Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Genominlaajuiset geenin ilmentymisen analyysit kasvaimet ovat tehokas väline tunnistamaan geeni allekirjoitukset liittyy biologisesti ja kliinisesti olennaisista ominaisuuksista ja useita kasvain tyypit ovat kliinisessä validointi mahdollisille tutkimuksissa. Kuitenkin käsittely ja jalostus kliinisistä näytteistä voi vaikuttaa merkittävästi molekyylien saadut tiedot niiden analysointia. Tutkimme vaikutuksia kudosten käsittelyaika geenien ilmentymisen ihmisen normaalin ja kasvaimen paksusuolen kudoksiin rutiininomaisesti kirurgisten.

Methods

RNA uutetaan yksilöitä 15 potilasta neljässä ajankohtina (varten yhteensä 180 näytettä) leikkauksen jälkeen analysoitiin geenien ilmentymisen korkean tiheyden oligonukleotidigeenisirumenetelmää. Sekoitettu vaikutusten mallia käytettiin tunnistamaan koettimien eri ilmaus tarkoittaa kaikkien neljän eri ajankohtina. P-arvot -mallin säätää Bonferronin menetelmällä.

Tulokset

Kolmellekymmenellekahdelle koetinsarjojen liittyy kudoksen käsittelyyn aikaa kasvain näytteet, kolmekymmentä yksi normaaleissa kudoksissa , tunnistettiin. Useimmat geenit kohtalainen muutoksia ilmaisun yli ajankohtina analysoitu; kuitenkin neljä heistä oli onkogeenien ja kaksi vahvisti vaikutusta kudoksen käsittelyn riippumattomien validointi.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että kriittinen ajankohta pehmopaperin käsittelyä paksusuolen näyttää olevan 60 minuuttia huoneen lämpötilassa. Vaikka määrä ajasta riippuvan geenien havaitsimme oli alhainen, kolme geeniä, joka jo näytti muutokset tänä ajankohtana Tuumorinäytteissä olivat kaikki onkogeenien, joten suositellaan standardointi kudos-käsittelyn protokollia ja pyritään vähentämään aikaa näytteen poistoa snap jäädyttäminen kirjanpito lämmin iskemia tämän kasvaimen tyyppi.

Citation: Musella V, Verderio P, Reid JF, Pizzamiglio S, Gariboldi M, Callari M, et al. (2013) Effects of Lämmin iskeeminen Aikaa geeniekspressioprofilointi kolorektaalisyövässä kudoksia ja Normaali limakalvon. PLoS ONE 8 (1): e53406. doi: 10,1371 /journal.pone.0053406

Editor: Shoba Ranganathanin, Macquarie University, Australia

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 30 marraskuu 2012; Julkaistu: 07 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Musella et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Fondazione Cariplo-Lombardian alueella (projekti Otsikko: ”Biobanca per il karsinooma colorettale”), Associazione Italiana Ricerca Cancro, Alleanza Contro il Cancro, ja EurocanPlatform projekti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

uusien genomista teknologioiden, kuten kudoksista RNA mikrosiruja, kuviot geeniekspression tunnistaa mikrosirujen analyysit ovat havainneet, että kerrostuvat kasvaimia ja ennustaa kliinisiä tuloksia eri syöpätyyppejä [1]. Osa niistä on käytetty onnistuneesti tunnistaa potilaat, jotka voivat hyötyä erityistä hoitoa ja FDA (Food and Drug Administration) -hyväksytyt perustuvat testit rintasyövän geeni allekirjoitukset ovat nyt kaupallisesti saatavilla. Tämän seurauksena, kokoamalla kudospankeissa kirurgisista näytteistä, joita voidaan käyttää näissä analyyseissä on tullut pakollinen ongelma ymmärtää vastaavilla tulokset Suurin osa nykyisistä kliinisistä tutkimuksista. Kuitenkin vaihtelua kudosten käsittelyä ja jalostusta kirurgisista näytteistä voi vaikuttaa toistettavuus ja tulosten tulkintaa. Useat muuttujat, kuten kudos manipulointi, lämmin ex-vivo iskemian ja säilytysajat voivat mahdollisesti muuttaa mRNA ekspressiotasot ja vaikuttaa haitallisesti pätevyyteen tutkimuksista, joissa käytettiin kliinisissä näytteissä [2]. Kaikki nämä muuttujat on selvitettävä tarkasti, jotta perustaa suuntaviivat kudospankkeihin [3]. Organisaatio pätevien ja sertifioitu biopankkeja tulee perustua taata verkottumisen toimintoja ja saatavuutta laatu-sertifioitua biologista materiaalia.

Tämän pilottitutkimus oli tutkia vaikutuksia kudosten käsittelyn ajan tarkasti dokumentoitu kudoksessa näytteet, jotka seurasivat rutiinia käsittelyvaatimukset meidän Institution (Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, INT-MI), kehittää soveltaa kliinisesti näytteistämismenetelmä kasvaimia kudospankeille jotka voidaan turvallisesti käyttää microarray analyyseja. Käytimme peräsuolen syöpä (CRC) malli. CRC on toiseksi yleisin syy syövän kuolema länsimaissa ja vaikka merkittäviä edistysaskeleita sen johto, yleinen selviytymisen kehittynyt ja etäpesäkkeitä on muuttunut vain vähän viimeisten 20 vuoden, viisi vuotta lähes 90% varhaisen ja 15% myöhässä kasvaimia [4]. Tämän seurauksena on pakottava tarve uusille biomarkkereiden parantamiseksi havaitsemisen ja kliiniseen hoitoon CRC. Käyttämällä high-density oligonukleotidigeenisirumenetelmää selvitimme peräkkäinen vaikutuksia kudosten käsittely yksilöiden saatu 15 CRC ja niiden vastaaviin normaaleihin kudos kerätään meidän Institution ja jätettiin huoneen lämpötilaan eri ajankohtina leikkauksen jälkeen. Tutkimuksen ensisijainen tulos oli arvioida vaikutusta ajan kasvaimen näytteitä ja mahdollisesti valita tiettyjä geenejä, joiden ilmentyminen on aika liittyviä, joita voitaisiin käyttää ilmaisimia kudoksen hajoamista. Lisäksi geenien tunnistamiseksi vaikuttavat aikaa riippumatta näytteen tyypin (normaali tai kasvain), tutkimme myös aikaan vaikutuksen normaaleissa kudoksissa ja verrata ero ilmaisu kahden kudostyypeistä osuus ajan.

tulokset osoittavat, että vaikutus kudoksen käsittelyaika koko geeniekspressioprofiili voidaan pitää vähäisenä paksusuolen ja että kohtuullinen kynnys yksilöitä kerätään voisi olla 60 minuuttia leikkauksen jälkeen, kun mitään geeniä muutoksia havaittu. Tällaisia ​​näytteitä voidaan käyttää tuottamaan toistettavissa microarray profiilien tukea hoitoon päätöksenteko hyödyntäen clinicogenomic malleja.

Materiaalit ja menetelmät

1 Ethics lausunto

Kaikki potilaat, joiden biologiset näytteet olivat mukana tutkimukseen allekirjoitti tietoisen suostumuksen hyväksymä riippumattoman eettisen komitean INT-MI, lahjoittaa INT-MI jääneen kudosnäytteet päätyttyä diagnostisten toimenpiteiden tutkimustarkoituksiin. The Independent eettinen komitea INT-MI hyväksytty käyttö näytteiden tämän erityisen tutkimuksen puitteissa hankkeen biopankkitoiminnan laadunvalvontaa.

2 Tutkimusasetelma ja Sample Handling

kasvain ja normaali vastinkappale käytettyjen näytteiden kokeet takautuvasti kerätty 15 potilasta, joille tehtiin kirurginen resektio on INT-MI ja joiden kasvaimet edustivat eri patologisen vaiheita kasvaimen tyypistä. Tällä histologinen rutiininomaisesti tutkimus kaikki kasvain näytteet luokiteltiin kohtalaisen eriytetty paksusuolen adenokarsinoomat NOS (grade G2 mukaan American sekakomitean Cancer 2010 https://www.cancerstaging.org/). Kliinis-patologisia ja histologisia tiedot on lueteltu taulukossa 1. Kuusi fragmentit kustakin näytteestä saatiin ja satunnaisesti jätettiin huoneen lämpötilaan eri ajankohtina seuraavasti: kolme fragmentit 20 min. (T0), yhden fragmentin 60 min. (T1), yhden fragmentin 180 min. (T2) ja yhden fragmentin 360 min. (T3). Aika mitattiin lähtien potilaan kirurgisen poiston ja ensimmäisen aikapisteessä analysoitu (T0) on käsitelty ja jäädytettiin 20 min. leikkauksesta. Näytteet kuljetettiin teatterista patologian huoneenlämmössä ilman jäätä. Kokonaismäärä analysoitu fragmenttien oli 180 (90 normaali näytteet ja 90 kasvaimen näytettä). Neoplastisia näytteitä saatiin keskiosan neoplasia välttäen valitsemalla nekroottista materiaalia tai siirtovyöhykkeet terveitä limakalvon. Näytteitä paksusuolen terve limakalvo resekoitiin vähintään 20 senttimetriä kaukana neoplasian ja kaukana kirurginen resektio marginaalit. Ohjaus on costituited yksinomaan normaalin limakalvon, stripattu luminaalipinnalle.

3-RNA: eristäminen ja arviointi

Tissue näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Kokonais-RNA uutettiin 10-20 mg kasvaimen näytteitä ja 30-40 mg normaalin näytteitä. Kudokset hajotetaan mekaanisesti ja samanaikaisesti homogenisoitiin läsnä QIAzol Lysis reagenssia (Qiagen, Valencia, CA, USA), käyttäen Mikrodismembrator (Braun Biotech International, Melsungen, Saksa). RNA uutettiin käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistus ja DNaasia ruuansulatusta suoritettiin käyttäen kahta eri sarjat: RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) käytettiin enimmillään 45

μ

g RNA taas RNeasy Mini Kit (Qiagen) käytettiin RNA vaihtelee 45 ja 100

μ

g. RNA mitattiin kanssa NanoDrop ND-100 Spektrofotometri (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ja RNA laatu arvioitiin kanssa Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) käyttäen RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies). RNA Integrity Number (RIN) [5] määritettiin käyttämällä ohjelmistoa valmistajan toimittamat.

4 geeniekspressioprofilointi

RNA-näytteet prosessoitiin microarray hybridisaatiota toiminnallisilla Genomics ydin laitokseen INT-MI. Lyhyesti, 800 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio, leimattu biotiinilla ja monistettiin yön yli (14 tuntia) käyttäen Illumina RNA TotalPrep Amplification Kit (Ambion, Austin, Texas, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Yksi ug biotinyloidun cRNA näytettä sekoitettiin Hyb E1 hybridizatioin puskuria, joka sisältää 37,5% (w /w) formamidi ja sitten hybridisoidaan Sentrix Bead Chip HumanHT12_v3 (Illumina, Inc., San Diego, CA) 58 ° C: ssa yön yli (18 tuntia). Array edustaa yli 48000 helmi tyyppejä, joista jokaisella on ainutlaatuinen sekvenssi on johdettu ihmisen geenien National Center for Biotechnology Information Reference Sequence ja UniGene tietokantaan. Array sirut pestiin valmistajan E1BC ratkaisu, värjätään 1 ug /ml Cy3-streptavidiini (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) ja lopulta skannattiin Illumina BeadArray Reader.

5 Real Time PCR

Taqman® geeni määrityksiä käytettiin validointi ABL1 (Hs00245443), FosB (Hs01547109), kesäkuu (Hs00277190) geenien Tuumorinäytteet ja HIST1H1D (Hs00271187), HIST1H1E (Hs00271195), HIST1H4E (Hs003743461), HIST4H4 (Hs00545522) sekä Kasvain ja Normaali näytteitä. Kaikki geenit normalisoitiin 18S (HS03003631), kun taas kolme kasvaimeen liittyviä geenejä on myös normalisoitu ACTB (HS03023942) ja GAPDH (Hs00266705). Lyhyesti, cDNA syntetisoitiin kahtena validointia varten ABL1, FosB ja kesäkuu ja yhdessä reaktiossa validointia histonien geenien 500 ng kokonais-RNA käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Real-Time qPCR suoritettiin käyttäen FAST kemiaa (Applied Biosystems) kanssa geenispesifiseen määrityksissä ABI PRISM 7900 HT Real-Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) käyttäen 10 ng cDNA.

6 Data Analysis

6.1 Microrarray datan esikäsittelyä.

Raaka tiedot saatiin skannattujen kuvien avulla Illumina BeadStudio ohjelmiston (versio 3.3.8) ja esikäsitellyt käyttäen lumi paketti [6] Bioconductor projekti [7]. Signaali keskiarvo, havaittava ja välillä array etäisyyksien arvioitiin laadunvalvonnassa askel. Kaksi 90 profiilien tuumorinäytteistä ja kaksi 90 profiilien normaalista näytteistä ei läpäissyt laadunvalvontaa ja heitettiin pois seuraavissa analyysiin. Data normalisoitiin käyttäen Robust Spline normalisoinnin menetelmää ja antureilla havaitseminen p-arvo 0,01 alle 10% näytteistä oli suodatettu pois. Kaikki microarray tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja raaka tietoja talletetaan NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokanta (https://www.ncbi.nmlm.nih.gov/projects/geo/) kanssa hakunumerolla GSE37182.The yhdistyksen välillä lähtötilanteessa geeni profiilit ja klinikan-patologiset ominaisuudet analysoitiin Yksisuuntainen ANOVA.

6.2 aika tietysti analyysejä.

tunnistamiseksi koettimet tuumorinäytteissä eri ilmaisi kaikkien neljän eri ajankohtina (

aika kurssin ilmentymisanalyysiä

) seka-vaikutusten mallia toteutettiin microarray tietojen huomioon kertoimella

aika

(T0, T1, T2, T3) kiinteinä ja kerroin

potilas

satunnaisina [8]. Malli toteutettiin harkitsevat riippuvat muuttujat log (base 2) ilmaus arvo kunkin koetin. P-arvot -mallin oikaistuna Bonferronin menetelmällä [9]. Sillä validointitutkimusta samaa lähestymistapaa sovellettiin tarkastelemalla yhtä riippuvainen muuttujat -ΔCt arvoja qPCR suoritetaan kiinnostavat geenit. Tilastollinen analyysi suoritettiin toteuttamalla erityinen koodi kehitetty SAS ® ohjelmiston v. 9.2 (SAS Institute Inc. Cary, NC). Päällekkäin tulokset tuotettiin käyttämällä ohjelmointikieltä R v. 2.12.0 [10] sekä käyttämällä vapaasti levitettävissä ja avoimen lähdekoodin EDGE ohjelmistopaketti [11]. Identtinen tilastointimenettely sitten sovellettiin saatujen tietojen käsittelyyn normaalia kudosta. RIN vastaavat arvot sekä normaalia kasvain näytteet analysoitiin noudattaen samaa lähestymistapaa käytetään microarray data ottamalla huomioon myös tekijän

laji

(normaali tai kasvain) kiinteinä (

aika kurssin RIN analyysi

) .

6,3 Gene asettaa analyysiin.

Gene asettaa toiminnallinen analyysi käyttäen Gene ontologia (2010) [12]; [13] tietokantoihin tehtiin käyttäen Bioconductor paketit GOstats [14] (v. 2.16.0) ja Luokka (v. 2.16.0) oletusparametrit (yliedustus p-arvo 0,01).

tulokset

1 RIN Analysis

RNA Integrity Number (RIN) kaikista näytteistä kaikkien ajankohtina oli keskimääräinen arvo 5,8 välinen kvantiili valikoima 1,95. Kasvainnäytteestä oli keskimäärin korkeampi RIN arvo kuin normaali näytteet (mediaani 6,4 ja 5,35 vastaavasti), varsinkin ensimmäistä kertaa piste T0. Samanlaisia ​​jakamiin RIN arvojen voitiin havaita kaikkialla eri ajankohtina ja huomattavaa vaihtelua havaittiin kunkin näytteen sisällä ensimmäisen aikapisteen T0 (RIN varianssi mediaani = 1,668, IQR = 2,084), mikä oli huomattavampi normaaleissa näytteissä. Aika kurssi RIN analyysi osoitti, että RIN-arvot oli taipumus vähentyä ajan myötä (yleinen p-arvo Aika = 0,0565 ja yhden kontrastit verrattuna T0, T1 = 0,0214, T2 = 0,1705 ja T3 = 0,0529). Jakauma RIN arvot eroavat merkitsevästi (p-arvo = 0,0008) Tuumorinäytteissä suhteessa terveisiin (Fig. 1).

RIN jakaumia kunakin ajankohtana sekä kasvain (A) ja normaali ( B) näytteitä. Suurempi RIN ilmoittamaan suurempaa RNA laatu.

ottamalla huomioon kaikki neljä ajankohtina tunnistimme alaryhmä 6 normaali ja 7 kasvaimen tapauksessa RIN joiden arvot oli yhä korkeampi kuin viisi ja ajan myötä ilmaisu analyysi tehtiin myös tähän osajoukon näytteitä. On syytä korostaa, ettei yhdistys ei havaittu geeni profiilien kasvaimen näytteiden T0 ja vaiheessa (p-arvo = 0,59) tai sijainti (p-arvo = 0,95) taudin.

2 Time Course Expression Analysis

Kun laadunvalvonnan microarray tietojen ilmaisu profiilit 4 näytettä (2 profiileja kasvaimen ja 2 normaalista näytettä) poistettiin. Nämä harha kuuluivat eri ajankohtina kahdella potilaalla, kun kyseessä on tavanomaisen näytteitä ja saman potilaan kasvaimen näytteestä. Luonteesta johtuen Tutkimuksen suunnittelu oli tärkeää saada jokaisen potilaille täyden kuvia kaikissa ajankohdissa ja siten kaikki profiilit liittyvät kyseisiin potilaita ei ota huomioon ajan myötä analyysiin. Tämän seurauksena, yhteensä 13 potilasta käytettiin Normaali aineisto, joka sisälsi 17895 koettimia ja 14 Kasvaimen aineisto, joka sisältää 18007 koettimia. Molemmat aineistot jaettu 16698 yhteistä antureista.

Anturit tunnistetaan tiukat Bonferroni korjaus (p-arvo 0,05) -menetelmää

Aika

tekijä tai ainakin yhden kerran kontrastien ( T0 lähtötilanteessa) Normal ja Tuumorin aineistot on lueteltu taulukossa 2 (N = 32) ja taulukossa 3 (N = 31) vastaavasti. Näissä taulukoissa, rivit on tilattu mukaan raaka p-arvot johtuvat

Aika

tekijä ja tähti (*) alla olevien sarakkeiden ”Time”, ”T1”, ”T2″ tai ” T3 ’osoittaa, josta kontrasti koetin valittiin. Heatmaps paneelissa A ja B kuvion S1 graafisesti suunnan ilmaisu muutos kunakin ajankohtana vuonna kasvain ja normaali aineistoja, vastaavasti.

Five antureista (geenit) joilla on eri ilmaisukeinot kaikkien neljän ajankohtina todettiin sekä Normaali ja kasvaimen aineistot (

HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E, HIST4H4 ja 5960086).

suurin osa erot olivat juontuu viimeinen ajankohtana T3 osoitteessa 360 minuuttia verrattaessa perustason T0. Tämä pätee erityisesti kasvaimen aineisto taas jotkut antureista johtuvissa T2 kontrastia syntyä Normal aineisto. Kaikki geenit tunnistettu Kasvain aineisto ovat jatkuvasti ajan säädellä ajan; sama pätee Normal aineisto muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta. Kokonaisuutena kuitenkin useimmat geenit eivät näytteille rajuja muutoksia ilmentymistasoissa. Toiminnallinen merkinnästä geenit kahden listan (käyttäen sekä Gene ontologia ja Kegg sellaisia ​​keinoja tietokannat) korosti, että 22 32 geenien moduloitu normaalissa kudoksessa olivat histones, mukana nucleasome organisaatiossa ja chromatin kokoonpano. Neljä heistä oli myös aika-riippuvainen kasvain näytteissä, yhdessä muiden 27 geenien eri toiminnoilla osallisina syövän, kuten onkogeenien, kuten

kesäkuu

,

FosB

,

ABL1

ja

EGR1

. Toinen geeni yleisesti moduloidaan Normaali ja kasvaimen kudokset oli

RNU11

, pieni ydin-RNA.

Samanlainen analyysi suoritettiin käyttäen osajoukon näytteitä RIN suurempi kuin viisi, joka tunnistaa vain 6 koettimet Normaali-aineisto ja 6 kasvain aineisto, aineisto luultavasti siksi Pienemmän näytekoon. Ei yhteistä koettimet Löytöpaikka kahden listan. Viisi 6 antureista (

HIST1H1E

,

HIST1H4B

,

HIST1H4E

,

HIST4H4

,

5960086

) Normal aineisto oli myös läsnä analyysin avulla kaikki näytteet ja 2 (

HSPA1A

,

IER5

) olivat yleisiä Kasvain aineisto.

3 RT-PCR Validation

kolme geeneistä

, jotka olivat merkittäviä

varten ”Time”, ”T2” ja ”T3” kontrasteja

kasvain näytteissä (kesäkuu

,

FosB

ja

ABL1) B valittiin teknisten validointi Real Time PCR (RT-PCR) analyysi samaan Kasvain kudoksiin kuuluvien 14 eri potilasta analysoitiin mikrosiruja. Kaksi niistä (

kesäkuu ja FosB) B vahvistivat tulokset taulukot. Kuviossa 2 esitetään ilmaisun dynaamista ajan geenien, normalisoitu 18S. Normalisointi käytetään GAPDH ja ACTB siivous geenien vahvistivat nämä tulokset (tuloksia ei ole esitetty). ABL1 ei validoitu ischemia liittyvä geeni todennäköisesti heikon tason yhdistyksen välillä microarray ja RT-PCR data. Tämä voidaan osittain selittää rajoitetun ilmentymisen vaihtelua tämän geenin meidän näytteitä verrattuna kesäkuu ja FosB (Fig. S2). Neljä geenejä yleisesti moduloitu normaalissa ja kasvainkudoksessa, analysoitiin myös (HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H4E ja HIST4H4); vain yksi niistä, HIST1H4E vahvisti microarray data.

RT-PCR arvot FosB, kesäkuu ja ABL1 (-ΔCt) normalisoitu talon pitäminen geenin 18S.

keskustelu

Tutkimme vaikutus kudoksen käsittelyaika maailmanlaajuisten geenin ilmentymisen käyttäen CRC yksilöt alinäytteistetyssä ja snap-jäädytettiin eri ajankohtina leikkauksen jälkeen rutiini kudosten käsittelyyn protokollien patologian yksikön. RNA laatu arvioidaan RNA Integrity Number (RIN) lievään suuntaus lasku liittyy ajoin kasvainnäytteestä näytteille korkeampi ja vähemmän vaihteleva RIN arvot T0 verrattuna normaaliin näytteitä. Läsnäolo hajoamista T0 voisi osoittaa vaihtelevuutta menettelyn tai erityinen herkkyys RNA koolonkudoksesta. Saadut tulokset kasvain näytteet ovat yhtä mieltä mitä saapuvat Bray et al. [15]. Kaikki näytteet käytettiin mikrosiruanalyysi riippumatta niiden RIN määrä ymmärtää, jos microarray alustan voisi korostaa paremmin valtakirjoja laadun pehmopaperin käsittelyä. Jakauma ominaisuuden intensiteetin ryhmää kohti oli hyvin samanlainen kaikissa 180 paneelit analysoidaan, mikä viittaa siihen, että kaikki RNA: t suoritettiin samalla tasolla ja että hybridisaatioita tehtiin samalla tavalla; vain 4 näytettä ei läpäissyt laadunvalvontaa.

arvioimiseksi vaihtelua geeniekspression mittausten ajan funktiona, kukin ominaisuus (koetin) mallinnettiin suhteessa Time luokat ja oikaistuna potilaan tekijä. Tämä tehtiin erikseen sekä Kasvain ja Normaali aineistoja. Käyttämällä Bonferroni korjauksen P 0,05, kolmekymmentäyksi koettimet havaittiin aikariippuvainen kasvaimen yksilöiden ja kolmekymmentäkaksi normaaleissa näytteissä. Monet identifioitujen geenien kasvaimen aineisto oli DNA: ta sitovien proteiinien mukana erilaisissa prosesseissa joitakin vastasi geenien syövän, kuten

ABL1

,

Kesäkuu

,

FosB

,

NFKB1A

ja

CCL5-

; neljä antureista kuului histonien (

HIST1H1E

,

HIST1H4E

,

HIST1H1D

ja

HIST4H4

), toiset olivat transkriptiotekijät (

DDIT3

) tai geenien transkriptio kuten

EGR1

ja

PPP1R15A

. Kuusi geeniä olivat mukana apoptoosin, yhdessä prosessien aiheuttama kudoksen resektio. Useimmat geenit tunnistettu (N = 22) olivat merkittäviä Time vertailussa mukana kaikkina ajankohtina, 16 havaittiin T3 versus T0 kontrastia ja vain 3-geenit (

ABL1

,

Kesäkuu

ja

FOS

) sekä ajankohtina T2 ja T3. Yhdeksän geenit vaihtaa vain T3. Toisaalta, monet geenit tunnistettu normaaleissa näytteissä (N = 21) vastasi geenejä, jotka koodaavat Histone proteiineja, ja kolme olivat pieniä ydin-RNA: iden (

RNU2-1

,

RNU11

ja

RNU12

). Kolmekymmentäkaksi geenien muuttunut kaikki neljä ajankohtina analysoitiin; 17 heistä oli merkittävästi erilaiset ajan hetkellä T3 ja 8 sekä ajankohtina T2 ja T3. Kaksi geeniä vaihtaa vain T3. Suorittamalla sama analyysi ainoastaan ​​käyttäen näytteitä RIN yli viisi hyvin harvoja geenejä tunnistettiin (6 antureista molemmissa tietokannoissa), joista pääasiassa histonien olivat yhteistä aikaisemmin tunnistetut geenit. Tulokset näistä kahdesta lähestymistavoista osoittavat, että havaitut muutokset ajan myötä ovat melko vähäinen. Todellakin, kun vertasimme kudostyypeistä molempien Normaali ja kasvaimen aineistot hyvin suuren määrän eroja, jossa havaittiin odotetusti, riippumatta laadun RIN. Edelleen, funktionaalinen analyysi Näiden koettimien avulla Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Kegg) reitin tietokannan osoitti, että nämä erot täsmäsi yksitoista merkittävää reittejä osallisina syövän etenemisen mukaan lukien Cell cycle, DNA: n replikaatiota ja p53 signalointireitin (tuloksia ei ole esitetty).

muutokset havaittu geenejä sekä normaali- että tuumorikudoksia pääasiassa tapahtui T3, vaikka joitakin geenejä on jo muuttunut T2, mikä viittaa siihen, että kriittinen ajankohta annetaan 60 minuuttia huoneenlämmössä. Mielenkiintoista, kolme geeniä, jotka osoittivat muutoksia jo T2 Tuumorinäytteissä olivat kaikki onkogeenien, mikä viittaa harkita tarkkaan muutoksia näiden geenien käsiteltäessä kasvain näytteet ja käyttää enemmän konservatiivinen aikakynnystä (eli 60 minuuttia) näytteiden keräämiseen. Ilmentymistasojen ajan useimpien geenien lisättiin. Esillä havainto on yhtäpitävä sen kanssa, mitä saapuvat DUMUR et al. [16] munasarja syöpätapausta ja Bray et al. [15], CRC, jossa määrä koettimien lisääntynyt ilmentyminen täydennetty ajan. Kuten laatijat kahdessa tutkimuksessa, tämä on päinvastainen kuin mitä odotetaan, koska käsittelyaika tulisi suosia hajoamiseen RNA-transkriptien ja saattaa ainakin osittain heijastavat aktiivisen modulaatio geeniekspression. Vertailu GO luokitus ilmentyvät eri geenien meidän (FDR säädetty p-arvot 0,05) ja Bray analyysit osoittivat muutamia yhteisiä rikastettu termejä ( ”proteiini dimerointi- toiminta” ja ”transkriptiotekijä toiminta”). Mahdollisia selityksiä nämä tulokset voivat olla eri ajankohtina arvioidaan (jopa 360 minuuttia tutkimuksessamme ja jopa 120 minuuttia Bray tutkimus), eri menettelyt, joita noudatetaan näytteen keräämistä (kirurgisista näytteistä seurannut rutiininomaista käsittelyä standardin vs kasvainbiopsioissa) ja eri mikrosirujen alustoja käytetään ilmaisua analyysejä (Illumina vs Affymetrix).

Kaksi kolmesta geenien valittu validointi

kasvainkudoksissa

(

kesäkuu ja FosB) vahvistivat array tulokset

. Nämä geenit olivat myös mRNA: iden vaikuttaa eniten aikaa jäädytetty rintasyövän tutkimuksessa [17]. Koska näiden kirjoittajien esittämällä JUN ja FosB on stressiä välitön varhainen transkriptiotekijöitä, jotka ovat komponentteja AP-1-dimeerien, ja nämä dimeerit on havaittu muutettu iskemian eri kudoksissa, mukaan lukien eturauhas- ja paksusuolen syöpä. Vuonna iskeeminen ja riperfused solujen kahden geenin aiheuttaa lisääntymistä ja apoptoosia ja voisi läheisesti attemps heikentymisen tai elvyttämiseen loukkaantunut kudosten [18]. Viisi koettimet jaetaan normaalin ja kasvaimen yksilöitä. He tunnistivat geenien histoni perhe (

HIST1H1D

,

HIST1H1E

,

HIST1H4E

ja

HIST4H4

) mukana DNA organisaatiossa, ja pieni ydin- RNA (

RNU11

). Vain yksi näistä geeneistä (

HIST1H4E

) validoitu microarray tiedot. Korkea sekvenssin samankaltaisuus on histonien selittäisi suuren määrän moduloitujen histonien tunnistettu, jotka voisivat johtua osittain epäspesifinen hybridisaatio- ja voisi olla syy puute validointi riippumaton tekniikalla.

Tässä tutkimuksessa ovat kuvanneet ensimmäistä kertaa vaikutus ajan käsittelystä jopa 6 tuntia normaalin peräsuolen kudos, jota käytetään usein valvonnan genomin laaja analyysejä. Mielenkiintoista, normaali kudos osoitti vähemmän hajoamista kuin sen vastaava tuumorinäytesylinterin, olipa kyse RNA laatu (RIN arvo) ja moduloitujen geenejä, jotka olivat pääasiassa histonien. Tuloksemme suosivat varastointi normaalin kudoksen, lisäksi kasvainten.

yleinen muutoksia geenien ilmentyminen nähtävissä näytteet analysoidaan nykyisessä tutkimuksessa, jossa yli 16000 antureista tutkittiin, eivät näytä korreloivan globaalinen transcriptome tapahtuma, joka voisi olettaa, ainakin aikakehyksen aikana analysoitu tässä tutkimuksessa ( 20 minuuttia, 60 minuuttia, 180 minuuttia ja 360 minuuttia). Ottaen huomioon hyvin vähäinen määrä vaikuttaa geenien löytyi, vaikutus kudoksen käsittelyaika yleisestä geeniekspressioprofilointi ainakin CRC, voidaan pitää pienet ja ei odoteta olevan tärkeä rooli geeniekspression-pohjainen kasvain kerrostumista.

Tuloksemme samaa mieltä kuin Dumor et al. [16] ja Micke et al. [19], että ei havaittu oleellisia muutoksia munasarjasyöpä ja mitä Hatzis et al. löydetty rintasyövän [20]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet merkittäviä muutoksia RNA 30 minuutin kudoksen katoamiseen [15]; [21]; [22]. Koska meidän suunnittelu ei sisältynyt alkuajoista, emme voi sulkea pois, että merkittäviä muutoksia on jo tapahtunut ennen ensimmäisen aikapisteen (20 minuuttia). Kuitenkin edellä mainitut tutkimukset on tyypillisesti hyvin pieni näyte koot ja olisi lisävalidointia.

merkitseviä muutoksia geeniekspressioprofiili havaittu edellisessä tutkimuksessa rintasyöpänäytteistä missä pehmopaperin käsittelyaika muuttanut geenien ilmentymistä sisältyy yleisin rintasyövän ennakoivan geeni allekirjoitukset [23]. Nämä tiedot olivat yhtä mieltä Borgan et al. [17], joka löysi miRNA (microRNA) ja mRNA: n ilmentymisen alterated rintasyövän kanssa iskemia aika jopa kuusi tuntia. Todellakin, Hatzis ja työtovereiden [20] rintasyövässä ei havaittu oleellisia muutoksia ekspressiotasot yksittäisten geenien ja monigeenisiin allekirjoitukset, luultavasti koska ne katsotaan 40 minuuttia pisin aika pisteen huoneenlämmössä tai jopa 180 minuuttia, mutta käyttäen RNA-myöhemmin RNA: n säilyttämiseksi eheys.

huolimatta osittainen erimielisyyttä sen laajuus, aika kudoksen käsittely voi vaikuttaa geenien ilmentyminen, ja luultavasti saattaa vaihdella kudoksen ja kasvaimen tyyppi, mukaan lukien ne, jotka voisivat herkempiä hypoksia vaikutuksia , kuten aivokasvaimet [24].

Johtopäätökset

havainnot, että neljä harvoista geenien merkittävästi erilainen eri ajankohtina analysoitu kasvainnäytteet onkogeenien, vihjaa, että analyysi niiden ilmaisun kasvain näytteet voisi johtaa harhaanjohtavia tuloksia. Vaikka kudos käsittelyaika on heikko vaikutus yleiseen geeniekspressioprofilointi, sääntelyn purkaminen geenien suoraan osallisena kasvaimen prosesseissa edellyttää, että kudokset on säilytettävä alkuajoista leikkauksen jälkeen (tässä yhteydessä enempää kuin yksi tunti) ja tukevat voimakkaasti sen käyttöönotto kuten ohjeena kudoksen arkistot.

tukeminen Information

Kuva S1.

Expression muutoksen kullakin ajanhetkellä Kasvaimen (A) ja normaali (B) aineistot

doi: 10,1371 /journal.pone.0053406.s001

(PPTX)

Kuva S2.

sirontakaavioissa RT-PCR ACt-arvot (x-akseli) vs. log 2 microarray-intensiteetin arvot (y-akselia) varten ABL1 JUN ja FosB geenejä. Kussakin kaavion Pearsonin korrelaatiokerroin (R) käytettiin mittaamaan voimakkuutta -alueella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0053406.s002

(PPTX) B