Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

In vitro

soluviljelmäkokeita kanssa alkusolut ovat kertoneet, että solujen lisääntymistä hidastuu läsnäollessa ympäristön verrattuna fysiologista O

2 tasoa. Syöpä on ensisijaisesti sairaus poikkeavan soluproliferaation siis tutkimalla syöpäsoluja kasvatetaan ympäristön O

2 voi olla ei-toivottuja. Ymmärtämään paremmin vaikutuksen O

2 leviämistä syöpäsolujen

in vitro

vertasimme kasvupotentiaalia paneelin munasarjasyövän solulinjoissa ympäristön (21%) tai fysiologinen (3% ) O

2.

Keskeiset havainnot

havainnot osoittavat, että samanlainen ensiöparit, monet syöpäsolut säilyttää luontainen herkkyys O

2, mutta jotkut näyttö ali muuttuu O

2-pitoisuuden. Tarkempi analyysi paljasti yhdistyksen välillä viallinen G2 /M solukierron siirtyminen sääntelyn ja O

2 sieto tuloksena päässä yliekspressio 14-3-3 σ. Kohdistaminen 14-3-3 σ yliekspressio kanssa RNAi palautettu O

2 herkkyyden näissä solulinjoissa. Lisäksi olemme havainneet, että metastaattinen munasarjakasvaimia usein yli-ilmentää 14-3-3 σ, joka yhdessä fosforyloidun RB, johtaa huonoon ennusteeseen.

Johtopäätökset

Syöpäsolut näyttää ero proliferatiivisia herkkyys muutoksille O

2-pitoisuuden. Vaikka suora yhteys O

2 sieto ja etäpesäkkeiden ei määritetty, tämä tutkimus osoitti, että O

2 tunteeton fenotyypin syöpäsolut korreloivan metastaattisen syövän etenemiseen.

Citation: Ravi D, Chen Y, Karia B, Brown A, Gu TT, Li J, et al. (2011) 14-3-3 σ Expression Effects G2 /M vastaus Happi ja korreloi munasarjasyöpä Metastasis. PLoS ONE 6 (1): e15864. doi: 10,1371 /journal.pone.0015864

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 elokuu 2010; Hyväksytty 25 marraskuuta 2010 Julkaistu: 10 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Ravi et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIEHS (K22-ES12264) ja Voelcker Fund Young Investigator Award Max ja Minnie Tomerlin Voelcker rahasto AJR Piispa. Kleberg Center for Molecular Markers at MD Anderson Cancer Center, MD Anderson Cancer Center lääkäri Scientist Program, McNair Scholars tukeman Robert ja Janice McNair Foundation ja American Society of Clinical Oncology (ASCO) Syöpäsäätiön Urakehitys Award (CDA ), Cancer Foundation ja jonka Science Foundation Ireland (SFI) /Health Research Board (HRB (Irlanti)) Translational Research Award (TRA), kaikki BT Hennessy. B. Karia tukee DOD CDRMP Breast Cancer Research Program Predoctoral Harjoittelu Award (BC093931). A. Brown tuetaan NIA T32 koulutus avustus (T32AG021890). Y. Chen tukevat NIH /NCI syöpä keskus avustus (P30 CA054174-17) ja NIH /NCRR CTSA avustus (1UL1RR025767). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

johdetut solulinjat syöpäpotilailla aikaan kokeellisesti koskettelumateriaaliin malli, joka edesauttaa tutkimuksia syövän biologian ja sen hoito. Rajoittamaton leviämisen mahdollisuudet syöpäsolujen on merkittävä tunnusmerkki maligniteetti kuitenkin käyttää standardin kudosviljelmän protokollat ​​rajoittaa usein solujen lisääntymistä, kuten havaittiin ensisijaisen solulinjoilla [1], [2], [3], [4]. Vaikka käyttö fysiologisissa olosuhteissa tiedetään vaikuttavan

in vitro

syöpäsolujen lisääntymistä [5], [6], [7] ja ensisijainen solujen tiedetään levittää paremmin fysiologisiin O

2 vaikutus fysiologisten O

2

in vitro

syöpäsolujen lisääntymistä on suhteellisen tutkimaton. Kuitenkin on raportoitu, että muuttuneen pitoisuudet O

2 aiheuttaa selviä eroja solujen lisääntymisen ja lääkekäsittelyyn syöpäsoluissa [8], [9], [10].

Oxygen lisäksi ravinteita ja kasvutekijöitä, on elintärkeää asianmukaista solujen kasvua ja sen saatavuus on suora vaikutus solujen aineenvaihduntaan, signalointireittien, proliferaatiota, erilaistumista ja eloonjääminen [3], [11], [12], [13]. Monet

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet edut fysiologisen O

2 kudosviljelytutkimukseen. Esimerkiksi biologisesta käyttäytymisestä ensisijaisen soluviljelmissä kanssa fysiologinen pitoisuus O

2 (2,7-5,3%) on huomattavasti parempi verrattuna tavanomaiseen käytäntöön kasvavat solut ilmakehän tai ”ympäristön” O

2 pitoisuus ( 21% O

2) [4]. Itse asiassa nämä kaksi kasvuolosuhteet tiedetään aiheuttavan erillisiä aineenvaihdunnan ja molekyylitason ominaisuudet [13].

on tärkeää tarkastella O

2 jännitys syöpäbiologian on vakiintunut. Esimerkiksi se, että monet syövät esiintyä ”hypoksinen” tila on johtanut kehitystä hypoksian täsmähoitoihin [14], [15]. Yleensä hypoksia pitoisuus O

2 on 1% useimmissa kiinteitä kasvaimia, mutta hypoksia-pitoisuus voi vaihdella solutyypeistä ja normaali perfuusiotilasta [16] ja lisäksi, hypoksia taipumus inhiboida soluproliferaatiota [ ,,,0],17]. Fysiologinen O

2 kireys vaihtelee 2,7-5,3% välitilassa [18], jossa monet primaarikasvainten asuvat, 14,7% vuonna valtimoverenkiertoon ja keuhkot, jossa vaeltavat ja mahdollisesti metastasoituneen syöpäsolut löytyy usein. Siksi syövän tutkimuksiin, joiden vain toteutetaan ympäristön (21%) O

2 voi jäädä asiaan biologisia havaintoja. Tämä voi olla erityisen tärkeää, kun yritetään etenemisen tutkimiseksi syövän etäpesäkkeitä, mikä on merkittävä tapahtuma syövän etiologiasta ja liittyy huonoon ennusteeseen [19]. Ottaen huomioon erot O

2 jännitystä eri osastoihin kehon, ymmärrystä vaikutuksen O

2 keskittyminen syöpäsolujen lisääntymistä voisi tarjota hyödyllisiä oivalluksia mekanismeja patologinen etenemistä syövän.

Syöpäsolut ovat hankkineet mutaatiot joko onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille näyttää ominaisuus hallitsematon leviäminen fenotyyppi [20]. Esimerkiksi tuumorisuppressorit kuten p53 tai RB toimii ”molekyyli portinvartijoita” tiedetään vaikuttavan solusyklin etenemisen. Mutaatio tällaisten tekijöiden helpottaa rajoittamaton proliferaatiota syöpäsoluissa [20]. Solusyklin etenemisen sisältyy peräkkäinen sarja tapahtumia katalysoivat sykliinejä ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) [21], ja normaaleissa soluissa on tiukasti säänneltyä prosessi. Kasvain p53 on päällikön säätelijä G1 /S ja G2 /M faasimuutos solusyklissä [22] ja sen tiedetään olevan tärkeä rooli vastattaessa happipitoisuuden, erityisesti hypoksia ( 1% O

2) [23] tai hyperoksia (95% O

2) [24]. Vaikka tutkitaan vaikutus äärimmäisen O

2 olosuhteet on tärkeä ja paljastava, on huomattava, että nämä aikaisemmat tutkimukset eivät tutkia vastaus p53 fysiologisessa (3%) O

2 ja ympäristön (21%) O

2. p21 ja 14-3-3 σ ovat transkription tavoitteet p53, jotka ovat mukana säädellään G1 /S ja G2 /M-siirtymiä solusyklin kohdistamalla CDK2 ja cdc2 (tunnetaan myös nimellä CDK1), vastaavasti [22], [25] . CDK: t puolestaan ​​säätelevät RB-proteiini-toiminto, välittävän solusyklin etenemisen kautta G1 /S ja G2 /M [26]. Näin ollen häiriöt RB funktio voisi myös vaikuttaa solusyklin etenemisen [26]. Ottaen huomioon, että erot O

2 pitoisuus tuloksen muuttuneessa solusyklin etenemisen ensiöparit mutta syöpäsolujen usein esille solusyklikontrollin vikoja, on selvästi potentiaalia, että nämä viat voivat vaikuttaa miten syöpäsolujen reagoivat muuttunut O

2 tasoilla tavalla, joka voisi olla syvällinen vaikutus syövän etenemiseen.

Tässä tarkastelimme biologisesta käyttäytymisestä munasarjasyöpäsoluja fysiologisissa ja ympäristön O

2. Mielenkiintoista, jotkut munasarjasyövän solulinjoissa oli normaali reaktio O

2-pitoisuus, (

eli

vähentää soluproliferaatiota lisääntynyt O

2-pitoisuus), kun taas lisääntymistä muiden munasarjasyövän solulinjoissa ei vaikuttanut tämän O

2 lisäys. Lisäksi meidän tutkimukset osoittivat, että 14-3-3 σ ja sen roolia solusyklin vaikuttavat proliferatiivinen vaste muuttunut O

2 tasoa. Ottaen huomioon vaihtelu osapaine happea koko kehoon ja mahdollista merkitystä, että tässä yhteydessä saattaa olla syövän etenemistä, on tärkeää ymmärtää vaikuttaa O

2 keskittyminen syöpäsolujen lisääntymistä ja syövän etenemistä. Tulosten mukaan hankinta O

2 sieto voi olla osa syövän etenemiseen ja tunnusmerkki onnistunut etäpesäkkeitä.

Tulokset

fysiologiset hapen johtaa lisääntyneeseen soluproliferaatioon munasarjasyövän solut

meidän alustava tutkimuksissa vertasimme vaikutusta fysiologisen (3% O

2) ja ympäristön (21% O

2) happipitoisuus käyttäen A2780 munasarjasyöpäsoluja ja katsoo, että 12 päivää soluviljelmässä näissä olosuhteissa johtivat 2,6 kertainen kasvun hidastuminen alle 21% O

2 (kuvio 1). Siksi tutkimme vaikuttaa O

2 keskittyminen kasvupotentiaalia kuusi munasarjasyövän solulinjoissa käyttäen fysiologista (3% O

2) ja ympäristön (21% O

2) happipitoisuudet. Koska seerumin läsnä soluviljelyelatusainetta voi myös olla määräävä vaikutus kasvuun, testasimme myös vaikuttavat eri pitoisuuksia seerumissa. Määrästä riippumatta seerumin läsnä kasvualustaan, viljelemällä 21% O

2 johtivat yleensä vähentynyt merkittävästi solujen lisääntymisen neljälle munasarjasyövän solulinjoissa (A2780, OVCAR5, OVCAR8 ja HOC8) verrattuna 3 % O

2 (kuva 2). Ainoa poikkeus havaittu oli kanssa HOC8 solujen läsnä ollessa korkein pitoisuus seerumissa (10% v /v), jossa on merkityksetön O

2-riippuvaista kasvua vaikutus havaittiin (kuvio 2). Oletettavasti puute vasteen Hoc8 johtuu määräysvaltaa seerumin, jota ei havaittu A2780, OVCAR5 ja OVCAR8. Sen sijaan ei ollut merkittävää vaikutusta kasvuun SKOV3 ja HeyA8 solulinjat lisäämällä O

2 pitoisuus 21%, riippumatta seerumissa (kuva 2). Havaittu poikkeus oli HeyA8 viljeltiin alle 2% seerumia, joka osoitti vähentynyt soluproliferaatiota 21% O

2 verrattuna 3% O

2 (

p

0,001). Toisin vaikutus O

2 tasossa, lisäämällä seerumin johti suhteellinen kasvu kasvu munasarjasyövän solulinjoissa A2780, OVCAR5 ja OVCAR8 (

p

10

– 5, kuvio 2). Pitoisuus seerumissa oli kohtalainen vaikutus kasvuun SKOV3 ja HeyA8 (kuva 2); seerumipitoisuuden välillä 2 ja 6%: lla oli merkittävä vaikutus (

p

10

-5) in SKOV3, kun taas HeyA8 seerumissa välillä 2 ja 10% seerumia oli suurin vaikutus 3% O

2 (

p

10

-5) (kuva 2). Lisäämällä seerumin 6%: sta 10%: lla oli vain vähäinen vaikutus kasvuun HeyA8, SKOV3- ja HOC8 (kuvio 2). Yhdessä näyttää siltä, ​​että sekä happipitoisuus ja seerumin kasvuun vaikuttavat näiden munasarjasyövän solulinjoissa, mutta riippumaton tavalla. Kuten odotettua työstä toisten kanssa alkusolut [4], havaitsimme, että suurin osa munasarjasyöpäsoluja näkyy vähentynyt soluproliferaatiota ympäristön O

2-pitoisuus verrattuna fysiologista O

2-pitoisuuden. Kuitenkin kaksi solulinjaa ei näyttänyt olevan esti solujen lisääntymistä korkeammalla (ambient) O

2 tasoa. Siksi luokitteli munasarjasyövän solulinjoissa perustuu näihin eroihin, jotka ovat joko O

2 herkkä (A2780, OVCAR5, OVCAR8 ja HOC8) tai tunteeton (SKOV3 ja HeyA8) (kuva 2). Kaiken kaikkiaan nämä erot viittaavat heterogeenisyys kasvun säätelyssä vastauksissa fysiologisten vihjeet O

2 korkeana näissä viljellyissä solulinjoissa.

Yhtä suuret määrät A2780 munasarjasyövän soluja siirrostettiin 10 cm: n petrimaljaan olivat rutiininomaisesti ylläpidetään 3% O

2 (fysiologinen) tai 21% O

2 (ambient). Kasvu solujen määrä määritettiin laskemalla käsin kerran kolmessa päivässä, ja koko solumäärät arvioitiin ja piirrettiin käyttämällä lineaarista asteikkoa (kaaviossa A) ja log asteikko (kaaviossa B).

munasarjasyövän solulinjoja viljeltiin 3% tai 21% O

2 ja laajuus leviämisen määritettiin seuraavien 3 päivän kasvun (katso materiaalit ja menetelmät -osiossa). Kutakin solulinjaa, prosentuaalinen solujen jakautumisen 3% O

2 (kevyt varjostetut pylväät) ja eri pitoisuudet seerumissa verrattiin leviämisen tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa koostuu 21% (ambient) O

2 (siniset palkit) ja 10% FBS. Virhe palkit edustavat keskihajonnan keskiarvon ja tilastollinen merkitsevyys (opiskelijan T Test) erot leviämisen välillä 3% ja 21% O

2 kutakin seerumin on merkitty tähdellä [(*)

p

0,05, (**)

p

0,001 ja (***)

p

0,0001].

on mahdollista, että näennäinen O

2 epäherkkyys ja erot leviämisen johtui eroista kaksinkertaistaa ajan kunkin solulinjan. Jos esimerkiksi SKOV3 ja HeyA8 (O

2 tunteeton solulinjoilla) lisääntyvät hitaammin, O

2 aina lisäänny muutokset voivat olla liian triviaalia mitata. Siksi mittasimme solun kaksinkertaistaa aikaa kaikille munasarjasyövän solulinjoissa. Tuloksemme osoittivat, että tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa (10% seerumia ja 21% O

2) kaksinkertaistaa aikaa kaikille munasarjasyövän solulinjoissa oli hieman samanlainen ( 24 tuntia), paitsi HOC8, joka oli pidennetty kahdentumisaikoina noin 45,5 ± 4,9 tuntia (taulukko S1, ja katso Methods S1). Siksi suurin osa munasarjasyövän solulinjoissa oli jakautuivat suunnilleen yhtä suuri nopeus, ja brutto ero kaksinkertaistaa aika tuskin olla tekijä havaitun leviämisen erot solulinjojen eri olosuhteissa.

Oxygen herkkyys korreloi dynaamisen muutoksia S- ja G2-vaiheissa solusyklin

Kun otetaan huomioon erot leviämisen havaittu munasarjasyövän solulinjoissa kasvatettu joko 3% tai 21% O

2, me tutki O

2-pitoisuus muuttaa solusyklin profiilia kunkin solulinjan. Riippumatta seerumissa, verrataan 3% O

2 21% O

2 johti merkittävään laskua solujen prosenttiosuus, jotka olivat G1 vaiheessa solusyklin ja merkittävä kasvu solujen prosenttiosuus S-vaiheessa (taulukko 1), mikä oli odotettua perustuu aikaisempien havaintojen kanssa alkusolut [27]. Lisäksi kolmessa O

2 herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5 ja OVCAR8) prosenttiosuus solupopulaation G2 faasi kasvoi merkittävästi 21% O

2. Kuitenkin merkittävä kasvu G2 ei havaittu neljännessä O

2 herkkä solulinja, HOC8 (taulukko 1). Samanlainen HOC8, O

2 tunteeton solulinjoista, SKOV3 ja HeyA8, ei näy merkittävää muutosta osuus solujen G2 vaiheessa solusyklin kun kasvatettu 3% O

2 tai 21% O

2 (taulukko 1). Ottaen huomioon, että O

2 herkkä solulinjoista lisääntynyt hitaammin 21% O

2 verrattuna 3% O

2 huolimatta pienempi osuus niiden solupopulaation G1 ja määrinä S ja G2, voimme päätellä, että nämä solut on etenee hitaammin solusyklin läpi. Kuitenkin O

2 tunteeton solulinjojen ja HOC8 (kanssa huomattavasti laajennettu kaksinkertaistaa aikaa), emme noudata kasvanut merkittävästi prosenttiosuus solujen G2 kun O

2 kohoamiseen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka G1 ja S vaiheiden solusyklin reagoivat samalla muutoksiin O

2 pitoisuus kummassakin O

2 herkkä ja tunteeton solulinjoissa, se on G2 vaihe solusyklin joka on ei reagoi O

2 -pitoisuus O

2 tunteeton solulinjoissa. Siksi ero solusyklin vastauksena havaittu näillä munasarjasyövän solulinjoissa ehkä tasolla asetuksen aikana solusykliä G2 M vaiheeseen. On myös mahdollista, että havaitut muutokset jossa G2 ja O

2 herkkyyden näissä syöpäsolulinjoissa heijastuu mitoosi komponentti solusyklin. Meidän havainto mitoosi solujen läsnä O

2 herkkä ja tunteeton solulinjoja kasvatettu 3% ja 21% O

2 tukee tätä päätelmää; O

2 herkkä solulinjoista osoittavat vähentämättä kohtuuttomasti mitoosi solupopulaation havaittiin 21% O

2 verrattuna 3% O

2, (kuva 3), joka vastaa kertyminen solujen G2 21% O

2 (taulukko 1). Samoin O

2 tunteeton solulinjoissa (HeyA8 ja SKOV3) osuus mitoosi soluista pysyi muuttumattomana riippumatta O

2 pitoisuudet (kuva 3). Tämän odotetaan, koska kuten edellä on todettu (taulukko 1), osuus solujen G2 O

2 tunteeton solulinjat olivat myös vaikuttanut O

2-pitoisuuden. Olemme päätellä, että useimmat syöpäsolut säilyttävät kyvyn säädellä solusyklin vastauksena muutoksiin O

2-pitoisuus on verrattavissa villityypin soluihin [27]. Jotkin syöpäsolut voivat menettää O

2 pitoisuudesta riippuvaista solusyklin (kuten O

2 tunteeton syöpäsolun riviä), jolloin erillinen fenotyypin.

Mitoosi indeksi munasarjan syöpäsolun linjat, jotka viljeltiin alle 3%: n tai 21% O

2 3 päivää määritettiin laskemalla ytimiä kondensoituneilla kromosomien joukossa vähintään 1000 solua läsnä jokaisessa kokeessa. Tilastollinen merkittävyys määritettiin ANOVA ja merkittävää eroa mitoosi-indeksi välillä 3% ja 21% O

2 on merkitty tähdellä [(*)

p

0,05, (***)

p

0,0001].

Oxygen sieto korreloi muuttunut G2 /M komponentteja

toistaiseksi olemme osoittaneet, että O

2 herkkä solusyklin vastetta G2 /M siirtymä puuttuu O

2 tunteeton solulinjoissa. Siksi lähti kuvaamaan tämän havainnon edelleen määrittämällä mikä komponentti G2 /M sääntely on puutteellinen O

2-tunteettomia syöpäsoluja. Suurimmat efektori G2 /M siirtyminen on cdc2 [22], [28]. Cdc2 muodostaa kompleksin sykliini B [29], [30], joka fosforyloi erilaisia ​​rakenteellisia proteiineja johtaen romahtaminen ydinvoiman kirjekuori, tiivistyminen ja kromosomien segregaatiota [30], [31] ja inaktivaation muut solusykliä sääteleviä proteiineja kuten kuten WEE1-, RB ja CDC25C [30], [32]. Normaaleissa soluissa, yleiseen tasoon cdc2 proteiinia pidetään vakiona koko solusyklin [33] ja säätelee translaation jälkeisen modifikaation [33] ja solusijaintipaikan [30], [31]. Kun Tyr15 jäännös cdc2 on defosforyloitiin CDC25C, aktivoitu cdc2 muodostaa kompleksin sykliini B, kerääntyy tumaan, ja edistää G2 /M siirtyminen [30], [33], [34]. Tämä tapahtuu portaittain lisäämällä määriä ydin- cdc2 proteiini [30]. Meidän tarkastelu koko cdc2 proteiinin ja fosforyloituu cdc2 proteiini osoitti, että molemmat ovat huomattavasti alhaisemmat O

2-tunteeton solulinjoissa (HeyA8 ja SKOV3) verrattuna O

2-herkkiä solulinjoissa (kuvio 4A). Vaikka tasot cdc2 olivat suhteellisen korkealla O

2-herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5 ja OVCAR8) (kuvio 2), havaitsimme lasku Tyr15 fosforylaatiotilaa riippumatta O

2 pitoisuus A2780, OVCAR5 ja OVCAR8 yhä seerumin (kuvio 4A). Tämä korreloi havainnon, että yhä seerumissa aiheuttaa kasvavia solujen lisääntymistä ja johtaa samanaikaisen osuuden väheneminen solujen G2 /M (vrt taulukko 1). Kuitenkaan mitään ilmeistä O

2-riippuvainen muutos joko kokonaan tai fosforyloitu sykliini B tai CDC25C havaittiin O

2 herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5, OVCAR8 ja HOC8) verrattuna O

2 tunteeton solulinjoja (HeyA8 ja SKOV3) (kuvio 4A). Näyttää siis siltä, ​​että havaittu väheneminen solupopulaation G2 21% O

2 ei ehkä ole riippuvainen fosforylaatio välittämän inaktivointi cdc2. On syytä huomata, että nämä kokeet suoritettiin asynkronisesti kasvavissa soluissa, ja sen vuoksi on mahdollista, että ohimeneviä eroja cdc2 tila oli menetetty. Mielenkiintoista, tasot cdc2, sykliini B ja CDC25c (negatiivinen säätelijä cdc2) olivat huomattavasti alhaisemmat O

2 tunteeton solulinjoissa (HeyA8 ja SKOV3) verrattuna O

2 herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5, OVCAR8 ja HOC8) (kuvio 4A). Nämä havainnot viittaavat siihen, luontainen puute ytimessä osallistuvia osia G2 /M etenemisen O

2 tunteeton solulinjoissa.

Protein lysaatit valmistettiin munasarjasyövän solulinjoissa pidetään kasvatusväliaineessa, joka koostuu yhä pitoisuudet seerumissa ja 21% tai 3% O

2 analysoitiin Western blot. (A) verrattuna O

2 herkkä solulinjat, vähentynyt ilmentyminen ydinosat mukana G2 /M solusyklin etenemisen cdc2 /sykliini B1 monimutkainen ja sen aktivaattori CDC25c havaitaan O

2 tunteeton solulinjoista ( merkitty tähdellä ja kursiivilla), kun taas ilmaisun 14-3-3 σ on proteiini, joka estää cdc2 on koholla O

2 tunteeton solulinjoissa. (B) fosforylaatio RB ja WEE1- seurattiin indikaattorina cdc2 toimintoa, koska sekä RB ja WEE1- tunnetaan tavoitteet fosforylaation cdc2. Yhtä suuri kuormitus proteiinin uutteet seurattiin tutkimalla kuorittu Western blotit ensisijaisen vasta-aineen β-aktiini.

p53, p21 ja 14-3-3 σ ovat tekijöitä, joilla on kyky negatiivisesti vaikuttaa cdc2 aktiivisuus ja G2 /M siirtyminen [22]. Nykyinen käsitys on, että p53 ja p21 vaikutus solukierron vuonna hypoksinen ja hyperoksi- olosuhteet [23], [24], [35], [36]. Ottaen huomioon alenemisesta cdc2 ja ilmeisesti viallinen G2 /M tarkastuspiste että O

2 tunteeton solulinjoissa (HeyA8 ja SKOV3), selvitimme mahdollisuutta, että vajaatoiminta johtui vika missä tahansa näistä molekyyli sääntelyviranomaisten. Western blot analyysissä havaittiin p53 ja p21 yliekspressoituvan yhdessä O

2-herkkä solulinja (HeyA8). Kuitenkin molemmat olivat poissa toisessa O

2-herkkä solulinja (SKOV3), ja ilmaisu malli näiden proteiinien pysyivät muuttumattomina riippumatta muutoksista O

2 tai seerumissa (kuva S1), mikä viittaa siihen, ettei p53 eikä p21 on merkitystä cdc2 tehtävälle O

2 herkkyyttä. Mielenkiintoista, havaitsimme merkittävää nousua ilmaus 14-3-3 σ (kuvio 4A) on O

2 tunteeton solulinjoissa (HeyA8 ja SKOV3) verrattuna O

2-herkkä solulinjoissa. Vaikka taso 14-3-3 σ ilmentyminen oli huomattavasti pienempi kaikilla O

2-herkkä solulinjoissa verrattuna HeyA8 ja SKOV3, emme tarkkailla kasvua ilmaus 14-3-3 σ 21% O

2 A2780 (kuvio 4A). Vaikka ristiriidassa tunnettujen estävää roolia 14-3-3 σ on cdc2 toimintaa, voimme päätellä, että korkea 14-3-3 σ yhdistettynä vähentäen samalla cdc2 on lisääntyvän syöpäsolun voi osoittaa valvonnan puutteesta G2 /M etenemistä vastauksena O

2 tasossa.

selventämiseksi seuraus vähäinen cdc2 proteiinin havaittiin O

2-tunteeton solulinjoissa, määritimme toiminnallinen aktiivisuus jäljellä cdc2 tutkimalla fosforylaatiota kaksi sen substraattien, RB ja WEE1-. Fosforylaation RB on Ser 807 jäännös välittyy cdc2 [32], ja totesimme tämän fosforylaation riippumatta cdc2 tasolla tai O

2 tasossa, 10% seerumia kaikissa solulinjoissa, paitsi HOC8 (kuvio 4B), joka osoittaa moitteettomia cdc2 aktiivisuutta näissä solulinjoissa. Väheneminen fosforyloidun RB korreloivat väheneminen seerumissa (kuva 4B) ja korreloi lisääntynyt kertyminen koko RB O

2-herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5 ja OVCAR8), mutta ei HOC8 (kuva 4B) . Yhteensä RB oli tuskin havaittavissa O

2-tunteeton solulinjoissa (HeyA8 ja SKOV3) (kuva 4B), lukuun ottamatta 2% seerumia 3% O

2 sairaudentilassa HeyA8 solulinjassa. Mielenkiintoista on, vertaamalla RB-ilmentyminen kuvio (kuvio 4B), ja solujen lisääntymistä (kuvio 2) kävi ilmi, että HOC8, HeyA8 ja SKOV3-solut kasvavat paremmin soluviljelyelatusainetta, joilla on alhainen pitoisuus seerumissa (2%) verrattuna A2780, OVCAR5 ja OVCAR8. Näin ollen näyttää siltä, ​​että koko RB-proteiinin tason toimia pysyy koskemattomana O

2-herkkien solulinjojen ja että tämä vastaus on luultavasti enemmän merkitystä seerumissa kuin O

2 tasoa. Toinen tavoite cdc2 välittämää inaktivoituminen fosforylaatio on WEE1-, joka voi myös vastavuoroisesti estää cdc2 toiminto fosforylaatio [37]. Havaitsimme lisääntynyt fosforylaatiota WEE1- että O

2 herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5 ja OVCAR8), tuskin havaittavia määriä vuonna HOC8, (kuva 4B) ja täydellinen puuttuminen O

2-tunteeton solulinjoissa ( HeyA8 ja SKOV3, kuvio 4B). Tämä malli oli pitkälti toisteta täydellistä WEE1- proteiinin tasot (kuva 4B). Siksi puuttuminen fosfo-WEE1- että O

2-tunteeton solulinjoissa ei osoita poissaolon cdc2 toimintaa, vaan pikemminkin poissaolo WEE1- alustan. Näistä tuloksista pääteltiin, että vaikka pienempiä määriä cdc2 että O

2-tunteeton solulinjoissa, cdc2 on toiminnallisesti aktiivinen ja estoton jonka kohonneeseen 14-3-3 σ. On huomattava, että RB ja cdc2 toimivat toistensa päälle säädellä toistensa funktiona [38], ja fosforylaatio asema RB [26], tai cdc2 [39] voi vaikuttaa E2F-välitteisen Sykliini, jotka ovat välttämättömiä solusyklin etenemisen. Siksi, kun otetaan huomioon tämä monimutkainen suhde RB ja cdc2, fosforylaatiota rakenteessa RB ei riitä ennustamaan G2 /M etenemistä.

Yhteenvetona O

2-herkkiä solulinjoissa (A2780, OVCAR5 ja HOC8 ) osoittivat lisääntyneen ekspression cdc2 ja sykliini B yhdistettynä alhaiseen 14-3-3 σ ilmaisun. Tämä viittaa siihen, että solusyklin tarvittavat komponentit dynaamisen proliferatiivinen vaste eroista O

2-pitoisuus on läsnä näissä solulinjoissa. Kuitenkin O

2-tunteeton solulinjoja, jotka ilmentävät korkeita 14-3-3 σ ja alhainen cdc2 ja CDC25C tällaisen dynaamisen solusyklin tapahtuu muutos O

2 keskittymä voi heikentyä. Sen vuoksi otimme sen mahdollisuuden, että tämä käänteinen korrelaatio 14-3-3 σ ja cdc2 voi olla tärkeää O

2-herkkää sääntelyn G2 /M siirtyminen.

14-3-3 σ ja mitoottista progressio happea herkkyyden

aikaisemmat havainnot viittaavat assosiaation kohonnut 14-3-3 σ ja O

2-insensitiivisyys joka tulee varmistaa. Siksi halusimme vahvistaa, että 14-3-3 σ todellakin vaikuttaa O

2-riippuvaista proliferaatiota. Tämän osa tutkimuksesta, me rajoitettu analyysimme kahteen solulinjoja villin tyypin p53: O

2-herkkä A2780 [40], ja O

2-tunteeton HeyA8 solulinjat [41]. Tähän mennessä olemme käyttäneet Western blot -analyysi seurata yleistä ekspressiotasot 14-3-3 σ ja cdc2 (kuvio 4A). Koska toiminnalliset vasteet näiden proteiinien ovat riippuvaisia ​​solusijaintipaikan, käytimme immunofluoresenssilla määrittää niiden sijainti solussa alle 3% O

2 ja 21% O

2. Vuonna O

2-herkkä A2780, lokalisoinnin 14-3-3 σ rajoitettiin sytoplasmaan alle 3% O

2 (kuvio 5A), mutta löydettiin sekä tumaan ja sytoplasmaan 21% O

2 (kuvio 5A). Cdc2 jaettiin koko solun ja sen lokalisointi ei vaikuttanut O

2-pitoisuuden. Näin ollen vaikuttaa siltä, ​​että ydin- poissulkeminen 14-3-3 σ korreloi vähentynyt murto-osa solujen G2 /M vaiheessa ja estoton solusyklin etenemisen, kun A2780 on kasvanut 3% O

2, kuten edellä on todettu (taulukko 1). Sen sijaan, että O

2-herkkä HeyA8 solulinja osoitti korkeita 14-3-3 σ ja alhainen cdc2 (kuvio 4A), jossa on huomattava määrä 14-3-3 σ sytoplasmassa (kuvio 5A). Edelleen, 14-3-3 σ jäi ulkopuolelle tumaan jopa 21% O

2, HeyA8 soluja (kuvio 5A). Nämä havainnot varmistettiin lisäksi Western blot-analyysi ydin- ja sytosolin solufraktioita saada näistä soluista (kuvio 5B). Lopuksi, vahvistaa vaikutusta G2 /M siirtyminen, määritimme osuus näiden solujen M vaiheessa eri O

2 pitoisuuksia käyttäen mitoosin markkeri fosfo-histoni H3. Vuonna O

2-herkkien A2780 soluissa, alle 21% O

2, havaitsimme lasku mitoosi-indeksi (P 0,001), verrattuna 3% O

2 (kuvio 5C). Mitään tällaista O

2-riippuvainen muutos mitoosi-indeksi havaittiin O

2-tunteeton HeyA8 soluissa (kuvio 5C). Nämä tulokset tukevat alkuperäistä päätelmää, että O

2-herkkä solujen linjat vajetta säätelyssä solusykliä G2 /M vastauksena lisääntyneeseen O

2 tasossa (kuva 2).

(A) Cellular lokalisointia immunof- osoittaa, että 14-3-3 σ (Green) sijaitsee sytoplasmassa ja cdc2 (punainen) on läsnä tumassa (Blue). Verrattuna O

2 herkkä A2780 soluissa, taso 14-3-3 σ on suurempi ja cdc2 on alhainen O

2 tunteeton HeyA8 soluja. Vuonna O

2 herkkä A2780, 14-3-3 σ on lokalisoitu sekä tumassa ja sytoplasmassa 21% O

2. (A pisteviiva keltainen viiva, hahmottelee edustaja ytimet osoittaa suhteellista lokalisointi 14-3-3 σ ja cdc2 näissä soluissa). (B) Western blot-analyysi ydin- ja sytoplasman jakeet osoittavat alhainen 14-3-3 σ tumassa verrattuna solulimassa, lisääntyneisiin 14-3-3 σ on läsnä sytoplasmassa O

2 tunteeton HeyA8 soluja. Taso cdc2 on korkeampi sekä tumassa ja sytoplasmassa O

2 herkkä A2780, mutta on läsnä pienempi määrä vain tumassa O

2 tunteeton HeyA8 soluja. Histoni H1 ja β-aktiini käytettiin lastaus säätimet ydin- ja sytoplasman jakeet, vastaavasti. (C) Mitoottista solut määritettiin laskemalla solut värjättiin positiivisesti mitoosia markkeri, Phospho-Histone H3 päässä solun koko väestöstä. (C). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.