Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä on peräisin soluista, jotka ovat hankkineet mutaatioita geeneissä kriittisiä ohjaukseen solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja erilaistumista. Usein kasvaimet ovat edelleen riippuvaisia ​​näistä niin kutsutuista kuljettaja mutaatioita, jotka tarjoavat perustelut kohdennettuja syöpähoitoihin. Tähän mennessä laajamittainen sekvensointi analyysit ovat paljastaneet satoja mutaatioita ihmisen kasvaimissa. Kuitenkin, ilman toiminnallinen validointi on edelleen epäselvää, mitkä mutaatiot vastaavat kuljettaja, tai pikemminkin sivullinen mutaatioita ja siten, onko mutatoitu geeni edustaa kohde terapeuttiselle väliintulolle. Ihmisen Kolorektaalituumorien, neurotrooppistyyp- reseptorin TrkB on löydetty mutatoitunut kahdessa eri paikassa sen kinaasidomeenissa (TrkB

T695I ja trkB

D751N). Toinen sivusto, solunulkoisessa osassa TrkB, on mutatoitunut ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinja (TrkB

L138F). Lopuksi meidän oma analyysi on tunnistettu yksi ylimääräinen TrkB pistemutaatio proksimaalisesti kinaasidomeenisekvenssiin (TrkB

P507L) ihmisen melanooman solulinjaa. Toiminnallinen seuraukset kaikkien näiden pistemutaatioiden ovat kuitenkin toistaiseksi pysyneet vaikeasti. Aiemmin olemme osoittaneet, että TrkB on voimakas suppressori anoikis ja trkB-ilmentävät solut muodostavat erittäin invasiivinen ja etäpesäkkeitä nude-hiirissä. Arvioida toiminnalliset seuraukset näiden neljän TrkB mutaatiot, päätimme ne saattavat estää anoikis ja muodostaa kasvaimia paljaissa hiirissä. Yllättäen sekä paksusuolensyöpä johdettuja mutantteja, TrkB

T695I ja trkB

D751N, näkyy vähentynyt aktiivisuus verrattuna villityypin TrkB. Johdonmukaisesti, stimuloitaessa TrkB ligandin BDNF, nämä mutantit heikentynyt aktivoinnissa TrkB ja sen loppupään efektoreja AKT ja ERK. Kaksi mutantit peräisin ihmisen kasvaimen solulinjojen (TrkB

L138F ja trkB

P507L) olivat toiminnallisesti erottaa villityypin TrkB sekä

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä. Lopuksi emme havaitse voitto-of-function neljän syövän johdettujen TrkB pistemutaatioita.

Citation: Geiger TR, Song JY, Rosado A Peeper DS (2011) toiminnallinen karakterisointi Ihmisen Cancer johdettu trkB mutaatioita. PLoS ONE 6 (2): e16871. doi: 10,1371 /journal.pone.0016871

Editor: Hang Nguyen, Emory University, United States of Ameica

vastaanotettu: 21 syyskuu 2010; Hyväksytty: 17 tammikuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Geiger et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Euroopan unionin FP6 avustus TRG, AR ja D.S.P. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on geneettinen sairaus, jossa on lukuisia somaattisia mutaatioita proto-onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille myötävaikuttaa pahanlaatuiseen fenotyyppiin [1]. Nämä geenit normaalisti ohjaavat elintoimintoihin, myös solujen jakautumista, eloonjäämistä tai erilaistuminen [2]. Niiden mutaatio itse antaa kasvainsolujen valikoiva etu, mikä klonaalisen ekspansion ja neoplasia. Vaikka kasvaimet yleensä satama useita geneettisiä poikkeavuuksia [1], esto vain yhden tai muutaman geenituotteet voivat olla riittävä suurelta osin estää kasvainsolujen proliferaatiota tai elinkelpoisuuden [3]. Tämän on osoitettu aiheuttavan kasvaimen taantumiseen eri syövän hiirimalleissa [4] – [6] perusteella käsitteet ”onkogeenin riippuvuus” ja ”tuumorisuppressorigeeniä yliherkkyys” [3]. Riippuvuutta kasvainsolujen tietyistä onkogeenien ja signalointireitteihin altistaa ”akilleenkantapää” syövän, jota voidaan suunnattu syöpähoidolla [7]. Tämän ratkaisun, useita uusia hoitomuotoja on kehitetty ja käytetään klinikalla [8]. Niihin kuuluvat imatinibimesylaatti (tai ”Gleevec” /”Glivec”) BCR-ABL esto in kroonisen myelooisen leukemian (KML) [9] ja KIT eston ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST) [10], tässä järjestyksessä. Vastaavasti rintasyöpäpotilaiden ErbB2 (myös nimeltään HER-2 /neu) yli-ilmentymisen, monoklonaalinen vasta-aine trastutsumabi [11] – [13] ja pienmolekyylisalpaaja- lapatinib [14] ovat tehokkaita. Kriittinen rooli onkogeeniselle mutaatiot on havainnollistettu esimerkkinä kasvutekijän reseptorin (EGFR /erbb1) Non pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jossa vain osa potilaista reagoi EGFR estäjä gefitinibi. Sekvensointi analyysit paljastivat, että reagoiva kasvaimia satama erityisiä mutaatioita EGFR, kasvatti aktivaatio EGF [15].

Nämä ja muut esimerkit osoittavat, että tunnistaminen onkogeenien kriittisesti tarvitaan kasvainsoluproliferaation ja selviytymistä voivat johtaa tehokkaaseen syövän vastaisen terapeuttisia. Siksi useat tutkimusryhmät ovat harjoittaneet systemaattisesti laajamittainen sekvensointi analyysit seulomiseksi geenejä, jotka mutatoitunut syövässä. Tämä strategia on johtanut ensin tunnistamiseen BRAF kinaasin kriittiseksi onkogeenin suuri osa ihosyövän ja useiden muiden syöpien [16]. Vuonna 2003 ryhmä Vogelstein, Kinzler ja Velculescu järjestelmällisesti sekvensoitiin kinaasin verkkotunnuksia kaikkien tyrosiini- kinaasien kokoelma ihmisen kolorektaalisyöpien. He löysivät 7 joukosta 138 geenejä analysoidaan mutatoitavat useammassa kuin yhdessä kasvaimen [17]. Sama ryhmä analysoitavaa yli 1000 erilaista geenien rinta- ja paksusuolen syöpä [18], tunnistaa jopa 189 uusia ja tunnettuja ehdokas syöpä geenit. Samoin Stratton, Futreal ja työtoverit Sanger-instituutin sekvensoitu ensimmäinen 518 täyspitkä kinaasien keuhkokasvaimia ja kasvainsolulinjoissa [19] ja sittemmin koko kinome kymmenessä eri syöpätyyppejä [20]. Nämä ja muut analyysit ovat tunnistaneet satoja uusia somaattisista mutaatioista useiden ihmisen maligniteettien [21]. Kuitenkin muutamia poikkeuksia syrjään, toiminnalliset seuraukset näiden mutaatioiden ovat pysyneet pitkälti vaikeasti. Valita sopiva tavoitteet tuleville syöpähoitoihin, on tarpeen testata kokeellisesti mitkä näistä mutaatioista ovat onkogeenisiä ja joihin mutatoituja geenejä kasvaimia riippuu.

Päätimme tutkia neurotrofisten reseptorin TrkB (NTRK2) varten joista kolme somaattiset, ei-synonyymi pisteen mutaatioita on raportoitu edellä mainittujen tutkimusten [17], [19], kun taas omaa selvitys on paljastanut toinen trkB pistemutaatio ihmisen melanooma solulinjaa. TrkB on yksi kolme jäsentä TRK reseptoriperheen, joka sisältää myös trkA ja TrkC. TrkB edullisesti sitoo neurotrofiini aivoperäinen neurotrofinen tekijä (BDNF) ja NT4 /5, kun taas trkA-ja TrkC on korkea affiniteetti hermokasvutekijä (NGF) ja NT3 [22]. Yleiseurooppalainen TRK reseptorin p75NTR edelleen moduloi reagointikykyä TRK reseptorien neurotrofiineille [22]. TrkB: n on havaittu yli-ilmentynyt useissa aggressiivista ihmisen syövän tyypit (katsausta varten katso [23]). Aiemmin olemme osoittaneet, että TrkB on voimakas suppressori anoikis (indusoiman apoptoosin sopimatonta tai poissa soluadheesiota) rotan epiteelisolujen, ja että trkB-yli-ilmentävät solut muodostavat erittäin invasiivinen ja etäpesäkkeitä nude-hiirissä [24]. Lisäksi meidän aiemmin raportoitu rakenne-toiminta-analyysi osoitti, että kaikki nämä toiminnot ovat riippuvaisia ​​TrkB kinaasiaktiivisuutta tässä kokeellisessa järjestelmässä [25]. Viime aikoina olemme osoittaneet varten TrkB transformoidut rotan epiteelisolujen että lisääntynyt MAPK aktiviteetti signaaleja kierre ja etana aiheuttavan epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) kaltainen muutos, anoikis tukahduttaminen ja etäpesäkkeiden [26]. Koska kaksi tunnistettu syöpää peräisin TrkB pistemutaatioita kartta sisällä kinaasidomeenin, mahdollisesti vaikuttaa sen entsymaattinen aktiivisuus, on mahdollista, että ne toimivat onkogeenisesti ja vastaavat kuljettajan mutaatioita. Tavoitteena tässä tutkimuksessa siis arvioida toiminnallinen seurauksia neljästä itsenäisestä ihmisen syövän johdettu TrkB pistemutaatioita.

Tulokset

tunnistaminen ihmisen syövän johdettujen TrkB pisteen mutantteja ja sukupolvi solu järjestelmät

Kaksi ei-synonyymi pistemutaatioita sisällä kinaasidomeenia

trkB

geeni on löydetty Kolorektaalituumorien: trkB

T695I ja trkB

D751N [17] ( numerointi kaikkien aminohapposekvenssien viittaa täyspitkän ihmisen trkB proteiinia, hakunumero NP_006171.2). Toinen TrkB pistemutaatio, TrkB

L138F, todettiin keuhkoissa adenokarsinoomasolulinjaan NCI-H2009 [19]. Tämä mutaatio sijoittuu leusiinirikkaita domeeni solunulkoisen osan reseptorin, joka on osoitettu tarvitaan sitoutumisen TrkB ligandin aivoperäinen neurotrofinen tekijä (BDNF) ja aktivoivat trkB-reseptorin [25], [27 ], [28]. Me vahvisti Tämän mutaation esiintyminen sekvensoimalla genomista DNA (gDNA) eristetty NCI-H2009-soluissa (kuvio 1A, vasen paneeli). Läsnäolo kaksinkertainen piikki (tymidiini ja sytosiini) osoittaa, että mutaatio on heterotsygoottinen, sopusoinnussa alkuperäisen raportin [19]. Se johtaa vaihdosta leusiini fenyylialaniinin. Jos haluat etsiä lisää syöpään liittyvien

TrkB

pistemutaatioita, sekvensoimme eksonit käsittävät

TrkB

kinaasialue genomisesta DNA: 28 ihmisen tuumorisolulinjoja, useista kudoksista peräisin (tuloksia ei ole esitetty ). Tämä analyysi paljasti yhden uuden

TrkB

pistemutaatio, että MDA-MB-435-melanoomasolulinja. (MDA-MB-435-solulinja on ilmeisesti luokiteltu väärin aiemmin [29]. Katsoo, että alun perin eristettiin potilaasta, joilla on rintasyöpä [30], [31], viimeaikaiset analyysi osoitti, että tällä hetkellä käytettävissä solulinja on melanooma alkuperästä [32], [33]).

TrkB

mutaatiosta MDA-MB-435-solujen on C1520T, jolloin korvaaminen proliini 507 leusiinilla (TrkB

P507L). Tällöin sekvensointi gDNA paljasti yhden piikin vain (kuva 1A oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että mutaatio on homotsygoottinen. P507 Jäännös sijaitsee proksimaalisesti kinaasidomeenia solunsisäisessä osassa reseptorin. Kuvio 1B esittää kaavamaisen yleiskatsauksen kantojen kaikkien ihmisen syövän johdettu TrkB pistemutaatioita analysoitiin tässä tutkimuksessa.

(A) sekvensointi analyysi gDNA NCI-H2009 -solut TrkB

L138F mutaatio ( vasen paneeli) ja MDA-MB-435-solujen kätkeminen trkB

P507L mutaatio (oikea paneeli). Tähdellä (*) ilmaisevat kunkin mutatoitunut emäkset. Mustat kirjaimet tarkoittavat villikannan tähteiden, punaiset kirjaimet tarkoittavat mutantti jäämiä. (B) Kaaviokuva kaikkien syöpää peräisin TrkB pistemutaatioita analysoitu tässä tutkimuksessa. LRM: leusiinirikkaita motiivi, Ig: Immunoglobuliini-kaltaisen domeenin, TM: transmembraanidomeeni. Numerot osoittavat asemat aminohappotähdettä. (C) Expression tasot mutantti tai villityypin TrkB in RIE-1-solut, analysoitiin immunoblot (IB). Tubulin toimii latauskontrollina. Numerot ovat määrällisesti TrkB signaalin normalisoidaan alfa-tubuliinin, ja suhteessa Vektorisäätö. (D) solun pinnalla biotinylaatio määritys osoittavat, että vähintään huomattava osa kaikista TrkB: n mutanttien paikantuu solukalvon. Yhteensä solunpintaproteiinit biotinyloitiin sulfo-NHS-LC-Biotin, hajotetaan ja trkB immunosaostettiin (IP) kanssa TRK-aineella (C-14, C-13 ohjaus). Geelielektroforeesin jälkeen biotinyloitu TrkB visualisoitiin streptavidiini-HRP: tä ja yhteensä trkB kanssa TRK-vasta-ainetta (C-14). Kaikki villityypin ja mutantti trkB proteiinit tuli biotinyloitua (ylempi vasen paneeli). Oikealla puolella spesifisyys osoitetaan: biotiini signaali havaittiin vain Täyspitkän TrkB (ylempi oikea paneeli, toinen kaista), mutta ei sytosolin, typistettyjä TPR-TrkB [25] (kolmas kaista, odotetaan -50 kD), eikä ohjaus IP (kaista 4) tai puuttuessa Sulfo-NHS-LC-Biotin (kaista 5). IP koko täyspitkän ja katkaistu trkB näkyy Pohjapaneeleihin. Arrowheads osoittavat täyspitkän TrkB, nuoli osoittaa katkaistun TPR-TrkB (alapuolella Ig raskaat ketjut).

arvioi näiden neljän syöpää peräisin TrkB pistemutaatioita vastaavat saada-of-function liittyvien mutaatioiden lisääntynyt onkogeeninen. Suoritimme tämän analyysin rotan epiteelisolujen ensin, koska ne ovat erittäin herkkiä trkB välittämää syövän syntyyn, kuten merkitty EMT kaltainen morfologista muuntumista, anoikis vastus ja etäpesäkekasvainten muodostumista nude-hiirissä [24] – [26]. Tätä varten me kloonattiin villityypin ja mutantti-trkB retroviruksen pBabe-puro ekspressiovektoriin ja transdusoidut rotan suolen epiteelin (RIE-1) soluissa sekä E1A-kuolemattomaksi rotan munuaisen epiteelisolujen (RK3E) soluja. Molemmat solulinjat ovat kuolemattomiksi, mutta ei-onkogeenisiä kateenkorvattomissa hiirissä. Negatiivisena kontrollina, esitimme kinaasi-inaktiivinen mutantti TrkB, TrkB: n

K588M [34], jota on aiemmin osoitettu olevan kykenemätön onkogeenisesti muuttamassa RIE-1-soluja [25], [26]. Olemme vahvistettiin Western blot -analyysillä, että kaikki trkB mutantit ilmennettiin ja samalla tasolla kuin villityypin TrkB (kuvio 1C RIE-1-soluja, kuvio S1A ja RK3E soluja). Yhdenmukainen aiempien havaintojen [25], havaitsimme TrkB useina lajien SDS-polyakryyliamidigeelissä, todennäköisesti heijastaa erilaisesti glykosyloituja lajit [35]. Lisäksi suorittamalla solun pinnan biotinylaatio määrityksessä olemme varmistaneet, että ainakin havaittavissa murto-osa kaikista TrkB mutantit oikein paikannettu solukalvon [36] (kuvio 1 D). Olemme täten syntyvää soluun, jonka avulla voimme vertailla toimintaa ja tehtäviä eri TrkB mutanttien vierekkäin.

Transforming potentiaalia ihmisen syövän johdettujen TrkB pisteen mutanttien in vitro

Kuten useimmat kinaasien , trkB tarvitsee vähimmäistaso aktivointi muuttaa epiteelisolujen. Oletimme, että jos syöpä johdettu TrkB mutaatiot antavat voitto toiminto, ne voivat muuttaa epiteelisolujen vaikkei (tai alhaisempia) BDNF. Kuitenkin, kun testattiin eri TrkB mutantit ilman koekspressoi ligandi, yksikään niistä ei indusoi kara-muotoinen solujen morfologia (kuvio 2A RIE-1-soluja, kuvio S1B ja RK3E solut) tai tukahdutetaan anoikis (kuvio 2B, Kuva S1C) ilman BDNF. Tämä oli toisin kuin havaittiin konstitutiivisesti aktiivisen ja ligandista riippumatonta TPR-TrkB mutantti, joka teki muunnos RIE-1 ja RK3E solut ja tukahdutti anoikis ilman eksogeenisten BDNF, vastaa meidän edellisessä raportissa [25].

(A) morfologia RIE-1 soluja, jotka ilmentävät mutantti tai villityypin trkB, valokuvannut 50x suurennuksella. (B) Anoikis määritys, jossa solut on kuvattu (A) ympättiin ULC levyille ja skannataan 1x suurennuksella 9 päivää myöhemmin (7 päivää ja TPR-TrkB).

Seuraavaksi aktivoidaan villityypin ja mutantti-reseptorien stabiilisti co-ilmentävät ihmisen BDNF, sekä RIE-1 (kuvio 3A) ja RK3E soluja (kuvio S1D). Yhdenmukainen aiempien havaintojen [24] – [26], sillä solut, jotka ilmentävät villityyppistä TrkB + BDNF tämä johti EMT kaltainen morfologista muuntumista (kuvio 3B, kuvio S1E), downregulation E-kadheriinin (kuvio 3C ja kuvio S1F) ja anoikis vaimennus (kuvio 3D, kuvio S1G). Sama nähtiin ilmentävien solujen trkB

L138F + BDNF ja trkB

P507L + BDNF. Sen sijaan TrkB

T695I- ja trkB

D751N ilmentäviä soluja heikentynyt vastauksessaan BDNF (kuvio 3B, C, D, kuvio S1E, F, G). Nämä tulokset osoittavat, että yllättäen, TrkB

T695I ja trkB

D751N on heikentynyt ne kykenevät muuttamaan rotan epiteelisolujen

in vitro

. Lisäksi trkB

L138F ja trkB

P507L on mahdoton erottaa villityypin TrkB tässä ympäristössä.

(A) RIE-1 soluja, jotka ilmentävät mutantti tai villityypin TrkB oli transdusoitiin BDNF ja analysoidaan on immuno- (IB). Nuolenkärki osoittaa aseman BDNF. Tubulin toimii latauskontrollina. (B) morfologinen transformaatio RIE-1-solut ilmensivät samanaikaisesti mutantti tai villityypin TrkB ja BDNF, valokuvannut 50x suurennuksella. (C) Epiteelin merkki E-kadheriinin on vaimentua in TrkB aiheuttama, morfologisesti transformoidut solut, kuten arvioitiin immunoblot (IB) analyysi. β-aktiini toimii latauskontrollina. (D) Anoikis tukahduttaminen mutantti tai villityypin TrkB + BDNF soluissa kuvattu (A). Solut skannattiin 1x suurennos 9 päivää sen jälkeen, kun kylvö päälle ULC levyille.

Responsiveness ihmisen syövän johdettujen TrkB mutanttien BDNF

Olemme aiemmin osoittaneet, että TrkB välittämää onkogeenisia transformaatio RIE-1-solujen riippuu ratkaisevasti trkB kinaasiaktiivisuutta [25], [26]. Etsiessään biokemiallisen selityksen ennakoimattomien Edellä kuvattujen tulosten päätimme onko syöpä johdettu TrkB mutanttien eroavat villityypin TrkB niiden reagointikykyä BDNF. Mitata TrkB aktivointia, käytimme RIE-1-solut ilmentävät villin tyypin tai mutantti TrkB mutta ei ligandia, ja stimuloi solujen fysiologisesti relevantti erilaisia ​​yhdistelmä-BDNF. Linjassa aiempien tutkimusten [25], [26], tämän indusoi autofosforylaatiota villityypin TrkB (kuvio 4A ja 4B), ja se johti aktivaatioon kaksi suurta alavirran signalointireittien [22]: PI3K reitti (johtaen fosforylaatiota AKT /PKB; kuvio 4C) ja MAPK-reitin (johtaen fosforylaatioon MAPK /ERK; kuvio 4D). Altistuminen 1 ng /ml BDNF oli riittävä saamaan aikaan villityypin TrkB autofosforylaation ja aktivoi MAPK-reitin, kun taas suuremmat pitoisuudet BDNF vaadittiin aktivoida AKT (kuvio 4B, C, D ja tietoja ei ole esitetty). TrkB

L138F ja trkB

P507L vastannut BDNF samalla villityypin TrkB. Sopusoinnussa niiden kyvyttömyys estää anoikis, TrkB

T695I vain osittain aktivoitiin BDNF, kun taas TrkB

D751N oli täysin vastetta BDNF, identtinen kinaasi-inaktiivinen TrkB

K588M (kuvio 4). Nämä tulokset osoittavat, että TrkB

T695I ja trkB

D751N näyttö pienentää vastata BDNF stimulaation rotan epiteelisolujen, kun taas TrkB

L138F ja trkB

P507L käyttäytyvät erittelemättä villin tyypin TrkB.

(A) RIE-1 solut, jotka ilmentävät villityypin tai mutantti-trkB stimuloitiin 10 ng /ml rekombinanttia BDNF ja analysoitiin fosfo-tyrosiini (pY) ja yhteensä TRK sisällön immunosaostuksella (IP) ja sen jälkeen immunoblottauksella (IB) analyysi . (B) RIE-1 solut, jotka ilmentävät villityypin tai mutantti-trkB stimuloitiin 1 ng /ml rekombinanttia BDNF ja analysoitiin fosfo (p) ja yhteensä TRK. (C) RIE-1 solut, jotka ilmentävät villityypin tai mutantti-trkB stimuloitiin 10 ng /ml rekombinanttia BDNF ja analysoitiin fosforia (p) AKT ja yhteensä AKT. PI3K estäjä LY294002 levitettiin vahvistaa identiteettiä Pakt signaalin nuolenpää osoittaa. Tähdellä (*) ilmaisee ei-tietyllä taajuusalueella. Näytteet ladataan rataa kahden ja kolmen toimivat kontrolleina ja olivat peräisin toisinto kokeessa, joka suoritettiin samoissa olosuhteissa. (D) RIE-1-solut ilmentävät villin tyypin tai mutantti trkB stimuloitiin 1 ng /ml rekombinanttia BDNF ja analysoitiin fosforia (p) ERK ja koko ERK. Kaikki paneelit, numerot alla osoittavat kvantifiointi fosfospesifisiä signaaleja, normalisoitu Signaalien kokonaismäärästä ja suhteellinen kuin villityypin TrkB.

onkogeeninen potentiaali ihmisen syövän johdettu TrkB mutantteja ilmaistuna rotan epiteelisolujen

Seuraavaksi testasimme kasvaimia synnyttävän potentiaalin trkB mutanttien

in vivo

, hiiren vierassiirrekokeissa. Olemme ihonalaisesti ympättiin Balb /c-nude-hiirissä, joilla on villin tyypin tai mutantti-trkB-ilmentäviä soluja. Ilman BDNF, vain villityypin TRKB-, TrkB

L138F- ja trkB

P507L ilmentävien RIE-1-soluja (kuvio 5A, B, kuvio S2A, B) ja RK3E soluja (kuvio S2E, F ) muodostivat suuria kasvaimia lyhyet latenssit, mutta mikään trkB

T695I- tai trkB

D751N ilmentäviä soluja teki. Tämän kaltaista, myös läsnä koekspressoi BDNF, TrkB

L138F ja trkB

P507L aiheutti kasvainten samalla tavoin villityypin trkB RIE-1 ja RK3E soluissa (kuvio 5C, D, kuvio S2C, D ja kuvio S2G, H). Tässä asetelmassa, RIE-1 TrkB

T695I + BDNF-ilmentäviä soluja myös muodostunut kasvaimia, mutta tilastollisesti merkitsevä viive verrattuna RIE-1 TrkB

wt + BDNF-ilmentäviä soluja (kuvio 5C, S2C). Huomattavaa on, että kun 1 * 10

5 solua ympättiin, myös RIE-1 TrkB

D751N + BDNF ilmentäviä soluja muodostunut kasvaimia, mutta joilla on merkittävä pidempi latenssi kuin indusoi RIE-1 TrkB

p- + BDNF-ilmentäviä soluja (tietoja ei esitetty). Vuonna RK3E soluissa, ekspressio TrkB: n

D751N ei johtanut kasvaimen muodostumisen, vaikka korkeat solumäärät, ja kun läsnä on BDNF, kun taas RK3E TrkB

T695I + BDNF-ilmentävät solut muodostivat kasvaimia, joilla on merkittävä pidempi latenssi verrattuna että RK3E trkB

wt + BDNF-ilmentäviä soluja (kuvio S2G). Poiketen joitakin eroja näiden kahden solulinjoista, kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että TrkB

T695I ja trkB

D751N on heikentynyt muuttamassa rotan epiteelisoluissa myös

in vivo

. Lisäksi kumpikaan TrkB

L138F eikä TrkB

P507L näyttää lisääntynyt kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden verrattuna villityypin TrkB.

(A) 1 * 10

6 RIE-1-solut ilmentävät trkB (villin tyypin tai mutantti) subkutaanisesti injektoituna molempiin paljaiden hiirien kylkiin. n = 5 paino- ja P507L, n = 4 T695I ja D751N. (B) 1 * 10

6 RIE-1 solut, jotka ilmentävät trkB: n (villityyppi tai mutantti) subkutaanisesti injektoituna molempiin paljaiden hiirien kylkiin. n = 4 molemmissa solulinjoissa. (C) 1 * 10

4 RIE-1-solut, jotka koekspressoivat BDNF ja trkB: n (villityyppi tai mutantti) injektoitiin subkutaanisti nude-hiiriin. n = 6 paino- ja P507L, n = 3 T695I ja D751N. (D) 1 * 10

5 RIE-1-solut, jotka koekspressoivat BDNF ja trkB: n (villityyppi tai mutantti) injektoitiin subkutaanisti nude-hiiriin. n = 4 molemmissa solulinjoissa. Kaikissa kokeissa, hiiret tapettiin, kun tuumorin koko saavutti 2 cm

2 ja Kaplan-Meier selviytymisen käyrä on esitetty. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Log-Rank-testi.

BDNF reagointikykyä ihmisen paksusuolen syövän johdettu TrkB

T695I ja trkB

D751N ilmaistu koolonkarsinoomasoluissa

yksi mahdollinen selitys heikentynyt aktiivisuus trkB

T695I ja trkB

D751N määrityksissä edellä kuvattu, että teimme niitä käytettäessä aphysiological Matkapuhelinyhteydessä. Todellakin, johdotus solunsisäisen signaloinnin verkkojen ja ekspressiokuviota TrkB: n sääntely tekijät voivat olla identtisiä koko solutyyppejä. Ihannetapauksessa tulisi arvioida toimintaa TrkB mutanttien niiden alkuperäisessä yhteydessä, että on, kasvainsoluissa, jossa ne alun perin tunnistettiin. Kuitenkin, ei ole olemassa solulinjoja, jotka ekspressoivat TrkB

T695I tai TrkB

D751N endogeenisesti. Lisäksi meidän tietääksemme ei ole ensisijainen ihmisen koolonin epiteelisolulinja saatavilla. Jonka tarkoituksena on käyttää fysiologisesti relevantti solu, meidän transdusoitu COLO 205 ja Caco-2 ihmisen koolonkarsinoomasoluja kanssa trkB

T695I tai TrkB

D751N ja saatu polyklonaalinen väestön vakaasti joka joko reseptoria. Me stimuloidaan nämä solut yhdistelmä BDNF ja myöhemmin mitattiin trkB autofosforylaation ja aktivointi loppupään efektorien. Samanlainen kuin mitä havaittiin RIE-1-soluissa, sekä COLO 205 ja Caco-2-solut, TrkB

T695I ja trkB

D751N olivat vähemmän runsaasti fosforyloitua kuin villityypin TrkB stimuloitaessa BDNF (kuva 6). ERK fosforyloitiin, kun TrkB stimulaation vain Caco-2-soluihin, mutta ei COLO 205 -soluista (kuvio 6C, D). Tämä johtuu todennäköisesti siitä, COLO 205-solut satama BRAF

V600E mutaatio (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), joka on konstitutiivisesti aktiivinen ja stimuloi MAPK signalointi [16]. Stimuloitaessa Caco-2-solujen BDNF, kumpikaan TrkB

T695I eikä TrkB

D751N aiheuttama ERK-fosforylaation (kuvio 6D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että TrkB

T695I ja trkB

D751N mutantit ovat vähemmän aktiivisia ei ainoastaan ​​rotan epiteelisoluissa, mutta myös kahden ihmisen paksusuolen karsinooman solulinjoissa.

(A) COLO 205 soluja ja (B) Caco-2-solut, jotka ilmentävät villi- tyypin tai mutantti-trkB stimuloitiin 10 ng /ml rekombinanttia BDNF ja analysoitiin fosfo-tyrosiini (pY) pitoisuus immunosaostuksella (IP) ja sen jälkeen immunoblottauksella (IB) analyysi. (C) Solulysaatit COLO 205 soluja (A) ja (D) solulysaateista Caco-2-soluja (B) analysoitiin fosfo (p) ja yhteensä TRK ja (p) ERK. MEK estäjä U0126 levitettiin varmentaa lisäansiot signaaleja. β-aktiini toimii latauskontrollina.

knockdovvn endogeenisen TrkB

L138F ja trkB

P507L ihmisen kasvainsolulinjoissa

Se, että TrkB

L138F ja trkB

P507L endogeenisesti ilmaistaan ​​kasvainsolulinjoissa antoi meille mahdollisuuden tutkia niitä tarvitaan niiden onkogeenisten fenotyyppi. Me köyhdytettyä trkB

L138F ja trkB

P507L NCI-H2009 ja MDA-MB-435-soluissa, vastaavasti, jonka RNA-interferenssi kaksi riippumatonta, ei-päällekkäistä lyhyt hiusneula (sh) RNA konstruktioita. Saavutimme ~75% downregulation TrkB NCI-H2009-soluissa (kuvio 7A). Kuitenkin tämä ei vaikuttanut solujen morfologia (kuvio 7B yläpaneeli) eikä anoikis vastus (kuvio 7B alapaneeli). Samoin -80% downregulation TrkB MDA-MB-435-solujen (kuvio 7C) ei ollut vaikutusta solujen morfologiaan (kuvio 7D yläpaneeli) ja anoikis vastus (Kuva 7D alapaneeli). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, E-kadheriinin tasot eivät muuttuneet heti TrkB Knockdown joko solulinjassa (kuva 7E). Lisäksi, ei ole vaikutusta proliferaatiota havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Huolimatta siitä, että trkB ei täysin tyhjentynyt kummassakaan solulinjassa, nämä tulokset viittaavat siihen, että (mutantti) TrkB NCI-H2009 ja MDA-MB-435-solujen ei ole merkittävä tekijä heidän transformoidun fenotyypin.

(A) qRT-PCR osoittavat knockdovvn trkB mRNA tasoilla kaksi ei-päällekkäistä lyhyen pinnit (sh). Keskiarvot kolme riippumatonta mittausta esitetään, virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa. (B) knockdovvn TrkB ei vaikuta morfologia toisissaan kiinni kasvavia NCI-H2009-soluissa, valokuvannut 50x suurennuksella (yläpaneeli), eikä anoikis vastus NCI-H2009-solujen suspensiossa (alapaneeli). ULC levyt skannattiin 1x suurennos 6 vuorokauden kuluttua kylvö. (C) qRT-PCR osoittavat knockdovvn trkB mRNA tasoilla kaksi ei-päällekkäistä lyhyt pinnit. Keskiarvot kolme riippumatonta mittausta esitetään, virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa. (D) pudotus TrkB: n ei vaikuta morfologia toisissaan kiinni kasvavia MDA-MB-435-soluja, kuvattuna 50x suurennos, eikä anoikis vastus MDA-MB-435-solujen suspensiota (alapaneeli). ULC levyt skannattiin 1x suurennos 6 vuorokauden kuluttua kylvö. (E) knockdovvn TrkB NCI-H2009 ja MDA-MB-435-solujen ei vaikuta E-kadheriinin proteiinin tasot, arvioituna immunoblottauksella (IB) analyysi. Pitkä ja lyhyt altistus saman blot on esitetty. β-aktiini toimii latauskontrollina.

Keskustelu

Kolme somaattista, ei-synonyymi pistemutaatioita TrkB: n on raportoitu alussa laajamittaisen sekvensointi tutkimukset ihmisen syövissä: kaksi peräsuolen kasvaimet, trkB

T695I ja trkB

D751N [17], ja yksi keuhkojen adenokarsinoomasolulinjasta trkB

L138F [19]. Havaitsimme yhden ylimääräisen TrkB pistemutaatio, TrkB

P507L, että MDA-MB-435 ihmisen melanooma solulinjaa. Vaikka jotkin näistä mutantteja on ehdotettu ehdokas syöpää ajo geenit [17], yllättäen, analyysimme rotan epiteelisoluissa ja ihmisen kasvainsolulinjoissa jättänyt tukea voitto-of-function vaikutus tahansa neljästä trkB pistemutaatiot. Itse asiassa, nämä kaksi peräsuolen kasvain- TrkB pistemutaatioita liittyi jopa vähentää kinaasiaktiivisuutta ja onkogeeninen, verrattuna villityypin TrkB. Koska varoittava huomata, yksi on muistettava, että emme testata peräsuolen kasvainperäinen TrkB mutantteja alkuperäisessä yhteydessä, eli kasvaimia, jotka ilmentävät endogeenisesti TrkB

T695I tai TrkB

D751N, kun taas solulinjoissa niistä eivät ole käytettävissä. Kuitenkin altistuminen BDNF sekä rotan epiteelin ja ihmisen paksusuolen syövän soluja, jotka ilmentävät näitä mutantteja johtivat pienentyneeseen reseptorin aktivoituminen TrkB

T695I ja lähes aktivoitumatta TrkB

D751N. Tämä viittaa vahvasti siihen, että nämä mutantit ovat heikentynyt entsyymiaktiivisuus yhteydessä BDNF stimulaatiota. Se jopa nostaa esiin mahdollisuuden, että TrkB

T695I ja trkB

D751N voi toimia vallitsevan negatiivisen tavalla, ja että villityypin TrkB voi olla myös kasvaimen estävä vaikutus (tai kaksitoiminen) paksusuolen syöpä, mutta lisätutkimuksia joutua käsittelemään näitä tärkeitä kysymyksiä. Emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että reagointikykyä TrkB

T695I ja trkB

D751N muihin trkB ligandit voivat olla erilainen kuin sen BDNF. Voimme myös muodollisesti sulkea pois sitä mahdollisuutta, että TrkB

T695I ja trkB

D751N ehkä on valittu alkuperäisessä kasvaimissa, edistää kasvaimen muodostumisen kanssa toimintoja, jotka ovat erilaisia ​​kuin testasimme

in vitro

. Näitä asioita ei kestä, mielestämme on kohtuullista sanoa, että nämä mutaatiot eivät täytä tavanomaisia ​​kriteerejä mutaatioanalyysiä aktivoitumisen reseptorikinaasit.

Teoriassa kaikki mutaatiot asuvat sytoplasman osa reseptorin voisi vaikuttaa sitoutumiseen sovitin proteiineja tai substraattien trkB, riippumaton vaikutus kinaasiaktiivisuutta. Läsnäolo ja toiminta näiden sitovien kumppanien riippuisi Matkapuhelinyhteydessä ja voi olla erilainen eri solulinjoissa. Vaikka prototyyppinä mekanismi onkogeenisia funktio tyrosiinikinaasien on konstitutiivisia tai parannettu kinaasiaktiivisuutta muuttunut alavirran signalointia [37], reseptorityrosiinikinaasien voi olla myös kinaasi-riippumaton toimintoja, jotka edistävät syövän. Tämä on esitetty villityypin EGFR, joka, riippumatta sen kinaasiaktiivisuuden, vuorovaikutuksessa ja siten stabiloi natrium /glukoosi kotransportteri 1 (SLGT1) [38]. Downregulation, mutta ei entsymaattinen esto, EGFR johtaa vähentyneeseen SLGT1 tasoa, vähentää glukoosin sisäänottoa ja autophagy kasvainsolujen [38]. Onko samanlainen toiminto liittyy myös TrkB ei ole tiedossa. Tuoreessa tutkimuksessa esitetään, että kinaasi puutosta TrkB-T1 silmukointivariantti, kun keinotekoinen yli-ilmentyminen, saattaa stimuloida etäpesäke haiman adenokarsinooma solujen [39]. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään kinaasi-riippumaton toimintoja TrkB ja niiden osuutta pahanlaatuinen sairaus, erityisesti käsitellä mitään roolia endogeenisen proteiinin syöpäsoluissa.

Olemme tunnistettu ja tunnettu myös uudenlainen trkB pistemutaatio , trkB

P507L, jota eristettiin MDA-MB-435 kasvaimen solulinja.