Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on yksi johtavista syistä syövän kuoleman miehillä maailmanlaajuisesti. Tässä tutkimuksessa käyttämällä siirtogeenisiä adenokarsinooma hiiren eturauhasen (TRAMP) hiirissä, vaikutusta ruokavalion rikastettu 1% paino /paino ursolic (UA) tutkittiin arvioida vaiheessa erityinen kemiallinen estoaktiivisuus eturauhassyöpää vastaan. Huomasimme, että TRAMP hiiriä ruokittiin UA 8 viikon ruokavalion (viikkoa 4-12) viivästyy muodostumista eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia (PIN). Samoin hiiret ruokittu UA ruokavalion 6 viikkoa (viikot 12 ja 18) esti eteneminen PIN adenokarsinooma määritettynä hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä. Lopuksi TRAMP hiiriä ruokittiin UA ruokavalion 12 viikon ajan (viikot 24-36) osoittivat selvästi vähensi kasvainten kasvua ilman merkittäviä vaikutuksia koko kehon painosta ja pitkäaikaiseen kokonaiselossaolo. Nähden molekyylimekanismin, huomasimme, että UA alassäädetty aktivaatio erilaisten proinflammatoristen välittäjäaineiden, kuten NF-KB, STAT3, AKT ja IKKα /β fosforylaation dorsolateral eturauhasen (DLP) kudoksiin joka korreloi laskun seerumissa TNF-α: n ja IL-6. Lisäksi UA merkittävästi alassäädetty ekspressiotasot sykliini D1 ja COX-2, mutta ajan säännelty kaspaasi-3, joka käy ilmi immunohistokemiallisella analyysi kasvainkudossektioista. Lopulta UA oli Seeruminäytteissä saatu useista hiiristä ryhmistä ruokittiin rikastettua ruokavaliota nanogrammoina määrä osoittaa, että se imeytyy hyvin ruoansulatuskanavasta. Kaiken kaikkiaan meidän havainnot antavat vahvaa näyttöä siitä, että UA voi olla erinomainen aine sekä ehkäisyyn ja eturauhassyövän hoitoon.

Citation: Shanmugam MK, Ong TH, Kumar AP, Lun CK, Ho PC, Wong PTH, et ai. (2012) ursolic Estää aloittaminen, eteneminen Eturauhassyöpä ja pidentää Survival TRAMP-hiirissä Moduloiva proinflammatoristen Pathways. PLoS ONE 7 (3): e32476. doi: 10,1371 /journal.pone.0032476

Editor: Ganesh Chandra Jagetia, Mizoram University, Intia

vastaanotettu: 08 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 28 tammikuu 2012; Julkaistu: 12 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Shanmugam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Medical Research Council of Singapore [R-184-000-168-275 ja R-184-000-201-275] GS. APK tukivat avustusta National Medical Research Council of Singapore [Grant R-713-000-119-275] ja Cancer Science Institute of Singapore, Experimental Therapeutics I Program [Grant R-713-001-011-271]. KMH tukivat avustusta National Medical Research Council of Singapore, Biomedical Research Council of Singapore, ja Singaporen Millennium Foundation. Rahoittajat ei ole roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä länsimaissa keuhkosyövän jälkeen [1]. Krooninen tulehdus on yhä useammin välittäjänä moniin syöpiin [2], [3], [4] ja huomattavaa näyttöä siitä, että se on merkittävä rooli sekä kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän [5]. Ensinnäkin, potilaat, joilla on oireinen eturauhastulehdus ovat alttiimpia kehittämään eturauhassyöpään. Toiseksi, eturauhassyöpä on liittynyt sukupuolitaudeista. Kolmanneksi, riski vähenee eturauhasen syöpä liittyy lisääntynyt saanti hedelmiä ja vihanneksia, antioksidantteja, ja ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (NSAID) [6], [7]. Neljänneksi, normaalissa eturauhasessa läpi proliferatiiviset tulehduksellinen atrofia (PIA) ennen muovauksen eturauhasen intraepiteliaalinen neoplasia (PIN), edeltäjä eturauhassyövän [8]. Viidenneksi PIA voi yli-ilmentävät tulehduksellinen entsyymi COX-2 [9]. Kuudenneksi transkriptiofaktoreiden NF-KB ja STAT3, molemmat suuret välittäjänä tulehduksen, ovat konstitutiivisesti aktiivisia eturauhassyöpäkudoksille [10]. Ja seitsemäs, NF-KB-säädellään tulehdusta edistävien sytokiinien, kuten interleukiini (IL) -6 on autokriinikasvutekijänä tiedetään erittyvän eturauhassyöpäkudoksille [11], [12]. Sen vuoksi on järkevää olettaa, että aineet, jotka voivat tukahduttaa tulehduksen välittäjäaineiden on mahdollinen sekä ehkäisyyn ja eturauhassyövän hoitoon.

UA (3β-hydroksi-urs-12-en-28-happo) , pentasyklisestä triterpenoidi johdettu marjoja, lehtiä, kukkia ja hedelmiä lääkekasvien, kuten

Rosemarinus officinalis

,

Eriobotrya japonica

,

Calluna vulgaris

,

Ocimum sanctum

, ja

Eugenia jumbolana

on yksi tällainen aine, joka on tutkittu laajalti sen tulehdusta ja syöpää ehkäisevistä toimintaa viime vuosikymmenen aikana [13]. UA on raportoitu tukahduttaa leviämisen erilaisia ​​kasvainsoluja, apoptoosin indusoimiseksi, ja estää kasvaimen edistämisen, etäpesäke, ja angiogeneesiä [14], [15], [16], [17]. Ryhmämme tutkii parhaillaan tutkimaton mahdollisuuksia UA ehkäisyyn ja eturauhassyövän ja on viime aikoina raportoitu kahdessa erillisessä tutkimuksessa, joka UA voi todellakin estää kasvun eturauhassyövän ksenograftin nude-hiirissä ja myös estää etäinen sivusto etäpesäke moduloimalla CXCR4 /CXCL12 signalointiryöpyn [18], [19].

siirtogeeninen adenokarsinooma hiiren eturauhasen (TRAMP) malli eturauhassyövän perustuu siirtogeenin, joka koostuu probasiinin (PB) promoottori-driven SV40 T-antigeenin (Tag) ilmaisu. Tämä siirtogeeninen hiiri on edullista istutusta malleja, koska tässä mallissa eturauhassyövän kehittää spontaanisti läpi sarjan hyvin määritetyt vaiheet. Niillä merkittäviä yhtäläisyyksiä ihmisen eturauhassyövän etenemistä PIN vaiheessa invasiivisen adenokarsinooma että metastasizes maksan, keuhkojen ja GI-kanavan kautta aktivoinnin siirtogeenin, joka on hormonaalisesti säätelee androgeenien [20], [21]. Lisäksi kaikki TRAMP hiiret kehittävät hyvin erilaistunut karsinooma (WDC) 8-12 viikon iässä ja etäpesäkkeitä kaukaisiin sivustoja välillä 18 ja 24 viikon iässä [22]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme mahdollisia vaikutuksia UA rikastettua ruokavaliota estämään kehitystä, etenemistä sekä eloonjäämisaste kasvaimia TRAMP hiirillä. Tuloksemme osoittaa selvästi ensimmäistä kertaa, että ruokinta hiirten dieetillä UA voi merkittävästi estää etenemistä PIN adenokarsinooma, ja kasvaimen kasvua. Se voi myös pidentää hiirten eloonjääntiin modulaation kautta useiden signalointikaskadien.

Tulokset

Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, mitä vaikutuksia (t) UA kasvaimen varhaiseen kehitykseen, kasvain etenemisen ja yleistä eloonjäämistä TRAMP hiirten (Fig. 1A).

A uros TRAMP-hiirillä 4 viikon iässä ruokittiin UA rikastettu 8 viikon ruokavalion (ryhmä 1); 12 viikkoa vanhoja hiiriä 6 viikon ajan (ryhmä 2); ja 24 viikon ikäisiä hiiriä 12 viikko (ryhmä 3). Hiiret lopetettiin lopussa hoidon aikana. Samanikäisiin ohjaus TRAMP-hiiret saivat tavanomaiseen ruokavalioon samaan ajanjaksoja. Hengissä tutkimuksia, Ryhmät 1-3 käsiteltiin samalla tavalla, kun Group 4 syötettiin UA rikastettua ruokavaliota 36 viikkoa alkaen 4 viikon iästä. B, H lovinen oikea nuoli osoittaa HG-PIN.

UA tukahduttaa eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) muodostuminen

On raportoitu aiemmin, että TRAMP hiirillä kasvoi epiteelin kerrostuneisuus dorsolateral eturauhasen epiteelin solut vaihtelevasti pitkänomainen ytimet kondensoituneilla kromatiinin taulu kuviot huonolaatuisen (LG) PIN (LG-PIN) 4-8 viikon iässä ja tukkasotka micropapillary ja seulamaisessa kuvio HG-PIN 6-10 viikon ikäisille [ ,,,0],22] .Voit selvittää, onko UA estää PIN muodostumista, 4 viikon ikäisiä hiiriä ruokittiin UA (1%, paino /paino), joka sisälsi 8 ​​viikon ruokavalion ja tapettiin 12 viikon iässä (ryhmä 1). Märkä paino eturauhasen rakkularauhaset ei juurikaan muuta sekä ohjaus- ja UA fed TRAMP hiiriä (tuloksia ei ole esitetty). Visuaalinen tarkastelu vatsaontelon myös ei paljasta epätavallinen laajentuminen rakkularauhaset, eturauhasen lohkoa tai lantion imusolmukkeiden. Kulutus UA rikastettua ruokavaliota oli hyvin siedetty ilman näyttöä myrkyllisyydestä suhteessa eläimen ulkonäkö, käyttäytyminen ja kehon paino.

Vaikka ei-TRAMP hiiret eivät osoittaneet PIN muodostumista (Kuva. 1 B, i), TRAMP hiiret eläimet osoittivat Lg- ja HG-PIN ja hyvin eriytetty karsinooma (WDC) (Fig. 1 B, II ja III). Vaikutukset UA-hoidon muodostumista PIN on esitetty kuviossa. 1C. LG-PIN nähtiin 60% UA-käsiteltyjen hiirten verrattuna 40% kontrolleissa taas HG-PIN nähtiin 20%: UA-käsiteltyjen hiirten verrattuna 80% kontrolleissa. Tämä osoitti, että UA hoito on vähentänyt muodostumista PIN sekä viivytti etenemistä Lg- HG-PIN. Lisäksi vain yksi eläin osoitti kohtalaisen (MDC) tai huonosti eriytetty karsinooma (PDC) tässä vaiheessa. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että UA on potentiaalia voidaan käyttää chemopreventive aineena.

UA estää etenemistä PIN eturauhassyöpää

onko vai ei UA voi estää etenemistä PIN eturauhassyöpä, 12-viikkoa vanha TRAMP-hiiret ruokittu ohjaus tai UA (1%, paino /paino) rikastettu ruokavalio 6 viikkoa ja sitten tapettiin 18 viikkoa (Fig. 1A, ryhmä 2). 18 viikon iässä, DLP TRAMP hiirillä oli korkeampi esiintyvyys LG-PIN, HG-PIN, WDC ja MDC (Fig. 2A, i ii) verrattaessa havaitaan nuorempiin (Fig. 1 B C). Ei merkittäviä muutoksia ulkonäkö, painon ja ruoan kulutus välillä ei havaittu ryhmän 2 hiiret ja niiden valvontaa. Kuitenkin, on olemassa huomattava, mutta tilastollisesti merkityksetön lasku märkäpainoa eturauhasen kanssa rakkularauhaset UA syötetään hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). UA-hoito vähensi LG-PIN 60%, HG-PIN 40% ja WDC 40% (Fig. 2A, iii) .Overall, oli havaittavissa siirtymistä korkeampi ilmaantuvuus ei-syöpä DLP in UA-hoidetut hiiret.

A, H Nuoli osoittaa MDC ja Chevron osoittaa PDC. C, Immunoblot pSTAT3, Pakt, pIKKα /β, ja p65 proteiinien DLP ryhmissä 1, 2 ja 3 hiiret. DLP lysaatit valmistettiin, ja immunoblottaus suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Equal proteiinia lastaus Pakt ja pIKKα /β määritettiin strippaamalla ja hyvää täydellistä AKT ja IKKα, p65 ja STAT3 blotit riisuttu ja uudelleenseulottiin varten β-aktiini määrittää yhtäläisen Proteiinilisäyksen. Bändi tiheys kvantitatiivisesti käyttäen Image J ohjelmisto. NT = ei TRAMP-hiirillä; T = TRAMP valvontaa; T + UA = UA-käsiteltyjen TRAMP-hiirillä.

UA tukahduttaa kasvun perustettu eturauhassyövän

in vivo

Voit selvittää UA voi tukahduttaa kasvua vakiintuneiden eturauhassyöpä, 24 viikon ikäisiä TRAMP-hiiret syötettiin ohjaus- tai UA (1%, paino /paino) rikastettua ruokavaliota 12 viikkoa ja sitten tapettiin 36 viikkoa (Fig. 1A, ryhmä 3). Tässä iässä silmämääräinen tarkastus vatsaontelon selvästi paljasti laajentuneen rakkularauhaset, DLP ja muut eturauhasen lohkoa kontrolliryhmässä TRAMP-hiirillä. DLP osoitti suurempi ilmaantuvuus WDC, MDC ja PDC verrattaessa havaitaan nuorempiin, mikä viittaa siihen, että suurin osa eläimistä ollut syöpä vaurioita DLP (Fig. 2B, i ii). Sen sijaan UA-käsiteltyjen TRAMP hiiret osoittivat alentunut esiintyvyys HG-PIN 40%, WDC 60%, MDC 40%, ja PDC 20% (Kuva. 2B iii). Kaiken kaikkiaan tulokset osoittivat, että UA-käsitellyistä hiiristä osoittivat ei-pahanlaatuisten vaurioiden vaihtelevat LG-PIN ja HG-PIN normaaliksi stroman verrattuna 100% ilmaantuvuus eturauhassyövän ohjaus TRAMP hiirillä.

UA estää aktivoinnin AKT: n, IKKα /β, NF-KB ja STAT3 DLP TRAMP hiirten

Olemme raportoi äskettäin, että UA voi estää AKT, IKKα /β, NF-KB ja STAT3 aktivaation androgeeniriippuvaisessa ja riippumaton eturauhassyöpä solulinjat [18]. Tässä tutkimuksessa olemme tutki vielä vaikutuksia UA rikastettua ruokavaliota aktivoinnista proinflammatoristen välittäjien että DLP TRAMP hiirten (Fig. 1A). Kuten on esitetty kuviossa. 2C, progressiivinen kasvu fosfo (p) -AKT, -pIKKα /β, pSTAT3, ja p65 ilmentyminen havaittiin ryhmästä 1 ryhmään 3 TRAMP hiirten syöpä pikkuhiljaa LG-PIN muodostuminen ryhmässä 1 klo 4-12 viikon ikäisille, HG-PIN ja WD karsinooman DLP ryhmässä 2 12-18 viikon ikäisille, ja WDC, MDC ja PDC klo 24-36 viikkoa iässä. Samanikäisiin ei-TRAMP C57BL /6-hiiristä, käytettiin negatiivisina kontrolleina, eivät osoittaneet mitään muutosta määriä näitä proinflammatoristen proteiinien. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että UA käsittely johti noin 40-50% estäminen ilmaisussa näiden fosforyloitujen proteiinien DLP ryhmien 2 ja ryhmä 3 verrattuna käsittelemättömiin TRAMP hiiriin, kun taas vain lievää laskua havaittiin ryhmässä 1 (Fig . 2C). Tasot fosforyloimattomat AKT ja IKKα oli tapahtunut vähäisiä muutoksia by UA-hoitoa (Fig. 2C). Yhdessä tuloksemme selvästi, että tukahduttaminen proinflammatoristen AKT, NF-KB ja STAT3 aktivointi on merkitystä esto etenemisen eturauhassyövän TRAMP hiiriin UA.

UA estää seerumin TNF -α ja IL-6: n tasoja TRAMP-hiirissä

TNF-α: n ja IL-6 ovat pro-inflammatoristen sytokiinien, ja pidetään merkittävä tulehduksen biomarkkereita. Ryhmät 1, 2 ja 3 hiiret sekä niiden valvontaa tapettiin lopussa kunkin hoito-protokollaa; veri kerättiin sydänpunktuurilla. Saatu seerumi arvioitiin TNF-α: n ja IL-6 käyttämällä ELISA-kittiä. Sekä TNF-α: n ja IL-6 tasot nousivat ryhmästä 1 ryhmään 3, joka vastaa iän myötä ja vaiheissa syövän etenemisen (Fig. 3A). UA-hoito laski merkitsevästi seerumin TNF-α ryhmän 2 (by ~90%) Ryhmä 3 (-30%) (Fig. 3A, i) sekä seerumin IL-6 kaikissa kolmessa ryhmille ~40-90% ( Fig. 3A, ii).

. Suppression seerumin TNF-α (i) ja IL-6 (ii) UA-hoitoa. Ryhmät 1-3 hiiriä käsiteltiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Sandwich-ELISA-määritys suoritettiin, kuten per valmistajien ohje (R 0,05). B, immunohistokemiallinen analyysi sykliini D1, kaspaasi 3: n ja COX-2 kasvainkudoksissa ryhmässä 3 TRAMP-hiirissä. DLP tuumorikudoksia, upotettu parafiiniblokit, leikattiin 5 uM kudosnäytteiden ja tutkittiin sykliini D1, kaspaasi 3 ja COX-2 immuunivaikutukset kuvatun Materiaalit ja menetelmät. UA-hoito (1% paino /paino) määrä väheni ilmentymistä sykliini D1: n ja COX-2, mutta kasvoi kaspaasi-3: n ekspressio verrattuna kontrolleihin. Kuvat otettiin käyttäen Olympus BX51 mikroskoopilla (suurennus, 20 x). Positiiviset solut (ruskea) kvantifioitiin käyttäen Image-Pro plus V6.3 ohjelmistopaketti (Media Cybernetics, Inc.).

UA: n ekspressiota vähentävän sykliini D1, COX-2 ja kaspaasi-3: DLP TRAMP hiirten

tutkimme seuraavaksi eri geenituotteiden osallisina syövän etenemisen (COX-2), lisääntymistä (sykliini D1) ja apoptoosin (kaspaasi-3), jonka immunohistokemia DLP 3 ryhmän TRAMP hiirillä. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, UA-hoito vähensi värjättyjen solujen positiivisia sykliini D1 31%: sta 3%: n ja COX-2: n 89%: sta 27%. Kuten odotettua, ilmaus kaspaasi-3 nousi 6%: sta 95%. Nämä tulokset osoittivat selvästi, että esto on useita geenituotteiden mukana kasvaimen etenemisen ja apoptoosin induktio edistää voimakas kasvaimen vastainen toiminta UA, kuten havaitaan TRAMP tuumorikudoksissa.

UA tukahduttaa kasvaimen kasvua ja lisää eloonjäämistä TRAMP-hiiret

Sen määrittämiseksi, UA voi estää kasvua perustettu eturauhassyövän, 24 viikon ikäisiä TRAMP-hiiret syötettiin ohjaus- tai UA (1%, paino /paino) rikastettua ruokavaliota 12 viikkoa ja sitten tapettiin 36 viikon aikana (Fig. 1A, ryhmä 3). Märkä paino eturauhasen rakkularauhaset osoittivat merkittäviä eroja painon koko eturauhanen. Merkittävä (P 0,05) ero tuumorin tilavuus havaittiin UA-käsiteltyjen hiirten (Fig. 4A). Huomasimme myös, että pitkällä aikavälillä ruokinnan UA rikastettu ruokavalio on turvallista ilman elimen tai kudoksen myrkyllisyys kanssa minimaalinen vaikutus kehon paino (Fig. 4B). Koko 36 viikkoa ajan, ikään sovitettu ei-siirtogeenisten C57BL /6-hiiriä käytettiin negatiivisina kontrolleina, jotka osoittivat mikään piirteitä liittyy eturauhasen syöpään havaittu TRAMP-hiirissä. Kaikki tiedot esitetään vaikutuksista UA-hoidon TRAMP hiirillä (ryhmät 1-3) ovat yhdenmukaisia ​​selviytymisen tiedon siitä, että tällainen käsittely voi merkittävästi pidentää elinikää hiirissä (Fig. 4C). Lisäksi ryhmät 1, 2 ja 3, 4th joukko TRAMP-hiiriä ruokittiin UA rikastettua ruokavaliota 36 viikkoa 4 viikon iässä (ryhmä 4); ohjaus ryhmät saivat normaalia ruokavaliota (Fig. 1A). Hiiret pisteytettiin ajankohtana kuolema perustuva kasvaintaakkaa. Kaplan-Meier selviytymisen käyrät laadittiin määrittää yleinen eloonjääminen. Log-rank (Mantel-Cox) tontteja osoitti nousua eloonjäämisaste hiirten kaikissa UA-hoidetuissa ryhmissä. Mediaanielossaolosta hiirten kontrolliryhmässä oli 55 viikkoa, verrattuna 75 viikkoa ryhmien 1 ja 2, ja 72 viikkoa Group 4 (P 0,05). Ryhmässä 3, mediaanielossaolosta oli 68 viikkoa, mutta ei tilastollisesti merkitsevä (kuvio. 4C). Sen vuoksi voidaan päätellä, että UA-hoito on tehokkainta, kun se aloitettiin varhain, kun TRAMP-hiiret eivät osoittaneet syöpää tai vain alkuvaiheessa PIN kehitystä.

, Hiiret lopetettiin 36 viikon kuluessa, ja kasvaimen tilavuus mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Virhe palkit edustavat SEM. * Tilastollisesti merkittävä (P 0,05). B, Kehon paino Ryhmät 1-3 TRAMP hiiriä ja niiden valvontaa. C, vaikutus UA-hoidon pitkän aikavälin selviytyminen TRAMP hiirillä. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin torjunta- ja UA-käsiteltyjen TRAMP hiirillä. Keskimääräinen elinaika oli 55 viikkoa valvonnalle (n = 5). Mediaani elinaika ryhmässä 1, ryhmä 2, ryhmä 3 ja ryhmän 4 oli 75, 75, 68 ja 72 viikkoa. Kaiken merkitsevyys määritettiin käyttäen log-rank (Mantel-Cox) testi. UA rikastettu ruokavalio merkittävästi pidentynyt eloonjääminen.

Detection of UA Seerumin

UA havaittiin seerumissa kaikista 3 ryhmää TRAMP-hiirillä ruokittu UA rikastettua ruokavaliota. Pitoisuudet havaittiin vaihteli noin 600-1300 ng /ml, joilla ei ole tilastollista merkitystä ryhmien välillä (kuvio. 5B). Kuten UA seerumissa odotettiin saavuttaneen vakaan tilan pitoisuus kaikissa kolmessa ryhmässä, erot pitoisuuden siten heijastuu yksilöllisiä eroja. Ei ole muita piikkejä ei havaittu seerumissa, mikä osoittaa, että UA ei johda metaboliitteja (Fig. 5A, iii ja iv). Tutkimuksemme esittelee ensimmäisen kokeellista näyttöä siitä, että UA imeytyy hyvin suun kautta syöttämisen jälkeen, ja seerumin saavuttaa riittävät saamaan aikaan biologiset vaikutukset, kuten ilmeistä, estämällä eturauhasen tuumorin kasvua TRAMP-hiirissä.

A, (i) Ion kromatogrammit seerumin otteita hiiristä, jotka eivät olleet saaneet UA (tyhjä). (Ii) Full scan-spektristä, jossa m /z piikki, jonka molekyylipaino on 469 vastaa sisäistä standardia (IS) glykyrretiinihappo. (Iii) Full scan spektri osoittaa m /z huippu, jonka molekyylimassa standardin UA at 455 ja IS 469 ja (iv) Full scan spektri näytteen, retentioaika oli 1,7 ja 1,96 min vastaavasti sekä IS ja näytteen. Kromatogrammit edustavat 3 itsenäistä koetta. B, seerumipitoisuudet UA laskettiin Analyst ohjelmistoa 1.4.2 lineaarisesta regressioyhtälöstä piikin alueen suhde vastaan ​​pitoisuuden kalibrointikäyrän. Virhe palkit edustavat SEM.

Keskustelu

TRAMP hiirimallissa on vakiintunut spontaanisti kehittää eturauhasen syöpä malli, joka jäljittelee luonnon eturauhasen syövän etenemiseen, mistä PIN erittäin invasiivisen metastaattinen eturauhassyöpä [ ,,,0],20] ihmisillä. TRAMP-hiirissä, kasvain on peräisin sekä DLP ja vatsanpuoleinen eturauhanen (VP) seurauksena Tag ilmaus, joka on pääasiassa rajoittunut eturauhasen lohkoa [22], kun taas ihmisen eturauhassyöpä peräisin reuna-alue, joka on samanlainen kuin DLP hiirillä [23]. Syövän vastainen vaikutus eri kemopreventiivisten aineiden, mukaan lukien oleanolihapon analogit, sulforaphane, polyfenolit on saatu vihreän teen, valkosipuli ainesosia, curcumin, 3, 3′-diindolylmethane ja genistein on arvioitu aikaisemmin spontaanisti kehittää eturauhasen tuumorigeneesiä TRAMP hiirillä [24], [25], [26]. Lisäksi lykopeeni, γ-tokoferoli, silbinin ja tomaatti rikastettu ruokavalio on kaikki todettu lisäävän selviytymisen ja viivästyttää etenemistä PIN adenokarsinooma ja vähentävän huonosti eriytetty syöpä [23], [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. Kuitenkin kemopreventiossa tutkimus UA eturauhassyövässä mallissa ei ole tehty aikaisemmin, ja vain ryhmämme on viime aikoina raportoitu ensimmäistä kertaa, että UA rikastettu ruokavalio voi todellakin estää eturauhassyövän etäpesäkkeiden moduloimalla CXCR4 /CXCL12 akselin TRAMP hiirillä [19 ]; vaikka vaikutus UA kasvaimen kehittymistä ja etenemistä ei arvioitu. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta UA hoidon kolmessa eri vaiheissa syövän kehityksen TRAMP-hiirissä. Huomasimme, että UA voi merkittävästi estää syövän kehittymisen ja etenemisen kaikissa kolmessa vaiheessa. Ryhmässä 1 hiirillä, havaitsimme mitattavissa tukahduttava vaikutus UA PIN kehitystä, kun taas ryhmän 2 hiiret, kehittäminen korkealuokkaisesta PIN estyi osoituksena väheneminen hyvin eriytetty PIN. Lisäksi UA estivät merkittävästi etenemisen esineoplastiset PIN DLP ja kasvaimen tilavuuden ilman havaittavia haittavaikutuksia Ryhmä 3 hiiret. Kehittäminen runsaasti ei-pahanlaatuisten vaurioiden tässä ryhmässä vastakohtana hallitsevuus pahanlaatuisten vaurioiden valvonta TRAMP hiirillä on ilmeinen. Tulokset histologista luokitusta Lisäksi ehdotetaan, että UA voi pääasiallisesti kehittymisen estämiseksi syövän esiasteita useimmissa hiiriä, ja siten estää kehittymistä erittäin invasiivisia pahanlaatuisten vaurioita. UA myös merkitsevästi lisääntynyt eloonjäämiseen peräti 20 viikkoa, viivästynyt etenemiseen PIN adenokarsinooma, ja vähensi ilmaantuvuus PDC.

Lisäksi havaitsimme, että antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin vaikutukset UA ovat liittyy tukahduttaminen sykliini D1: n ja COX-2, ja NF-KB: n, STAT3, AKT ja IKKα /β aktivoinnin prostates TRAMP-hiirissä. Tällainen inhibitio korreloi pituus ruokinnan aikana kuten ilmeistä on olennaisesti suurempi inhibitio ryhmän 3 hiirillä, jotka saivat UA jatkuvasti for12 peräkkäisen viikon ajan. Väheneminen TNF-α: n ja IL-6 tasot korreloi myös pituus hoitojakson aikana. Tukahduttaminen sykliini D1: n ja COX-2 voi olla seurausta vähentää NF-KB: n ja STAT3, koska nämä tulehdusta transkriptiotekijöiden säätelemään sykliini D1: n ja COX-2 [2], [3], [ ,,,0],31]. Lisääntynyt kaspaasi-3 ilmaisu on ohjeellinen apoptoosin. Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että esto soluproliferaation ja apoptoosin lisääntyminen on keskeinen rooli UA estoa eturauhasen syövän etenemisen TRAMP hiirillä. Se, että UA todettiin kaikissa seeruminäytteistä merkittävinä pitoisuuksina osoittavat edelleen, että UA imeytyy hyvin ja ruokinnalla suun kautta voidaan pitää edullinen antoreitti mahdollisen chemopreventive ja terapeuttinen aine eturauhassyöpää. Sen vuoksi voidaan päätellä, että UA-hoito esti etenemistä PIN adenokarsinooma, vähensi kasvainten kasvua ja lisäsi elinaikaa hiirillä. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että UA voi olla valtava potentiaali käytettäväksi chemopreventive aineena sekä lupaava aine eturauhassyövän hoitoon.

Yhteenvetona tietomme osoittavat selvästi, että UA ruokinta viivästyttää etenemistä eturauhasen syöpä hiirillä modulaation kautta eri tulehdusta molekyylejä. Koska TRAMP on spontaani malli eturauhasen syöpä, joka jäljittelee läheisesti edistyneemmät muodot ihmisen taudin tämän tutkimuksen tulokset antavat hyvän pohjan jatkaa lisätutkimuksia käytöstä UA joko yksin tai yhdessä muiden hoito ehkäisyyn ja /tai eturauhassyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

UA (98%) hankittiin Guangxi Changzhou Natural Products Development Company Ltd (Kiina). UA sekoitettiin normaalin hiiren ruokavalio 1% paino /paino, ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Tris, glysiini, NaCl, SDS, glykyrretiinihappo ja β-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Vasta-aineita fosfo-STAT3 (Tyr 705), fosfori-AKT (Ser 473), STST3 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet AKT, p65: n, fosfo-specific IKKα /β (Ser 180 /Ser 181), ja IKKα ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). TNF-α: n ja IL-6 ELISA-hankittiin Research Instruments (MA, USA). Bradford-reagenssia ostettiin Bio-Rad (Hercules, CA). Immunohistokemia -värjäyspakkausta hankittiin Dako (Tanska).

TRAMP hiiret jalostukseen ja genotyypin

Eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Singapore NACLAR suuntaviivojen (laki marraskuussa 2004) laboratorio- eläinten käyttöä ja care ja hyväksynyt NUS Institutional Animal care ja käyttö komitea protokollan numero 052/09. Lyhyesti, 4 viikon ikäisiä TRAMP naarashiirillä hankittiin The Jackson Laboratory olivat pariutua C57BL /6 uros NUS CARE (Singapore). Pennut genotyypattiin siirtogeenin (Tag) 3 viikon iässä; DNA uutettiin hännästä leikkeet käyttäen TRIZOL® reagenssia (Invitrogen, USA) ja kvantitoitiin käyttäen Nanodrop spektrofotometriä (Thermo tieteellinen, USA). Yksi ug DNA otettiin PCR-analyysillä. Polymeraasiketjureaktio (PCR) Reaktioseos sisälsi 10 ui 5 x QIAGEN PCR-puskuria, 1 ug DNA: ta, 0,6 uM kutakin eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, 2 ui dNTP-seosta ja 1 ui Taq-polymeraasia entsyymiä lopullisessa tilavuudessa 50 ui. Käytetyt alukkeet genotyypin eteenpäin aluke: 5′-CCG GTC GAC CGG AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3 ’, käänteinen aluke: 5′-AGG CAT TCC ACC ACT GCT CCC ATT CAT C-3’. PCR-olosuhteet olivat 94 ° C: ssa 3 min, 94 ° C 30 sekuntia, 62 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, toista vaiheet 2-4 35 sykliä, 72 ° C 2 min ja pidettiin 4 ° C. PCR-tuotteet ajettiin 1% agaroosigeelillä, joka sisälsi 1 x GelRed nukleiinihapon geeli tahra Biotium (Hayward, CA). Stained nauhat saatiin näkyviin UV-valossa ja valokuvattiin käyttäen Biorad Gel doc EZ-järjestelmä (Bio-Rad, USA). Siirtogeenin positiivinen pennut käytettiin sitten seuraavissa kokeissa.

Patologiset arvosteluun tuumorikudoksista

patologinen luokittelu TRAMP eturauhassyövän suoritettiin luokitusjärjestelmä kuvattu aiemmin [22]. Eturauhasen vaurioita DLP histologisesti luokiteltiin normaali (kanava vuorattu yksikerroksinen sekretorisen epiteelisolujen ympäröi kaksi tai kolme solua kerrosta fibrousmuscular strooman), matala-asteinen eturauhasen intraepiteelinen neoplasia (PIN) [epiteelisolujen vaihtelevasti pitkänomainen ytimet kondensoituneilla kromatiinin], laadukkaat PIN (epiteelin kerrostuminen ja tufting, läsnäolo micropapillary ja cribiform rakenteet), hyvin erilaistunut karsinooma (WDC) (epiteelisolut tunkeutuvat fibromuskulaarinen strooman), ja kohtuullisesti erilaistunut (MDC) ja huonosti eriytetty (PDC) adenokarsinooma eturauhasen (arkkia neoplastiset solut, joilla on vähän tai ei lainkaan rauhasrakenteet). 15 satunnaisesti valittua mikroskooppisen kentät hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Ryhmä 2: 12 viikkoa vanha TRAMP hiiriä ruokittiin UA rikastettua ruokavaliota 6 viikon ajan; Ryhmä 3: 24 viikkoa vanha TRAMP-hiiret ruokittiin UA rikastettua ruokavaliota 12 viikkoa. Ohjaus TRAMP hiiret saivat normaalia ruokavaliota. Ruumiinpaino ja kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa ja kasvaimen koko määritettiin Vernier ja lasketaan kaavalla [pituus x (leveys)

2] /2. Hiiret lopetettiin CO

2 hengitysteitse seuraa niskanmurrolla. Verinäytteet, kerättiin sydänpunktiolla, pidettiin 4 ° C: ssa yön yli ja sentrifugoitiin 10000 rpm: ssä 20 minuutin ajan seerumin saamiseksi, jota säilytettiin alikvootteina -80 ° C: ssa. Kasvaimen tilavuus mitattiin ja punnittiin. Eturauhanen microdisected päässä rakkularauhaset stereomikroskoopin alla, kiinnitettiin 10%: fosfaattipuskuroidussa formaliiniin H & E ja immunohistokemiallista analysointia varten.

ELISA-määritys TNF-α: n ja IL-6

Tallennetut seeruminäytteet analysoitiin TNF-α: n ja IL-6 tasot käyttäen ELISA-kittiä (R & D systems, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sandwich-ELISA protokollia käytettiin ja kalibrointi tehtiin standardin TNF-α: n ja IL-6, joka on pakkauksessa.

Western blotting

Dorsolateral eturauhassyövän kudokset lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi (20 mM Tris (pH 7,4), 250 mM NaCl, 2 mM EDTA (pH 8,0), 0,1% Triton X-100, 0,01 mg /ml aprotiniinia, 0,005 mg /ml leupeptiiniä, 1 mM PMSF, ja 4 mM NaVO4). Lysaatit sentrifugoitiin 13000 rpm 10 minuutin ajan liukenemattoman materiaalin poistamiseksi, ja 50 ug proteiinia erotettiin 10% SDS-geelille.