Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on edelleen vaikea hoitaa lähinnä esittely taudin myöhäisessä vaiheessa. Ehdollisesti replikoituva adenovirukset (CRAds) ovat lupaavia syöpälääkkeet, jotka selektiivisesti tappavat kasvainsoluja. Tässä tutkimuksessa arvioitiin tehoa uuden henkilökortti- (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2), joka sisälsi CXCR4 promoottorin valikoivan virusreplikaation syöpäsoluissa yhdessä TIMP2 terapeuttisena siirtogeenin, kohdistaminen matriksimetalloproteaaseja (MMP: t) on hiiren ortotooppisten mallin laajalle levinneestä munasarjasyöpä. Ortotrooppinen malli munasarjasyövän perustettiin kateenkorvattomissa nude hiiriin intraperitonal injektion ihmisen munasarjasyövän solulinja, SKOV3-Luc, jotka ilmentävät lusiferaasia. Kun vahvistus vatsakalvon levittäminen solujen ei-invasiiviset, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään hoitoryhmään: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, ja Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Kaikki hiiret kuvattiin viikoittain seurata kasvaimen kasvua ja uhrattiin saavuttaessaan ennalta määritetyn muuttujiin, myös korkea kasvaintaakkaa ja merkittävä laihtuminen yhdessä kliinistä näyttöä kipua ja kärsimystä. Survival-analyysi suoritettiin käyttäen Log-rank-testiä. Keskimääräinen elinaika PBS kohortin oli 33 vuorokautta; Ad-ΔE1-TIMP2, 39 päivää; Ad5 /3-CXCR4, 52,5 päivää; ja Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, 63 päivää. TIMP2-aseistettu henkilökortti- viivästynyt kasvaimen kasvua ja merkittävästi lisääntynyt eloonjääminen verrattuna aseeton henkilökortti-. Tämä terapeuttinen vaikutus vahvistettiin välittyvän estämällä MMP-9. Tulokset

in vivo

tutkimuksessa tukea translationaalinen potentiaalin Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 hoitoon ihmisen joilla on pitkälle edennyt munasarjasyöpä.

Citation: Yang SW, Chanda D, Cody JJ , Rivera AA, Wæhler R, Siegal GP, et al. (2011) ehdolliseen replikointi adenovirus ilmaiseminen TIMP2 Lisäykset Survival in hiirimallissa Disseminated munasarjasyöpä. PLoS ONE 6 (10): e25131. doi: 10,1371 /journal.pone.0025131

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 27, 2011; Hyväksytty: 25 elokuu 2011; Julkaistu: 12 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää R01CA108585, T32 CA075930, ja University of Alabama at Birmingham, Patologian osasto Research Fund arvostetaan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava syy gynekologisen syövän kuolemaan Yhdysvalloissa [1]. Merkittävä sairastuvuuteen ja kuolleisuuteen potilailla, joilla on tämän ryhmän kasvainten johtuu siitä, että potilaat esittää ainoastaan ​​epäspesifinen oireita alkuvaiheessa, mikä estää sen diagnoosi [2]. Suurin osa potilaista diagnosoidaan vaiheen III tai ulkopuolella, jossa syöpä on levittää koko vatsaonteloon, mikä johtaa huonoon ennusteeseen. Nykyiset hoitomuodot on rajoituksia, koska viiden vuoden pysyvyys on pysynyt ennallaan 50% viimeisen neljän vuosikymmenen [3]. Siten uusi ja tehokkaasti kohdennettuja hoitomuotojen levitetään taudin kiireellisesti.

ehdolliseen replikoituvan adenovirukset (CRAds) ovat lupaava uusi luokka terapeuttisten, koska nämä virukset on mahdollista valikoivasti ja itsensä alati replikoida ja lyse syöpä solujen hävittämiseksi koko kasvain [4]. Kliinisiin tutkimuksiin CRAds ovat toistaiseksi osoittaneet turvallisuuteen onkolyyttisten adenovirusten. Kuitenkin vaatimaton terapeuttinen tehokkuus voidaan CRAds ehdottaa optimoidaan tehokkaaseen kliinisen käännös on tarpeen [5]. Yksi strategia laventaa antituumorivaikutuksen tehosta hyödyntää henkilökortti- alustana toimituksen terapeuttisen siirtogeenin, lisäksi niiden onkolyyttisten potentiaali [6]. Tätä varten me arveltu, että tehosta jäljittelevän adenoviruksen voitaisiin parantaa hoitoon munasarjasyöpä aseistamalla geenillä, joka toimii isäntä microenvironment, koska vuorovaikutus syöpäsoluihin ja sen mikroympäristölle on tiedetty moduloida kasvaimen etenemistä [7], [8], [9].

(MMP: t) ovat monipuolinen perheen proteaasien, joka pystyy hajottamaan useita komponentteja soluväliaineen (ECM) [10]. Ne ovat yksi ihanteellinen tavoitteet munasarjasyövän hoidossa, koska niiden dysregulaatio on osoitettu edistetään kasvaimen kasvun, angiogeneesin, invaasio ja metastaasi [11]. Erityisesti, MMP-2 ja MMP-9 ovat johdonmukaisesti yläreguloituja munasarjasyövän ja niihin liittyy huonoon ennusteeseen [12], [13]. Tärkeää säätelijänä MMP ovat niiden endogeenisten estäjien kudosta estäjä metalloproteinaasien (TIMP), perheen pieniä eritettyjen proteiinien, jotka toimivat sitoutumalla suoraan aktiiviseen MMP estäen siten niiden toimintaa. Tähän mennessä neljä nisäkkään TIMP on havaittu [14]. Niistä TIMP perheenjäseniä, TIMP-2 on ainutlaatuinen kyky estää kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä läpi polkuja myös riippumattomia MMP esto [15], [16], [17]. Oletimme, että tuotanto TIMP2 viruksen tartunnan soluista pitäisi sitoa ja estää ylimääräisen solunulkoisen MMP ja siten estää kasvaimen etenemisen kautta sekä MMP-riippuvaista ja MMP-riippumaton polkuja.

Aiemmin olemme kehittäneet ja määritettiin terapeuttisen potentiaalin TIMP2 aseellisen henkilökortti-, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, munasarjasyövän hoidossa [18]. Transduktion valikoivuus henkilökortti- saavutettiin geneettisesti korvaamalla Ad5 nuppi kanssa Ad3 nuppi, joka kiertää coxsackie- ja adenovirus-reseptori (CAR) ja ohjaa sitoutuminen Ad3 reseptoriin, joka on runsaammin ilmentyy munasarjasyöpäsoluja [19], [ ,,,0],20]. CXCR4-promoottori käytettiin välittävän kasvaimen selektiivisen vektorin replikaatiota, koska se on ylivoimainen aktiivisuus sekä vakiintuneiden ihmisen munasarjasyövän solujen ja potilaasta peräisin primaarikasvaimen kudoksia [18]. Lisäksi aktiivisuus CXCR4 promoottori on minimaalinen maksassa, suuret elimen tiedetään moduloida systeemisesti toimitetaan adenovirusvektorit [21]. TIMP2 geeni sisällytettiin estävän kasvaimen etenemistä. Olemme äskettäin vahvistettu

in vitro

, että Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 tuotettu toiminnallinen TIMP2, kuten estämällä entsymaattisen hajoamisen gelatiinia aktiivisen MMP: [18]. Sillä TIMP2 aseellisen henkilökortti- olevan tehokas, oli tärkeää, että ilmaus TIMP2 ei heikennä viruksen replikaatioon tai sen onkolyyttistä teho. Olemme viime aikoina osoittaneet, että sekä viruksen replikaatiota ja onkolyyttisten teho ei vaarannu sekä SKOV3.ip1 ja OV-4 ihmisen munasarjasyöpäsoluja aseistamalla kanssa TIMP2 [18]. Lisäksi me osoitimme, että oli valikoivuus replikaation kanssa CXCR4-promoottori, kuten on esitetty korkeamman tason replikoitumaan munasarjasyöpäsoluja, verrattuna valvoa fibroblasteissa. Kohti kääntäminen tämä virus klinikalle, me käytettiin edelleen käyttöä koskevan

ex vivo

mallijärjestelmä tutkia edelleen virusreplikaation kasvaimissa kudoksissa saatiin potilailta, joilla oli vahvistettu vaiheen III ja IV munasarjasyöpä. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat johdonmukaisesti korkean tason replikointi Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 [18]. Yhdessä nämä tiedot olivat hyvin rohkaisevia, mikä viittaa siihen, että Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 voisi olla tehokas edenneen munasarjasyövän. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittämään terapeuttista tehoa Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 on hiiren potilaalle tehdä mallin levittää munasarjasyöpä. Syövän etenemistä seurattiin ei-invasiivisia

in vivo

kuvantamiseen. Tulokset Tämän tutkimuksen osoitti merkittävän kasvun selviytymisen hoidon jälkeen Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, mikä viittaa sen mahdollisuudet kliinisen käännöstä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

tulikärpäsen lusiferaasi ilmentävä munasarjan adenokarsinooman solulinjan SKOV3-luc luovutti ystävällisesti Dr. R. Negrin (Stanford Medical School, Stanford, CA). A549-ihmisen keuhkokarsinooma solulinja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Molemmat solulinjat viljeltiin 01:01 seos Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) ja Hamin F-12-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) , L-glutamiinia (2 mM), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml), 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, ja 5% CO

2. Media ja täydennykset ostettiin Mediatech (Herndon, VA).

Rakentaminen ja tuotannon virusten

Ad-ΔE1-TIMP2 on E1-, E3-poistetut replikaatiovialliset Ad5 vektorin ilmaisee TIMP2 valvonnassa CMV-promoottorin [22]. Ad5 /3-CXCR4, on henkilökortti- kanssa CXCR4 promoottori työnnetty E1A asentoon yhdessä tropismista-modifioitu kuitu, joka sisältää Ad5-säikeen akselin ja hännän, joka on ollut nuppi verkkotunnuksen korvattu kuin Ad3 virus [23]. Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 rakennettiin käyttäen ihmisen täyspitkän TIMP2 cDNA kuten aiemmin on kuvattu [18]. Replikaatio-puute adenovirus, Ad-ΔE1-TIMP2 kasvatettiin 293-soluissa. CRAds, Ad5 /3-CXCR4 ja Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 monistettiin A549 solulinjassa. Kaikki virukset puhdistettiin kaksi kierrosta cesiumkloridia tiheys sentrifugoimalla. Tiitterit viruspartikkelien ja infektoivaa yksikköä määritettiin aikaisemmin kuvatulla [24].

Orthotopic munasarjasyöpä malli ja vektori hoito

BALB /c nu /nu hiirille 6 tai 8 viikon ikä saatiin National Cancer Institute-Frederick Animal Production Area (Frederick, MD) ja karanteenissa 2 viikkoa. Hiiriä pidettiin patogeenivapaissa olosuhteissa mukaan American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care ohjeita. Animal pöytäkirjat tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitea University of Alabama at Birmingham.

In vivo

optisen kuvantamisen suoritettiin pieneläinten kuvantamisen core facility kokonaisvaltaisessa Cancer Center of University of Alabama at Birmingham. Päivänä 0 hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (i.p.) 5 x 10

6 SKOV3–luc solua 250 ul: ssa PBS: ää ja kuvattavan varten bioluminesenssi saada perustason lukemat. Kahdeksan päivää myöhemmin hiiret reimaged varmistamiseksi kiinnittymisestä kasvaimia ja sitten jaettiin sattumanvaraisesti neljään ryhmään: PBS, Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, ja Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, jossa n = 10 ryhmää kohti. Jokainen hiiri injektoitiin i.p. 2 x 10

8 IU annetuista viruksen 200 ul PBS, tai pelkkää PBS: ää. Kaikki hiiret kuvattiin ja bioluminesenssin viikoittain sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion seurata kasvaimen kasvua. Kaikki hiiret seurasi päivittäin nauhoittaa selviytymistä. Elinaika heijastaa aika, joka tarvitaan, jotta eläimet voivat päästä molemmat seuraavat parametrit. Ensinnäkin kliinistä näyttöä kipua tai tuskaa. Toiseksi, mikä tahansa ennalta määrätty mitattavissa päätepisteet, mukaan lukien: laihtuminen yli 15%, tai painonnousu yli 20% kehon painosta. Eläinten paino mitattiin päivänä 0 ja arvostetaan joka 3 päivä ennen kokeen loppuun. Survival tiedot piirrettiin käyrälle Kaplan-Meier käyrä, ja eri ryhmien verrattiin käyttäen Log-rank (Mantel-Cox) testi (GraphPad Prism Software v.5).

Bioluminescence kuvantamisen havaita

vuonna vivo

lusiferaasiekspressio

Hiiret kuvattiin päivänä 0 bioluminescent signaalin injektion jälkeen SKOV3–luc-solujen saamiseksi perustason käsittelyyn kasvaimen taakkaa. Kuvaus suoritettiin uudelleen ennen ensimmäistä hoitoa päivänä 8 ja sitten viikoittain, kunnes hiiret tapettiin. Lyhyesti, 150 mg /kg D-lusiferiini ruiskutettiin i.p., ja hiiret nukutettiin isofluraanilla kaasu anestesian ja laitettiin valonpitävään kammioon. Valokuvaus (harmaa-asteikko) viite kuva saatiin 10 minuutin kuluttua D-lusiferiini injektio, ja bioluminescent kuva kerättiin heti sen jälkeen. Kuvat saatiin CCD jäähdytetty -120 ° C, käyttäen IVIS -100 Imaging System (Xenogen Corp., Alameda, CA), jossa näkökenttä asetettu 25 cm: n korkeuteen. Bioluminescent käytetyt kuvat vastuut vaihtelevat 1 ja 10 s, 1 f /stop, 4 binning, ja avaa suodatin. Tiedonkeräysohjelmilla kalibroitiin niin, ettei pikseliä kyllästettiin aikana kuvakokoelman. Bioluminescent ja harmaasävykuvia peitettiin käyttämällä LivingImage ohjelmistoa. Living Image Software (Xenogen, Alameda, CA) käytettiin myös saamiseksi pseudovärin kuva edustaa bioluminenssina voimakkuus (sininen, vähiten voimakas, ja punainen, voimakkain). Tutkittavat alueet ympärille piirretään i.p. kasvaimia, ja koko määrä (fotonit) laskettiin yhteen koko kasvaimen alueelle. Kokonaismäärä laskee normalisoituivat kuva hankinta aika (fotonit /s). Tilastoeroja kasvaimen koon ryhmissä arvioitiin Studentin t-testiä.

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD.

immunohistokemia

Hiiret lopetettiin suurella tuumorikuorma mukaan ennalta määrättyjen parametrien, kuten edellä määriteltiin. Hetkellä uhrauksia, ruumiinavauksen tehtiin 3 hiirtä kustakin hoitoryhmässä, joista kasvaimet ja tärkeimpien elinten kerättiin ja kiinteät osaksi parafiinilohkoihin. Lyhyesti, parafiinileikkeillä Ksenosiirretyn ihmisen munasarjan kasvaimet poistettiin parafiini ksyleenillä ja sammutettua kautta arvostellaan alkoholia. Antigeeni haku suoritettiin sitraattipuskurilla (pH 6,0), alle höyryä 20 min. Leikkeitä jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, ja endogeeninen peroksidaasi poistettiin käyttäen 0,3% H

2O

2 metanolissa 30 minuutin ajan ja blokattiin 5% BSA: ssa 30 minuuttia. Kudosleikkeitä inkuboitiin sitten primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Leikkeitä pestiin fosfaattipuskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (PBST) ja inkuboitiin jälleen huoneenlämpötilassa biotiini-konjugoitu vuohen anti-vuohi /anti-hiiri-vasta-aineen kanssa 2 h ajan. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin streptavidiini-konjugoitua piparjuuriperoksidaasi 1 h huoneen lämpötilassa. Kun toinen pesun PBST immunohavaitsemis- suoritettiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia-H

2O

2 (Vector Labs) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä.

Tulokset

viritys kanssa TIMP2 viivästynyt kasvaimen kasvua

in vivo

arvioimiseksi terapeuttista tehoa Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 kliinisesti relevantti

in vivo

mallissa, me tuotti ortotooppisesti levitetään munasarjojen syöpä injektoimalla naispuolinen nude-hiirissä ihmisen SKOV3–luc soluja vatsaonteloon (ip). Lusiferaasia ilmentäviä stabiileja solulinjaa käytettiin seuraamaan terapeuttista tehoa hoitojen invasiivisen kuvantamisen

in vivo

. Kahdeksan päivää kasvainsolujen annon jälkeen hiiret uudelleen kuvaamisen varmistaa istuttamista kasvaimia ja jaettu neljään hoitoryhmään, 10 hiirtä ryhmässä. Kontrolliryhmiin saivat PBS: ää, replikaatiodefisientti ilmentävän TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), tai CXCR4 promoottori säädelty henkilökortti- kimeerisen Ad5 /3 fiber (Ad5 /3-CXCR4). Terapeuttinen ryhmä sai TIMP2 aseellisen CXCR4 promoottori perustuu henkilökortti- kimeerisellä Ad5 /3 kuitu (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) (Fig. 1). Kaikki hiiret kuvattiin jälkeen i.p. injektiot D-lusiferiini viikoittain. Paneeli edustavat kuvat esitetään kuviossa. 2A, kun taas kvantitatiivinen määritys bioluminesoivista signaalit on esitetty kuviossa. 2B. Alhainen bioluminoivat signaalit SKOV3–luc-soluja havaittiin niinkin aikaisin kuin 8 päivää kasvaimen solujen injektion, ja ne olivat suhteellisen yhdenmukaisia ​​neljän ryhmän. Päivällä 22, oli merkittävä kasvaimen kasvua PBS-ryhmässä ja Ad-ΔE1-TIMP2 hoidetussa ryhmässä. Sitä vastoin ryhmissä käsiteltyjen CRAds oli merkittävää inhibitiota kasvaimen kasvuun. Ryhmä käsitelty tavoitteen virus, Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, näytteillä kasvaimen regressio päivänä 22. päivänä 30, oli huomattavaa tuumoritaakka PBS-ryhmässä, kun hiiret osoittivat huomattavaa kasvua vatsan ympärysmitan ja alkoivat merkkejä taudeista. Sen sijaan, kasvaimen kasvu estyi merkittävästi kaikissa ryhmissä käsiteltiin viruksia (p 0,001). Päivällä 36, suurin osa hiiristä PBS-ryhmässä oli kuollut raskas kasvaintaakka. Tänä ajankohtana, hiiriä hoidettiin Ad-ΔE1-TIMP2, alkoi näyttää huomattavan kasvaintaakkaa. Kuitenkin, molemmat ryhmät käsiteltiin CRAds oli huomattavasti vähemmän bioluminescent signaalin (p 0,001), mikä osoittaa, hitaampi kasvaimen kehittymisen. Lisäksi kasvain taakka ryhmä hiiriä hoidettiin Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, aseellisesta henkilökortti-, oli merkittävästi vähemmän verrattuna tuumoritaakka hoidetuilla hiirillä sekä Ad5 /3-CXCR4 ja aseettoman henkilökortti- (p 0,01 , Fig. 2B). Samanlainen suuntaus eloonjäämisen hoidon jälkeen eri vektoreilla havaittiin kahden ohjaajan tutkimuksissa vähemmän eläinten määrä ryhmää kohti (tietoja ei esitetty). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä viruksen replikaatiota ja viritys kanssa TIMP2 osaltaan tarkoitus on hidastaa kasvaimen kasvua.

Adwt300, on villityypin Ad5 virus. Ad-ΔE1-TIMP2 on E1-, E3-poistetaan replikaatiovialliset Ad5 vektori, joka ilmentää TIMP2 valvonnassa CMV-promoottorin E1. Ad5 /3-CXCR4 on aseeton henkilökortti- kanssa CXCR4 promoottorin E1 rajoittaa virusreplikaation syöpäsoluihin yhdessä Ad5 /3 modifioitu kuitu, joka sisältää varren ja pyrstö Ad5 kuidun ja Ad3 kuidun nuppi. Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 on henkilökortti- kanssa CXCR4 promoottorin E1, aseistettu TIMP2 vuonna E3B alueen ja edellä mainitun F5 /3 modifioitu kuitu.

Disseminoitunutta kasvaimia todettiin injektoimalla 5 x 10

6 SKOV3–luc solujen ip naaraspuolisiin kateenkorvattomiin nude-hiiriin päivänä 0. Päivänä 8, hiiriä käsiteltiin joko i.p. injektion PBS, tai 2 x 10

8 IU Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4, ja Ad5 /3-CXCR4-TIMP2, vastaavasti. Bioluminesenssi mitattiin viikoittain. (A), pseudovärin kuva edustaa bioluminenssina voimakkuus päivinä 8, 22, 30 ja 36. (B), bioluminesenssia intensiteettiä vatsan alueella kvantitoitiin ja normalisoitu, ja keskimääräinen fotoni impulssit sekuntia kohden kussakin ryhmässä on esitetty tietyn päivän . Tiedot, jotka ilmoitetaan keskiarvona ± SD kussakin testiryhmässä. * P 0,05.

viritys kanssa TIMP2 elonjäämisetua

Kaikki hiiret olivat sitten seuraa hengissä kuten kuvassa. 3A. Keskimääräinen elinaika oli kasvanut 33 päivää, että PBS kohortin, 39 päivää kohortin injektoitu replikoituvissa ilmentävän TIMP2 (Ad-ΔE1-TIMP2), tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,03). Kohortti käsitelty aseeton henkilökortti- (Ad5 /3-CXCR4) oli keskimääräinen eloonjäämisaika 52,5 päivää, kun taas kohortti käsitelty TIMP2 aseellisen henkilökortti- (Ad5 /3-CXCR4-TIMP2) oli keskimääräinen eloonjäämisaika 63 päivää ( Fig. 3B), tämä ero on tilastollisesti merkitsevä (p 0,002). Yhteenvetona virityksen kanssa TIMP2 näyttää olevan käyttökelpoisia hoidettaessa levittää munasarjasyövän, koska se elonjäämisetua

in vivo

.

Hiiriä seurattiin hengissä. Survival tiedot piirrettiin Kaplan-Meier-käyrä (A). Hoito Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 merkittävästi parannettu eloonjääminen verrattuna hoitoon Ad-ΔE1-TIMP2, Ad5 /3-CXCR4 tai PBS (p 0,05). (B), eloonjäämismediaani päivinä kussakin testiryhmässä.

TIMP2 ilmentyy tuumoreissa aseellisen virusten

Voit selvittää, elonjäämisetua nähty TIMP2 aseellisen henkilökortti- verrattuna aseeton henkilökortti- johtui modulaatioon microenvironment mukaan TIMP2, ilmaus TIMP2 ensimmäistä kertaa tutkituilla tuumorit leikattiin kustakin hoitoryhmässä ruumiinavauksessa. Kuten nähdään Fig. 4, kasvaimet irrotettiin joita hoidettiin PBS ja Ad5 /3-CXCR4 olivat negatiivisia TIMP2 ilmaisua. Tuloksena immunohistokemia osoitti, että kasvaimia leikattiin kohortin käsitelty Ad-ΔE1-TIMP2, TIMP2 ekspressio oli vähäistä ja ilmestyi rajoittuvat kehän kasvain. Tämä ei ollut odottamatonta, koska Ad-ΔE1-TIMP2 on ei-replikoituva vektori ja sen ei odoteta levittää sisällä kasvain tehokkaasti. Sen sijaan kasvaimet käsiteltyjen hiirien Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 osoittivat parannettu TIMP2 värjäytymistä koko kasvain, mikä osoittaa, että tämä onkolyyttisten virus oli tehokas infektoimaan ja jäljittelemällä koko kasvaimeen.

Lopettamishetkellä hiirien takia tuumorikuorma, kasvaimet kerättiin merkitty hoitoryhmässä ja tutkittiin ilmentymistä TIMP2 immunohistokemiallisesti.

TIMP2-aseellisen henkilökortti- laski tasolle aktiivisen MMP

TIMP2 on tunnettu estäjä MMP2 ja MMP-9. Näin ollen, värjäys aktiivisen MMP2 ja MMP9 suoritettiin sen määrittämiseksi, onko tasot vaikuttaa. Tämän analyysin tulokset osoittivat, että kasvaimia ryhmistä käsiteltiin PBS, Ad5 /3-CXCR4, ja Ad-ΔE1-TIMP2, kaikki näytteillä korkea aktiivisen MMP2. Sen sijaan kasvaimet ryhmästä käsiteltiin Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 oli hyvin alhainen MMP2. Identtinen malli havaittiin myös MMP-9 ilmaisun immunohistokemiallisesti. Ryhmät käsiteltiin PBS, Ad5 /3-CXCR4, ja Ad-ΔE1-TIMP2, kaikki näytteillä immunoreaktiivisuus aktiivisen MMP-9. Sen sijaan kasvaimet ryhmästä käsiteltiin Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 oli hyvin alhainen aktiivisen MMP-9 ilmentymisen (Fig. 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että TIMP2 erittyvän aseistetut henkilökortti- oli myös tehokkaita estämään MMP2 ja MMP-9 toimintaa.

Tuolloin uhri hiirten takia tuumorikuorma, kasvaimet kerättiin osoitetusta hoitoryhmässä ja tutkittiin ilmaus MMP-9 immunohistokemiallisesti.

TIMP2-aseellisen henkilökortti- esti angiogeneesiä

Lopuksi kasvaimet tutkittiin ilmentymisen CD31, merkkiaine angiogeneesiä. Kohortteja käsitelty PBS: llä, Ad-ΔE1-TIMP2, ja Ad5 /3-CXCR4, oli suuri halkaisija alusten minimaalinen immunoreaktiivisuus vuori endoteelisolujen seinät verrattuna ikäluokat käsiteltiin Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 (Fig. 6).

Kasvain ryhmittymiä vatsan alueella kerättiin aikana uhri eläinten osoitetusta hoitoryhmässä ja kiinteä. Viisi uM osissa parafiiniblokit kasvaimen kudokset värjättiin ihmisen CD31-vasta-aineen havaitsemiseksi verisuonistossa.

Keskustelu

tärkeys vuorovaikutusta kasvainsolujen ja microenvironment modulointiin kasvain eteneminen on tunnustettu jo pitkään [25]. Patogeneesissä munasarjasyöpä, MMP-2 ja MMP-9 ovat jatkuvasti voimistunut [12]. Lisäksi kohonneita näiden MMP korreloivat negatiivisesti säilymiseen, koska ne liittyvät pitkälle, laadukkaat vatsaonteloon sekä positiivinen (metastasoituneen) imusolmuke [13]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että MMP: t ovat voimassa terapeuttisina kohteina munasarjasyövän hoitoon. Keskeinen säädin MMP on niiden endogeeninen inhibiittorit, TIMP. Neljä nisäkkään TIMP on tunnistettu tähän mennessä, niiden joukossa TIMP2 on laajimmin tutkittu, koska sen kyky estää kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä erilaisia ​​mekanismeja riippumaton suoran MMP-inhibitio [15], [16], [17]. TIMP2 voi estää endoteelisolujen proliferaation induktion kautta proteiinityrosiinifosfataasi toimintaa [17]. TIMP2 estää myös kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä lisäämällä aktiivisuutta mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin fosfataasin 1 [15]. Kun pyritään kehittämään onnistuneen henkilökortti- suunnattu hoitoon levittää munasarjasyövän, ehdotimme, että varustamalla se TIMP2 olisi lisätä terapeuttista tehoa henkilökortti- estämällä kasvaimen etenemisen kautta sekä MMP-riippuvaista ja MMP-riippumatonta reittejä.

meidän äskettäisessä tutkimuksessa olemme tunnettu ja arvioitiin tehoa Ad5 /3-CXCR4-TIMP2

in vitro

. Olemme vahvistaneet, että TIMP2 ilmaisua ei heikennä viruksen replikaatioon tai onkolyyttistä teho viruksen. Lisäksi valikoivan replikaation saavutettiin kanssa CXCR4 promoottori. Validointi Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 on primaarikasvaimen näytteistä viidestä potilaalla on vahvistettu vaiheen III tai IV munasarjasyöpä, paljasti yhdenmukainen korkea taso lisääntymään verrattuna muihin ohjaus viruksia. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, potentiaalin Ad5 /3-CXCR4-TIMP2 varten edenneen munasarjasyövän [18].

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme pyrkineet tehon määrittämiseksi Ad5 /3-CXCR4- TIMP2

in vivo

. Noninvasiivinen bioluminesoiviin kuvantaminen tarjoaa tehokkaan työkalun, joka sallii pitkittäinen seuranta kasvaimen kasvua hiirissä. Lisäksi se antoi meille mahdollisuuden käyttää mallijärjestelmä on kliinisesti merkittävä. Useimmissa tapauksissa munasarjasyövän diagnosoidaan edennyt pitkälle, kun syöpä on levittää koko vatsaonteloon, mikä käyttäen ihonalaisen eläinmallia arvioimaan hoidon tehokkuutta, vaikka kätevä, ei heijasta luonnollista kliinistä etenemistä sairaus. Siksi tehdyn levitetään kasvaimista i.p. injektio SKOV3–luc solut yhdessä kuvantamisen ansiosta voimme käyttää kliinisesti pätevä malli, joka voi tarkemmin ja tehokkaammin ennustaa translationaalinen arvon Ad5 /3-CXCR4-TIMP2. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, herkkyys ja pätevyys bioluminesoivista kuvantamisen i.p. kasvainmuodoista [26], [27], [28].

Hoito TIMP2 aseellisen henkilökortti- merkitsevästi elonjäämisetua verrattuna aseeton henkilökortti-, mutta nousu ei ollut vankka. Esillä olevassa tutkimuksessa, virotherapy annettiin yksi injektio pieniannoksisen viruksen päivänä 8 tuumorin implantaation jälkeen. Sen sijaan monet

in vivo

kokeissa tutkitaan tehoa aloitettu hoito joko ennen tai samana päivänä kasvaimen injektion jälkeen. Lisäksi viruksen käytetyt annokset olivat ainakin yksi-kaksi lokit suurempia ja kautta toimitettiin moniannosantamisia viruksen [29], [30], [31], [32]. Päätarkoituksena rajoittamiseksi vektorin annos esillä olevassa tutkimuksessa oli luoda turvallinen terapeuttinen indeksi. Koska nude mouse käytettävien mallien prekliininen arviointi kokeellisten hoitojen munasarjasyöpä ei ole toimiva immuunijärjestelmä, lisäämällä vektorin annos korkeimmalla tasolla mahdollista saavuttaa terapeuttinen vaikutus ei ole asianmukainen ekstrapolointiin ihmisille kuin korkein vektori annos tulokset aktivointi immuunijärjestelmän aiheuttaa vakavia sivuvaikutuksia. Kuitenkin tiedot tässä tutkimuksessa, on mahdollista, että suuremman annoksen tai useampia annosteluohjelmaa terapeuttinen teho voitaisiin edelleen vahvistaa. Yksi mahdollinen haittapuoli toista hallinnon virus on, että immuniteetti voi tulla merkittävä ongelma ja vaikeuttaa terapeuttista tehoa. Hiljattain julkaiseman

Hemminki ym

mukaan vaikka läsnä merkittäviä immuniteetin Ad5, voisi ohittaa tämän immuniteetin yksinkertaisesti käyttämällä serotyyppi, joka on harvinaisempaa populaatiossa, kuten Ad3 näin päästään terapeuttinen teho ilman tarvetta lisätä viruksen annosta. Tätä periaatetta voitaisiin helposti soveltaa toistoantamisia viruksen, jossa jos koskemattomuus kehittyy serotyypin käytetty, niin voidaan yksinkertaisesti muuttaa selkäranka viruksen vähemmän vallalla serotyypin [33]. Lisäksi lisäämisen viruksen tehoa voitaisiin saavuttaa multimodaalisuudesta lähestymistapaa käyttäen säteilyä tai kemoterapiaa liitännäishoitona hoitojen [34], [35], [36]. Meidän nykyisen käyttöjärjestelmän viruksen kohdistamisen kautta Ad5 /3 on mahdollista, että se voisi mahdollisesti tartuttaa ja replikoida ihmisen immuunisolujen, joiden laajuutta ei voida määrittää tässä mallissa, koska ihmisen adenovirus ei replikoida hiiren kudoksessa ja kateenkorvattomien nude hiirillä ei ole T-soluja. Kuitenkin tämä mahdollinen sivuvaikutus voitaisiin lieventää muuttamalla tropismi viruksen alustan. Perreau

et al

osoitti vähentynyt infektio dendriittisolujen kanssa koiran adenovirus 2 (CAV-2) kuitu nuppi [37]. Täten vaihtamalla kuitu nuppi Ad5 /3 Ad-CAV2, voimme estää transduktio dendriittisolujen. Lisäksi näin voidaan säilyttää CXCR4 promoottorit koska se osoittaa suurta aktiivisuutta tuumorisoluissa.

tuumoribiologiassa luonne vatsakalvon levittäminen munasarjasyövän, sekä paradoksaalinen roolit MMP ja TIMP syövän etenemisen lisää entisestään monimutkaisuutta tehokas taudin hoitoon. Se on vakiintunut, että lisääntynyt MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun munasarjasyöpää negatiivinen korrelaatio ennustetta ja selviytymisen [12], [13], [38], [39], [40], [41]. Kuitenkin erityiset roolit MMP: iden munasarjasyövän etenemisessä ei ole määritelty. Tutkimukset osoittavat, että MMP-2 on pääasiassa tärkeää alussa tumorgenesis aloittamalla etäpesäkkeiden tehostamalla adheesiota munasarjasyövän solujen vatsakalvon [42]. Siten terapiat estää sitä kerran etäpesäke on perustettu ovat tehottomia. Kuitenkin muita raportteja roolia tukevat MMP-9 kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä [43]. Roolit MMP ja TIMP munasarjasyövän edelleen sekoitti immunohistokemiallisella tutkimuksia tarkastelemalla ilmentymistä TIMP2 munasarjasyövän kudoksissa. Vaikka jotkut ryhmät ovat raportoineet alhainen ilmentyminen TIMP2 perusterveydenhuollossa munasarjakasvaimia [38], toiset ovat nähneet kasvanut TIMP2 ilmentymistä munasarjasyövän kudoksissa, mikä viittaa siihen, että TIMP2 edistää syövän etenemiseen, osittain aktivoinnin avulla pro-MMP2 ja estämällä anti- kasvain toiminta MMP [39], [41]. Sen sijaan monet eläinkokeissa hyödyntäen viruksen toimituksen TIMP2 ovat osoittaneet sen hyödyllisyys tukahduttaa kasvaimen kasvua, muuttoliikkeen ja etäpesäkkeiden eri syövän mallit [44], [45], [46], [47], [48]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että ehkä vaikutukset TIMP2 kasvaimen edistäminen tai vaimennus riippuvat ajoitus ja tietyntyyppisen kasvain. Sen sijaan epäspesifinen esto MMP on ehkä hyödyllisempää nimenomaan estää eri MMP aikana vaiheissa syövän etenemisen.

Kehittyvät Kliinisten, patologinen, ja molekyyligenetiikan tutkimukset viittaavat uutta mallia munasarjojen syövän synnyn, jossa munasarjojen syöpä luokitellaan kahteen eri ryhmään, tyypin I ja II [49]. Tyypin I kasvaimet ovat kliinisesti veltto, koska ne kasvavat hitaasti ja yleensä rajoittuu munasarja diagnoosi. Sitä vastoin tyypin II kasvaimet ovat kliinisesti aggressiivisia, läsnä on edennyt pitkälle, ja niiden uskotaan syntyä

de novo

, kuten esiasteleesioita ei ole tunnistettu. Tyypin II kasvaimia, osuus 70% munasarjasyöpä, on tunnusomaista mutaatiot TP53 80%: ssa tapauksista. Nämä uudet tiedot viittaavat siihen, että p53 voisi mahdollisesti olla terapeuttinen kohde aseistaa viruksen munasarjojen syövän hoidossa. CRAds varustettuna p53 on osoitettu

in vitro

parantaa oncolysis kohdunkaulan syövän [50] ja useita muita syövän solulinjat [51]. Toinen mahdollinen terapeuttinen kohde on CXCR4, ainoa kemokiinireseptoria todettu ilmentyvän munasarjasyöpä [52].