Krooninen sairaus

tiivistelmä

histonideasetylaasi estäjät (HDACIs) on voimakas syövän vastaista aktiivisuutta erilaisissa syövän malleja. Ymmärtäminen molekyyli- mekanismeja terapeuttisen reagointia HDACI tarvitaan ennen sen kliinistä soveltamista. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, voimakas HDACI, LBH589 (Panobinostat), oli ero terapeuttinen reagointikykyä kohti LNCaP-ja PC-3 eturauhassyöpä (PCA) soluja. Entinen osoitti prometaphase pidätys myöhempien apoptoosin upon LBH589 hoitoa, kun taas jälkimmäinen oli vähemmän herkkä ja oli myöhään G2 pidätykseen. LBH589 hoito alassäädetty HDAC6 ja jatkuva ERK aktivointi, ja osaltaan prometaphase pidätykseen. Mekanistisesti LBH589 esti HDAC6 aktiivisuutta, aiheutti sen irtaantuu Proteiinifosfataasiin PP1α, ja lisääntynyt 14-3-3ζ asetylointi. Asetyloitu 14-3-3ζ julkaisi maski vaikutus seriini 259 c-Raf ja seriini 216 Cdc25C jälkeen de-fosforylaatiota PP1α, mikä osaltaan ERK aktivointia. Parannettu ERK aktiivisuus LBH589 edelleen alassäädetty HDAC6 proteiinin tasot ja jatkuva ERK aktivaatio vapaasti eteenpäin sääntelyä. Pitkäkestoinen Cdc25C ja ERK aktivointi johti varhaisen M-vaihe (prometaphase) pidätys ja myöhemmin apoptoosin herkin LNCaP-soluissa, mutta ei PC-3-solut. Tutkimus tarjoaa prekliinisen näyttöä siitä, että HDAC6 voi toimia herkkänä terapeuttinen kohde hoidettaessa eturauhassyövän HDACI LBH589 kliiniseen käännös. Tämä tutkimus myös arvelee uudenlainen mekanismi HDAC6 osallistumisen säätelyssä c-Raf-PP1-ERK signalointireitin ja edistää M vaihe solusyklin siirtyminen.

Citation: Chuang MJ, Wu ST, Tang SH, Lai XM, Lai HC, Hsu KH, et ai. (2013) HDAC estäjä LBH589 indusoi ERK-Dependent Prometaphase pidätys Eturauhassyöpä kautta HDAC6 inaktivointi ja Down-asetus. PLoS ONE 8 (9): e73401. doi: 10,1371 /journal.pone.0073401

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 20 helmikuu 2013; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2013; Julkaistu: 04 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Chuang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Science neuvosto (97-2314-B-016-023-MY3 ja 99-2628-B-016-012-MY3) ja Tri-Service General Hospital Research Foundation (TSGH-C101-009 -S02, TSGH-C100-128 ja TSGH-C99-012-13-S03), Taiwan, ROC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nopea kehitys HDAC-inhibiittorit (HDACI), kuten syöpähoitojen on hartaasti sovellettu yli 80 kliinisissä tutkimuksissa [1]. Ymmärtäminen yksityiskohtainen molekyylitason mekanismeja miten HDACI välittää syövän vastainen aktiivisuus on välttämätöntä onnistuneesti helpottaa sen kliinisen käännöksen. Se estää syövän solujen selviytymistä eri mekanismien kautta, mukaan lukien estää angiogeneesiä inhiboimalla solunsisäistä stressin vastaus reittejä, lisäämällä sukupolven reaktiivisia happiradikaaleja, ja vaikuttaa solulimakalvostoon stressin vasteen heikentyneen käsittelystä mis-laskostuneita proteiineja [2-4]. Näistä syövän toimintaa, HDACI-välitteisen G1 solusyklin pysähtymisen aiheuttaa lisää ilmentymisen tuumorisuppressorigeenin p21 transkription riippuvalla tavalla [5]. Se on myös osoitettu, että HDACI indusoi G2 /M solusyklin pidätyksen kautta transkriptiosta riippumaton polku kautta alas-säätely Aurora A ja B-kinaasien [6-8]. Lisäksi, HDACI laukaisee G2-vaiheen tarkastuspiste vaste ihmisen normaaleissa soluissa ja että tämä tarkistuspisteen vaste on viallinen alueella kasvainsolujen [9]. Näin ollen, kohdistaminen esto G2 /M-solusyklin etenemisen on edullisempaa strategia erityisesti tukahduttaa syöpäsolujen kasvua estämättä normaaleihin soluihin.

induktio mitoosin solusyklin on tiukasti säädeltyä koordinoidut aktivointia ja inaktivaatio useiden proteiinikinaasien ja fosfataasien. Alussa mitoosia, Cdc25C (dual fosfataasi) aktivointi on kriittinen vaihe aktivoitumisen Cdc2 /sykliini B monimutkainen. Inhiboiva jäännös Ser216 on Cdc25C on defosforyloitiin PP1 aktivoimiseksi Cdc25C [10,11]. Täydellinen aktiivisuus Cdc25C säätelee ERK upon mitogeenistimulaation aikana G2 /M siirtyminen nisäkässoluissa [12]. ERK kuuluu MAPK Cascade ja sen toiminta ohjataan ylävirran Raf /MEK signalointi. Vuonna lepotilassa olevat solut, 14-3-3 sitoutuu c-Raf kautta S259 ja S621 fosforylaatiota ja ylläpitää c-Raf inaktivaation [13,14]. Kun solut tulevat mitoosiin, PP1 tai PP2A välittämää defosforylointia S259 on edellytys fosforylaation S338 c-Raf ja edelleen laukaisee c-Raf ja ERK aktivointi [15,16].

On huomattava, PP1 ja ERK toiminta ovat välttämättömiä Cdc25C aktivointia alussa mitoosia, minkä jälkeen vähentämällä ERK toiminnan aikana M faasimuutos [12,17]. PP1 voi sitoutua suoraan katalyyttisen alayksikön C-terminaaliin HDAC6. Vuorovaikutus HDAC6 ja PP1 voi häiritä inhiboimalla joko HDAC6 tai PP1 [18]. HDAC6 on suuri deasetylaasi, joka on vastuussa deasetylointi α-tubuliinin ja lämpöshokkiproteiini 90 (Hsp90) [19]. Kuitenkin myös HDAC6 edistää sääntelyn G2 /M solusyklin siirtyminen jää epäselväksi.

LBH589 (Panobinostat), joka on HDACI, osoittaa vähintään kymmenen kertaa voimakkaampi estävä vaikutus kaikissa luokan I, II, ja IV HDAC verrattuna SAHA (vorinostat) [20]. LBH589 hallussaan voimakas kasvun estäminen vaikutuksia erilaisten syöpäsolujen, mutta vaihtelevalla terapeuttista tehoa, joka voi edustaa potentiaalisia vastustus tiettyjen syöpätyyppien ja estävät kliininen käännös LBH589. Vaikka LBH589 indusoi G2 /M solukierron pysähtymisen läpi hajoamisen sekä Aurora A ja B-kinaasien [6,7], yksityiskohtaiset molekyylitason mekanismeista sekä mahdolliset HDAC: kohteena LBH589 edelleen määrittelemätön.

Tämä tutkimuksen tunnettu kahta eri tyyppiä G2 /M-solusyklin pysähtymisen välittämän LBH589 eturauhassyöpäsoluissa. LBH589 ei ainoastaan ​​inhiboi HDAC6 ja parannettu 14-3-3ζ asetylointi, mutta myös köyhdytettyä HDAC6 käynnistää dissosiaatiota PP1α peräisin HDAC6. LBH589 myöhemmin puuttui säätelyssä c-Raf-ERK signalointireitin, edistää M vaiheeseen solusyklin siirtyminen. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus osoittaa, että HDAC6 voi olla herkkä terapeuttinen kohde hoidettaessa eturauhaissyöpää LBH589 kliiniseen käännös tulevaisuudessa.

Tulokset

LBH589 aiheuttama G2 /M solusyklin pidätyksen ja kasvun inhibitio eturauhassyöpäsoluissa läpi erillisten mekanismien

Koska ensimmäinen yritys tutkia sytotoksista vaikutusta LBH589, neljä eturauhassyövän solulinjoissa, LNCaP, PC-3, DU-145 ja 22Rv1, käsiteltiin erilaisilla pitoisuudet LBH589 ja solujen elinkyky mitattiin MTT-määrityksellä. Yleensä LBH589 osoitti voimakasta kasvun estäminen vaikutus kullakin tasyöpäsolulinja annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Niistä solulinjat, LNCaP-ja PC-3 olivat herkkiä ja resistenttejä LBH589 hoitoa, vastaavasti (kuvio 1A). Tutkiminen solusyklin profiilit jälkeen LBH589 altistumisen, LBH589 hoito ei aiheuta G2-M, mutta ei G1, kasvun pysähtymistä neljän eturauhassyöpäsolulinjoissa 24 tuntia (kuvio 1 B). LBH589 aiheuttama G2-M kasvu pidätys oli merkittävintä PC-3 ja LNCaP. Vaikka LBH589 indusoi vastaavan tasoisesti G2-M pidätys LNCaP ja PC-3-solut, merkittävä ero apoptoosin näiden kahden solulinjojen pitkittynyt LBH589 altistuksen (kuvio 1 C) ehdotti, että taustalla olevat mekanismit voivat olla erilaiset.

(A) LBH589 oli annoksesta riippuva vaikutus kasvun estäminen eturauhassyövän solulinjoissa. Solulinjoja käsiteltiin 50, 75, 100, ja 150 nM LBH589. Solujen eloonjääminen mitattiin käyttäen MTT-määritystä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Kuvaajat verrattuna prosenttiosuus kasvun estämistä vehikkelikontrollieläimiin 24 (ylempi) ja 48 (alempi) tuntia. (B) LBH589 indusoi G2 /M solusyklin pysähtymiseen. Kaikkia solulinjoja käsiteltiin LBH589 tai ajoneuvon hallinnan 24 tuntia. Solu syklit analysoitiin PI-värjäys ja virtaussytometria mukaan DNA-pitoisuutta. Lisääntynyt prosenttiosuudet G2 /M-soluja verrattuna ajoneuvon hallinnan. (C) LBH589 indusoi apoptoosia PC-3 ja LNCaP-soluissa. Molemmat solulinjat käsiteltiin 75nM LBH589 tai ajoneuvon ohjaus 24 (ylempi) ja 48 (alempi) h. Prosenttiosuudet apoptoottisten solujen analysoitiin laskemalla populaatio DNA-fragmentaation virtaussytometrialla. (D-E) HDACIs aiheuttama Aurorakinaasi hajoamista löytyy PC-3, mutta ei LNCaP. PC-3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin eri HDACIs on osoitetut pitoisuudet LBH589, SAHA ja SBHA 24 tuntia ja solulysaateista analysoitiin western-blottauksella käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. (F) Profiili proteiinien suhteen etenemisen G2 /M solusyklin. Soluja käsiteltiin eri annoksilla LBH589 24 tuntia. Lysaatti analysoitiin western-blottauksella.

Aikaisempi tutkimus on osoittanut LBH589 välittämää G2 /M solusyklin pidätyksen kautta alas-säätely Aurora A ja B kinaasia munuaissolusyövässä [6]. LBH589 käsittely lisäsi saman määrän histoni H3 asetylointi sekä LNCaP-ja PC-3-soluja, mikä osoittaa, että LBH589 on toiminnallinen sekä eturauhassyövän solulinjoissa. Kuitenkin alas-säätely Aurora A ja B kinaasien mukaan LBH589 havaittiin ainoastaan ​​PC-3-solut, mutta ei LNCaP (kuvio 1 D). Sen tutkimiseksi, ovatko muut hydroksaamihappojohdannaisilla oli samankaltaisia ​​vaikutuksia LNCaP-ja PC-3-solut, kaksi muuta HDACIs, SAHA ja SBHA, testattiin ja osoitti, että alas-säätely Aurora A ja B kinaasien vain tapahtui PC-3-solujen mutta ei LNCaP (kuvio 1 E). Edelleen käsitellä ristiriita LNCaP ja PC-3-soluilla LBH589 hoito, kaksi G2-M siirtyminen molekyylien Cdc2 ja Cdc25C verrattiin. LBH589 laski Cdc25C ja fosforyloitu Cdc2 tasoa PC-3-soluissa, mutta ei LNCaP-soluissa. LBH589 indusoi myös bändi siirtyminen rakenteessa Cdc25C LNCaP-soluissa annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 1 F).

LBH589 aiheuttama ERK aktivointi ja Cdc25C hyper-fosforylaation

molekyylitason mekanismeja mukana erillisiä LBH589-välittyvät vaikutukset kahden PCa solut tutkittiin. Signalointireittien osallistuvat solujen lisääntymisen ja selviytymistä, kuten Akt ja p38 ei todettu merkitsevää eroa LNCaP ja PC-3 PCa soluissa (kuvio 2A). Mielenkiintoista, LBH589 hoito johti lisääntyneeseen ERK-fosforylaation vain LNCaP, ei PC-3-solut. Down-regulation histoni H3 seriini 10 fosforylaatiota (kuten M-vaihe merkki) esiintyi PC-3-solut, mutta ei LNCaP (kuvio 2A).

(A) LBH589 aiheuttama ERK aktiivisuus on valikoivasti aktivoitu LNCaP solussa. PC-3 ja LNCaP-soluja käsiteltiin 75nM LBH589 tai ajoneuvon hallinnan 24 tuntia. Tasot ilmoitetaan proteiinien immunoblottaus blotattiin vastaan ​​yksittäiset vasta-aineet. GAPDH oli sisäinen latauskontrollina. (B) ja ajasta riippuva korrelaatiot LBH589 välittämän ERK aktivointia ja Cdc25C hyper-fosforylaatiota. LNCaP altistettiin eri pitoisuutta LBH589 24 h (vasen) tai 25 nM LBH589 eri aikoina (oikealla). (C) annosriippuvaisesti korrelaatiota LBH589 aiheuttaman G2 /M pidätykseen. LNCaP käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla LBH589 24 tuntia. Solusykleihin analysoitiin virtaussytometrialla. (D) Cdc25C-hyperfosforylaatiota vahvistettiin defosforyloimalla määrityksellä. LNCaP käsiteltiin 50 nM LBH589 24 tuntia. Lysaatit inkuboitiin fosfataasin (CIP) tai yhdistettynä fosfataasinestäjällä. Hyper-fosforyloitu ja defosforyloitiin Cdc25C analysoitiin immunoblottaus kanssa Cdc25C vasta-aineella. (E) Cdc25C-hyperfosforylaatiota tukahdutettiin MEK-inhibiittoreita. LNCaP käsiteltiin MEK-inhibiittorit, PD (100 uM PD98059) tai UO (20 uM UO126) 30 minuutin ajan. LBH589 lisättiin sitten viljelmään 24 tunnin kuluttua. ERK aktiivisuus ja Cdc25C hyper-fosforylaatiota analysoitiin Pi-ERK ja Cdc25C vasta Länsi-blottauksella.

Lisäksi LBH589 hoito lisännyt ERK-fosforylaation ja bändi siirtyminen Cdc25C annoksesta ja aikaa riippuvaisella tavalla LNCaP-soluissa (kuvio. 2B), joka korreloi kasvavan populaation G2 /M solufaasia (Fig. 2C). Sen tutkimiseksi, bändi muutos Cdc25C edusti hyper-fosforylaation alle LBH589 Hoidon LBH589 käsitelty LNCaP lysaattia käsiteltiin CIP (fosfataasi) yksin tai yhdistää käsitelty fosfataasinestäjällä. Yhtye siirtymä Cdc25C aiheuttama LBH589 poistettiin CIP, mutta palautettiin fosfataasinestäjällä (kuvio 2D), mikä osoittaa Cdc25C hyper-fosforylaatiota.

Lisäksi tutkitaan korrelaatio ERK aktivointi ja Cdc25C hyper-fosforylaatiota solut alle LBH589 hoidon Cdc25C hyper-fosforylaation aiheuttama LBH589 esti MEK inhibiittorit U0126 ja PD98059 LNCaP-soluissa. Tämä osoitti, että Cdc25C hyper-fosforylaation oli alavirtaan tapauksessa LBH589 aiheuttaman ERK aktivaation (kuvio 2E).

LBH589 aiheuttama G2 tai M vaiheen pysähtymisen ja ERK: aktivointi ja edistänyt prometaphase solusyklin pidätyksen

immuno-fluoresenssia, jakelu malleja Cdc2 ja Cdc25C välillä LNCaP ja PC-3-solut tutkittiin tarkemmin. LBH589 hoito johtivat immunologiseen fluoresenssin voimakkuus Cdc25C PC-3-solut, mutta ei LNCaP. Solujen morfologia ja DAPI tumavärjäystä edustavat LBH589 saaneilla PC-3 ja LNCaP-solut pidätettiin myöhään G2 ja varhaisen M vaihe, vastaavasti (kuvio 3A, vihreä, nuolet). Sen määrittämiseksi, LBH589 aiheuttamaa solu pidätettiin G2 tai M vaiheessa vaikutus LBH589 on sentrosomimäärän erottaminen, morfologisia tunnusmerkkejä varhaisen mitoosia, tutkittiin immunovärjäys jossa γ-tubuliinia vasta-aineita. Erottaminen kaksi sentrosomien havaittiin vain LBH589 käsiteltyjen LNCaP-soluja (kuvio 3B), mikä viittaa siihen, että kun LBH589 hoito, PC-3-soluja pidätettiin myöhään G2 vaiheen ja LNCaP pidätettiin varhain M vaiheessa (todennäköisimmin prometaphase ).

(A-B) Immuno-värjäys LNCaP-ja PC-3. Molemmat solut käsiteltiin 75 nM LBH589 24 tuntia. Immuno-värjäys (A) Cdc2 ja Cdc25C vasta-aineita ja (B) γ-tubuliinin (vihreä) ja DAPI (sininen) ajoneuvojen ohjaus (vasemmalla) ja LBH589 hoito (oikealla) LNCaP. (C-D) MEK estäjä heikennettyjä LBH589 aiheuttama prometaphase pidätys LNCaP. Soluja esikäsiteltiin 30 kanssa UO126 30 minuuttia ja käsiteltiin peräkkäin LBH589 24 tuntia. (C) Solujen sykliä analysoitiin PI-värjäys ja virtaussytometria. (D) metafaasissa solut laskettiin DAPI-värjäyksellä esitetään lauhde kromatiinin.

tutkimiseksi osallistumista ERK aktivaation, LNCaP-soluja käsiteltiin MEK-inhibiittorin, U0126, estämään ERK toimintaa läsnäolo LBH589. LBH589-välitteinen G2 /M-pidätys on heikennetty ERK inhibitio käsitellyissä soluissa UO126 (kuvio 3C). Lisäksi ERK esto vähensi LBH589 välittämää prometaphase solujen 24%: sta 13% (kuva 3D), mikä viittaa siihen, että ERK aktivaatio oli tärkeä rooli LBH589 välittämää prometaphase pidätys LNCaP.

LBH589 alassäädetty HDAC6 ja jatkuva ERK aktivointi

vaikutukset LBH589 on HDAC1, HDAC3 ja HDAC6 tarkastettiin. LBH589 alassäädetty HDAC6 LNCaP mutta ei PC-3-soluja (kuvio 4A). Lisäksi LBH589-välitteinen säätely alaspäin HDAC6 korreloi ERK-aktivaation annoksesta riippuvalla tavalla, mutta vain löytyy LNCaP-soluissa (kuvio 4B). Jotta tiedettäisiin mikä HDAC oli vastuussa ERK aktivointia, kolme proteiinit tippuu alas siRNA tutkia ERK-fosforylaation tila 293T-soluissa, koska 293T-solut oli korkea transfektion tehokkuus ja LBH589 hoito aiheutti myös prometaphase pidätyksen ja ERK aktivointi 293T solut (kuviot S1, S2, S3). Knock-down of HDAC6, mutta ei HDAC1 tai HDAC3, jonka siRNA merkittävästi aiheuttama ERK-fosforylaation 293T-soluissa (kuvio 4C).

(A) seulonta HDAC: ien mukana ERK aktivointi. Immunologiseen blottings on LBH589 käsiteltiin solulysaateista suoritettiin mainituilla vasta-aineilla. (B) LBH589 indusoi alas-säätely HDAC6, joka korreloi ERK aktivoinnin LNCaP mutta ei PC-3. (C) knockdovvn HDAC6 kasvoi ERK toimintaa. 293T transfektoitiin siRNA of HDAC1, 3, 6, tai ei-kohdistaminen 72 tuntia. Lysaatit analysoitiin immunoblottauksella. (D) ERK aktiivisuus oli mukana LBH589 välittämää HDAC6 alassäätöä. Solulysaatteja käsiteltyjen solujen LBH589 tai yhdistettynä UO126 esikäsittelyn immunosaostettiin blotattiin.

LNCaP-soluja käsiteltiin sitten LBH589 ja MEK-inhibiittori, U0126. Inhibitio LBH589 aiheuttaman ERK aktivointi palauttaa HDAC6 proteiinin tasot (kuvio 4D). Lisäksi ERK oli yli-ilmentynyt 293T-soluissa, mikä johti down-regulation of HDAC6 proteiinin tasot verrattuna EGFP-vektorilla yksinään (tuloksia ei ole esitetty). Nämä osoittivat, että estäminen HDAC6 aktiivisuuden LBH589 aiheuttama ERK aktivointi, joka myöhemmin johti alas-säätely HDAC6 proteiinin tasoja. Vastavuoroisesti asetus voisi siten olla välillä HDAC6 ja ERK signalointireitille.

LBH589 aiheuttama ERK aktivointi kautta PP1 /c-Raf-reitin

Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että HDACI voisi lisätä solunsisäisten ROS tasoja ja aktivoivat Ras-Raf signalointireitin [21]. ROS tasot LNCaP ja PC-3-soluilla LBH589 hoito Sitten tutkittiin. LBH589 indusoi prometaphase pidätetty mutta ei lisännyt merkittävästi solunsisäistä ROS tasoilla LNCaP, mutta indusoi tietyn tason PC-3-solut (kuvio 5A). LBH589 hoito vähensi myös seriini 259 fosforylaatio (estävä signaali) ja lisäsi seriinin 338 fosforylaatio (aktivoiva signaali) c-Raf, joka korreloi ERK-aktivaation LNCaP mutta ei PC-3-solut (kuvio 5B). Nämä ehdotti, että LBH589 aiheuttama ERK aktivaatio voisi välittyvän c-Raf aktivointi.

(A) analyysi ROS tuotanto. Ilmoitettu solut käsiteltiin 75 nM LBH589 24 tuntia. ROS mitattiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. (B) Kuvion c-Raf-signalointireitin on LBH589 hoitoon. Solut käsiteltiin LBH589 24 tuntia ja lysaatit olivat immunologisesti blotattiin mainituilla vasta-aineilla. α-kateniinin oli latauskontrollina.

LBH589 kytketty PP1 vuorovaikutusta 14-3-3ζ ja HDAC6

yli-ilmentyminen PP1α, mutta ei PP2A, parannettu defosforyloitumista c -Raf Ser259 ja fosforylaatiota Ser338, ja sitten edelleen aktivoidaan myötävirtaan ERK-fosforylaation alle LBH589 käsittely 293T-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, LBH589 saattavat laukaista PP1α aktivoimaan c-Raf by defosforyloimaan Ser259 ja myöhemmin aktivoivan ERK. Koska sekä fosfaatteja Cdc25C-Ser216 ja c-Raf-Ser259 oli substraatit PP1, vaikutus LBH589 on Ser216 fosforylaatiota Cdc25C tutkittiin edelleen. LBH589 hoito vähensi Ser216 fosforylaatiota Cdc25C annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla LNCaP-soluissa (kuvio 6A).

(A) LBH589 aiheuttama Cdc25C-S216 defosforyloinnilla annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. LNCaP altistettiin 75 nM LBH589 eri aikoina tai ilmoitettu LBH589 pitoisuuksina 24 tuntia. Fosforylaatio Cdc25C-S216 suoritettiin immunoblottaus jossa Pi-Cdc25C-S216-aine. (B-C) LBH589 käsittely kytki PP1α vuorovaikutuksessa kumppani. Immunoaktiivisuus Saostukset tehtiin anti-HDAC6 tai anti-14-3-3ζ. Saostuneet näytteet analysoitiin immunoblottaus käyttäen vasta-ainetta PP1α, 14-3-3ζ, Lys-Ac (Pan-asetyloitu lysiini). IgG oli epäspesifinen avattavan ohjaus.

14-3-3 oli chaperon proteiini säilyttää fosforylaatioon tilasta S216 of Cdc25C ja S259 c-Raf suojaamalla niitä defosforylaatio PP1 [ ,,,0],10,22]. Vuorovaikutus 14-3-3, PP1α, ja HDAC6 tarkistettiin käyttäen 14-3-3ζ, PP1α ja HDAC6 vasta-aineiden yhteistyössä immunosaostuksella analyysi. LBH589 käsittely lisäsi 14-3-3ζ asetylaatio ja sen vuorovaikutusta PP1α (kuvio 6B). Sen sijaan HDAC6 laski sen vuorovaikutusta PP1α jälkeen LBH589 hoidon (kuvio 6C). Nämä osoittivat, että HDAC6 voisi olla syynä 14-3-3ζ deasetyloitumisen suojella asiakas proteiinit c-Raf ja Cdc25C alkaen defosforylaatio PP1α.

Keskustelu

edellinen tutkimus osoittaa, että LBH589 hoito syyt G2 /M solusyklin pidätyksen kautta hajoaminen Aurora kinaasien munuaissolukarsinooma (RCC) [6]. Samoin Tässä tutkimuksessa täsmennetään, että LBH589 indusoi myöhäisessä G2 vaiheessa pidätyksen kautta alas-säätely Aurora-kinaasien PC-3 syöpäsolujen suhteellisen vastustuskyvyn LBH589 hoitoon. HDACIs laukaista G2 tarkastuspiste normaaleissa soluissa, joka on yleensä viallinen syöpäsoluissa, joka tarjoaa selityksen vuoksi normaalit solut ovat yleensä resistenttejä HDACI hoitoon [9]. Taustalla olevien mekanismien mukana LBH589 välitteisen G2-vaiheen pysähtymisen välillä normaalit solut ja eturauhassyövän solut voivat olla erilaisia. Kuitenkin tulokset tästä tarkoita sitä, että LBH589 aiheuttama G2 pidätys voi olla fenotyypin syöpäsolut, jotka ovat sietävät LBH589 hoitoon.

Toisin LBH589-välitteisen G2 vaiheen pysähtymisen PC-3-solut, LBH589 indusoi prometaphase pidätys jälkeen syvällinen apoptoosin LNCaP. Vaikka geneettiset taustat eturauhassyövän solulinjoissa ovat erilaisia, LBH589 hoito indusoi ERK aktivointi ja HDAC6 alassäätöä in 22Rv1 ja DU 145 PCa solulinjojen muu kuin LNCaP-soluja (kuvio S4). Kuitenkin merkittävä prometaphase pidätys tapahtuu vain PCA solujen alhainen lähtötasolle ERK-fosforylaation, joka voidaan kestävästi indusoida LBH589. LBH589 ohimenevästi indusoi ERK aktivointia tunnin kuluttua hoidon, joka on nopeasti eliminoituu 6 tunnin kuluessa LBH589 hoidon PC-3 (tuloksia ei ole esitetty).

Inhibition of HDAC6 aktiivisuuden LBH589 indusoi ainoastaan ​​ohimenevän ERK aktivointi ja ei HDAC6 proteiini Tasonvaihtelut huomautetaan PC-3-solut. Ilmiö on samanlainen kuin ohimenevä ERK aktivaation aiheuttamien mitogeenit, kuten EGF PC-3-solut. Tämä tutkimus osoittaa, että inhibitio HDAC6 mukaan LBH589 suoraan ylös-säätelee ERK aktivaation c-Raf /PP1 reitti, joka on samanlainen kuin mitogeenistimulaation, mutta joilla on täysin päinvastainen biologisen tuloksen solusyklin pidätyksen sijasta solujen lisääntymisen.

ERK aktivointi, joka reagoi erilaisiin solunulkoisen ärsykkeet kuten mitogeenit tai jännityksiä, johtaa dramaattisesti erilainen biologisten seurausten kuten proliferaatiota, erilaistumista ja solukuolemaa [23-25]. Jatkuva ERK aktivointi voi aiheuttaa solukuoleman, kun solut olivat stressiä [26]. LBH589 indusoi jatkuvan ERK aktivointi kautta vapaa eteenpäin sääntelyn välillä HDAC6 ja ERK syöpäsoluissa, joka ei ainoastaan ​​saa aikaan prometaphase pidätetty vaan myös laukaisee apoptoosin. Ei ole detectible ilmentymisen muutosta HDAC6 mRNA: n LNCaP-soluissa, kun LBH589 hoidon (tuloksia ei ole esitetty). Proteasomin inhibiittoria palauttaa HDAC6 proteiinin tasot jälkeen LBH589 hoidon, mikä viittaa siihen, että ehtyminen HDAC6 proteiinien voi riippua proteasomin-välitteisen hajoamisreitit (tuloksia ei ole esitetty). Miksi kuitenkin LBH589 selektiivisesti alaspäin säätäminen HDAC6 proteiineja ja Aurora-kinaasien A ja B tietyissä syöpäsolulinjoissa jää epäselväksi.

HDAC6 kuuluu luokan II a-alatyypin HDAC perheitä. Se sukkuloi välillä tumassa ja sytoplasmassa saavuttamiseksi biologisia toimintoja. HDAC6 on merkittävä deasetylaasi joka vastaa deasetyloiminen α-tubuliinin ja HSP90 moduloida mikroputkijär- riippuvan kuljetuksen, rekrytoida mis-taitettu proteiineja, ja kuljetus aggresomes heikentymisen [27-29]. Lisäksi mukana useissa solun normaalitoimintoja, HDAC6 voidaan tarvita tehokasta syövän syntyyn ja se voi olla mukana Cascade transformoivan kasvutekijä β1 (TGF-β1) aiheuttaman epiteelin-mesenkymaalitransitioon [30,31]. Nämä osoittavat yhtä tärkeää roolia HDAC6 in onkogeenisten prosesseissa.

On raportoitu, että akuutti myelooinen leukemia soluja puuttuu HDAC6 kestävät hyvin hydroksamaattiryhmän HDACIs [32]. Näin ollen, HDAC6 voi toimia keskeinen terapeuttisena kohteena HDACIs syövän hoidossa. Koska LBH589 on voimakas hydroksamaattiryhmän HDACI vahvat estävä vaikutus HDAC6, LBH589 etuna on kliinistä soveltamista syöpien kanssa HDAC6 ilme. Vaikka entsyymin aktiivisuutta HDAC6 voidaan estää LBH589 sekä LNCaP-ja PC-3 PCa soluja, LBH589 valikoivasti köyhdyttää joko HDAC6 tai Aurora-kinaasien LNCaP ja PC-3 PCa solujen erilliset biologiset vaikutukset, tässä järjestyksessä. Tutkimus nostaa esiin tärkeän kysymyksen, miksi LBH589 selektiivisesti kuluttaa joko HDAC6 tai Aurora-kinaasien kautta proteasomin hajoamisreitit eri PCa soluissa. Ymmärtäminen molekyylitason mekanismeista tämä ristiriita terapeuttisessa vaste LBH589 eri PCa solut voivat tarjota enemmän oivalluksia kliinisen soveltamisen LBH589.

Tulokset tässä todistaa, että LBH589 indusoi ERK aktivaation estämällä HDAC6 aktiivisuutta tietyissä soluissa . ERK aktivointi ohjataan ylävirran Ras /Raf /MEK-reitin [33]. Defosforylaatio S259 c-Raf kahdella fosfataaseja PP1 tai PP2A, johtaa c-Raf vapautumisen 14-3-3 ja mahdollistaa uudelleenaktivointi c-Raf, mikä puolestaan ​​laukaisee ERK toimintaa [34]. HDAC1, 6, ja 10 on raportoitu muodostaa kompleksin PP1, vastaavasti. HDACIs valikoivasti häiritsevät HDAC-PP1 monimutkainen ja lisäävät yhdistyksen PP1 ja Akt, joka edistää kasvainten vastaiset toimet HDACI [35]. Tämä tutkimus osoittaa, että LBH589 häiritsee HDAC6 /PP1α kompleksin ja edistää vuorovaikutusta PP1α ja asetyloitu 14-3-3ζ. Kun PP1α liittyy 14-3-3ζ, PP1α on säilyttänyt fosfataasiaktiivisuus [36]. Jossa LBH589 kytkentä sen vuorovaikutuksessa olevaa kumppani, PP1α voi muuttaa affiniteettia tai spesifisyyttä alustoihin. Jälleen tärkeä kysymys tulee esille, onko HDAC osallistuvat solukierron säätelyssä muuttamalla substraatit ”yhtäläisyyksiä tai spesifisyyden PP1α.

Lisäksi ERK aktivaation inhibitio HDAC6 mukaan LBH589 indusoi myös Cdc25C hyper- fosforylaatio poistamalla estävän fosforylaation seriinin 216 Cdc25C. LBH589 aiheuttama defosforylaatiota S216 on Cdc25C säädellään myös PP1α ja 14-3-3ζ kanssa samaa mekanismia vastuussa S259 defosforylaatiota c-Raf. Siten HDAC6 paitsi osallistuu asetuksessa c-Raf /PP1 /ERK signalointireitille mutta myös koordinoi ERK signalointiryöpyn M vaiheeseen solusyklin siirtyminen.

Tässä tutkimuksessa ehdotetaan malli selittää, miten LBH589 indusoi prometaphase pidätys. Kun HDAC6 sitoutuu kanssa HDACI, kuten LBH589 tässä tutkimuksessa, se voi aiheuttaa konformaatiomuutoksen HDAC6, johtaa dissosiaatio PP1α ja lisäämällä 14-3-3ζ asetylointi. Asetyloitu 14-3-3ζ on korkea affiniteetti sitova kanssa PP1α ja moduloimalla affiniteetti PP1α sitoutumisen alustoille. Edelleen fosfaatit c-Raf-Ser259 ja Cdc25C-Ser216 ovat defosforyloitiin PP1α ja nämä aiheuttavat jatkuvan ERK aktivointia. Yllä ERK aktivointi voi horjuttaa HDAC6 proteiineja ja hyper-fosforyloivat Cdc25C, joka johtaa prometaphase solusyklin pysähtymisen LNCaP-soluja (kuvio 7).

LBH589 sitoutumisen HDAC6 saattaa aiheuttaa konformationaalisen muutoksen HDAC6, johtaa dissosiaatiota PP1α ja parantaminen 14-3-3ζ asetylointi. Asetyloitu 14-3-3ζ lisäsi vuorovaikutuksessa affiniteetti PP1α ja puuttunut affiniteetti PP1α sitoutumisen alustaan. PP1α defosforyloitiin sitten S259 c-Raf ja S216 sekä Cdc25C, liipaisu ERK aktivointi. Jatkuva ERK aktivointi aktivoitumisen takia c-Raf voi horjuttaa HDAC6 proteiineja ja hyper-fosforyloivat CDC25C, joka johtaa prometaphase solusyklin pysähtymisen LNCaP-soluja.

Lopuksi LBH589 indusoi jatkuvaa ERK aktivaation vapaa eteenpäin sääntely, joka estää HDAC6 entsyymin aktiivisuutta, jonka jälkeen alas-säätely HDAC6 proteiinin ilmentymisen. Nämä havainnot vastata kysymykseen siitä, miten ERK aktivointi voi olla vastuussa sekä solujen lisääntymisen ja kasvun estäminen fenotyyppejä. HDAC6 on keskeinen tekijä olennaista vuorovaikutusta Raf /ERK-signalointireitin aktivaatio ja biologisten M vaiheen solusyklin siirtymistä, mikä tekee siitä täydellisen kohde HDACI LBH589. Tämä tutkimus edelleen valottaa LBH589 välittämää myöhään G2 ja varhaisen M vaihe solusyklin pidätyksen kautta erillisen molekyylitason mekanismeja PC-3 ja LNCaP PCa soluja erilaisilla hoitotulosten. Siksi yksityiskohtainen vastaavien mekanismien LBH589-välitteistä kasvun estäminen eturauhasen syöpäsoluja unraveled tarjota uusia oivalluksia, jotka voivat ohjata suunnittelua tehokkaampia strategioita, jotka optimoivat HDACI syövän hoidossa kliinisissä käännös.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

LBH589 saatiin Novartis Pharmaceuticals (East Hanover, NJ) liuotetaan dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Suberoyl Bishydroxamic Acid (SBHA) ja Suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) olivat ATON Pharma (Tarrytown, NY). Propidiumjodidia (PI), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), RNaasi A: ta ja proteaasi-inhibiittoreita cocktail ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . UO126 ja PD98059 ostettiin Calbiochem.

Soluviljely

LNCaP, PC-3, ja 22Rv1 ystävällisesti toimittanut Dr. Pei-Wen Hsiao (Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taiwan ) [37]. DU 145 ja 293T ostettiin Bioresource Collection ja Research Center (BCRC, Taiwan). PC-3 ja 293T solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, kun taas LNCaP ja 22Rv1 viljeltiin RPMI-1640. DU 145 pidettiin muokatussa Eaglen väliaineessa. Kaikki alustat täydennettiin 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 2 mM glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 mg /ml streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa 5% kostutetussa CO

2 /ilmakehässä.

MTT määrityksissä

solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 3000 -5000 solua kuoppaa kohti, riippuen solulinjasta, vehikkeliä (DMSO) tai erilaisten annosten LBH589, SAHA, ja SBHA käyttäen viittä syvennystä per hoito. 24, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen media siirrettiin ja 100 ui 1 mg /ml MTT lisättiin ennen inkubointia 37 ° C: ssa.