Krooninen sairaus

tiivistelmä

sykliini B1, mitoottinen sykliini, on liitetty malignances. Kuitenkin sen osuus peräsuolen syövän eteneminen ja metastaasit ovat edelleen huonosti ymmärretty. Täällä, osoitimme, että hyökkäys ja etäpesäkkeiden paksusuolisyövän säätelee sykliini B1. Yliekspressio sykliini B1 havaittiin peräsuolen syövän kudoksissa, mutta tämä kohonnut ilmentyminen negatiivisesti yhteydessä imusolmuke etäpesäke, kaukainen etäpesäke vaiheessa ja TNM-luokitus. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että alhainen sykliini B1-ilmentyminen liittyy huono eloonjäämisaste sairastavien potilaiden peräsuolen syöpä. Esto sykliini B1 peräsuolen syöpäsoluissa tehosti Solujen migraation ja invaasion kolme erilaista kolorektaalisyövän solulinjoissa. Tutkittaessa mahdollinen mekanismi, jolla sykliini B1 estää peräsuolen syövän eteneminen ja metastaasit, havaitsimme, että suppressio sykliini B1 vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin proteiinin tasolla. Tulosten perusteella näyttää, että sykliini B1 voisi tukahduttaa hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden paksusuolisyövän soluihin säätelemällä E-kadheriinin ilmentymisen, joka mahdollistaa kehittämisen mahdollisten strategioiden osalta paksusuolisyövän.

Citation: Fang Y, Liang X, Jiang W, Li J, Xu J, Cai X (2015) sykliini B1 vaimentaa peräsuolen syövän eteneminen ja metastaasit säätelemällä E-kadheriinin. PLoS ONE 10 (5): e0126875. doi: 10,1371 /journal.pone.0126875

Academic Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 18 tammikuu 2015; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2015; Julkaistu: 11. toukokuuta 2015

Copyright: © 2015 Fang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki kansainvälisen tiede- ja teknologiayhteistyötä Projects of China (https://www.istcp.org.cn/) (Grant No. 2012DFA30410 että Xiujun Cai), ja National Science-teknologia Tukisopimusvaihtoehdot Projects of China (https://www.most.gov.cn/) (Grant nro 2012BAI14B06 on Xiujun Cai).

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Vaikka lisääntynyt yleinen tietoisuus, peräsuolen syöpä on edelleen yksi kolmesta johtavista syistä pahanlaatuisuuteen liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1]. Suurin osa peräsuolen syöpäpotilaiden alkuvaiheessa (TNM I ja II) voidaan hoitaa tehokkaasti kirurginen resektio ja 5 vuoden eloonjäämisluvut varten alkuvaiheen syöpien on jopa 95% (vaihe I) ja 60-80 % (vaihe II), vastaavasti. Kuitenkin useimmat Metastasoivassa peräsuolen syövän pitkälle edennyt (TNM-luokitus III ja IV) ovat yleensä tulenkestävä nykyisiin hoitoihin ja on melko huono ennuste, koska 5-vuoden eloonjäämisluvut pudota dramaattisesti 35% imusolmuke osallistuminen (vaihe III ) ja 10%, kun tauti on levinnyt kaukaisiin elimiin (vaihe IV) [2-5]. Siten etäpesäkkeiden muodostuminen on ratkaiseva ja kaikkein vaarallisin tapahtuma tänä taudinkulku. Itse asiassa, kasvaimen etäpesäke on monimutkainen biologinen prosessi, johon ensisijainen tuumoriangiogeneesissa, syöpäsoluinvaasiota, verisuonten /imusuonten intravasation, kaukainen kohde-elimessä ekstravasaatio, ja kasvu hyökkäsi solujen ulko- mikroympäristön muodostamiseksi metastaattisen kolonisaation [6-8]. Vaikka dysregulaatio signalointireittien ja toimintahäiriö monien molekyylien on havaittu syövän etäpesäkkeitä, ne eivät voi täysin selittää ilmiön paksusuolen syövän etäpesäkkeiden [2]. Näin ollen on erittäin tärkeää paljastaa biologisten mekanismien etäpesäke kolorektaalisyövässä ja laatia strategioita puuttua tähän prosessiin.

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) tunnetaan ratkaiseva mekanismi kolorektaalisyövässä etäpesäke ja avainsäätelijä kaukaisten elimen muodostumisen [9-11]. Prosessin aikana EMT, epiteelin johdettuja kasvainsolujen menetys soluadheesion ja päin, ja voitto muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia, jotka aiheuttavat mahdollistaa kasvainsolujen tunkeutua ympäröiviin kudoksiin ja siten lisensointi näiden solujen etäpesäkkeitä kaukaisiin kudoksiin [9, 12 ]. Molekyylitasolla, E-kadheriinin on parhaiten tunnettu molekulaarinen merkkiaine EMT. Menetys E-kadheriinin ilmentymisen tunnetaan kaikkein hallitseva tunnusmerkki EMT [13-15]. E-kadheriinin, jota koodaa CDH1 geeni, joka sijaitsee kromosomissa 16q22 [16], on läpäisevä glykoproteiini rajoittuu epiteelisoluihin ja on pääasiassa vastuussa solujen välinen kiinnittyminen risteyksissä [17]. Monet transkriptiotekijät, kuten Snail, ZEB1, ZEB2, FOXC2, Slug, ja Twist on osoitettu suoraan tai epäsuorasti aiheuttaa tukahduttaminen E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus [18-21]. Lisäksi menetys tai vähentäminen E-kadheriinin ilmentyminen havaittiin sallia tai nopeuttaa ja metastaasit, ja siten ehdotti mahdollisena ennustetekijä peräsuolen syöpä [22-25].

sykliini-B1, kartoitetaan ihmisen kromosomi 5q12, tunnetaan mitoottinen sykliini koska sen keskeinen rooli moduloimaan G2 /M-vaiheen etenemisen solusyklin ja osallistuu solujen kasvuun, erilaistumiseen, apoptoosin, ja etäpesäkkeiden eri syöpätyypeissä [26-29]. Tähän mennessä lisääntyneen ekspression sykliini B1 on raportoitu rinnan, eturauhasen, ruokatorven, keuhko-, paksusuoli-, ja syöpien [30-36]. Aiemmissa tutkimuksessa löytyi myös yli-ilmentyminen sykliini B1 edistetään solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua paksu- ja peräsuolisyövän [37]. Kuitenkin puuttuminen prognoosi- merkitystä tai myönteinen ennusteeseen sykliini B1 havaittiin myös peräsuolen syöpä, lymfooma ja haiman neuroendokriinikasvain [35, 38, 39]. Nämä eroavuudet osoittavat lisätutkimuksia voidaan tarvita.

Tässä tutkimuksessa selvittämään, onko ja miten sykliini B1 on mukana soluinvaasiota ja etäpesäkkeiden kolorektaalisyövässä, me aluksi arvioitiin sykliini B1 ilmaisun 150 paria peräsuolen syöpä ja sovitettu viereisen ei-kasvain peräsuolen kudoksiin, sitten analysoidaan sen korrelaatio kliinis. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että yliekspressio sykliini B1 kolorektaalisyövässä oli negatiivinen korrelaatio imusolmuke etäpesäke, kaukainen etäpesäke, TNM vaiheissa, ja huono selviytyminen. Tutkimuksemme paljasti myös estämällä sykliini B1 tukahdutti ilmentymistä E-kadheriinin ja johti sittemmin induktion muuttoliikkeen ja invaasion peräsuolen syövän soluja. Nämä havainnot paitsi osakkuusyrityksen sykliini B1 metastasiaa kolorektaalisyövässä, mutta myös lupaava kohde hoidettaessa myöhäisen vaiheen potilailla, joilla peräsuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

tumorous ja sovitettu viereisten normaali peräsuolen kudoksista saatiin 150 potilasta, joille tehtiin leikkaus Sir Run Run Shaw sairaala, School of Medicine, Zhejiang University (Hangzhou, Kiina), välillä huhtikuussa 2005 ja kesäkuussa 2009. erityisesti viereisen normaaleissa kudoksissa otettiin 5 cm sivusuunnassa reunasta syöpä alueella. Kukaan näistä potilaista olivat saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen käyttöä. Tämä tutkimus hyväksyi Sir Run Run Shaw sairaala tutkimus- eettinen komitea ja kaikki näytteet saatiin kirjallinen suostumus (S1 Kuva). Kaikki näytteet jäädytettiin välittömästi nestetyppeen jälkeen kirurgisen resektion ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA.

Kliiniset tiedot näistä potilaista, mukaan lukien ikä, sukupuoli, erilaistumisen tilasta, kasvaimen sijainnista, kasvaimen koko, imusolmuke etäpesäke , etäinen etäpesäke, ja TNM-luokitus, kerättiin ja esitetty S1 taulukossa. Potilaiden seuranta-up kerran 3 kuukauden välein vähintään 5 vuotta leikkauksen jälkeen. Kaikki potilaat saivat puhelimitse tai kyselyn kirjaimia tarkistaa heidän terveydentilaa. Death potilaista varmistettiin raportti heidän perheensä.

RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä PrimeScript RT-reagenssia (Takara) ja monistettiin SYBR Esiseos Ex Taq (TaKaRa) ABI 7500HT järjestelmän (ABI). Pohjamaalina sykliini B1 oli osoitti aiemmin [37]. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Suhteellinen kvantitointi mRNA ilmaisun laskettiin 2

-ΔCT tai 2

-ΔΔCT menetelmällä.

Soluviljely ja transfektio

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, ja SW480 saatiin American Type Culture Collection. p53

+ /+ HCT116 ja p53

– /- HCT116-soluja viljeltiin McCoyn 5A täydellisessä väliaineessa (Gibco). SW480-soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Gibco). Kaikki kolme solulinjaa viljeltiin kostutetussa kammiossa 5% CO

2 37 ° C: ssa.

siRNA vastaan ​​sykliini B1 ja siRNA negatiivisen kontrollin syntetisoitiin bioneer. Solut transfektoitiin ohimenevästi siRNA käyttäen lipidi-pohjainen transfektioreagensseja DharmaFECT1 (Dharmacon) mukaan valmistajan protokollaa. Transfektiotehokkuus ja transfektio taso sykliini B1 siRNA määritettiin aiemmin [37].

Cell migraatiokokeessa

24 transfektion, 1 x 10

5 käsitelty syöpäsoluja 200 ul seerumitonta alustaa lisättiin yläosaan siirtoaltaat (8 um: n huokoskoko, Costar). Pohja kammiot täytettiin keski täydennetty 10% FBS ja inkuboitiin 37 ° C: ssa /5% CO

2, kunnes havaitseminen aika (24h p53

+ /+ HCT116, 36h p53

– /- HCT116, ja 36h varten SW480, vastaavasti). Solujen alapuolella kalvon kiinnitettiin, värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin (viisi itsenäistä mikroskooppisia kentät 20-kertainen suurennus). Analyysit tehtiin kahtena ja toistettiin kolme riippumatonta kertaa.

Cell invaasiomääritys

24 kuopan transwell levyn (8-huokoskoon päällystetty matrigeelin (BD Biosciences) käytettiin mittaamaan solun invaasio kapasiteetti. 24 tuntia transfektion, 1 x 10

5-solut suspendoitiin uudelleen seerumittomassa elatusaineessa ja lisätään ylempään kammioon. Elatusaine, johon oli lisätty 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti alempaan kammioon ennen tutkimusta. soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa osoitetun ajan (30h p53

+ /+ HCT116, 42h p53

– /- HCT116, ja 48h varten SW480, vastaavasti). solut yläpinnalla raaputettiin vanutupoilla ja pestä pois, kun taas hyökkäsi solut alapinnan kiinnitettiin, värjättiin 0,1% kristalliviolettia 1 h, ja määrällisesti määrittämällä solujen määrän viidessä randmonly valittu näkökentät Analyysit tehtiin kahtena ja toistettiin kolme riippumatonta kertaa.

Western blot-analyysi

Solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi proteaasinestäjä (Pierce). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä kit, ja yhtä suuri määrä proteiinia suoritettiin elektroforeesi 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi membrances (PVDF, Millipore). Jälkeen estää epäspesifisen sitoutumisen, kaivoa inkuboitiin erityisiä ensisijainen vasta-aineita sykliini B1 (1: 2000, Epitomics), E-kadheriinin (1: 1000, Abcam), ja GAPDH (1: 2000, Santa Cruz), yli yön 4 ° C, ja sitten se pestiin kolme kertaa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella ja Tween 20: tä, minkä jälkeen inkuboidaan sopivalla piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (HRP, Dawen Biotec) 1 h huoneen lämpötilassa. Proteiini ilmentyminen lopulta visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (ECL, Biological Industries). Intensiteettejä proteiinin ilmentymisen signaalit kvantitoitiin käyttäen densitometrinen analyysi Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad), ja tuloksena olevat arvot proteiinin normalisoitiin vastaavaan lastaus valvontaa.

immunohistokemia

Anti -E-kadheriinin-vasta-aine (Epitomics) käytettiin IHC värjäytyminen ksenograftikasvaimissa. IHC suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [37].

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS standardin versio 21.0 (SPSS Inc.) ja GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Ero ryhmien välillä kudosnäytteistä arvionsa nonparametric Mann-Whitney

U

testi. Suhteellinen kvantitointi sykliini B1 ilmentyminen oli laskettu 2

-ΔCT tai 2

-ΔΔCT menetelmä (ACt = sykliini B1 (CT) -GAPDH (CT); ΔΔCT = ACt (kasvain) – ACt (Normaali)) ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM. Kaplan-Meier ja log-rank testejä käytettiin arvioitaessa potilaan yleistä (OS) ja luoda eloonjäämiskäyristä perustuu korkean ja matalan sykliini B1 tasolla (kuten määritelty ROC käyrä). Yksiulotteista ja monimuuttuja eloonjääminen analyysi suoritettiin Coxin regressiomallin. Kaikki in vitro kokeet suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. In vitro ja in vivo eläinkokeita ero kahden ryhmän välillä arvioitiin käyttämällä Studentin

t

-testi, ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. Arvo

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

sykliini B1 yliekspressio korreloi negatiivisesti imusolmuke matastasis, etäinen etäpesäke ja kehittyneet TNM ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin

tunnistamiseksi mahdollinen rooli sykliini B1 kolorektaalisyövässä etäpesäkkeitä, me aluksi tarkasteltiin ilmentymisen sykliini B1 150 paria kolorektaalisyövissä ja sovitettu viereisen ei-kasvain peräsuolen kudoksiin käyttämällä qRT-PCR. Sykliini B1 mRNA yli-ilmentyy 139/150 (92,7%) pareja, joiden keskimääräinen lisääntynyt kertainen muutos 5,30 syövän kudoksissa. Olemme lisäksi havainneet, että suhteellisen keskimääräisen ilmaus sykliini B1 oli paljon pienempi potilailla, joiden imusolmuke etäpesäke kuin potilailla, joilla ei etäpesäkkeitä (

P

= 0,011) (kuvio 1 B). Potilailla, joilla etäpesäkkeiden, taso sykliini B1 oli myös merkittävästi pienempi kuin potilailla, joilla ei etäpesäkkeiden (

P

= 0,021) (kuvio 1 C). Kuten taulukosta 1, yhdistyksen välillä sykliini B1 tasolla ja kliinis ominaisuudet osoittivat ilmentymistä sykliini B1 negatiivisesti korreloi imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke, ja kehittyneet TNM (

P

= 0,007) (kuvio 1 D ) potilailla, joilla peräsuolen syöpä. Ei kuitenkaan ole merkittäviä assosioitunut sykliini B1 ilmaisun ja muut kliinis-, kuten potilaan ikä, sukupuoli, kasvaimen sivusto, kasvaimen koko ja erilaistumista (kaikki

P

0,05). Lisäksi olemme myös vahvistaneet proteiinin taso sykliini B1 30 kliinisessä kudosnäytteistä, joista 10 normaalia peräsuolen kudoksiin, 10 peräsuolen syöpä kudoksiin ilman etäpesäkkeitä, ja 10 syövän kudoksissa metastasiaa Western blot. Saimme johdonmukainen tulos RNA-tasolla tuloksen. Sykliini B1-proteiini yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä kudoksissa ilman etäpesäke, verrata normaaliin peräsuolen kudosten (

P

= 5,51 x 10

-5), kun taas sykliini B1-proteiinin taso laski merkittävästi kolorektaalisyövässä kudoksiin etäpesäke, verrattaessa ilman etäpesäkkeiden (

P

= 0,012) (kuvio 1 E). Nämä tiedot paljastavat, että sykliini B1 ilmentyminen käänteisesti yhteydessä peräsuolen syövän etäpesäkkeitä.

(A) sykliini B1 mRNA ilmentyminen testattiin qRT-PCR 150 paria paksu- ja peräsuolisyövän kudosten ja viereisen ei-syöpäkudoksissa. Muutoksia ilmaus esitetään hajontakuvioiden, jossa y-akselilla on sykliini B1 ilme. Sen ilmentyminen normalisoitui tasolle GAPDH ilmentymisen kunkin näytteen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. ***

P

0,001. (B) qRT-PCR-analyysi sykliini B1 ilmaisun kolorektaalisyövässä potilaalla ei imusolmuke etäpesäke. Tiedot edustettuna 2

-ΔΔCT (kasvain /normaali). *

P

0,05. (C) tilastollinen analyysi suhteellisen sykliini B1 ilmentymistaso kolorektaalisyövässä kudoksissa tai ilman kaukainen etäpesäke. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *

P

0,05. (D) arviointi suhteessa sykliini B1 ilmentymistaso kolorektaalisyövässä kudoksissa TNM I, II, III, ja IV. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *

P

0,05; **

P

0,01; NS, ei merkittävää. (E) Western blot validointi sykliini B1-proteiinin taso normaaleissa peräsuolen kudoksista (N) ja peräsuolen syövän kudoksissa (CA) metastasiaa (M +) ja ilman (M). GAPDH haettiin normalisointia. Suhteellinen intensiteetti sykliini B1-proteiinin osoitettiin seuraavassa baarissa kuvaajat. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. ***

P

0,001. *

P

0.05.

sykliini B1 ilme on negatiivisesti liittyy vähentynyt selviytymisen kolorektaalisyövässä

arvioimiseksi ennustetekijöiden potentiaalia sykliini B1 kolorektaalisyövässä, olemme analysoineet yhdistyksen välillä sykliini B1 ilmaisun ja eloonjäämisen kesto käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi log-rank-testi. Alussa piirretty vastaanotin toimii (ROC) käyrä sykliini B1 (kuvio 2A). Mukaan maksimaalisen Youdenin indeksi, optimaalinen raja-arvo sykliini B1 ilmentyminen oli 3,33-kertaisesti kasvain /ei-kasvain. Sitten 150 potilasta, joilla peräsuolen syöpä jaettiin kahteen ryhmään: korkea sykliini B1 lauseke (n = 88), jotka sykliini B1 ilmaisu suhde ≥ 3,33, ja alhainen sykliini B1 lauseke (n = 62) että sykliini B1 ilmaisu suhde 3,33 mukaan raja-tason (kuvio 2B). Kaplan-Meier arvio analyysi osoitti korrelaation sykliini B1 ekspressiotason ja kokonaiselossaolo kertaa. Potilaat, joilla on alhainen sykliini B1 oli ilmeisesti pienempi eloonjäämisaste kuin ne, joilla on korkea sykliini B1 ilmaisun (

P

= 0,002) (kuvio 2C).

(EN) optimaalinen cut-off tasoa sykliini B1 suhteellinen ilmentyminen määritettiin perustuen suurin herkkyys ja spesifisyys vastaanotin toimii ominaiskäyrä (ROC) analyysi kokonaiseloonjääminen. Alapuolinen alue (AUC) on ROC oli 0,90. (B) mukaan optimaalinen raja-arvo (3,33-kertainen), 150 potilasta, joilla peräsuolen syöpä jaettiin kahteen ryhmään: ≥ 3,33 pidettiin korotetussa sykliini B1 lauseke (n = 88); 3,33 katsottiin alhainen sykliini B1 lauseke (n = 62). (C) Kaplan-Meier selviytymisen analyysin mukaan sykliini B1 ilmentymisen potilailla, joilla peräsuolen syöpä (log-rank-testi). (D) Kumulatiivinen yleinen eloonjäämiskäyristä potilailla, joilla on korkea tai matala sykliini B1 ilmentymisen tasoa monimuuttujamenetelmin.

Voit selvittää sykliini B1 ilme on itsenäinen indikaattori yleistä survical paksusuolisyövän potilaille, ensin hyödynsi univariate Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin arvioida yksittäisten riskisuhde kaikille kliinis ominaisuuksista. Tulokset paljastivat, että eloonjäämisaste oli significally liittyy sykliini B1 ekspressiotason (RR = 2,062; 95% CI, 1,273-3,340; P = 0,003) ja muut neljä parametrit (kasvaimen kokoa, imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke, ja TNM ; kaikki

P

0,05). Kuitenkin Monimuuttuja-analyysissä Coxin suhteellisten riskien mallia kuten sykliini B1 ilme, kasvaimen koon, imusolmuke etäpesäke, ja etäinen etäpesäke, jonka tunnuksena kasvaimen koon, imusolmuke etäpesäke ja etäinen etäpesäke riippumattomana ennustetekijöitä indikaattorit yleisestä eloonjäämisaste potilaiden kolorektaalisyöpään (HR: 0,564, P = 0.022; HR: 0,205, P = 2,0 x 10

-8, HR: 0,148, P = 1,0 x 10

-6, vastaavasti), mutta ei sykliini B1 ilmaisua (p = 0,45) (kuvio 2D). Tilastollinen arvot sykliini B1 ilmaisun ja muut kliinispatologiset ominaisuudet ovat peräisin Coxin suhteellista riskiregressioanalyysiä mallin osoitti taulukossa 2.

vastustamisesta sykliini B1 helpottanut leviämiskyky eri peräsuolen syövän solut

edellä havainnot sai meidät tutkimaan mahdollisia biologisen toiminnan sykliini B1 sääntelyn purkamista peräsuolen syövän etenemiseen. Kyky kasvainsolun tehdään muuttoliikettä sallitaan se muuttaa asema kudoksissa, ja tämä prosessi mahdollistaa kasvainsolujen jättää niiden primäärikasvain [40]. Niinpä arvioitu vaikutus sykliini B1 siirtolaisuudesta kolorektaalisyövässä soluissa käyttäen Transwell määritystä. Kolme peräsuolen syövän solulinjat, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, ja SW480 transfektoitiin tiettyjä sykliini-B1 siRNA tai siRNA negatiivinen kontrolli, vastaavasti, kuten aiemmin on raportoitu. Tulokset osoittivat, että esto sykliini B1 näkyvästi parantanut muuttavia kykyä p53

+ /+ HCT116-soluissa 127% (p = 1,45 x 10

-5) (kuvio 3A). Samoin muuttoliike kapasiteetti p53

– /- HCT116 myös huomattavasti lisääntyi 193% (p = 3,30 x 10

-8) (kuvio 3B) jälkeen tukahduttaminen sykliini B1 ilmaisua. Lisäksi siirtyminen toiminta sykliini B1 siRNA-transfektoiduissa SW480-solujen määrä nousi merkittävästi eli 155% (p = 2,85 x 10

-6) (kuvio 3C), kontrolliin verrattuna soluihin. Nämä tiedot osoittavat, sykliini B1 kykenee siirtymän alentava toiminto ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, ja tämä vaikutus on riippumaton solun tyyppi.

(A, B, C) Transwell muuttoliike määritykset p53

+ /+ HCT116 p53

– /- HCT116, ja SW480-solut tehtiin transfektion jälkeen sykliini B1 siRNA tai negatiivinen kontrolli, vastaavasti. Edustavat kuvat migraatiokokeessa näytettiin. Kaikki paneelit, tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. NC, siRNA negatiivinen kontrolli. Tiedot edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± SD. ***

P

0,001.

knockdovvn sykliini B1 edistää peräsuolen syöpäsoluinvaasiota

Cell invaasio on luontainen soluprosessi jolloin solut reagoivat solunulkoiseen ärsykkeiden liikkua ja hajottavat soluväliaineen (ECM). Syövän, soluinvaasiota mahdollistaa syöpäsolujen hankkia kyky tulla imusuonten ja /tai verisuonten levitystä verenkiertoon, jonka jälkeen invaasio kaukaisiin elimiin metastasoineeseen kasvuun [8, 40]. Tutkia mahdollisuuksia vaikutus sykliini B1 soluinvaasiota kolorektaalisyövässä soluissa, käytimme Matrigel invaasiomääritys havaitsemiseen. Huomasimme, että ehtyminen sykliini B1 johti 1,82-kertaiseksi ja 1,72-kertainen määrä hyökkääviä solujen sekä p53

+ /+ HCT116 ja p53

– /- HCT116-solut (p = 6,88 x 10

-6; p = 6,70 x 10

-6, vastaavasti) (kuvio 4A ja 4B). Samoin esto sykliini B1 myös lisääntynyt hyökkäys aktiivisuutta SW480 solujen 4,47-kertaisesti (p = 2,07 x 10

-7) (kuvio 4C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat sykliini B1 estää hyökkäys paksusuolisyövän soluja.

(A, B, C) vaikutus sykliini B1 soluinvaasiota havaittu kolmessa peräsuolen syövän solulinjoissa, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, ja SW480-soluissa, käyttäen siirtokuoppaan kammio määrityksiä. Kammiot päällystettiin matrigeelin, joka toimii solunulkoisen solumatriisimo-. Edustavat kuvat tunkeutuneet solujen näkyvät. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. Virhe palkit kuvaavat SD. ***

P

0,001.

esto sykliini B1 pienenee E-kadheriinin tason kolorektaalisyövässä solulinjoissa

Koska sykliini B1 negatiivinen korrelaatio tehostettu peräsuolen syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota, tutkimme onko EMT on taustalla mekanismi. Dysregulaatio E-kadheriinin on katsottu olevan tärkeä kriittinen molekyyliä EMT-välitteisen syöpäsolumetastaasi. Täällä, selvitimme roolia sykliini B1 sääntelyssä E-kadheriinin ilmentymisen edellä mainittujen kolmen peräsuolen syövän solulinjoissa. Kuvio 5A ja 5B molemmat osoittivat, että sykliini B1 siRNA transfektion p53

+ /+ HCT116 ja p53

– /- HCT116 väheni voimakkaasti E-kadheriinin ekspressiotaso, vastaavasti (p = 0,038; p = 0,011, tässä järjestyksessä) . Myös sykliini B1 siRNA-käsiteltyjen SW480-solujen, E-kadheriinin -proteiiniekspressio ilmeisesti pienentää verrattuna ilmaisua negatiivisen kontrollin-transfektoiduissa soluissa (p = 0,0006) (kuvio 5C). Meidän tiedot osoittavat, että sykliini-B1-inhibitiota soluinvaasion voi tapahtua säädellään E-kadheriinin ilmentymisen.

(A, B, C) 72 tunnin transfektion jälkeen 50 nM sykliini B1 siRNA tai siRNA Negatiivisena kontrollina käytettiin endogeenisen proteiinin tasot E-kadheriinin ja sykliini B1 p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, ja SW480-solut analysoitiin western-blottauksella ja määrällisesti. Bars osoittavat suhteellista proteiinin tasoja, jotka on normalisoitu GAPDH. Tiedot edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± SD. *

P

0,05; ***

P

0,001.

esto sykliini B1 downregulates E-kadheriiniekspressiota in vivo

Voit selvittää sykliini B1 muuttaa E-kadheriinin ilmentymisen in vivo, arvioimme E-kadheriinin ilmentymisen edellisessä -tuumoriksenografti mallit [37] immunohistokemiallisella värjäyksellä. Kuten on esitetty kuviossa 6A, E-kadheriinin taso väheni merkitsevästi sykliini B1-estävä p53

+ /+ HCT116 kasvaimissa verrattuna sykliini B1 ei-estävä ohjaus kasvaimia. Vastaavasti, E-kadheriinin proteiini tietenkin myös vaimentua in sykliini B1-estävä SW480 kasvaimia, verrattuna kontrollien tuumoreiden (kuvio 6B). Nämä tiedot viittaavat lisäksi siihen vaikutusta sykliini B1 on E-kadheriinin ilmentymisen.

(A) Kuvia (x200; X400), joka edustaa immunohistokemiallisella värjäyksellä E-kadheriinin p53

+ /+ HCT116 ilmentävien kasvainten sykliini B1 shRNA tai vektorisäätö. (B) esittävät kuvien (x200, x400) E-kadheriinin in SW480 ilmentävien kasvainten sykliini B1 shRNA tai vektorisäätö.

Keskustelu

Yksi tärkeimmistä syistä paksusuolen syöpään liittyvien kuolleisuus johtuvat johtuvia komplikaatioita etäpesäke. Mukaan syöpä tilastojen noin 60% paksusuolen syövän potilaiden odotetaan kehittyvän etäpesäkkeitä. Vaikka useat approachs hoitoon on kehitetty viime aikoina paksusuolisyövän, joilla on pitkälle edennyt tai metastasoitunut kolorektaalisyöpä vielä huonon ennusteen. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että sykliini B1 tukahdutti peräsuolen syövän eteneminen ja metastaasit säätelyn kautta E-kadheriinin ilmentymisen.

säätely hallittu solusyklin etenemistä on välttämätöntä solujen säilyttämiseksi genomista eheys on elintärkeää solujen eloonjäämistä ja ohjattu leviämisen. Sykliinit ovat perhe proteiineja, jotka vaihtelevat niiden ekspressiotasot solusyklin aikana aktivoida tiettyjä sykliiniriippuvaisten kinaasien tarvitaan etenemistä solusyklin läpi. Joukossa, sykliini B1 on ensiarvoisen kiinnostusta, koska se oli alun perin uskottiin, että sykliini B1 ohjattu G2-M vaihe tarkastuspiste ja säännelty oikea puhkeamista mitoosia, jotka ovat molemmat välttämättömiä DNA-synteesiä ja solujen lisääntymistä. Kertynyt todisteita ovat osoittaneet, että sykliini B1 olivat yli-ilmentyy rinta- syöpä, ruokatorven okasolusyöpä, keuhkosyöpä, mahasyöpä, hepatosellulaarinen syöpä, ja muut syöpäsolut [31, 32, 41-43]. Tilastollinen näyttö viittasi siihen, että sykliini B1 liittyi kasvain malignance. Lisäksi yli-ilmentyminen sykliini B1 on todettu lupaavaksi huono prognostinen markkeri potilailla, joilla hepatosellulaarista syöpää, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, ja pään ja kaulan okasolusyöpä [32, 34, 43]. Kuitenkin Chae et ai. [44] kertoi, että sykliini B1 ilmaisu ei ollut vaikutusta selviytymisen rintasyöpäpotilaiden. Bjorck et ai. [38] kertoi, että follikulaarista lymfoomaa sairastavilla potilailla ilmentävät korkeampaa sykliini B1 osoitti parempaan tulokseen kemoterapian jälkeen, verrattuna potilaisiin, jotka ilmentävät alhaisempi sykliini B1. Nämä ristiriitainen havainnot voidaan selittää sillä erilaisia ​​ekspressiokuviota sykliini B1 eri kasvaintyypeissä. Olemme aikaisemmin havainneet, että sykliini B1 yliekspressoitui ja tärkeä soluproliferaation ja kasvaimen kasvua kautta edistää solusyklin etenemisen ja /tai vähentämällä apoptoosin peräsuolen syöpä solujen [37]. Kuitenkin rooli ja mekanismi sykliini B1 peräsuolen syövän etäpesäkkeitä ei ole hyvin tutkittu.

Tässä tutkimuksessa löydettiin sykliini B1 ilmentymistaso kolorektaalisyövässä kudoksissa oli myös korkeampi kuin nomal kudoksissa isossa paneeli 150 potilasta, yhdenmukaisia ​​aiempien tietojen. Kuitenkin sykliini B1 yliekspressio negatiivisesti korreloi aggressiivinen kliinis-, kuten imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke, ja TNM-luokitus. Potilailla, joilla oli alhainen ilmentyminen sykliini B1 olivat huomattavan heikko kokonaiselossaoloaikaa verrattuna potilaisiin, joilla oli korkea ilmentymä sykliini B1. Univariate analyysi osoitti, että sykliini B1 oli ennustetyövälineenä indikaattori kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla peräsuolen syöpä, vaikka monimuuttuja-analyysi osoitti Cylcin B1 ei ollut itsenäinen ennustetekijä. Yhdessä nämä tulokset osoittivat selvästi, että matalan sykliini B1 taso liittyy huonoon ennusteeseen ja epäsuotuisa kliininen tulos peräsuolen syöpä. Kuitenkin meidän tulokset eivät ole samaa mieltä Kahdessa muussa tutkimuksessa [35, 45]. Heike et ai. osoittivat sykliini B1 yliekspressio ei ollut liittynyt histopatologisia kasvain ominaisuuksia eikä huonon ennusteen kolorektaalisyövässä, kun taas Jia-Qing et al. paljasti sykliini B1 yliekspressio tehostettu aikana Karsinogeneesin mutta lieventynyt aikana hyökkäyksen, ja kasvoi sitten aikana etäpesäkkeiden kolorektaalisyövässä.

tukemiseksi edelleen käsityksemme rooli ja mekanismi sykliini B1 etäpesäkkeitä havaittiin eri peräsuolen syöpä solumalleja, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, ja SW480. Annoimme näyttöä siitä knockdovvn sykliini B1 ilmaisun aiheuttama enemmän soluja tunkeutua läpi matrigeelin ja siirtokuoppaan membrance kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa, mikä osoittaa, että sykliini B1 estää peräsuolen syövän etäpesäkkeiden negatiivisesti säätelemällä solumigraation ja invaasiota. EMT oli osallisena kuin keskeinen vaihe etenemistä kasvaimia kohti ja metastaasit [9]. E-kadheriinin oli tunnettu solu-solu-adheesiomolekyyli, joka muodostuu epiteelin kiinnittynyt risteyksissä ja sequestrated CTNNB1. Vuonna EMT muutoksia, tukahduttaminen E-kadheriinin on ratkaiseva askel etenemisen aikana moniin syöpiin kuten peräsuolen syöpä [15, 46]. Se on erityisen tärkeää tutkia taustalla mekanismi, joka johtaa E-kadheriinin tukahduttaminen. Huolimatta monista molekyylit on tunnistettu moduloivan E-kadheriinin ilmentymisen [17, 47, 48], lisää tutkimuksia tarvitaan edelleen valaista tärkeitä molekyylejä säätelemiseksi E-kadheriinin. Täällä, osoitimme, että sykliini B1 osallistui sääntely E-kadheriinin ilmentymisen. Esto sykliini B1 vaimentua E-kadheriinin proteiinin p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, ja SW480-soluissa. Lisäksi, in vivo ksenografti- määritykset osoittivat myös E-kadheriinin taso oli huomattavasti vähentynyt sykliini B1-estävä p53

+ /+ HCT116 ja SW480 kasvaimet, verrattuna vastaaviin kontrolli kasvaimia.