC-7901-soluja käsiteltiin osoitetulla β, β-dimethylacrylshikonin keskittyminen tai ilmoitettu välein, yhteensä solu-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys tason mittaamiseksi fosforyloidun muotojen ERK (A), JNK (B) ja p38 (C). Membraanit, joissa vasta-aineita yhteensä ERK, JNK: n ja p38 normalisointia.

ERK signalointireitin on mukana β, β-dimethylacrylshikonin indusoiman apoptoosin SGC-7901-solujen

jälkeen tutkittiin β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttama jatkuva aktivointi ERK signalointireitin tärkeä rooli apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 5A B, Western blot-määritys paljasti, että U0126 (tietty MEK: n estäjä) inhiboi jatkuvasti ERK aktivointi ja lohkaisu kaspaasi-3, PARP β, β-dimethylacrylshikonin hoitoa, kun taas pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-FMK ei ollut vaikutusta β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttama aktivointi ERK (Fig. 5D). Lisäksi, U0126 vähentää β, β-dimethylacrylshikonin-indusoitua apoptoosia in SGC-7901-soluissa (kuvio. 5C). Nämä tulokset osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin-indusoitua apoptoosia in SGC-7901-solut välittävät jatkuva aktivointi ERK signalointireitin.

(A) SGC-7901-soluja esikäsiteltiin tai esikäsitelty U0126 ( 10 umol /l) ja sitten lisättiin DMSO: ta (vehikkeli) tai β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l), 2 tuntia, 24 tuntia vastaavasti. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys tason mittaamiseksi fosforyloidun ERK. Proteiini veren kokonaiskolesterolia ERK myös mitata kontrolleina. (B) SGC-7901-soluja esikäsiteltiin tai esikäsitellyt U0126 (10 umol /l) ja sitten lisättiin DMSO: ta (vehikkeli) tai β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) 24 tuntia. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​katkaistun kaspaasi-3, pilkotaan PARP. Proteiini tasot aktiini mitattiin myös kontrolleina. (C) SGC-7901-soluja käsiteltiin β, β-dimethylacrylshikonin läsnä ollessa tai poissa ollessa U0126 (10 umol /l) 24 tuntia. Apoptoottiset tila määritettiin anneksiini V-FITC sitoutumisen määrityksessä. Oikeassa alareunassa (anneksiini V-FITC

+ /PI

-) katsottiin alkuvaiheessa apoptoottisten solujen ja oikeassa yläkulmassa osa (anneksiini V-FITC

+ /PI

+) katsottiin koska myöhäisessä vaiheessa apoptoottisia soluja. Näytön vasemmassa alakulmassa (anneksiini V-FITC

– /PI

-) katsottiin eläviä soluja ja vasempaan ylänurkkaan (anneksiini V-FITC

– /PI

+) pidettiin nekroottisena solut. (D) SGC-7901-soluja esikäsiteltiin kanssa tai ilman Z-VAD-FMK (10 umol /l) inkuboitiin edelleen β, β-dimethylacrylshikonin (10 umol /l) 24 tuntia. Proteiini-uutteet valmistettiin ja alistettiin Western blot -määritys tason mittaamiseksi fosforyloidun ERK. Proteiini tasot ERK mitattiin myös kontrolleina.

Keskustelu

shikonin johdannaiset ovat aktiivisia komponentteja eristettiin kasviperäisten Lithospermum erythrorhizon [5]. Nämä yhdisteet ovat lupaavia lääke-ehdokkaita, koska niitä on raportoitu olevan useita syövän vastaisia ​​vaikutuksia in vivo ja in vitro [5], [26]. Niistä komponentit Lithospermum erythrorhizon, β, β-Dimethylaerylshikonin on tärkeä anti-kasvain vaikutuksia verrattuna muita aktiivisia aineosia [27]. Mitä tulee sen syövän vastainen vaikutus, shikonin-sulatettu solujen apoptoosia kaspaasi-riippuvaisen reitin havaittiin monissa pahanlaatuisia kasvaimia. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta β, β-dimethylacrylshikonin ihmisen mahasyövän SGC-7901-soluja. Tuloksemme osoittivat, että hoito SGC-7901-solujen β, β-dimethylacrylshikonin osoitti merkittävää sytotoksista vaikutusta SGC-7901-solujen annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, ja β, β-dimethylacrylshikonin indusoiman apoptoosin SGC-7901-soluissa näkyi lisääntynyt varhainen apoptoottisia soluja (anneksiini V

+ /PI

-) ja myöhäinen apoptoottisten solujen (anneksiini V

+ /PI

+).

suhde anti ja pro-apoptoottisen proteiinin ekspressiota, kuten Bcl-2 /Bax, on ratkaisevan tärkeää, että apoptoosin induktion, ja se päättää herkkyyttä solujen apoptoosin [28]. Mitokondriot tärkeä rooli signaalin siirtoon apoptoosin [29]. Translocalization apoptoottisten proteiinien sytosolista mitokondrioita johtaa vapautumisen sytokromi c: n ja toisen mitokondrioiden johdettu aktivaattori kaspaasien väheneminen mitokondrion kalvon potentiaalia [30], [31]. Shikonin on raportoitu indusoivan apoptoosia kautta mitokondrioiden väylän HepG2-soluissa [32]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että β, β-dimethylacrylshikonin alassäädetty ilmaisua XIAP, CIAP-2 ja Bcl-2 ja sääteli ilmaus Bak ja Bax, ja aiheutti mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapauttamaan sytokromi c: in SGC-7901-soluissa, sopusoinnussa mitokondrioita riippuvaista apoptoosia. Havainto β, β-dimethylacrylshikonin välitteisen kaspaasi-9, kaspaasi-3, ja sen jälkeen lohkaisu PARP, sekä sillä seurauksella, että yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK vähensi β, β-dimethylacrylshikonin indusoiman apoptoosin in SGC-7901-soluissa, mikä viittaa siihen, että mitokondrio-välitteisen kaspaasi cascade polku on keskeinen rooli β, β-dimethylacrylshikonin indusoiman apoptoosin. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin säätelee ekspressiotasot apoptoosiin liittyvien proteiinien, aiheuttaa sytokromi c: n vapautumisen ja trigs kaspaasiriippuvaisen solujen apoptoottisen kuoleman.

mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) säädellä erilaisia cellular ohjelmia, kuten alkionkehityksen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia [33]. MAPK proteiinit koostuvat kolmesta proteiinikinaasien: ERK1 /2 (solunulkoinen signaali-säännelty kinaasien 1 ja 2), JNK (c-Jun N-terminaalisen kinaasin) ja p38 [34], [35]. Yleensä lyhytaikaisessa ERK aktivaatio johtaa solujen proliferaatiota, mutta jatkuva aktivointi ERK on assoctiated eriytetty [36]. Kehittyvät viittaavat siihen, että aktivointi ERK osallistuu apoptoosin. Jeong et ai. osoittivat, että kaempferol aiheutti syöpäsolujen apoptoosin kautta ERK-riippuvaisen reitin [21], [37], [38]. Viime aikoina on raportoitu, että icaritin indusoi kasvun esto ja apoptoosin ihmisen PSMCs kautta ERK signalointireitin [39]. Li et ai. osoittivat, että aktivoituminen RAF /MEK /ERK signalointireitille on kriittinen rooli kalsiumin aiheuttaman apoptoosin linssin epiteelisolujen [40]. Täällä myös, että jatkuva aktivointi ERK osallistuu β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttama kasvun esto ja apoptoosin SGC-7901-soluissa. U0126, spesifinen inhibiittori MEK (MAPK /ERK-kinaasi), esti tehokkaasti β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttama ERK aktivointia ja heikennetty β, β-dimethylacrylshikonin-indusoitua apoptoosia, mikä viittaa pro-apoptoottisen vaikutusten β, β-dimethylacrylshikonin in SGC-7901-solut välittävät jatkuva aktivoituminen ERK1 /2 signalointireitin.

Yhteenvetona, olemme havainneet, että β, β-dimethylacrylshikonin inhiboi solujen kasvua ja aiheutti apoptoosia SGC-7901-soluja. Tutkimme myös taustalla olevien mekanismien mukana β, β-dimethylacrylshikonin: n indusoiman apoptoosin. Tuloksemme osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin indusoiman apoptoosin liittyy vähentämisessä XIAP, CIAP-2, ja Bcl-2-proteiinin ilmentymisen ja induktio Bak ja Bax-proteiinin ilmentymisen, ja aiheutti mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapautumista sytokromi c SGC-7901-soluissa. Tuloksemme osoittivat myös, että β, β-dimethylacrylshikonin aiheuttaman apoptoosin liittyy kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 ja pilkkominen PARP. Lisäksi ERK signalointireitin osallistui myös β, β-dimethylacrylshikonin: n indusoiman apoptoosin. Tuloksemme osoittivat, että β, β-dimethylacrylshikonin voitaisiin kehittää potentiaalisena syöpälääke ihmisen mahasyövän.

Kiitokset

Haluamme kiittää H-BW niiden teknistä tukea ja me myös kiittää X -QM ja J-HC hyödyllisiä kommentteja tämän artikkelin.