Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jo pitkään on oletettu, joskin yllättävän vähän todisteita, välistä kilpailua Core 1 Gal-transferaasi (C1GalT), Core 3 GlcNAc-transferaasi (C3GnT) ja sialyyliryhmiä-transferaasi (ST6GalNAc-T) varten venymään O-sidottu limaa glykaaneja aloitetaan GalNAcα-Ser /Thr. Tutkimuksessa testattiin tämä oletus selektiivinen esto näistä glykosyylitransferaasien ja sitten analysoi ilmentymiä entsymaattisen tuotteiden kolmen muun glykosyylitransferaaseihin. Todettiin, että siRNA tukahduttaminen C1GalT merkittävästi alentunut ilmentyminen Galβ1,3GalNAcα- (Core 1) ja samalla lisäsi ilmaisuja sialyyli-GalNAcα- (sialyyli-Tn), GalNAcα- (Tn) ja GlcNAcβ1,3GalNAcα- ( Core 3) -associated glykaanien ihmisen paksusuolen syövän HT29 ja SW620-soluissa. Tämä tukee kilpailukykyistä muuttaminen GalNAcα-Ser /Thr välillä C1GalT, C3GnT ja ST6GalNAc-T O-glykaanitähteen biosynteesiä. Kuten Tn, TF ja sialyyli-Tn ovat onkofetaalinen antigeenejä ja yli-ilmentynyt useimmissa ihmisen syövissä, tämä tieto on hyödyllinen kehittämiseen Glykosylaasitransferaasitoiminnan kohdistetun terapeuttisia strategioita syövän hoitoon.

Citation: Barrow H, Tam B, Duckworth CA, Rhodes JM, Yu LG (2013) Suppression Core 1 Gal-transferaasi liittyy vähentäminen TF ja vastavuoroinen lisäys Tn, sialyyli-Tn ja Core 3 glykaanien in Human koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (3): e59792. doi: 10,1371 /journal.pone.0059792

Editor: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 19 lokakuu 2012; Hyväksytty: 18 helmikuu 2013; Julkaistu 25 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Barrow et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustus (CR777) North West Cancer Research Fund ja University of PhD stipendi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Lu-Gang Yu on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Kirjoittajat vahvistavat, että tämä toimitusneuvosto jäsenyys ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

biosynteesi

O

linkatun musiini glykaaneja on monen porrastettu, peräkkäinen Translaationjälkeiset prosessi katalysoi ilmaisuja ja toiminnan joukko glykosyylitransferaaseihin. Biosynteesiä prosessi alkaa lisäämällä

N

asetyyli-galaktosamiini (GalNAc) ja seriini (Ser) tai treoniini (Thr) tähteet täysin taitetun /koottu proteiinit muodostavat ensimmäisen O-kytketty GalNAcα- Ser /Thr-rakenne (Tn-antigeeni) katalysoi yksi tai kaksi suuren perheen jopa 20 erillistä UDP-N-asetyyli-α-D-galaktosamiini-polypeptidin GalNAc-transferaasit (ppGalNAc-Ts) [1], [2]. Nämä ppGalNAc-T-isoentsyymien ovat erilaisia, mutta osittain päällekkäisiä, peptidi erityispiirteet proteiineja eri Ser ja Thr-sivustoja ja ilmentyvät eri soluissa ja kudoksissa kehityksen aikana, erilaistumista ja sairaustiloissa, kuten syövän [3], [4], [5 ]. Tämä ensimmäinen vaihe biosynteesin O-liitettyjä musiinin glykaaneja uskotaan aloittaa inter ER-Golgin osasto [6], [7], [8] ja viimeistely Golgin laitteessa [9], [10].

muodostamisen jälkeen GalNAcα-Ser /Thr, GalNAc jäännös voidaan modifioida, jossa Gal jäännös katalysoi Core 1 Gal-transferaasi (C1GalT) [11] muodostumista Core 1 rakenne, Galβ1,3GalNAcα – [Thomsen-Friedenreich (TF) antigeeni]. GalNAc jäännös GalNAcα-Ser /Thr voidaan myös modifioida, jossa on GlcNAc jäännös katalysoi Core 3 GlcNAc-transferaasi (C3GnT) muodostamista varten Core 3 rakenne GlcNAcβ1,3GalNAcα-. GalNAc jäännös GalNAcα-Ser /Thr voidaan myös modifioida kanssa sialihappotähteen jonka sialyyli-transferaasin (ST6GalNAc-T), jolloin muodostuu siaalihappoa β1,6GalNAcα- (sialyyli-Tn) antigeeni [12], [13] . ST6GalNAc-I uskotaan olevan hallitsevia sialyyli-transferaasin muodostumista sialyyli-Tn [13]. Muodostuminen sialyyli-Tn lopettaa sokeriketjuosa taas TF ja Core 3 rakenteita voidaan edelleen toiminut muiden glykosyylitransferaasien vaiheittain tavalla, jolloin saadaan jopa 8 ydinkompleksiin glykosylaatio rakenteita [14]. Ydin 1-3 glykaanirakenteet voidaan myös modifioida asetylaatio fukosyloitu-, sialylaatio- tai sulfatointi.

Jo pitkään on arveltu, että C1GalT, C3GnT ja ST6GalNAc-T kilpailla muuttaa GalNAc jäännös vastikään syntetisoitiin GalNAcα-Ser /Thr muodostumista TF, Core 3 tai sialy-Tn rakenteet elävissä soluissa [15], [16], [17]. Kuitenkin suoria todisteita, jotka tukevat tätä kilpailukykyinen muutos GalNA-muunnos on yllättävän puuttuu. Mutaatio tai inaktivoida Cosmc, ER-lokalisoitu molekyyli kaperoni, joka tarvitaan entsyymin aktiivisuuden C1GalT [18], on osoitettu liittyvän Tn oireyhtymä, harvinainen autoimmuunisairaus, jossa alaryhmien veren solut kantavat epätäydellisesti glykosyloitu Tn-antigeeni [19]. Ihmisen syövän hoidossa solujen kanssa O-glykosylaation inhibiittori bentsyyli-GalNAc, kilpaileva estäjä varten C1GalT transferaasin ja alfa-2,3-sialyylitransferaasi-, vähentää ilmentymistä solun sialihappojen ja lisää ekspressiota TF [20].

tässä tutkimuksessa arvioimme seurausta valikoivaa tukahduttamista C1GalT siRNA on ilmauksia TF, Tn, sialyyli-Tn ja Core 3 liittyvä glykaanien ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

siRNA rakentaa vastaan ​​C1GalT ja salatun ohjaus ei-suunnattu siRNA saatiin Dharmcon (Perbio Science, Northumberland, UK). Biotinylated-

Griffonia simplicifolian

lektiini II (GSL-II) hankittiin Vector laboratories (Peterborough, Iso-Britannia). Monoklonaalisia vasta-aineita Tn (klooni HB-TN1) ja sialyyli-Tn (klooni HB-STn1) hankittiin Dako (Pathology Products, Ely, UK). FITC-konjugoitua maapähkinä agglutiniini (FITC-PNA) hankittiin Sigma.

Solulinjat

Ihmisen paksusuolen syövän HT29 ja SW620-solut hankittiin Euroopan Soluviljely Collection at Public Health Laboratory, Porton Down Wiltshire, UK ja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 4 mM glutamiinia, kuten edellä on kuvattu [21].

Suppression of C1GalT Expression siRNA

soluja viljeltiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä (5,0 x 10

3 solua /kuoppa) anti-biotic DMEM: joka sisälsi 5% FCS: ää 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, ennen kuin inkuboitiin kanssa tai ilman 100 nM siRNA vastaan ​​C1GalT tai ohjaus salattu kuin kohdistaminen siRNA 37 ° C: ssa 48 tunnin ajan. Solut pestiin ja hajotettiin proteiinin määrän ja slot blotteja.

Slot pyyhkinyt

solun uutteet blotattiin nitroselluloosalle kalvo PR600 SlotBlot (Hoeffer Scientific Instruments, CA). Blotit blokattiin 5% BSA: ta, 0,5% Tween-20 PBS: ssä 4 ° C: ssa yön yli ennen käyttöä monoklonaalisten vasta-aineiden TF: ää vastaan ​​(TF5) (0,2 ug /ml) [22], Tn (0,2 ug /ml), sialyyli -Tn (0,03 ug /ml) tai biotinyloitua GSL-II (0,6 ug /ml) 1 tunnin ajan. Pesun jälkeen ja myöhemmän hakemuksen peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (3 ng /ml) tai peroksidaasi-Extravidin (Sigma, 1:10,000 laimennos) 1 tunnin ajan, blotit pestiin ja visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssi Super-signaalin immunoblottauksella havaitseminen (Pierce ; Rockford IL, USA). Densitometria-analyysi blotit suoritettiin käyttämällä Image Lab ohjelmisto (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK).

Fluoresenssi immunohistokemia

SW620-soluja viljeltiin 8-kaivokammion kalvot (BD Biosciences) (1 x 10

4 solua /kuoppa) antibiooteille DMEM, joka sisälsi 5% FCS 37 ° C: ssa 24 tuntia ennen inkubointia tai ilman 100 nM siRNA vastaan ​​C1GalT tai valvonnan muokkaamalla ei-kohdistuksen siRNA 37 ° C: ssa 48 tuntia. Solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä 10 min. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin 10% kanin seerumia 1 tunnin ajan ennen käyttöä vasta-aineiden STN, Tn (sekä 1/100 laimennus 10% kanin seerumia), FITC-PNA (5 ug /ml) tai biotinyloitua GSL-II (5 ug /ml) 2 tunnin ajan. Solut pestiin PBS: llä ja levitetään FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:100 laimennus) tai FITC-streptavidiinia (1:1,000 laimennos) 1 tunnin ajan. Solut pestiin PBS: llä, joka on kiinnitetty DAPI-sisältävien fluoresenssi kiinnitysväliaine ja kuvattiin Olympus B51 fluoresenssimikroskoopilla käyttäen 40x tavoite.

Tulokset ja keskustelu

Suppression on C1GalT saavutettiin siRNA hoito ihmisen paksusuolen syövän HT29 ja SW620-soluissa. Tehokkuus C1GalT knock-down seurattiin solun ilmaus TF anti-TF-vasta-aine. C1GalT siRNA hoito HT29 48 tunnin ajan aiheutti estämiseksi tehokkaasti C1Gal1T ilmentymisen, mikä ilmenee 86 ± 3% (keskiarvo ± SD) väheneminen solujen TF ilmentymisen (Fig. 1 A ja B). Samanlainen väheneminen TF ilmaisun havaittiin myös SW620-soluissa jälkeen C1GalT siRNA hoidon (Fig. 2 A ja B).

V: HT29 glykaanin ilmentyminen soluvasteen C1GalT siRNA tai kontrolloida siRNA. Käsittelyn jälkeen Solujen C1GalT siRNA tai ohjaamaan muita kuin kohdistaminen siRNA (con-siRNA), solu ilmauksia TF, Tn, sialyyli-Tn ja GSL-II sitoutuminen (GlcNAc-, Core 3 liittyvä glykaanien) arvioitiin slot blotteja monoklonaalisilla vasta-aineita TF (TF5), Tn (HB-TN1), sialy-Tn (HB-STn1) tai biotiini-GSL-II. Parallel blotit vasta-aineella vastaan ​​β-aktiini yhtäläistä proteiinia lastaus. Monista arvioinnit näkyvät kunkin blot. B: kvantifiointi ilmaisut solujen TF, Tn, sialy-Tn ja GSL-II sitoutuminen (GlcNAc-, Core 3 liittyvä glykaanien) in HT29 soluvastetta C1GalT siRNA. Tiheydet rakojen blotit määrällisesti * ja glykaanirakenteeseen ilmaisuja ilmaistaan ​​prosentuaalinen muutos ei-siRNA ohjaus normalisoinnin jälkeen proteiinia lastaus. * Blottia tiheydet TF ilmaisun käsittelemättömästä ja C1GalT siRNA käsiteltiin HT29 olivat 5004 ja 715; Tn 1314 ja 4345; sialyyli-Tn 1634 ja 4868; GSL-II sitoutuminen (Core 3) 489 ja 1156 sekä tublin 1898 1928.

V: SW620 glykaanin ilmentyminen soluvasteen C1GalT siRNA tai kontrolloida siRNA. Käsittelyn jälkeen Solujen C1GalT siRNA tai ohjaamaan muita kuin kohdistaminen siRNA (con-siRNA), solu ilmauksia TF, Tn, sialyyli-Tn ja GSL-II sitoutuminen (GlcNAc-, Core 3 liittyvä glykaanien) arvioitiin slot blotteja monoklonaalisilla vasta-aineita TF, Tn, sialy-Tn tai biotiini-GSL-II. Parallel blotit vasta-aineella vastaan ​​β-aktiini yhtäläistä proteiinia lastaus. Monista arvioinnit näkyvät kunkin blot. B: kvantifiointi ilmaisut solujen TF, Tn, sialy-Tn ja GSL-II sitoutuminen (GlcNAc-, Core 3 liittyvä glykaanien) in SW620 soluvastetta siRNA C1GalT. Tiheydet rakojen blotit määrällisesti * ja glykaanirakenteeseen ilmaisuja ilmaistaan ​​prosentuaalinen muutos ei-siRNA ohjaus normalisoinnin jälkeen proteiinia lastaus. * Blottia tiheydet TF ilmaisun käsittelemättömästä ja C1GalT siRNA käsiteltiin SW620-soluja 5144 ja 834; Tn 1437 ja 4313; sialyyli-Tn 1748 ja 4792; GSL-II sitoutuminen (Core 3) 481 ja 1229 sekä tublin 1984 ja 1982.

ottavat tehokkaasti tukahdutti C1GalT ilmaisua, me sitten verrataan solun ilmaisuja sialyyli-Tn (STN), Tn ja Core 3 glykaanien. Ilmaisut solujen sialyyli-Tn ja Tn Glykaanit arvioitiin slot blotteja vasta-aineilla sialy-Tn ja Tn. Ei vasta-aine Core 3 glykaani on tällä hetkellä saatavilla ja siksi käyttää

Griffonia simplicifolian

lektiini II (GSL-II) sitova indikaattorina ilmentymisen Core 3 liittyvän glykaanien. GSL-II on lektiini eristetty

Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia

ja tunnistaa α- ja β-sidottu GlcNAc jäämiä ei-pelkistävään terminaaliseen kaikkien oligosakkaridien [23]. Todettiin, että tukahduttaminen C1GalT johti 198 ± 8% lisäys sialyyli-Tn ja 136 ± 24% kasvua GSL-II sitoutuminen (GlcNA-, Core 3), vastaavasti, HT29 ja 174 ± 11% ja 155 ± 37 % kasvu SW620-soluissa (kuvio. 1 ja Fig. 2). Suppressio C1GalT nähtiin myös liitettävä nousi jopa Tn ilmentymisen HT29 (231 ± 6%) ja SW620 (200 ± 5%) soluista.

Vahvista nämä glykosylaatio havaitsemia slot blot, me edelleen analysoineet ilmaisuja näiden glykaanien in SW620 solujen vastauksessaan C1GalT siRNA mukaan immunohistochemstry. Hoito Solujen C1GalT siRNA osoitti jälleen selvä väheneminen cellular TF ilmaisun (PNA sitova) ja selvästi kohonneita Tn, sialyyli-Tn ja Core 3 (GSL-II sitova) ilmaisuja kun taas solujen käsittelyä kanssa ohjaus siRNA osoitti vähän vaikutusta ilmaisut näiden glykaanien (Fig. 3).

subkonfluenteista SW620 soluja viljeltiin 8-hyvin lasikammiota dioja hoidettiin ilman tai C1GalT siRNA tai ohjaamaan muita kuin kohdistaminen siRNA 48 h ennen ilmaukset solu TF, Tn, sialyyli-Tn ja GSL-II sitoutuminen (Core 3 liittyvä) glykaanien arvioitiin fluoresenssi immunohistokemiallisesti käyttämällä biotiini-PNA, biotiini-GSL-II tai vasta-aineita Tn (HB-TN1) tai sialyyli-Tn (HB -STn1). Edustavat kuvat on esitetty.

Nämä tulokset osoittavat, että suppressio C1GalT, joka ohjaa biosynteesiä Core 1 rakenne musiini tyyppiä O-kytketty glykaanien liittyy lisääntynyt ilmaisuja sialyyli-Tn ja GSL- II sitova (Core 3) ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Tämä tukee pitkän epäillään kilpailua muuttaminen GalNAc jäännös GalNAcα-Ser /Thr välillä C1GalT, C3GnT ja ST6GalNAc-T biosynteesissä monimutkaisten O-kytketty musiinin glykaaneja. Kaaviokuva aloittamisesta ja venymä limakalvon tyyppiä O-kytketty glykaanien, jota tässä tutkimuksessa, on esitetty kuviossa 4.

Suppression on C1GalT havaittiin myös tässä tutkimuksessa johtaa merkitty lisäys solujen Tn ilmaisua. Tämä osoittaa, että lopullinen muodostuminen solun TF, Tn, sialyyli-Tn ja Core 3 glykaaneja ohjataan ei ainoastaan ​​aktiivisuutta kaupallisista glykosyylitransferaaseihin. Pitoisuudet nukleotidisokeri-luovuttajan ja nopeus alustan kuljetuksen koko Golgin on osoitettu aiemmin edistää ilmaisuja erityisten glykaanien [17]. Suhteellinen asemointi glykosyylitransferaasien sisällä Golgin on myös raportoitu olevan tärkeä tekijä. Work Kellokompu ja työtovereiden [24], [25] ja itse [26] on osoittanut, että Golgi häiriintyneisyys esiintyy epiteelisyövissä ja voidaan jäljitellä aineet, jotka estävät normaalin Golgin happamoituminen, molemmissa tapauksissa johtaa lisääntyneeseen muodostumiseen onkofetaalinen hiilihydraattiantigeenit . Lisäksi ilmaisu ja toimintaa ER-lokalisoitu molekyyli saattajia voi myös olla rooli ilmaus onkofetaalinen glykaanien ohjaamalla taitto ja siten aktiivisuutta asiaa glykosyylitransferaasien [18]. Siten yleinen solujen ilmentymiä Tn, sialy-Tn, TF ja Core 3 rakenteet ovat seurausta useista monimutkaisista tekijöistä, jotka sisältävät kilpailua asianomaisten glykosyylitransferaaseja, avaruudellinen järjestely glykosyylitransferaasien sisällä Golgin saatavuus nukleotidisokeri -donors Golgin laitteessa ja toimien asiaan molekyyli saattajia.

Tn, TF ja sialyyli-Tn-antigeenit ovat kaikki tunnetaan onkofetaalinen hiilihydraatti- rakenteisiin. Ne ilmaistaan ​​sikiön epiteeli sitten tulla piiloon muiden sokeria jäämiä terveillä aikuisilla kudoksessa vaan toistu vuonna syöpä- ja syövän esiasteiden dysplastic soluissa. On arvioitu, että jopa 90% kaikista ihmisen syövistä kuljettaa näitä onkofetaalinen hiilihydraattiantigeenit [27], [28], [29], [30]. Lisääntynyt esiintyminen näiden onkofetaalinen hiilihydraatti- rakenteisiin liittyy kehittymistä ja etenemistä erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien rintasyöpä [31], paksusuolen [27], [32] ja haiman [33] syöpiä. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että muutos nämä onkofetaalinen glykaanien voi olla aktiivinen rooli etäpesäkkeitä. Poistetaan suoliston Core 1-johdettu O-glykaanien on äskettäin osoitettu aiheuttavan spontaanin paksusuolentulehduksen, hiirissä [34]. Down-regulation C3GnT6 ilmentyminen liittyy lisääntynyt dysplasia /kasvainten paksu- ja peräsuolisyövän [35]. Yli ilmentyminen sialyyli-Tn-antigeenin syöpäsolujen on todettu aiheuttavan enemmän aggressiivisia solun käyttäytymistä, kuten lisääntynyt kiinnittyminen solunulkoisen matriisin ja lisääntynyt maahanmuutto ja invaasion

in vitro

[36], [37] ja

in vivo

in sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä [37]. Yli-ilmentymisen ST6GalNAc-I on osoittautunut sovitettava paikallistaa sialyyli-Tn ihmisen suoliston metaplasiaa sekä mahakarsinoo- ja on ehdotettu olevan tärkeä rooli sialyyli-Tn yli-ilmentymisen syöpä olosuhteissa [12], [13] . Lisääntynyt vuorovaikutus TF ilmentyy syöpään musiini proteiinin MUC1 ja kiertävän galectins, seurauksena lisääntynyt ilmentyminen TF-ilmentävien MUC1 syöpäsolujen ja myös lisääntynyt vapautuminen galectins syöpä /strooman /immuunikudoksessa /solujen liikkeeseen, jotka molemmat ovat yhteisiä piirteitä syöpä, on osoitettu edistävän syöpäsolujen metastaaseja kauko-elinten [21], [38], [39]. Tämä vaikutus TF /MUC1-galektiini vuorovaikutus tapahtuu seurauksena lisääntynyt syöpäsolujen heterotypic adheesion verisuonten endoteeliin [38] ja myös seurauksena syöpäsolun homotyyppistä aggregaatiota muodostaa mikro-kasvain veritulppien pidentävät kasvainsolujen eloonjäämisen liikkeeseen ja mahdollistaa majoitus sisällä kapillaareja klo metastaattista sivustolla [40], [41]. On myös raportoitu, että rintasyövän potilailla, joilla on korkeammat tasot anti-TF-vasta-aine näyttää parempi ennuste kuin potilailla, joilla on alemmat anti-TF-tasot [42]. Kohdentamalla onkofetaalinen glykaanien immunoterapia TF muistuttavia peptidejä mahdollisille syövän hoidossa on saatu lupaavia tuloksia hiirissä [43].

Näin ollen kilpailu glykosyylitransferaaseja muuttamista GalNAc jäännös GalNAcα-Ser /Thr ja sen vaikutukset ilmentymisen onkofetaalinen hiilihydraattiantigeenit merkitsee potentiaalisesti-hyödyllinen kehittämisstrategia Glykosylaasitransferaasitoiminnan kohdistettujen hoitojen syöpään.