Krooninen sairaus

tiivistelmä

On kasvava trendi tutkijoille käyttää

in vitro

3D-malleja syövän tutkimuksiin, koska ne voivat paremmin kerrata monimutkainen

in vivo

tilanteessa. Ja että etenemistä ja kehittäminen kasvaimeen liittyvät läheisesti sen strooman mikroympäristölle tunnustetaan yhä laajemmin. Tällaisia ​​kasvain tukevan markkinarako on elintärkeää ymmärtää kasvaimen edistymistä ja etäpesäkkeiden. Mesenkymaaliset alkuperä monia soluja asuvat syövän kapealla tarjoaa lähtökohtaan myös MSC: in matkii paikkansa neuroblastooma. Täällä co kapselointi ja yhdessä viljelemisen NBCS ja MSC 3D-

in vitro

malli ja tutkia morfologian, kasvukinetiikat ja matriisi remodeling in saatetun strooman ympäristö. Tulokset osoittivat, että sisällyttäminen MSC: mallissa johtaa nopeutetun syöpäsolujen kasvun sekä kertaus ainakin osittain kasvaimen microenvironment

in vivo

. Nykyinen tutkimus siis osoittaa toteutettavuus, että kollageenin mikropallo toimimaan 3D

in vitro

syövän mallin eri aiheista syövän tutkimuksiin.

Citation: Yeung P, Sin HS, Chan S, Chan GCF, Chan BP (2015) mikrokapselointi neuroblastoomasoluja ja Mesenkymaaliset stroomakasvaimet Solut Kollageeni mikropallot: 3D Model for Cancer Cell Niche Study. PLoS ONE 10 (12): e0144139. doi: 10,1371 /journal.pone.0144139

Editor: Stan Gronthos, The University of Adelaide, Australia

vastaanotettu: 21 elokuu 2015; Hyväksytty: 14 marraskuu 2015; Julkaistu: 14 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Yeung et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Käyttämällä 2D yksikerroksisiin syöpäsolulinjoissa yksinkertainen malli tutkia syöpätutkimukseen voitaisiin jäljittää 1950 [1, 2]. Kuitenkin samanlainen terveitä kudoksia, kasvaimen kudokset ovat 3D yhteisöihin soluilla, soluväliaineen ja muut microenvironment. Tähän mennessä se on yleisesti sovittu, että yksikerroksista solulinjan kulttuuri huonosti edustaa

in vivo

ilmiö [3], jossa solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia esiintyy, siis rajoittaa sen kyky ennustaa syöpäsolun vasteen todellisuudessa [4].

viime vuosina on kasvava trendi tutkijoille käyttää

in vitro

3D-malleja syövän tutkimuksissa [3, 5, 6] aiheista, kuten kasvain microenvironment [7], angiogeneesin [8] ja etäpesäkkeiden [9]. Nämä mallit sisältävät palloset [10] ja mikropallot [11, 12]. Ne tukevat yhdessä viljelemisen useiden solutyyppien, sallii solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutusta, ja siten säilyttää paremmin

in vivo

ominaisuudet kasvainkudoksen. Joissakin malleissa pystyvät luomaan rakenteellista monimuotoisuutta kasvaimen kudosten kanssa vyöhykkeitä lisääntyvien, lepotilassa tai nekroottisten solujen [4]. Kyky Näiden 3D-malleja sisältävän useita kapealla tekijöitä mahdollistaa osittaisen rekapitulaatio ja hyvin samankaltaisia ​​ja

in vivo

microenvironment syöpäsolujen [4, 13, 14], edistää kasvaintauti mallintamiseen ja henkilökohtaista kemoterapiaa seulonta pitkällä aikavälillä.

kasvaimet eivät ole yhtenäisiä elimiä, mutta hyvin monimutkaisia ​​kudoksia, joissa erilaiset solutyypit, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen syöpäsoluja, syövän progenitorisolut, endoteelisolut, tulehdukselliset solut ja syöpään liittyvän fibroblastit [3, 15-17 ]. Sen lisäksi, että lisääntyvien neoplastisten parenkymaalisolut (syöpäsoluja), tukeva stroma koostuu solujen mesenkymaaliset voisi selittää puolet strooman massa [3]. Etenemistä syöpä ei riipu pelkästään syöpäsolujen lisäksi myös stroomasolujen asuvat kasvaimen mikroympäristössä [18, 19]. On osoitettu, että multipotentteihin mesenkymaaliset kantasolut (MSC) oleskella aikuisen kudoksissa [20, 21]. Vaikka ovatko nämä solut ovat peräisin luuytimen edelleen kiistanalainen, mutta hyvin samankaltaisia ​​MSC kanssa perisyyteissä pitkin verisuonia seinään tuottaa toisen houkutteleva selitys [22, 23]. Kasvava todisteet osoittavat, että syöpä liittyy strooman erityisen fibroblastisoluja kiihtynyt kasvaimen kasvua [3] ja edistettävä salliva mikroympäristön syövän etäpesäkkeiden [24, 25]. Jotkut tulokset osoittavat, että mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) kautta kulkisi luuytimestä kasvaimen aikana kasvainten kehittymiseen [26-29]. Kuitenkin rooli MSC kasvainten synnyssä yhä kiistanalainen [26, 30-33]. Yksi hyvin tunnettu käsite on se, että heterotyyppisten vuorovaikutusta useiden solutyyppien on tarpeen tarkka samankaltaisuus

in vivo

vastauksia. Jotta tämä tavoite saavutettaisiin, 3D-malleja, joiden avulla vuorovaikutus useiden solutyyppien ovat houkuttelevia tutkii tällaisia ​​monimutkaisia ​​vuorovaikutuksia.

Olemme aiemmin perustaneet kollageeni mikrokapselointi alustan, joka vangitsee eläviä soluja sisällä rekonstruoitu nanofibrous kollageenia meshwork [34 ]. Kollageeni meshwork on bioyhteensopiva, joka tarjoaa fysiologisesti relevantti mikroympäristön salliva solun liitetiedoston, lisääntymistä, vaeltamisen ja erilaistumisen in monenlaisia ​​soluihin, kuten MSC: [34-37], HEK293-solut [38], alkion kantasolujen [39], kondrosyyttien [ ,,,0],40], nucleus pulposus soluihin [41] ja osteoblastien [42]. Yksi merkittävä etu kollageenin mikrokapselointi malli on se, että mallin kollageeni meshwork tukee matriisi remontin, jossa viitataan samanaikaisesti hajoamisen ja laskeuman soluväliaineen, kun viljellään kypsät solut ja erottamaan kantasoluja 3D. Tämä voimakkaasti perustelee käyttökelpoisuutensa toimii mallina pääpiirteittäin

in vivo

solujen microenvironment aikana rakenteellisia ja toiminnallisia kudoksen muodostumista. Toinen merkittävä etu kollageenin mikrokapselointi on sen hallittavissa ja pienennetyt (satoja mikronia) koko [34], että mikro-kudos sisältää useita satoja soluja mahdollistaa kyky on edullinen, henkilökohtainen ja suuren suoritustehon seulontaa varten.

Neuroblastooma (NB) on lasten syöpä osuus 6% kaikista pahanlaatuisten kasvainten todettu lapsilla [43]. NB microenvironment koostuu soluväliaineen, strooman fibroblastit, verisuonten solujen ja immuunijärjestelmän solujen [3]. Erityisesti, strooman fibroblastien on osoitettu lisäävän kasvaimen kasvua, angiogeneesin ja metastaasin [44, 45]. Raportit osoittavat myös, että co-kulttuuri neuroblastoomasolujen (NBCS) muiden solutyyppien johtaisivat merkittävästi erilaisia ​​käyttäytymismalleja. Esimerkiksi ei-yhteyttä co-kulttuuri NBCS kanssa hepatosyyttien vähentäisi apoptoosin aktiivisuus ja suurempi VEGF ilmaisun [46, 47]. Toisessa esimerkissä, co-kulttuuri NBCS HUVEC vähensi havaitsemista syöpäsolujen neutrofiilien [48]. Lisäksi rajat väliset neuvottelut NBCS ja Schwannin solujen on osoitettu stimuloivan NB erilaistumista, mikä vähentää aggressiivisuutta kasvain [49, 50] irtoaminen valot uusia hoitostrategioita. Toisaalta, muutaman raportit ovat osoittaneet, että kun läsnä on MSC lisäisi invasiivisuus neuroblastooma [27, 51, 52]. Vaikka rooli MSC neuroblastooma ei ole täysin tiedossa, läsnäolo MSC ei johda käyttäytymisen muutokseen NBCS. Tällä välin, vaikka kaikki nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että NBCS aktiivisesti vuorovaikutuksessa muiden solutyyppien, nämä kokeet toteutetaan kaikki 2D-malleja. 3D malli salliva ja NBCS kasvua ja lisääntymistä sekä vuorovaikutusta stromasoluja ei ole vielä raportoitu. Tässä tutkimuksessa oletamme, että co-mikrokapselointi NBCS MSC: eiden kanssa kollageenia mikropallot Yhteenvetona, ainakin osittain, kasvain microenvironment

in vivo

. Erityisesti pyrimme tutkimaan morfologian, kasvukinetiikat ja matriisi remodeling in co-mikrokapselointiprosessin ympäristössä.

Neuroblastooma (NB) on lasten syöpä osuus 6% kaikista pahanlaatuisten kasvainten todettu lapsilla [43]. NB microenvironment koostuu soluväliaineen, strooman fibroblastit, verisuonten solujen ja immuunijärjestelmän solujen [3]. Erityisesti, strooman fibroblastien on osoitettu lisäävän kasvaimen kasvua, angiogeneesin ja metastaasin [44, 45]. Raportit osoittavat myös, että co-kulttuuri neuroblastoomasolujen (NBCS) muiden solutyyppien johtaisivat merkittävästi erilaisia ​​käyttäytymismalleja. Esimerkiksi ei-yhteyttä co-kulttuuri NBCS kanssa hepatosyyttien vähentäisi apoptoosin aktiivisuus ja suurempi VEGF ilmaisun [46, 47]. Toisessa esimerkissä, co-kulttuuri NBCS HUVEC vähensi havaitsemista syöpäsolujen neutrofiilien [48]. Lisäksi rajat väliset neuvottelut NBCS ja Schwannin solujen on osoitettu stimuloivan NB erilaistumista, mikä vähentää aggressiivisuutta kasvain [49, 50] irtoaminen valot uusia hoitostrategioita. Toisaalta, muutaman raportit ovat osoittaneet, että kun läsnä on MSC lisäisi invasiivisuus neuroblastooma [27, 51, 52]. Vaikka rooli MSC neuroblastooma ei ole täysin tiedossa, läsnäolo MSC ei johda käyttäytymisen muutokseen NBCS. Tällä välin, vaikka kaikki nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että NBCS aktiivisesti vuorovaikutuksessa muiden solutyyppien, nämä kokeet toteutetaan kaikki 2D-malleja. 3D malli salliva ja NBCS kasvua ja lisääntymistä sekä vuorovaikutusta stromasoluja ei ole vielä raportoitu. Tässä tutkimuksessa oletamme, että co-mikrokapselointi NBCS MSC: eiden kanssa kollageenia mikropallot Yhteenvetona, ainakin osittain, kasvain mikroympäristön in vivo. Erityisesti pyrimme tutkimaan morfologian, kasvukinetiikat ja matriisi remodeling in co-mikrokapselointiprosessin ympäristössä.

Methods

Neuroblastooma soluviljelmässä

neuroblastoomasolulinjasta oli eräänlainen lahja Dr. NKV Cheung Memorial Sloan Kettering Cancer Center, USA. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jossa oli paljon glukoosia (Gibco), jossa on täydentää 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), 1% penisilliini streptomysiiniä (Gibco), 1% glutar-max (Gibco).

mesenkymaalisten /stroomasolulinja (MSC) kulttuuri

Ihmisen MSC: luuytimestä [53] saatiin ystävällisesti professori GCF Chan, laitos Lastentautien ja nuorten Medicine, University of Hong Kong ja viljeltiin yksittäiskerroksina kuten aikaisemmin on kuvattu [53]. Nykyinen protokolla on hyväksynyt yhdistetyn Clinical eettinen komitea University of Hong Kong ja Hong Kong West Cluster Sairaalat sairaalan Authority. Lyhyesti, MSC: eitä viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa DMEM: ssä, jossa on alhainen glukoosi (Gibco), jossa on lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), 1% penisilliini streptomysiiniä (Gibco) ja 1 % glutar-max (Gibco). Kasvualusta vaihdettiin joka 3-4 päivä. Noin 80% konfluenssiin, hMSC eristettiin trypsiinikäsittelyllä 0,05% trypsiini-EDTA (1 x) (Gibco) lyhyesti ennen uudelleen suspendoimalla kokonaan väliaineessa seuraavissa kokeissa. Solut P6 käytettiin myöhemmissä kokeissa.

Kollageeni mikrokapselointi

Solut mikrokapseloitu, kuten aiemmin on raportoitu [34]. Lyhyesti, hMSC ja NBCS niitä kasvatettiin subkonfluenssin ja sitten irrotettiin käsittelemällä NBCS ja MSC 0,25% ja 0,05% trypsiini-EDTA (1X) (Gibco), 5 minuutin ajan. NBCS ja MSC sekoitettiin eri ennalta määrätyllä suhteissa (NBCS: 100, 80, 50, 20 ja 0%) ennen mikrokapselointia. Rotan hännän tyypin I kollageenia (Becton Dickenson Biosciences, Bedford, MA), neutraloitiin 0,1 N NaOH: lla ja laimennettiin eri lopullisissa konsentraatioissa (0,5, 1 ja 2 mg /ml). Cell seokset suspendoitiin neutraloitu kollageenin liuokseen muodostavat soluväliainekonstruktin seoksia, joilla on eri lopullinen solutiheys (2.5x10e5, 5x10e5 solua /ml ja 1x10e6 solua /ml, mikä vastaa 1250, 2500 ja 5000 solua /5 ui pisaran, vastaavasti). Nestepisarat solu-matriisin seokset annostellaan tarttumattoman pinnan, joka on UV-säteilytetty parafilmillä on läpimitaltaan 90 mm petrimaljalle (Sterilin, Lontoo, Iso-Britannia), ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 45 minuutin aiheuttaa geeliytymistä. Geeliytyneet kollageenia mikropallot sisältävät sekä NBCS ja MSC ennalta suhdelukuja kevyesti huuhdella yhdessä viljelemisen väliaineessa petrimaljalle varten vapaasti kelluva jousitus kulttuureissa eri kesto (7, 14 ja 21 päivää). Yhteensä 100 mikropallojen viljeltiin kussakin petrimaljassa. Co-viljelyalustaa sekoitettiin NBC ja MSC kasvatusalustasta solun kapselointi suhde, täydennettiin joka 2-3 päivä.

mittaaminen ulottuvuuden soluväliaineen mikropallot

Ajallinen elimellisen muutoksen NBC-MSC-kollageeni mikropallot kirjattiin faasikontrastimikroskooppia jopa 21 päivää. Halkaisijat noin 10% mikropallon väestön valittiin satunnaisesti ja mitataan silmä-pala mikrometrin.

kasvukinetiikka solujen

Jokainen 200 Mikropallot kapseloidaan 2.5e5 solujen eri NBC : MSC suhteet päivänä 0, ja ne viljeltiin 7, 14, ja 21 päivää. Kullakin ajanhetkellä, 200 mikropallot kustakin ryhmästä pilkottiin entsymaattisesti kollagenaasilla Clostridium histolyticum (Sigma) 200 yksikköä /ml 45-60 minuutin ajan. Yksittäisten solujen suspensioita saatiin käsittelemällä pilkotaan aggregaattien 0,25% trypsiini-EDTA: a (1 x) (Gibco), ennen kuin numerointi trypaanisini määrityksessä. Solujen kasvun mikropalloihin voitaisiin sitten laskea.

Virtaussytometria-analyysi osuus NBCS

Yksisolususpensiot (1x10e6 soluja) saadaan kollagenaasi-trypsiinillä NBC-MSC- kollageeni mikropallot suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan co-viljelyalustaa, inkuboitiin huoneen lämpötilassa tunnin ajan, jotta talteenotto solun pinnan proteiinin ekspression, ja kiinnitettiin sitten 0,01% PFA: ssa 15 minuutin ajan. Sitten solut estettiin 2% vuohen seerumin (Vector Laboratories) PBS: ssa 30 minuuttia ennen epäsuora värjäys vasta-aineita. Kuhunkin näytteeseen, 1 ui hiiren monoklonaalisen vasta-aineen Neuroblastooma (NB84a, Abcam) 2% vuohen seerumia (laimennus 1: 100) lisättiin. Isotyyppikontrolleja (normaali hiiri-IgG-vasta-ainetta, Millipore) suoritettiin kunakin ajankohtana. Värjäyksen jälkeen huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, 1 ml PBS: ää lisättiin kuhunkin putkeen pestä pois ylimääräinen vasta-aineita. Kun oli sentrifugoitu 2000 rpm: ssä 5 minuutin ajan, supernatantti poistettiin ja 0,5 pl Alexa Fluor 647 vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Invitrogen) 2% vuohen seerumia (laimennus 1: 200) lisättiin kuhunkin näytteeseen. Värjäyksen jälkeen pimeässä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, 1 ml PBS: ää lisättiin kuhunkin putkeen pestä pois ylimääräinen vasta-aineita. Kun oli sentrifugoitu 2000 rpm: ssä 5 minuutin ajan, supernatantti poistettiin ja solupelletit suspendoitiin uudelleen, ja sitä säilytetään 500 ul: 1% PFA solutiheyteen vähintään 4x10e5 solua /ml virtaussytometriaa analyysi FACSCanto II -virtaussytometrillä (BD Biosciences, Bedford , MA). 10,000 tapahtumia kunkin näytteen analysoitiin. Tulokset analysoitiin Virtaava Software 2.5.1.

Histologia ja immunohistokemia NBC-MSC-kollageeni mikropallot

NBC-MSC-kollageeni mikropallot fiksoitiin 4% PFA huoneenlämpötilassa pimeässä 30 minuuttia ja poistettiin vesi käyttämällä sarja- kaltevuus etanolin käsittely ennen käsittelyä varten parafiinileikkeitä 5 um paksuus. Rutiini hematoksyliinillä ja eosiinilla (Sigma) värjäys suoritettiin paljastaa solumorfologia mikropalloihin. Arvioida läsnä NBCS, ensisijainen vasta-aine (ab49501, Abcam) käytettiin. Anti-hiiri-vasta-ainetta (BA-1000, Vector Laboratories) käytettiin immunohistokemiassa, jonka jälkeen ABC värjäys, diaminobentsidiini merkintöjä, ja counterstaining käyttäen hematoksyliinillä. Arvioida läsnä tyypin I kollageeni, joka on primääristä vasta-ainetta (C2456, Sigma), käytettiin. Anti-hiiri-vasta-ainetta (BA-1000, Vector Laboratories) käytettiin immunohistokemiassa, jonka jälkeen ABC värjäys, diaminobentsidiini merkintöjä, ja counterstaining käyttäen hematoksyliinillä. Arvioida läsnä Matrix-metalloproteinaasi 9, ensisijainen vasta-aine (ab38898, Abcam) käytettiin. Anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (BA-2000, Vector Laboratories) käytettiin Immunohistokemian seuraa ABC värjäys, diaminobentsidiinillä merkintöjä, ja counterstaining käyttäen hematoksyliinillä.

Tietojen analysointi ja tilastot

Kvantitatiiviset tulokset mukaan lukien microsphere ulottuvuus, solumäärät ja NBC mittasuhteet esitettiin keskiarvo ± standardipoikkeamat ellei toisin mainita. Kaksisuuntainen ANOVA asianmukaiset post hoc testejä käytettiin paljastaa tilastollisesti merkittäviä eroja eri ryhmiin. Merkitys asetettiin arvoon 0,05 ja SPSS 19,0 (IBM, NY, USA) käytettiin suorittaa tilastollinen analyysi.

Tulokset

morfologinen luonnehdinta NBC-MSC-kollageeni mikropallot

Kuva 1A1-1E6 esittää brutto ulkonäkö NBC-MSC-kollageeni mikropallot eri ryhmissä. Pallomainen esiintymisiä olivat samanlaisia ​​viljelyn alussa, mutta tuli monipuolinen myöhemmässä vaiheessa, kuten mikropalloja ryhmissä alkuvaiheessa korkeammilla NBC osuus vähitellen menettäneet pallomainen muoto ja tuli epäsäännöllinen rakenne, mikä viittaa liikakasvua. Aikana kulttuuri, pieni mikro-massat suspensiossa havaittiin NBC 100%, 80% ja 50% ryhmissä ensimmäisen viikon jälkeen. Vaikka NBC 20% ryhmässä, havaittavissa massat ilmestyi jälkeen toisella viikolla. NBC 80% ryhmässä oli suhteellisesti suurempi määrä mikro-massojen kuin muissa ryhmissä. Ei ollut liikakasvua mikro-massat NBC 0% ryhmässä (100% MSC ryhmä). Kuviossa 1F on esitetty muutos ulottuvuuden mikropallojen viljelyn aikana. Oli merkittävä supistuminen mikropallojen ensimmäisellä viikolla kaikille ryhmille, mitä seuraa nousu halkaisija kaikissa syöpäsolujen sisältävät ryhmät, mikä viittaa siihen, kasvaimia kasvua. Sillä välin, fuusio ja yhdistäminen mikropallojen noudatetaan. Käyrä osoittaa myös, että laajuus supistuminen ja laajentuminen on riippuvainen NBCS sisällöstä. Kaikki ryhmät paitsi NBC 100% yhtä dramaattisesti vähentynyt koko ensimmäisen päivän jälkeen kapselointi. Mikropallot sisältävä terveellinen MSC: vain (NBC 0%) jatkuvasti pudota koko ajan. NBC 20% ryhmä osoitti jatkuvaa ulottuvuus alkuvaiheen jälkeen lasku koon, kun ryhmissä 50% tai enemmän NBCS alkoi kasvaa kooltaan 7 päivän jälkeen, mikä viittaa siihen, nopean kasvun syöpäsoluja. Kaksisuuntainen ANOVA osoitti, että sekä aikatekijällä (p 0,001) ja NBC: MSC-suhde (p 0,001) vaikutti merkittävästi ulottuvuutta mikropalloja. Bonferroni post hoc testit osoittivat, että lukuun ottamatta day1-day14 (p = 0,518), ja Day3-päivä7 (p = 1,000) paria, kaikki muut vertailut olivat tilastollisesti merkitsevästi erilainen kuin muut (p 0,001), kun taas kaikki NBC: MSC-suhde ryhmien olivat tilastollisesti merkitsevästi erilainen kuin muut (p 0,001).

mikropallot eri prosenttiosuuden NBCS ja siten NBC: MSC suhteet: (A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (20% MSC) ja (E): 100% NBC (0% MSC) viljeltiin eri ajan: 0 (A1, B1, C1, D1, E1); 1 (A2, B2, C2, D2, E2); 3 (A3, B3, C3, D3, E3), 7 (A4, B4, C4, D4, E4), 14 (A5, B5, C5, D5, E5) ja 21 (A6, B6, C6, D6, E6 ) päivää (asteikko palkit: 100 um: A2, A3, A4, A5, A6, B2, B3, B4, B5, B6, C2, C3, C4, C5, D2, D3, D4, 500 um: A1, D5, E3, E4, E6, 1000 um: B1, C1, C6, D1, D6, E1, E2, E5); (F): Line kaavio ajallisen muutoksen ulottuvuus (keskiarvo ± 1SD) NBC-MSC-kollageenin microsphere populaatioiden aikana kulttuureissa.

morfologiset muutokset NBC-MSC-kollageeni mikropallot eri NBC: MSC-suhteet, ajankohtina, alustavan solun tiheyteen ja kollageenin pitoisuus

kuvio 2 esittää H (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: päivä 7; A2, B2, C3, D2, E2: päivä 14; B3, C3, D3, D3a, E3: päivä 21 jälkeen kulttuuri (Mittaviivat: 100 m).

(A1-A3): 1250 solua /microsphere; (B1-B3): 2500 solua /mikropallo; (C1-C3): 5000 solua /mikropallo; 1: 7 päivää; 2: 14 päivää; 3: 21 päivää (asteikko palkit: 100 um).

Kuvio 3 esittää H (B): 2 mg /ml; 1: 7 päivää; 2: 14 päivän (asteikko palkit: 100 m).

kasvukinetiikka NBC-MSC-kollageeni mikropallot

Kuvio 5A esittää viivakaavion solun numeron NBC-MSC -collagen mikropalloja eri NBC: MSC suhteet eri ajankohtina yhdessä viljelemisen aikana. Mikropalloja 0% NBC, eli 100% MSC: osoitti jatkuva lasku solujen määrä. Toisaalta, kaikki ryhmät, jotka sisältävät syöpäsolut oli positiivinen kasvu ajan kuluessa. 20% ryhmä osoitti asteittainen nostaminen ensimmäisen 2 viikkoa ja kaikki yhtäkkiä määrä dramaattisesti lisääntynyt räjähdysmäisesti päivänä 21. 100% NBC ryhmässä (0% MSC) osoitti merkittävää kasvua alkupuolella kulttuureissa 7. päivänä kuin muita ryhmiä, mutta että ei antanut tähän ryhmään mitään lisäkasvua hyötyä myöhemmin päivinä. Samanlaisia ​​suuntauksia havaittiin 50% ja 80% NBC: MSC ryhmiä. Kaksisuuntainen ANOVA osoitti, että sekä aikatekijällä (p 0,001) ja NBC: MSC suhde kerroin (p 0,001) vaikuttaa merkittävästi solujen määrä. Bonferroni post hoc testit osoittivat, että 0% NBC (100% MSC) merkittävästi erilainen kuin kaikki muut ryhmät (p = 0,003). 20% NBC ryhmä osoitti merkittäviä eroja 0% (p = 0,003), 80% (p = 0,033) ja 100% (p = 0,008), vastaavasti. 50% NBC ryhmä, ja 80% ja sitten 100% eivät olleet merkittävästi erilaiset keskenään (p = 0,342). 100% NBC oli vain merkittävä ero 0% ja 20% NBC: MSC suhteet (p = 0,008). Mielenkiintoista on, alkaen saman solun numero, 20% NBC ryhmä osoitti paljon alhaisempi (~ 2 päivää) kaksinkertaistaa ajan, joka mittaa aikaa, joka solupopulaatio kaksinkertainen itse verrattuna korkeampi NBC: MSC-suhde (kuvio 5B ). 0% NBC (100% MSC) ryhmä ei kasvanut, kun taas 100% NBC (0%) osoitti paljon alhaisempi kaksinkertaistaa aikaa ( 6 päivää).

Päivänä 7, päivänä 14 ja päivänä 21, 200 mikropalloja pilkottiin laskea solujen määrä. (A): Kasvu kineettinen käyriä muutoksia solujen lukumäärä ajan eri kapselointi- suhde (keskiarvo ± 1SD); (B): Population kaksinkertaistaa aikaa eri ryhmille.

Ajallinen muutos prosentteina NBC mikropalloihin

Kuvio 6A esittää prosenttiosuudet NBCS eri ryhmien ajan. Kun 20% NBC ryhmä, prosenttiosuus NBCS pidettiin noin 20%: iin päivänä 7 ja 14, mutta dramaattisesti 33%: iin 21. päivänä (kuvio 6A). Toisaalta, 50% ja 80% NBC ryhmät osoittivat samantasoiset NBCS ajan. Kuvio 6C esittää edustavat histogrammin virtaussytometrialla-base luettelointi NBCS eri ryhmissä. Kuvio 6B näyttää prosentteina NBCS laskettu saatuja tietoja virtaussytometrialla. Kaksisuuntainen ANOVA osoitti, että NBC: MSC suhde kerroin (p 0,001) vaikuttaa merkittävästi prosenttiosuus NBC ylitöitä, mutta ei aika kerroin (p = 0,85). Bonferroni post hoc testit osoittivat, että 20% NBC ryhmä poikkeaa merkittävästi 50% (p 0,001) ja 80% (p 0,001) vastaavasti. 50% NBC ryhmässä ja 80% eivät olleet merkittävästi erilaiset keskenään (p = 0,366).

(A): Error bar taulukot osoittavat prosenttiosuuden NBCS määritetty kautta virtaussytometrialla (keskiarvo ± 1SD); (B): Taulukko, joka osoittaa keskimääräisen prosenttiosuuden NBCS eri ryhmien ja eri ajankohtina; (C): edustaja histogrammi, joka esittää soluja värjättiin isotyypin kontrollivasta-aineella ja solut värjättiin NB84a vasta-aineen eri ryhmissä eri ajankohtina.

immunohistokemia tyypin I kollageenin

Kuvio 7 esittää immunohistokemiallista analyysiä I-tyyppisen kollageenin NBC-MSC-kollageenin mikropalloja. Vuonna 0% NBC (100% MSC) ryhmä, tyypin I kollageenin positiivinen microsphere pysyi pallomainen vaikka se muuttuu huokoinen 14 päivää (kuvio 7A ja 7B). Vuonna 20% NBC ryhmien mikropallokerroksen oli ehjä 7. päivänä, mutta alkoivat hajota päivänä 14 ja oli lähes kokonaan hajonnut päivänä 21 (kuvio 7B2 ja 7B3). Sillä 50% NBC ryhmä, mikropallot olivat ehjä päivänä 7 (kuvio 7c1), mutta enemmän huokoinen myöhempinä ajankohtina (kuvio 7C2 ja 7C3). Tämä suuntaus oli samanlainen 80% NBC ryhmä (kuvio 5B). Tyyppi I kollageenin ilmentävien solujen, jotka ovat todennäköisesti MSC käytti enimmäkseen rajoittuvat mikropallot vaikka havaittiin satunnaisesti uloskasvamisen ulkopuolella mikropallot (Kuva 7F ja 7G).

(A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: päivä 7; A2, B2, C3, D2, E2: päivä 14; B3, C3, D3, D3a, E3: päivä 21 jälkeen kulttuuri (Mittaviivat: 100 m).

immunohistokemia of MMP-9

Kuvio 8 esittää immunohistokemiallisella värjäyksellä MMP-9 on NBC-MSC-kollageeni mikropallot kiinteät 80% NBCS ja eri solujen tiheydet ja kollageenipitoisuuksilla. Kollageeni alueet osoittivat positiivista värjäytymistä, kun taas MMP-9-ilmentävien solujen havaittiin sekä out-kasvu ja reuna-kerrokset solumassoihin (kuvio 8A1, 8b1, 8b2 ja 8C1).

(A): 5000 solua /ml; (B): 2500 solua /ml; (C): 1250 solua /ml; 1: 0,5 mg /ml; 2: 1 mg /ml; 3: 2 mg /ml (asteikko palkit: 100 m).

Keskustelu

In vitro syövän malleissa

nopeuttamiseksi prekliinisiä huumeiden seulonta ja saavuttaa yksilöllisiä lääketiede tulevaisuudessa, taudin kehittymistä tai potilaan erityinen in vitro malli on suuri merkitys [54]. Kuten edellä, tavanomainen 2D yksikerroksista malleja arvostellaan niiden ei-fysiologisia kulttuuri ympäristö ja he eivät pysty kerrata in vivo kunnossa, siis tuottaa epäluotettavaa tietoa. Kun etukäteen alalla kudosteknologian, käyttö in vitro kolmiulotteisen mallin matkimalla kasvaimissa on tulossa yhä suositumpi. [55-57]. Tärkeä kysymys luomassa in vitro malli olisi valinta biomateriaaleja, jotka voivat olla peräisin luonnosta tai synteettisesti. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet lupaavia tuloksia käyttämällä luonnollisia biomateriaaleja, kuten kollageenia, fibriiniä, Matrigel [58] ja hyaluronihappoa. Niiden helppo saatavuus, helppokäyttöisyys ja korkea bioaktiivisuus, ne ovat suosittuja ja houkuttelevia vaihtoehtoja tutkijoille. Kollageeni on erinomainen biologinen yhteensopivuus ja vähäinen immunogeenisyys. Nämä ominaisuudet mahdollistavat tutkijat käyttää kollageenin sopivana materiaalina in vitro syövän mallissa. Kuitenkin helppous hajoamisen, määrittelemättömiä matriisi koostumus ja heikot mekaaniset ominaisuudet ovat heidän ongelmansa. Lisäksi korkea tuote-erän heterogeenisyyden koostumuksessa tekee vertailun eri tutkimusten välillä hyvin vaikeaa. Toisaalta, synteettisiä materiaaleja kuten PA, polyesteri, PEG hallussaan viritettävä parametrit ja mahdollistavat tarkemman materiaalien ominaisuuksien hallinta [59], joka johtaa vähemmän monimutkaisia, korkea toistettavuus ja vertailtavuus eri tutkimusten välillä. Silti jotkin niistä ovat myrkyllisiä ja ne vaativat enemmän kehittyneempiä vaiheita ennen kuin niitä voidaan käyttää mallintamista. PEG-hydrogeelin, esimerkiksi on ei-säikeisen rakenteen ja vaatii joko fyysistä tai kemiallista ristisidoksia prosesseja [60-62]. Nämä vaikuttaisi matkapuhelinverkon käyttäytymiseen ja helppokäyttöisyys verrattuna luonnon polymeerit kuten kollageeni. Itse asiassa, universaali biomateriaalien soveltuu kaikkiin taudin malleja ei ole olemassa.