Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Joka vuosi noin 74000 naista kuolee kohdun limakalvon syöpä, lähinnä toistuvia tai etäpesäkkeitä. Läsnä kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL), samoin kuin progesteronireseptoriin (PR) positiivisuus on korreloitu parannettu ennuste. Tutkimuksessa kuvataan kaksi mekanismia, joilla progesteronin estää metastaattinen leviäminen kohdun limakalvon syöpä: stimuloimalla T-solujen tunkeutuminen ja estämällä epiteelin-to-mesenkyymisolun siirtyminen (EMT).

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Parafiinisektioista sairastavilla potilailla (n = 9) tai ilman (n = 9) etenevä endometriumsyöpään (uusiutuva tai etäpesäkkeitä) arvioitiin läsnäolon CD4 + (auttaja), CD8 + (sytotoksinen) ja Foxp3 + (sääntely) T-lymfosyytit ja PR ilme. Etenevä sairaus havaittiin liittyvän merkittävän menetyksen TIL ja menetys PR ilmaisun. Jäädytetyt kasvain näytteitä, joita käytetään genominlaajuisten ilmentymisen analyysi osoitti merkittäviä sääntely reittejä mukana immunesurveillance, EMT ja etäpesäke. Useita geenejä, kuten CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 ja WIF1, kvantitatiivisia RT-PCR suoritettiin sen varmistamiseksi, ylä- tai downregulation in etenevä sairaus. Vahvistavan roolin progesteronin säätelyssä invaasio, Ishikawa (IK) kohdun limakalvon syövän solulinjat transfektoitiin stabiilisti PRA (IKPRA), PRB (IKPRB) ja PRA + PRB (IKPRAB) viljeltiin ilman /progesteroni (MPA) ja käytetyt for genominlaajuisten ilmentymisen analyysi, Boyden- ja haavan muuttoliike määrityksissä ja IHC tunnetut EMT markkereita. IKPRB ja IKPRAB solulinjat osoittivat MPA inhiboivan vaikutuksen muuttoliike ja tappio mesenkymaalisten merkki vimentiinista leviämisrintamassa haavan paranemista määrityksessä. Lisäksi polku analyysi merkittävästi MPA geenien osoitti merkittäviä alas säätely tärkeitä reittejä mukana EMT, immunesuppression ja etäpesäkkeiden: kuten IL6-, TGF-β ja Wnt /β-kateniinin signalointi.

Johtopäätös

Ehjä progesteroni signalointia ei-progressiivinen endometriumsyöpään näyttää olevan tärkeä tekijä stimuloiva immunosurveilance ja estämällä siirtymistä epiteelin entistä mesenkymaaliset, enemmän invasiivisia fenotyyppi.

Citation: van der Horst PH, Wang Y , Vandenput I, Kühne LC, Ewing PC, van IJcken WFJ, et al. (2012) Progesteroni Estää epiteelikasvaimet-to-mesenkymaalitransitioon in endometriumsyöpään. PLoS ONE 7 (1): e30840. doi: 10,1371 /journal.pone.0030840

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 22 joulukuu 2011; Julkaistu: 25 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 van der Horst ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ of LJB ja MvdZ tukee avustusta Alankomaiden Cancer Society (EMCR 2008-4056). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysit, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Joka vuosi kaikkialla maailmassa, yli 287000 naiset kehittävät endometriumsyöpään tehden yleisin gynekologinen syöpä maailmassa ja neljänneksi yleisin naisten maligniteetti kehittyneissä maissa [1]. Yleensä kohdun limakalvon syöpä havaitaan varhaisessa vaiheessa ja leikkaus on kulmakivi hoitoa. Jos on uusiutuva tai etäpesäkkeitä, mutta tilanne on erilainen. (Neo-) adjuvantti säteilyä ja /tai systeeminen hoito yhdistettynä leikkaus on yleensä merkitty ja yleensä etenevä sairaus on huono ennuste osuus 74000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti vuosittain [2], [3]. Ennustavat tekijät toistuvia ja metastasoituneen kohdun limakalvon syöpä ovat kirurgiset FIGO vaiheessa luokan erilaistuminen, histopatologisten alatyyppi ja myometrisia ja lymphovascular hyökkäys [2], [4], [5], [6], [7].

useita syöpätyyppejä, läsnäolo kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) on korreloitu parannettu ennuste, ja paljon tutkimusta on tehty tästä aiheesta [8], [9], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Ajatuksena on, että hyvin eriytetty syöpää herättää tulehdusvasteen samankaltainen akuutti vamma, joka sen jälkeen, kun juokseva tunkeutumisen eri dendriittisten solupopulaatioiden lopulta johtaa T-lymfosyyttien tunkeutumisen [16]. Soluttautumista TIL positiivisena ennustetekijä kuvattiin ensimmäisen ihomelanooman, jossa läsnäolo TIL oli ennustavat parantaa selviytymistä [8]. Galon et ai. vuonna 2006 osoitti, että tunkeutuminen lymfosyyttien adaptiivisen immuunijärjestelmän keskelle ja invasiivisia marginaali paksusuolisyövän korreloi positiivisesti alentunut toistuminen ja parantunut eloonjääminen [10]. Vuonna 2009 Kilic et al., Osoittivat, että korkeita TIL sisällä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä korreloi vähentynyt toistuminen ja tehostettu selviytyminen [12]. Munasarjasyövän, läsnäolo kasvaimensisäisenä T-lymfosyyttien myös korreloi positiivisesti parantunut eloonjääminen ja viivästynyt taudin uusiutumista [15]. Lisäksi TIL munasarjasyövän myös liittynyt kohonneeseen INF-γ, IL2 ja kemokiinit, joka osoittaa T-soluaktivaation ja vetovoima [15].

Läsnäolo TIL ei ole laajasti tutkittu kohdun limakalvon syöpä . Endometriumin syöpä, tunkeutumisen sytotoksisten (CD8 +) T-lymfosyytit alueella vaurion on kuvattu itsenäisenä ennustetekijä ja positiivisesti korreloi taudin vapaasti ja elinaika [17], [18]. Lisäksi korkea sytotoksinen T-lymfosyytti /säätelijä-T-lymfosyyttien (CD8 /FOXP3) suhde on kuvattu korreloivan parantanut selviytymistä tyypin I kohdun limakalvon syöpä [17].

Seuraava virtaa T -lymfosyyttien kasvaimeen alueelle, läsnäolo progesteronireseptoreihin (PR) on kuvattu myös tärkeä voimavara ennusteen ja hoidon endometriumsyöpätapausta [19], [20], [21]. Vuonna hyvin eriytetty endometriumsyöpään PR ilmaisua pidetään tavallisesti ja hoitoa medroksiprogesteroniasetaattia (MPA), ja potilailla, joiden hyvin eriytetty tautia, jotka päättivät säilyttää hedelmällisyyden, on yleensä onnistunut [22], [23]. Menetys PR on kuitenkin negatiivinen ennustetekijä ja liittyy etenevä sairaus, jossa MPA hoito on yleensä vain ajallisesti onnistunut 15-20% tapauksista [24].

Äskettäin ryhmämme on tutkinut mekanismi, jonka avulla progesteronia voi aiheuttaa erilaistumista normaalin kuukautiskierron aikana ja voivat estää hyvin eriytetty kohdun limakalvon syövän kasvua. Havaittiin, että progesteroni käsittely johtaa: n ilmentymisen induktion kaksi tärkeää estäjien Wnt /β-kateniinin signalointi: DKK1 ja FOXO1 [25], [26]. Endometriumin syöpä, aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointi havaitaan 30-40% ja eriytetyn endomet- karsinoomien [27] ja progesteronin inhiboivan vaikutuksen Wnt-signalointireitin on arveltu olevan tärkeä mekanismi vähentää syövän etenemistä [25] .

tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään roolin progesteronin suorana estäjä muuttavia kapasiteetin kohdun limakalvon syövän solujen ja sen roolia T-lymfosyytin liittyvä inhibitioon etenevä sairaus.

Materiaalit ja menetelmät

Patient materiaalit

Ensisijainen kohtukarsinooma kudosta naisilla (n = 9) ja ilman (n = 9) tunnetun episodi toistumisen tai etäpesäke, saatiin hoidettujen potilaiden välillä 1997 ja 2006 yliopistollisen sairaalan Gasthuisberg, katolinen yliopisto Belgian Leuvenissa. Tästä eteenpäin, ei-uusiutuva sairaus kutsutaan ei-etenevä sairaus ja uusiutuva /etäpesäkkeitä kuin etenevä sairaus. Histopatologisia luokittelua, lavastus ja kirjoittamalla määritettiin ohjeiden mukaan WHO ja FIGO [28], [29] ja kaikki kasvaimet tarkistettiin patologi kokemusta gynaecopathology (PCE). Potilaille, joilla on endomet- tyyppi ja levinneisyysaste I kohtukarsinooma olivat mukana. Potilaita hoidettiin radio- tai kemoterapiaa ennen leikkausta käyttäen hormonaalisia steroideja tai toisen syövän suljettiin pois. Täydellinen kliininen historia saatiin kaikista potilaista ja seuranta tarkistettiin tasalla. Näytteet snap-jäädytettiin nestetyppeen RNA-eristys tai kiinnitetty formaliiniin ja upotettiin parafiiniin immunohistokemiallinen (IHC). Sillä mikrosiruanalyysi, 4 ei-progressiivinen ja 4 etenevä potilaita, snap jäädytetty kasvain näytteitä käytettiin. Nämä valittiin, koska ne sisälsivät 80% kasvainkudoksen ja hyvä laatu RNA voidaan eristää niistä. RT-PCR, 6 ei-progressiivinen ja 6 progressiivinen snap jäädytetty potilaskudos näytteitä käytettiin. IHC 9 ei-progressiivinen ja 9 progressiivinen parafiiniin potilaan kudosnäytteistä oli saatavilla. Tissue ja kliinisten tietojen keruu nykyisen tutkimukseen hyväksyi Medical eettinen komitea yliopistollisen sairaalan Gasthuisberg ja potilaat antoivat tietoon suostumus Kudosten keräys ja kliinisten tietojen keruu kaikista tutkimustarkoituksiin.

Soluviljely

kaikille solulinjakokeissa, Ishikawa kohdun limakalvon syöpä solulinjoja stabiilisti transfektoitu PRA (IKPRA-1), PRB (IKPRB-1) tai PRA ja PRB (IKPRAB-36) (aikaisemmin kuvanneet Smit-Koopman et al. [30]) viljeltiin ja pidettiin tavanomaisessa viljelyväliaineessa (DMEM /F12 Glutamax, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) läsnä ollessa 5% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), johon oli lisätty penisilliiniä ja streptomysiiniä (Invitrogen). Neomysiini (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) ja hygromysiini (Invitrogen) 1:200 käytettiin yllä valintaan. Kaikki määritykset, soluja viljeltiin DMEM /F12 Glutamax elatusaineessa, jota oli täydennetty penisilliinillä ja streptomysiinillä (Invitrogen), joka sisälsi 5% puuhiilellä puhdistettua FCS: ää (Invitrogen), johon oli lisätty hygromysiini ja neomysiiniä.

Immunohistokemia

IHC tutkimukset CD4 (SANBio BV, Uden, Hollanti), CD8 (Dako, Glostrup, Tanska), FOXP3 (Natutech, Frankfurt am Main, Saksa) ja PRA + PRB (progesteronireseptorille Ab-8, Neomarkers, Fremont, CA, USA) suoritettiin 4 um: parafiinia osioista Starfrost-dioja (Knittel, Braunschweig, Saksa). Ennen inkubointia primaarisen vasta-aineen, objektilasit poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin 70% etanolia. CD4 + ja CD8 + T-lymfosyyttien värjäytymistä, objektilaseja mikroaalloilla 850 wattia Tris /EDTA pH 9,0: ssa 15 minuuttia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 30% H

2O

2 PBS: ssä 5 min. Primaaristen vasta-aineiden levitettiin vastaavasti 1:160 (CD4) ja 1:200 (CD8) Tris /HCI, pH 8,0, ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Pesun jälkeen Tris /HCl pH 8,0, leikkeitä inkuboitiin 30 minuutin ajan. huoneenlämpötilassa biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (Dako, 1:400). Pesun jälkeen Tris /HCL, substraatti diaminobentsidiini (Dako) käytettiin visualisointi antigeeni-vasta-reaktiivisuus.

FOXP3, kalvot estettiin (peroksidaasi deaktivointi) 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT) 30 % H

2O

2 metanolissa ja keitetty (antigeeni haku) on sitraatti-puskuri, pH 6,0 15 minuuttia. Primaarinen vasta-aine levitettiin 1:25 ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. PBS-pesun jälkeen, laseja inkuboitiin 30 min. toissijaista kanin-anti-rotta-vasta-ainetta (DAKO, 1:150) ja inkuboitiin 30 min. jossa AB-kompleksin (Dako). Alustan Diaminobenzidine (Dako) käytettiin visualisointi antigeeni-vasta reaktiivisuus.

PRA + PRB värjäys, endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin 5 minuutin ajan RT: ssa 10% H

2O

2 metanoliliuosta ja objektilasit mikroaalloilla (antigeeni haku) mikroaaltouunissa-uunissa 850 Watt 10 nM sitruunahappoa, pH 6,0 (DAKO) 15 minuutin ajan. Jäähdytyksen jälkeen huoneen lämpötilaan levyt pestiin PBS: llä ja blokattiin 30 minuutin ajan 0,3% BSA /PBS: ssä. Primaarinen vasta-aine levitettiin 1:50 ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. PBS-pesun jälkeen, laseja inkuboitiin 30 minuuttia biotinyloidun sekundaarisen vuohen-anti-hiiri-vasta-ainetta (Dako, 1:400). Toisen pesun jälkeen objektilasit inkuboitiin 30 min AB-kompleksin (Dako, 01:01:50). Substraatti diaminobentsidiini (Dako) käytettiin visualisointi reaktiivisuus. Kaikki objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä 30 s, sitten kuivattu ja kiinnitetty.

vimentiinista värjäystä, haavan paranemista määritys suoritettiin 2-Kaivokammio dioja (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , USA), läsnä ollessa ja puuttuessa 1 nM medroksiprogesteroniasetaatin (MPA), ja päättyy 48 tunnin kuluttua. Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, kiinnitettiin 4% formaldehydiä /PBS: ssä 15 minuutin ajan ja tehtiin läpäiseviksi 0,3% Triton100 /PBS: llä 5 minuutin ajan. Pesun jälkeen endogeeninen Peroksidaasiaktiivisuuden blokattiin 10% H

2O

2 metanolissa 5 minuuttia. Objektilasit pestiin ja salvattiin sitten 30 minuuttia 0,3% BSA /PBS: ssä. Anti-vimentiinin vasta-ainetta (Invitrogen) levitettiin 1:50 ja laseja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, laseja inkuboitiin kanssa GFP-fluoresoiva vuohen-anti-hiiri-vasta-ainetta (Invitrogen) on 1:500. Pesun jälkeen laseja inkuboitiin 5 minuuttia DAPI Nucleic Acid Värjäys Solution (Invitrogen) ja tumavärjäystä. Päättymisen jälkeen reaktio dH

2O, objektilasit asennettu ja loisteputki Kuvat on otettu kanssa Axioplan 2 Imaging fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa).

Counting TIL

värjäyksen jälkeen levyt skannattiin NDP dia skanneri (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japani) ja CD4, CD8 ja FOXP3 kasvain tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) laskettiin käyttäen Image J ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, MD , USA). Lukumäärä TIL määritettiin sisällä kasvain (kasvaimensisäisiä), kasvaimen reuna (kasvain Edge) ja kohdun /myometrisia rajalla (EM). Täydellinen kasvaimen reuna ja kohdun limakalvon /myometrisia rajalla arvioitiin läsnäolon TIL. Kasvaimensisäinen määrä suoritettiin laskemalla TIL 10 eri sattumanvaraisesti alueita (1170 pm x 932 um) valitsi riippumaton tutkija, mikä hävittää tarkkailija bias.

WST1 määritys

WST1 proliferaatiomäärityksessä IKPRA-1, IKPRB-1 ja IKPRAB-36 solulinjoja viljeltiin puuttuessa tai läsnä mykofenolihapon 96-kuoppaisen levyn (Corning Costar, Cambridge, MA, USA). Hetkellä 0, soluja inkuboitiin solujen lisääntymistä reagenssin WST1 (Roche, Basel, Sveitsi) 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja absorbanssi mitattiin mikrolevylukijaa (Biorad, malli 550, Hercules, CA, USA). Sen jälkeen, kun mittausta solulinjoja viljeltiin läsnä ollessa ja puuttuessa 1 nM MPA 96 tuntia ja 96 tuntia, WST1 määritys toistettiin.

Migration määrityksissä

haavan paranemista määritys, IKPRA-1, IKPRB-1 ja IKPRAB-36 solulinjoja viljeltiin 6-kuoppaisella levyllä (Corning Costar). Sen jälkeen, kun indusoiva haava, soluja inkuboitiin 1 nM MPA 96 tuntia. Haavan paranemisen varmistettiin aina 24 h valokuvauksen, ja analysoitiin mittaamalla sulkeminen haavan.

modifioitu Boydon määrityksessä solut ympättiin ylemmän hyvin modifioidun Boydon kammion (Transwell, 8 um huokosia, 24 mm insertit, 6-kuoppaisella levyllä, Corning Costar) 2,5 x 10

5 solua per kuoppa läsnä ollessa tai puuttuessa 1 nM MPA. Lisäksi kontrollina soluja viljeltiin Boyden kammion läsnä ollessa tai puuttuessa 1 nM MPA yhdessä 100 nM anti-progestagin Org31489 (Organon, Oss, Alankomaat). 96 tunnin kuluttua solut, jotka olivat vaeltaneet suodattimen läpi alempaan hyvin tai insertin pohjaan trypsinoitiin ja laskettiin mikroskoopin alla.

Western blotting

IKPRA-1, IKPRB- 1, IKPRAB-36 ja IKLV-8 solulinjoja viljeltiin puuttuessa tai läsnä on 1 nM MPA 96 tuntia ja sen jälkeen hajotettiin 0 ° C: ssa Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 5 minuuttia . Sitten solut kaavittiin, sentrifugoitiin 14,000 rpm 10 minuuttia, ja supernatantti poistettiin. Proteiinikonsentraatio laskettiin käyttäen Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ja kunkin näytteen 4,5 ug proteiinia 30 ul: lyysispuskuriin + BSA ladattiin 10% SDS-PAGE-geelissä. Western-blottaus suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Imupaperissa blokattiin 30 minuutin ajan RT: ssä estopuskuria (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA) ja inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa käyttäen kaniinin polyklonaalista anti-hFOXO1-vasta-aine (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) estopuskurissa (LI-COR Biotechnology). Seuraavaksi Blottauskalvoa inkuboitiin toisen vuohen anti-kani-IgG (IRDye 800CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology) 30 minuuttia RT: ssa ja pestiin. Latauskontrollina, kaivoa inkuboitiin 30 minuuttia monoklonaalisen anti-β-aktiini (1:1000, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 30 minuutin ajan sekundaarisen goat- anti-hiiri-IgG (IRDye 680CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology). Erityinen Proteiinivyöhykkeet havaittiin käyttäen Odyssey Scanning System (LI-COR Biotechnology).

RNA-eristys, geenien ilmentyminen analysoidaan ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

Patient kudosnäytteet leikattiin (5 um, kryostaatti) ja joka 10.

th jakso oli HE värjätään ja tarkistaa niitä patologi (PCE) arvioida kasvaimen kuormaa. Vain kohdat sisältävä 80% kasvain lyysattiin Trizol (Invitrogen) ja sonified 1 min. PRA ja PRB ilmentävät Ishikawa solulinja (IKPRAB-36) viljeltiin 48 h puuttuessa tai läsnä on 1 nM MPA (n = 3), laitettiin jäihin ja hajotettiin Trizol (Invitrogen).

faasien erottumista suoritettiin 0,2 ml: lla kloroformia ja sentrifugoitiin 15 min. Supernatantti siirrettiin ja lisättiin isopropanolia RNA saostumisen. Saostunut RNA pestiin 75% etanolilla. RNA puhdistettiin kanssa Rneasy MinElute uudelleenjärjestäminen (Qiagen, Venlo, Alankomaat). Määrä ja laatu RNA arvioitiin käyttämällä Nanodrop (Nanodrop, Wilmington, DE, USA) ja Bio-analysaattori (Aligent, Santa Clara, CA, USA).

RNA eristettiin potilaan ja solulinjan materiaali leimattiin mukaan Affymetrix merkintöjä protokollia ja leimattu RNA sovellettiin genominlaajuisten ilmaisu paneelit (Affymetrix U133plus2 GeneChips sisältävien 54614 koetinsarjojen eli noin 47.000 selostukset (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)). Käyttämällä RMA (Robust Multi-array-analyysi [31]), normalisoituminen raakadatan tehtiin pystyä tuottamaan geenin luetteloihin ja lopulta laskea merkittävästi geenien käyttämällä SAM (Stanfordin yliopisto, Stanford, CA, USA [32]). Luettelot SAM säänneltyjen geenien (1,25-kertainen tai enemmän, delta-arvot muistuttavat p 0,05) on ladattu Ingenuity polku auttaa ohjelmisto arvioida osallistumista erilaisten biologisten reittien (kekseliäisyyttä, Redwood City, CA, USA). Potilaalle materiaalit raaka luettelot säännellyistä geenien (1,25-kertainen tai enemmän) ladattiin kekseliäisyyttä.

Kaikkia mikro-array data on MIAME yhteensopiva ja raaka tiedot on talletettu MIAME yhteensopiva GEO-tietokannan alle sarja: GSE29437 (koostuu GSE29435: solulinjan tietojen ja GSE29436: potilastiedot).

Geenit kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR tunnistettiin mikro- erilaisia ​​analyysi ja polku analyysi. RNA cDNA: ksi käyttämällä Affymetrix yhden syklin cDNA-synteesi kit (Affymetrix). Yksilöityjen geenit, alukkeet tilattu ja testattiin (luettelo alukkeiden ovat taulukossa S1). Housekeeping-geeni β-aktiini käytettiin referenssinä geeni. RT-PCR suoritettiin ja analysoitiin käyttäen CFX RT-PCR-järjestelmä (Bio-Rad, Veenendaal, Alankomaat).

Tilastot

tilastotiedot CD4 +, CD8 + ja FOXP3 + solujen laskee, modifioitu Boyden chamber koetulokset, WST1 koetulokset ja RT-PCR data, SPSS 15.0 käytettiin (IBM, Armonk, NY, USA). Normaalille hajautettu data t-testi ja vino datan Mann-Whitneyn U-testi arvioimiseksi suoritettiin P-arvoja. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Laskea p-arvo säänneltyjen polkuja, kekseliäisyyttä polku auttaa ohjelmisto käyttää Fisherin testiä.

Tulokset

Potilaan ominaisuudet (taulukko 1)

Potilaat, joilla on (n = 9) ja ilman sitä (n = 9) etenevä kohdun limakalvon syöpä oli mukana. Kaikki mukana potilaalle tehtiin ensisijainen yhteensä abdominal- tai laparoscopically avustamana emättimen kohdunpoisto ja kahdenvälistä salpingo munasarjan poisto yhdistettynä imusolmuke poiston. Yksikään naisista sai kemoterapiaa ja vain yksi nainen etenevä sairaus ryhmälle annettiin sädehoitoa leikkauksen jälkeen. Histopatologisia alatyyppejä olivat endomet- (n = 17) ja sekoitetaan endomet- /mucinoid (n = 1). Kasvaimen laadut olivat 1 (n = 7), 2 (n = 4) ja 3 (n = 7) ja FIGO vaiheet olivat Ia (n = 11) ja Ib (n = 7). Vuonna etenevä sairaus ryhmän kaikki 9 potilaalla oli yksi tai useampia jaksoja paikallisen uusiutumisen ja 4 potilaista kehittyi yksi tai useampia kaukaisia ​​etäpesäkkeitä. Toistuminen oli emättimen, lantion tai (retro) vatsakalvon ja metastaasien olivat keuhkot (n = 3), maksassa (n = 1), perna (n = 1) ja aivot (n = 1). Kliinistä seurantaa tasalla oli saatavilla kaikille potilaille. Ei-progressiivinen ryhmä 8 potilasta hetkellä tautivapaita ja 1 potilas kuoli seurantaan. Vuonna etenevä sairaus ryhmän 3 potilaat ovat tautivapaita ja 6 potilasta kuoli niiden kohdun limakalvon syöpään liittyvät sairaus. Potilaiden ominaisuudet on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa 1.

progesteroni reseptoristatus ja havaitseminen CD4 + T-auttaja, CD8 + sytotoksiset T-solut ja FOXP3 + säätelijä-T-solujen ei-etenevä ja etenevä sairaus

läsnäolo kasvain tunkeutuvia lymfosyyttejä on korreloi pidensi elinaikaa endometriumin syöpä [17], [18]. Lisäksi menetys progesteronireseptorin (PR) ilmentyminen kohdun limakalvon syöpä on todettu olevan riskitekijä etenevä sairaus, [33]. Tukeakseen suhdetta ehjä PR signalointi ja läsnäolo tunkeutuvia lymfosyyttejä ei-etenevä sairaus, immunohistokemiallisella värjäyksellä ja tarvittaessa määrällinen mittaukset suoritettiin.

Kuten kuviossa esimerkkinä. 1A, vuonna etenevä sairaus immunohistokemiallisella värjäyksellä CD4 +, CD8 + ja FOXP3 + T-lymfosyyttien näyttää pienentynyt verrattuna värjäystä ei-etenevä sairaus. Kvantifiointi CD4 +, CD8 + ja FOXP3 + T-lymfosyyttien, etenevä sairaus vahvistivat, pienempi määrä positiivisia soluja sijaitsee kohdun-myometrisia rajalla (Fig. 1 B, EM), reunalla kasvain (Fig. 1 B, kasvain Edge) ja sisällä kasvain (Fig. 1 B, kasvaimeen). Onko alennettu solumäärä oli merkitsevää eroa ei-progressiivinen ja progressiivinen kohdun limakalvon syöpä kudoksiin on esitetty kuvassa (Fig. 1 B).

V: Katsaus immunohistokemiallisella värjäyksellä CD4, CD8 ja FOXP3 perusterveydenhuollossa kohdun limakalvon syöpä yksilöt ei-etenevä sairaus (n = 9) verrattuna etenevä sairaus (n = 9) (suurennos 0,4x, inlay 10x). Ei-progressiivinen tauti osoittaa lausutaan värjäys, kun taas etenevä sairaus osoittaa pienentää värjäystä. Asteikko-pylväs edustaa 10 mm. B: kvantitointi CD4, CD8 ja FOXP3 solumäärät kasvaimen reunalla (kasvain Edge), että kasvain (kasvaimensisäisenä) ja kohdun-myometrisia rajalla (EM raja). * Osoittaa p-arvo 0,05 (Mann-Whitney U-testi). C ja D: Havainnollinen ei-progressiivinen (C) ja progressiivinen (D) potilaan kudokset värjättiin CD4, CD8 ja PRA + PRB ja on positiivinen korrelaatio läsnäolon TIL ja ilmaus PR. Suurennus on 5x ja asteikko-pylväs edustaa 1 mm. Potilaat 6 ja 11 olivat molemmat mukana mikro-array analyysit. Lisäksi potilaalla 11 oli vain uusiutuva sairaus, kun taas potilaalla 12 oli uusiutuva ja etäpesäkkeitä.

Lisäksi tarkastellaan peräkkäistä leikettä ulkopuolisissa etenevä sairaus ilmentämiseen progesteronireseptorit (PR) paljasti, että läsnä oli CD4 + ja CD8 + T-lymfosyytit korreloi positiivisesti läsnäolon PR värjäyksen (Fig. 1 C ja 1 D).

genominlaajuiset ilmentymisen analyysit ensisijainen kohtukarsinooma kudoksen

tutkia, onko korrelaatio PR signalointi ja läsnäolo kasvain tunkeutuvia lymfosyyttejä voisi osoittaa kausaalinen suhde, genomin laajuinen mRNA-ekspression analyysi snap-jäädytetty ensisijainen kohtukarsinooma näytteitä 4 potilailla, joilla ei ja 4 potilaalla on etenevä sairaus tehtiin. Yksilötasolla geeni taso havaittiin, että huomattava määrä kemokiinien ja sytokiinien olivat säädellään eri tavalla välillä ei-progressiivinen ja etenevä sairaus (taulukko S2). Esimerkiksi kemokiinien CCL21 (-1.5x), CXCL9 (-2.9x), CXCL10 (-2.1x) ja CXCL14 (kolme tiedot esitetään esillä: -33.0x, -20.5x, -6.4x, vastaavasti) olivat kaikki alas säännelty etenevä sairaus, kun taas sytokiinien IL8 (2.0x, 5.7x, 9.5x) ja IL32 (1.9x) oli säädellään ylöspäin etenevä sairaus (taulukko S2). Lisäksi aikaisempi työ ryhmämme on ilmoittanut aktivointi Wnt /β kateniinin signalointi etenevä sairaus [25] ja hyväksyy tämän useita Wnt /β-kateniinin inhibitory- ja kohde- geenien unohtuivat etenevä sairaus (DKK1, DKK4 ja WIF1) (taulukko S2).

Mielenkiintoista, useita edellä mainittuja geenejä, jotka ovat alaspäin säädeltyjä etenevä sairaus, on kuvattu kirjallisuudessa olevan ajan säädellä progesteroni (CXCL14 [34], DKK1 [25], MMP7 [35] ja SFRP4 [36]). Tämä on yhtäpitävä sen havainnon kanssa, että PR lauseke (at proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen taso (Fig. 1 C ja 1 D ja taulukko S2) on alaspäin säännellään etenevä sairaus.

Tarkistaessamme väyliä säädeltyjä ei-progressiivinen ja progressiivinen sairaus, sääntely useita reittejä osallisena syövän synnyn ja invasiivisia sairauksia ja mukana immuunitutkimusohjelmasta havaittiin merkittävästi säädellä: integriini Signaling, Molecular Mechanisms of Cancer, antigeeninesittelyreitille, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Signaling, IGF-1 Signaling, rooli Tissue Factor Cancer, Leukocyte Ekstravasaatiota Signaling, ERK /MAPK Signaling, peräsuolen syövän etäpesäke Signaling (joka sisältää Wnt /β kateniinin signalointi), FGF Signaling, FAK Signaling jne (täydellinen lista säännellyn reittejä ja niiden perättäisen p-arvot pääsee taulukosta S3).

useita geenejä (CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 ja WIF1) kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin varmistaakseen asetuksen (Fig. 2).

CXCL14, DKK1, DKK4, WIF1 ja PEG10 valittiin mikro-array tuloksia ja todentaa reaaliaikainen RT-PCR. Merkittävyys laskettiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testi. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Vaikutus progesteronin siirtolaisuudesta Ishikawa kohdun limakalvon syövän solulinjoissa

Jotta voitaisiin edelleen vahvistaa mahdollisesta roolista progesteronia säätelyssä invaasio, Ishikawa kohtukarsinooma solulinjat transfektoitiin stabiilisti PRA, PRB tai PRA ja PRB [30] viljeltiin läsnä ollessa tai poissa ollessa MPA eripituisia aikoja ja käyttää kahdella eri kokeessa mitataan solujen vaeltamiseen. Voit tarkistaa solujen lisääntymistä aikana eri kokeissa WST1 leviämisen Testi suoritettiin osoitti, että sisällä ilmoitettu aikataulussa ole merkittäviä eroja lisääntymistä voitiin havaita solujen välillä inkuboitu kanssa tai ilman MPA.

Kuvassa 3 eri Ishikawa solu linjat tehtiin haavan paranemista määritys läsnä ollessa tai poissa ollessa MPA (1 nM) ja jopa 96 tuntia. Havaittiin, että stabiilisti PRB ilmentävät (IKPRB-1) ja PRA + PRB ilmentävien (IKPRAB-36) Ishikawa solulinjat, MPA esti sulkeminen käsin aiheutettu haava (Fig. 3A-D). Lisäksi, kun värjätään reunan haavan mesenkymaaliset merkki vimentiinin, havaittiin, että kun läsnä on MPA vimentiinista ilmentyminen väheni selvästi (Kuva. 3E). Seuraava tähän yksityiskohtaisesti ilmaus vimentiinista yleinen vimentiinistä tasot laskivat IKPRB-1 ja IKPRAB-36 solulinjoja inkuboitiin 1 nM MPA. Havaittiin myös, että stabiilisti PRA ilmentävät (IKPRA-1) Ishikawa solulinjaa, ei haavan paranemista eikä vimentiinista ilmentyminen vaikutti MPA (Fig. 3A ja 3E).

IKPRA-1 (A), IKPRB-1 (B) ja IKPRAB-36 (C) soluja viljeltiin ilman (valkoiset luodit) tai läsnä ollessa (mustat luoteja) 1 nM MPA ja käytetään haavan paranemista määrityksessä (n = 3) ja sulkeminen haava mitattiin prosentteina koko suljin (100% tarkoittaa, että haava on auki, 0% tarkoittaa, että haava on suljettu). D esitetään edustavat kuvat prosessin haavan paranemista kanssa punaisella haavan. E esittää IF ytimet (DAPI) ja vimentiinista ilme invasiivisia edessä käsin aiheutettu haava. Tässä kuviossa, haava oli aina sijaitsee oikealla puolella.

Kuviossa 4, toinen lähestymistapa on käytetty tutkimaan vaeltavien kapasiteetti eri Ishikawa solulinjojen läsnä ollessa tai ilman progesteronin. Havaittiin, että IKPRB-1 sekä IKPRAB-36-soluja, muuttoliikettä modifioitu Boyden kammion estyi, kun läsnä oli progesteronin. Lisäksi niiden IKPRA-1 solulinja tällainen ero sääntely maahanmuuton vaikutuksen alaisena MPA ei havaittu.

IKPRA-1, IKPRB-1 ja IKPRAB-36-soluja viljeltiin ilman (mustat pisteet ) tai läsnä ollessa (valkoiset pisteet) 1 nM MPA muokatussa Boyden kammion. 96 tunnin kuluttua solut, jotka olivat vaeltaneet huokosten läpi ylemmän ja laskettiin. Luku edustaa kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. * Osoittaa p-arvo 0,05 (Mann-Whitney U-testi).

Genominlaajuiset ilmentymisen analyysi Ishikawa kohdun limakalvon syövän solulinja

Edelleen dokumentti progesteroni inhiboivan vaikutuksen solumigraatiota ja tutkia osallistumista progesteronin signaloinnin T-lymfosyyttien infiltraatio, IKPRAB-36-soluja viljeltiin 48 h ajan, kun läsnä tai poissa ollessa 1 nM MPA ja käytettiin genomin laajuinen ilmentymisen analyysi. Havaittiin, että 1616 geenit merkittävästi säätelee progesteronin IKPRAB-36-solulinja (1029 säädelty, 587 alassäädetty, taulukko S4).

Käyttämällä Nerokkuus koulutusjakson analyysi merkittävästi geenien, seuraavat