Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Sen lisäksi, että vastaavat energiantuotannossa solussa, mitokondriot ovat keskeisiä pelaajia apoptoosin sekä tärkein haitallisten reaktiivisia hapen lajeja. Näin ollen, se voi olla oletettu, että sekvenssin vaihtelu mitokondrion genomissa on vaikuttava tekijä etiologiaa liittyvien sairauksien näiden eri solujen tapahtumia, mukaan lukien syöpä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida taajuus haplogroups ja polymorfismit valvonta-alue, (CR) mitokondrio-DNA: perifeerisen veren mononukleaaristen solujen potilailla, joilla on eturauhasen syöpä (n = 304) verrattuna potilailla, seulottiin eturauhasen sairaus, mutta havaittiin olevan negatiivisiksi syöpä biopsianeulat (n = 278) on jokin Lähi-Euroopan väestöstä.

Menetelmät /Principal havainnot

yhdeksän suuren eurooppalaisen haplogroups ja CR polymorfismit tunnistettiin avulla primer extension analyysin ja DNA: n sekvensointi, vastaavasti. Huomasimme, että mitokondrioiden haplogroup frekvenssi ja CR polymorfismien eivät eroa merkittävästi potilaiden välillä tai ilman eturauhassyöpä, mikä ei vaikuta perinnölliseen mitokondriaalisen DNA muunnelma alttius eturauhasen syöpä on Lähi Euroopan väestöstä.

Johtopäätökset /Merkitys

Tuloksemme kontrastin tuoreessa raportissa väitetään yhdistyksen välillä mtDNA haploryhmä U ja eturauhassyöpää pohjoisamerikkalainen väestöstä valkoihoisia syntyperää.

Citation: Mueller EE, Eder W, Mayr jA, Paulweber B , Sperl W, Horninger W, et ai. (2009) Mitokondrioiden Haplogroups ja valvonnan alue polymorfismit eivät liity Eturauhassyöpä Lähi Euroopan valkoihoisilla. PLoS ONE 4 (7): e6370. doi: 10,1371 /journal.pone.0006370

Toimittaja: Andrew Vickers, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 28 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Mueller et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta ”Itävallan Krebshilfe – Krebsgesellschaft Tirol” ja Paracelsus Medical University Salzburg (07/05/027). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin kuolinsyy kehittyneissä maissa. Se on yleisin syöpä miehillä Yhdysvalloissa ja toiseksi yleisin Euroopan unionissa [1], [2].

siirtyminen solun energian tuotannon oksidatiivisen fosforylaation mitokondrioita anaerobinen Glykolyysivaiheen, nimeltään Warburg vaikutus, on perustavanlaatuinen ominaisuus syöpäsoluja. Koska keskeinen rooli entsyymien koodaamien mitokondriaalisen DNA (mtDNA) energia-aineenvaihduntaan, muutoksia mitokondrion genomissa on epäilty pystyä aiheuttaa metabolista siirtymää kasvaimissa [3]. Lisäksi mitokondrioiden hengitysteiden toimintaa liittyy reaktiivisten hapen lajien (ROS), jotka voivat vaikuttaa etiologiaa ja etenemisen syövän [4]. Koska mitokondriot tärkeitä rooleja sekä ROS tuotanto ja apoptoosin, voidaan päätellä, että ne voisivat vaikuttaa syövän esiintymisen helposti piirretään.

Useimmat eukaryoottisolut sisältävät satoja mitokondrioita josta satama lukuisia kopioita mtDNA [5], [ ,,,0],6]. Pyöreä ja kaksijuosteinen mitokondrioiden genomi on noin 16 kiloemäsparin pitkä ja voidaan edelleen jakaa kahteen alueeseen: koodaavan alueen ja kontrollialueella. Koodausalue koostuu 37 geenien 24 koodaus komponentit mitokondrioiden translaatiokoneistolla ja 13 geenit tarjoavat tärkeitä alayksiköt Tuotannollisten entsyymejä oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) reitin [5], [7]. Ohjaus alue (CR), joka on ei-koodaus, sisältää kaksi hypervariaabelialueet (HVI ja HVII) ja tilavuus (D-loop) alue, ja on mukana mtDNA replikaatioon ja transkriptioon [8].

ihmispopulaatiossa on kertynyt suuri määrä mtdna emässubstituutiota pitkin säteilevän äidin suvusta, joista erityisiä yhdistelmiä ovat ns mitokondrioiden haplogroups [7], [9]. Yhdeksän erillistä Euroopan mtdna haplogroups (H, U, J, T, K, W, I, V, X) määriteltiin Torroni et al. [10], [11]. Vaikka useimmat mitokondrioiden polymorfismien uskotaan olevan neutraali, asujaimisto- erityinen mtDNAs voi olla toiminnallisesti erilainen ja käyttää vaihtelevia vaikutteita tuloksia sairauksien [7], [12] – [14].

Mitokondrioiden haplogroups ja polymorfismit ovat todettu olevan yhteydessä syövän synnyn. Esimerkiksi mtDNA 10398A polymorfismi on sekaantunut parannettu ROS tuotanto, ja sen havaittiin olevan riskitekijä rintasyöpään ja ruokatorven syöpä Intian potilailla, ja invasiivisen rintasyövän in Afrikkalainen Amerikan naisten [4], [15]. Lisäksi Aasian haplogroup D todettiin liittyvän suurempi riski sairastua kohdun limakalvon syöpä Kiinassa [16]. Vuonna valkoihoinen väestö, haplogroup K liittyi merkittävään kasvuun, ja haplogroup U merkittävä lasku, rintasyövän riskiä [17].

Booker et al. [18] raportoitu koholla taajuus haplogroup U eturauhasen syöpä potilaiden tutkimus Pohjois-Amerikan valkoiset. Tämä valkoihoinen haplogroup korreloi 2-kertainen riski sairastua tautiin [18].

pyrittiin jäljittelemään jälkimmäinen tutkimus Lähi Euroopan väestöstä. Koska yhdistysten ikään liittyvien sairauksien ovat osoittaneet paitsi mitokondrioiden haplogroups, mutta myös yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) CR [19], tutkimme myös sekvenssin vaihtelut HVI ja HVII meidän ikäluokat.

tulokset

arvioitiin yhdeksän suuren eurooppalaisen haplogroups sekä CR polymorfismien perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa 582 valkoihoisia miehiä, 304 joista oli diagnosoitu eturauhasen syöpä; loput 278 tunnistettiin seerumin PSA-arvot, mutta olivat histologisesti negatiivisia syövän yhteydessä eturauhasen koepalan ja toimi kontrolliryhmään. Kliiniset ominaisuudet syöpäpotilaiden ja ohjaimet on esitetty taulukossa 1. Kaikkien yhdeksän Euroopan haplogroups havaittiin meidän kohortissa. Taajuudet mitokondrioiden haplogroups ei eronnut merkitsevästi potilaiden eturauhasen syöpä ja verrokeilla (taulukko 2). Kun mitokondrioiden haplogroup frekvenssi verrattiin toisiinsa syöpäpotilaat koepala Gleason pisteet ≤6 syöpäpotilaille, joilla koepala Gleason pisteet ≥7 myöskään havaittu merkittäviä eroja (taulukko 3).

mitokondrioiden CR sekvensoitiin ja analysoitiin välillä nukleotidiasemien 16145 ja 530. Kaksisataa ja yhdeksäntoista polymorfismien todettiin joukossa 582 aiheita, 197 homoplasmic yhden emäsparin vaihtoa, 10 yhden emäsparideleetioita ja 5 yhden emäsparin insertiot verrattuna tarkistetun Cambridge Reference Sequence. Kaksi näytettä esitteli samaan 6 emäsparin deleetio nukleotidien 106 111. CA-deleetio asemissa 514 ja 515 tapahtui 40 kertaa, ja CA-insertiot ja CACA-insertiot havaittiin myös tämän sivuston 64 kertaa. CC-insertiot tapahtui asemissa 302 ja 310, ja heteroplasmy havaittiin yhdessä näytteessä (A 16280 A /G). Näistä 219 polymorfismien, 16 ei ole lueteltu MITOMAP tai ihmisen mitokondrio Genome Database (www.mitomap.org; www.genpat.uu.se/mtDB/). Kaikki polymorfismit ja niiden taajuuksia ohjaus ja syövän opintoryhmää on lueteltu Täydentävä taulukossa S1.

Kaksi 219 polymorfismien – 189 G, ja T 310 C – havaittiin merkittävästi alhaisempi taajuus syöpäpotilaiden kontrolliin verrattuna väestöön (p 0,05) (taulukko 4, täydentävä taulukko S1). Kuitenkin merkitys oli kadonnut korjauksen jälkeen monimuuttujille (Bonferroni analyysi), johtaa uuteen vaaditun merkitsevyystasolla 0,00023. Taulukossa 4 35 polymorfismit taajuudella ≥5% joko ohjaus tai eturauhassyövän tutkimusryhmän.

Keskustelu

tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli jäljitellä kyselyn varaaja et ai. [18], joka suoritti tapauskontrollitutkimuksessa 221 valkoinen miesten eturauhassyövän ja 246 valkoista valvonta Pohjois-Amerikassa ja löysi mitokondrioiden Haploryhmä U on yliedustettuna syövän ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (OR: 1,95). Lähi Euroopan valkoihoisten emme löytäneet merkittäviä eroja haplogroup jakaumat eturauhassyöpäpotilailla kontrolleihin verrattuna. Säätö monimuuttujille tutkimiseen käytetään Booker et al. johti myös menetys tilastollisen merkitsevyyden [18]. Haplogroup jakelu Pohjois-Amerikan tutkimuksen muistuttaa läheisesti jakelun meidän syöpäpotilailla, kun taas verrokkiryhmässä tutkimuksessa Bookerin ym. [18] on aliedustettuna ajaksi haplogroup U noin 45% verrattuna meidän kontrolliryhmässä (taulukko 5). Kun vertasimme Amerikan tapauksessa ryhmä Itävallan kontrolliryhmään ei merkittäviä yhteenliittymän haplogroups eturauhassyöpää havaittiin.

sulje pois sitä mahdollisuutta, että ottaa eturauhasen ongelmia yleensä – osoitetaan kohonnut PSA seerumipitoisuuksilla potilaamme ja kontrolliryhmän – liittyy suurempi haploryhmä U taajuus, me arvioitu, haplogroup U taajuus kesken osallistujien SAPHIR tutkimuksessa (Salzburg Atherosclerosis Prevention Program, kuten aiemmin julkaistu [14], [20]). Taajuudet Haploryhmä U meidän ohjaus ja eturauhasen syöpä ryhmät eivät ole merkittävästi poikkea näistä terveen SAPHIR koehenkilöillä. Alaryh- tästä väestöstä, joka koostuu vain miehistä (n = 988, keski-ikä 49 vuotta), on myös taajuus haplogroup U samanlainen eturauhassyövän ryhmä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi taajuus haplogroup U joukossa 277 satunnainen länsieurooppalaiset valkoihoisten tutkineet Brandstätter et al. [21] ei myöskään ole merkittävästi erilainen kuin taajuus meidän kontrolliryhmässä (taulukko 5). Tutkittavat Kyseisen tutkimuksen otettiin samalla yliopistollisen sairaalan Itävallassa missä potilas ja ohjaus kohortit recruted.

mtDNA liittyviä epidemiologisia tutkimuksia tärkeyttä asianmukaisten kontrolliryhmien on korostettu aiemmin [22], [ ,,,0],23]. On olemassa useita syitä, jotka voivat selittää discrepant tuloksia. Esimerkiksi alueellinen vaihtelu, iästä tai sukupuolesta erot voivat vaikuttaa lopputulokseen tilastollisia laskelmia. Varaaja et ai. [18] ei määritetä, onko heidän valvonnassaan koostui kokonaan tai miesten myös naisia. Valvonnassaan kohortti koostui elinluovuttajien joka Yhdysvalloissa on mainittava selkeästi haluavansa tulla luovuttaja; Näin riippuen taipumukset eri etnisten ryhmien luovuttaa elimiä, Elinluovuttaja pankit saattavat esiintyä eri Haploryhmä jakaumat verrattuna väestöön. Keski-ikä niiden valvonta oli vähemmän kuin syöpäpotilailla. Ikä voi vaikuttaa alueellista väestöä vaihtelu, erityisesti maassa, kuten Yhdysvalloissa, jossa on suuri maahanmuuttajaväestön. Muuttoprofiili saattanut muuttua ajan kuluessa, mikä johtaa eri Haploryhmä jakaumat eri ikäryhmissä väestöstä.

Toisessa Yhdysvaltalaisessa tutkimuksessa, jossa pyrittiin jäljittelemään havainnot Bookerin ym. [18] suhteen yhdistyksen välillä Haploryhmä U ja eturauhassyöpä valkoisten miesten, Canter et al. [24] ilmoitetaan Haploryhmä U prosenttiosuudet 26,7% niiden eturauhassyöpä ryhmä (n = 71) ja 11,7% niiden kontrolliryhmässä (n = 128). Rajoituksena niiden tutkimus on vähäinen määrä eturauhassyöpäpotilaalla. Lisäksi niiden lyhyt selvitys ei anna ominaisuuksia tutkimukseen osallistuneista tai miten ne on valittu.

Sitä ei voida sulkea pois, että maantieteellinen vaihtelu haplogroup taajuuksien verrokkitutkimuksen väestö on läsnä välillä Itävallassa ja Yhdysvalloissa.

mukaisesti tuloksemme, korealainen tutkimuksessa ei havaittu yhteyttä mitään mitokondrioiden haplogroups ja eturauhassyövän [25]. Yhteiset 22. Itä-Aasian haplogroups tutkittiin ja tilastollisesti merkittävää eroa jakaumat mtDNA haplogroup frekvenssi välillä havaittiin tapauksessa (n = 139) ja kontrolliryhmissä (n = 122).

vertailu CR polymorfismit syöpäpotilaiden valvonnan löysimme kaksi 219 tilastollisesti merkittäviä eroja, jotka menettivät merkitystään korjauksen jälkeen monivertailuja.

Kuten olemme analysoineet vasta mitokondrioiden haplogroups ja valvonta-alue polymorfismien, emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että polymorfismeilla mitokondrioiden koodaavan alueen, ei sisälly ennalta haploryhmä polymorfismien, voisi liittyä eturauhasen syöpä. Toinen rajoitus analyysimme on pieni tutkimus virtaa. Erittäin suuret otoskoot vaadittaisiin luotettavasti havaita vaatimaton ero haplogroup frekvenssi kahden ryhmän välillä [26].

Somaattiset mutaatiot mtDNA on raportoitu erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien eturauhassyöpä [27], [ ,,,0],28]. Tässä tutkimuksessa vain veren genomista DNA näytteet käytettävissämme, ja näin ollen ole assosiaatioita somaattisten mutaatioiden /polymorfismien voitiin määrittää.

Yhteenvetona emme löytäneet mitokondrioiden haplogroups tai CR polymorfismien liittyvän eturauhassyöpä itävaltalainen väestö.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus tehtiin mukaan Itävallan geenitekniikkalain ja noudatetaan Helsingin julistuksen. Tutkimuksessa ja käyttö arkiston näytteitä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Innsbruckin Medical University (tutkimus YK 3174). Näytteet arkistoidaan 1995-2006 käytettiin tutkimuksessa. Kirjallinen suostumus saatiin lähtemällä vuonna 2001.

Potilaiden ja verrokkien

Yhteensä 582 valkoihoisiin analysoitiin; kaikki rekrytoitiin Department of Urology, että Innsbruckin Medical University. Potilaiden ja verrokkien otettiin Tirolin varhaiseen havaitsemiseen ohjelma eturauhassyövän, joka perustuu säännölliseen PSA (eturauhasen spesifisen antigeenin) testaus [29], [30]. Tapaus ryhmän muodostavat 304 vuotiaat miehet 51-84 vuotta, joilla on diagnosoitu eturauhassyövän histopatologisissa mukaan Maailman terveysjärjestön suositukset. Koska sairaus kontrolliryhmään, 278 vuotiaat miehet 46-80 vuotta hyvänlaatuinen tulokset eturauhasen biopsia on otettu palvelukseen kuten aiemmin on kuvattu [29] (taulukko 1). Jotta tauti kontrolliryhmän keskimäärin seuranta 4,3 vuotta biopsia on saatavilla vaihtelee nollasta 12 vuotta, jos ei syöpä oli diagnosoitu.

DNA eristys ja mtDNA analyysi

DNA eristettiin jäädytetystä perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t) avulla AllPrep DNA /RNA Mini Kit 50 (Qiagen, Hilden, Saksa). Hierarkkinen järjestelmä mitokondrion haplogrouping, joka yhdistää multiplex PCR-monistus, multiplex yhden emäksen primer extension, ja kapillaari-pohjainen elektroforeettisen erotuksen analysoimiseksi kymmenen haplogroup diagnostiset mitokondrioiden SNP: t (mtSNPs) käytettiin määrittämään Haploryhmä jakautuminen yleisin Euroopan haplogroups, H, U, J, T, K, I, V, W ja X, kuten aiemmin on kuvattu [20].

kuitenkin seuraavat muutokset tehtiin tätä protokollaa: poista alukkeita ja rekisteröimättömät deoksinukleotidit päässä PCR-tuotteet, joka on ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH, USA) sulattaa tilavuudessa 4,5 ui, joka sisälsi 0,5 ui ExoSAP ja 2 ui PCR-tuotetta tehtiin 37 ° C: ssa 60 min, mitä seurasi entsyymin inaktivointi 80 ° C: ssa 15 min. Multiplex primer extension reaktiot suoritettiin kokonaistilavuudessa 5 ui, joka sisälsi 1 ui SNP Start Master Mix (GenomeLab ™ SNP Start Primer Extension Kit, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA), 1 ui PCR-tuotetta, ja 1 ui pohjamaalia sekoitetaan. Kaksi SNP alukkeita muutettiin 8251r: (A)

15GAGGGGGTGCTATAGGGTAAATACGGG ja 16391r: (A)

6TGATTTCACGGAGGATGGTGGTCAAGGGA. Sisäisenä standardina, fluoresoivasti leimattuja alukkeita (Biomers, Ulm, Saksa) pituudet 15 ja 60 emästä käytettiin (15 emästä standardi DY781: CACATGTCGGAGTCT, 60 emästä standardi DY781: TACAGTTCGTGCACACCGGCATCAGCTGTGTGCGAGAGTACTTACTATTGGTTGGCCAGA).

Haplogroups, että voisi olla luokitellaan johonkin yhdeksän suuren eurooppalaisen haplogroups jonka SNP yhdistelmä oli nimetty ”muut”.

CR-sekvenssit analysoitiin välillä nukleotidiasemien 16145 ja 530, mistä 1066-emäsparin fragmentti. Fragmentti monistettiin alukkeilla 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG ja 638r: GGTGATGTGAGCCCGTCTAAAC. PCR suoritettiin 30 ui, joka sisälsi 10 x PCR-puskuria B (Solis Biodyne, Tartu, Viro), 2,5 mM MgCI

2, 333,3 pM eteen ja taakse pohjamaali, 133,3 uM kutakin deoksinukleotiditrifosfaatti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja 0,083 U Hot palo polymeraasi (Solis Biodyne, Tartu, Viro). Lämpökäsittelyyn olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 15 minuuttia, 35 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 58 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 2 minuutin ajan, ja lopuksi 37 ° C: ssa 2 minuutin ajan.

PCR-tuotteet puhdistettiin samalla tavalla kuin kuvattiin haplogroup analyysi (ExoSAP-IT, USB, Cleveland, OH, USA). Fragmentti sekvensoitiin käyttämällä alukkeita 16098f: ACATTACTGCCAGCCACCATG ja 17 f: CCCTATTAACCACTCACGGG. Sekvensointi suoritettiin käyttäen GenomeLab ™ vikakoodit – Quick Start Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) tilavuudessa 10 ui, joka sisälsi 2 ui Master Mix ja 500 pM sopivan pohjamaali. Lämpökäsittelyyn edellytykset sekvensointi suoritettiin 30 sykliä denaturointi 96 ° C: ssa 5 sekunnin ajan, pariutuminen 50 ° C: ssa 5 sekunnin ajan ja laajentamisesta 60 ° C: ssa 4 minuuttia, jonka jälkeen 25 ° C: ssa 10 sekunnin ajan. Näytteet etanoli-saostettiin ja erotettiin kapillaarielektroforeesilla Beckman Coulter CEQ ™ 2000 Genetic Analysis System.

Tilastollinen analyysi

taajuudet kaikkien mitokondrioiden haplogroups ja CR polymorfismien eturauhassyövän potilaiden ja verrokkien testattiin itsenäisyys käyttämällä Pearson chi-square tilastoja ja Fisherin testiä tarvittaessa. Lisäksi samalla tavalla, taajuudet mitokondrioiden haplogroups potilailla, joilla on eturauhassyöpä ja koepalan Gleason Pisteet ≤6 ja potilailla, joilla on eturauhassyöpä ja koepalan Gleason Pisteet ≥7 testattiin. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Analysointiin CR polymorfismien merkittäviä p-arvot korjattiin monimuuttujille mukaan Bonferroni analyysi (vaaditaan merkitsevyystaso = 0.05 /vertailujen määrä), johtaa uuteen vaaditun merkitsevyystasolla 0,00023 [vertailujen lukumäärä = 219]. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 15.0 opiskelija versio (SPSS GmbH Software, 80339 München, Saksa).

tukeminen Information

Taulukko S1.

Ohjaus alue polymorfismien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0006370.s001

(0,21 MB DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Michaela Öller apua DNA eristäminen, Adel Sakic apua otoksen valinnassa ja DNA eristys, ja Birgit Stenzel valmistelusta kliinisten tietojen joukko. Kiitämme myös Neil D. Jones kriittistä lukemista käsikirjoituksen.