Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syövät on paljastunut olevan erittäin heterogeenisen suhteen taajuuden ja tyypit mutaatioiden läsnä soluissa eri pahanlaatuisia kasvaimia. Näin ollen on todennäköistä, että yhtenäistä kliininen hoito ei ole optimaalinen kaikille potilaille, ja että kehitys yksilöllisiä hoito-voi olla hyödyllistä. Kuvaamme sukupolven useita ainutlaatuisia pienet peptidit yhdeksän-kolmekymmentäneljä aminohapon pituisia, joka, kun leimattu radioisotoopilla

32P, sitoutuvat kanssa täysin eri tehokkuutta solu- linjat, jotka ovat peräisin eri paksusuolen adenokarsinoomien. Lisäksi, tehokkain näiden peptidien pysyvästi siirtää

32P radioisotooppi peräsuolen syövän solun proteiinien kanssa kahden tunnin kuluessa nopeudella, joka on enemmän kuin 150 kertaa suurempi kuin solulinjoissa, jotka ovat peräisin muiden syöpien tai normaalista testatuissa kudoksissa. Tällä hetkellä ainoastaan ​​kaksi FDA-hyväksytty radioimmunotherapeutic aineita käytettäväksi sekä käyttää vasta-aineita, jotka kohdistuvat B-solujen markkeri CD20 hoitoon ei-Hodgkinin lymfooma. Käyttämällä tässä kuvattua menetelmää, suuria määriä erilaisia ​​

32P-leimattuja peptidejä voidaan tuottaa helposti ja määritettiin laajaa kirjoa vastaan ​​syövän tyyppejä. Mietinnössä ehdotetaan kehittämistä ja käyttöä

32P-leimattua peptidit potentiaalisina yksilöllinen peptidi sitovan hoitojen paksusuolen adenokarsinooman potilaista.

Citation: Abraham JM, Cheng Y, Hamilton JP, Paun B, Jin Z, Agarwal R, et ai. (2008) Generation of Small

32P-leimattu peptidit mahdollisena lähestymistapa peräsuolen syövän Therapy. PLoS ONE 3 (6): e2508. doi: 10,1371 /journal.pone.0002508

Editor: Edathara Abraham, University of Arkansas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2008; Hyväksytty: 06 toukokuu 2008; Julkaistu: 25 kesäkuu 2008

Copyright: © 2008 Abraham et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 ja 7R21 /R33CA106763 National Cancer Institute.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset maamerkki löydöt ovat vakuuttavasti dokumentoitu laaja geneettinen heterogeenisuus ihmisen syöpien, erityisesti peräsuolen kasvaimet, luomalla olemassaolo pieni määrä usein mutatoitunut geeni ”vuoret” ja paljon suurempi joukko geeni ”mäkiä” mutatoitu paljon matalammilla taajuuksilla [1], [2]. Tämä korkea monimuotoisuuden keskuudessa ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä viittaa siihen, että yksilöllinen hoito strategiat lupaavia onnistuneessa kliinisiä interventioita. Useat syövänvastainen immunoterapioiden ovat käytössä, kuten Herceptin Rituxin, ja Avastin, monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu VEGF (verisuonten endoteelin kasvutekijä), joka on hyväksytty ja peräsuolen syövän hoidossa [3] – [9].

radioimmunoterapiassa (RIT) on kehitteillä oleva teknologia, jossa toistaiseksi vain kaksi FDA-hyväksyttyjen käytäntöjen, molemmat suunnattu non-Hodgkin-lymfooman (NHL). Jokainen protokolla hyödyntää monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu CD20 B-solujen markkeri ja voi toimittaa

90Y (Zevalin) tai

131I (Bexxar), joista kukin tuottaa elektroneja (beta hiukkaset), jotka vaurioittavat DNA: ta, johtaen solukuolemaan [10], [11]. Tällä hetkellä ei ole RIT ole vielä hyväksytty hoitoon kolorektaalisyövän [12].

raportoi äskettäin joukon yhdeksän eri dekapeptidien, kukin vaihtelee toiset hakemaan ainoa kolme aminohappoa, joka silloin, kun leimattu beta-emitteri

32P, sidottu ja pysyvästi toimitetaan, vaihtelevassa määrin, tämä radioisotooppi on johdetut solulinjat paneelin eri peräsuolen adenokarsinoomien [13]. Tehokkain

32P-leimattua dekapeptidi, saivat aikaan pysyvän sisällyttäminen radioisotooppi tulee paksusuolen adenokarsinooma solun proteiinien nopeudella yli 100 kertaa suurempi kuin solulinjoissa, jotka ovat peräisin eri muiden syöpien tai normaalista paksusuolen, munuaisten tai ruokatorveen.

Tässä kerromme luokan hieman suurempi peptidejä (enintään 34 aminohappoa pitkä), jotka sisältävät liian suuret erot peptidisekvenssejä, mikä johtaa laaja solujen sitoutumisen ja radioisotooppi otto ominaisuuksia. Jokainen 34 aminohapon peptidi sisältää yhdeksän aminohapon ydin sen aminopäästä, jotta

32P merkintöjä proteiinikinaasi A kahdeksan aminohapon ydin sen karboksipään, ja jopa 17 ylimääräisiä aminohappoja, jotka dramaattisesti muuttaa sekä sen sitoutumisen soluihin ja sen pysyvä sisällyttäminen radioisotooppeja osaksi paksusuolensyöpä solun proteiinien. Nämä tulokset tukevat edelleen tutkia tämän strategian kehittämiseksi mahdollisia uusia yksilöllisiä hoito-ohjelmia vastaan ​​paksusuolen syöpiä.

Tulokset

Tuotanto

32P-leimatun peptidejä ja sitoutumisesta paksusuolen adenokarsinoomasolua

Aikaisemmin on raportoitu löytö yhdeksän eri

32P-leimattua dekapeptidejä, kukin vaihtelee toisistaan ​​ainoa kolme aminohappoa, joka osoitti laajalti erilaisia ​​kykyjä sitoutua ja siirtää radioisotooppien pysyvästi proteiinien solulinjoissa perustetaan paneelin paksusuolen adenokarsinoomien. Tehokkain näistä

32P-leimattua dekapeptidien pysyvästi toimitetaan radioisotooppi paksusuolen syöpäsoluja yli 100 kertaa tehokkaammin kuin solulinjat, jotka ovat peräisin muiden syöpien tai testatuista normaaleista kudoksista. Tässä raportoimme tuotanto ja tunnistaminen uusi sarja peptidejä, jopa 34 aminohapon pituisia, joiden aminohapposekvenssit dramaattisesti muuttaa niiden kykyä sitoutua ja pysyvästi helpottamiseksi

32P sisällyttämistä soluihin. Kuvio 1 on kaavamainen esitys kokeen suunnittelusta, joka havainnollistaa kloonaus DNA-fragmentti, joka sisältää 17 satunnaisesti kodonia BamHI restriktioentsyymin pGEX-2TK. Sen jälkeen bakteeri muutos, yksittäiset kloonit valittiin ja laajennettiin tuottamaan monipuolinen kokoelma

32P-leimattua peptidejä. Jos ei ole lopetuskodonia oli läsnä satunnainen DNA-sekvenssin, sen jälkeen 34-tähteen peptidi synnytettiin, reunustaa sen aminopäästä, jonka 9-tähteen proteiinikinaasi A: n merkintöjä motiivi ja sen karboksipää by 8-tähteen sekvenssin. Kuten odotettua, useita klooneja, lopetuskodonin lisättiin, tuloksena katkaistu peptidit; kuitenkin, kaikki nämä katkaistun peptidien sisälsi proteiinikinaasi A: n substraatin osaan. Nämä erilaiset peptidit inkuboitiin useita erilaisia ​​solulinjoja, kaksi tuntia, kiinnittyneet solut pestiin kolme kertaa, ja radioaktiivisuus jäljellä sitoutunut soluihin määritettiin joko välittömästi tai sen jälkeen yli yön inkubointi täydellisessä väliaineessa.

PCR-tuote, joka sisältää 17 satunnaisesti kodonit insertoitiin BamHI pGEX-2TK tuottaa erilaisia ​​glutationi-S-transferaasi fuusioproteiineja, jotka oli sidottu glutationi-Sepharose, ja merkitty

32P käyttäen proteiinikinaasi A pesun ja trombiinidigestiolla, leimattu peptidejä inkuboitiin useilla eri solulinjoilla ja analysoitiin.

Kuva 2 esittää dramaattinen vaihtelut pysyvään

32P sisällyttäminen koolonadenokarsinooma rivi Caco2 pesun ja yli yön keskisuurten inkuboinnin. Olemme aiemmin osoittaneet, että solut onnistuneesti sitova dekapeptidien kahden tunnin inkuboinnin vapautuu korkeintaan 88% niiden alun perin sitoutunut

32P osaksi media sen jälkeen, kun on inkuboitu yön yli, mutta silti on liitetty kiinteästi korkea radioisotooppi niiden proteiineihin. Yhdeksästätoista eri peptidiä kuvassa 2 on nimetty MA (Muutettu adjuvantti) 10 kautta 28. Yksitoista näistä 19 sisällä täydellisiä 17-tähteen insertit, jossa MA18 pysyvästi siirtämällä

32P on Caco2 soluihin yli 37 kertaa tehokkaammin kuin MA26. Tehokkain pysyvä radioisotooppi sisällyttäminen Caco2-soluissa esiintyi inkuboinnin jälkeen MA27, joka sisältää vain yhden satunnaisesti lisätty aminohappo ylävirtaan lopetuskodonista. Peptidit MA16 ja MA17 koodasi alkuperäinen rekombinantti ekspressiovektori, joka johtaa alhaiseen radioisotooppi sisällyttäminen.

Eri

32P-leimattua peptidejä inkuboitiin kaksi tuntia 10000 Caco2-solut, pestiin kolme kertaa, ja inkuboitiin täydellisessä kasvualustassa 24 tunnin ajan. Määrä

32P radioisotooppi, joka pysyi sisällytetään pysyvästi solun proteiinien on esitetty prosentteina sisäänottoa peptidin määrään lisätään jokaiseen soluviljelmään hyvin (keskiarvo plus yksi keskihajonta). Lukumäärä aminohappoja, joka on läsnä sisäke on esitetty, ja se vaihteli 0-17 aminohappoa. Aminohapposekvenssi kunkin insertin on esitetty alla tasolla

32P sisällyttäminen kullekin insertin.

visualisointi

32P muodon, geelin autoradiografialla

neljä peptidejä osoittavat keskimääräiset tasot radioisotooppeja sisällyttäminen valittiin jatkotutkimuksia; kolmena kappaleena-ja määrityksiä näiden peptidien näytetään kuviossa 3. Peptidi MA11: n insertti sisälsi kolme tähdettä ylävirtaan lopetuskodonin, mikä johtaa peptidin vain 12 aminohappoa pitkä. Huolimatta suhteellisen lyhyt pituus, tämän katkaistun peptidin siirretään

32P ja Caco2-solut 215 kertaa tehokkaammin kuin kohdunkaulan kasvainta solulinjaa HeLa kaksi tuntia. Pesun ja inkuboimalla yön yli väliaineessa, radioaktiivisuuden säilyttää Caco2-soluissa oli yli 150 kertaa suurempi kuin säilytettävä HeLa-soluissa. Kuten kuviossa 3 on esitetty, suurin osa

32P sitoutuneen Caco2-soluihin esillä olevan matalan molekyylipainon (LMW) komponentti (

lihavoitu nuoli

) 2 tuntia, mutta 24 tunnin kuluttua suurin osa radioaktiivisuudesta oli sisällytetty useita erilaisia ​​solun proteiinien kanssa.

Neljä MA (Modified adjuvantti)

32P-peptidejä on esitetty kuviossa 2, inkuboitiin kolmena rinnakkaisena kuoppiin Caco2 tai HeLa-solujen kaksi tuntia. Pesun jälkeen 100 ui geelilatauspuskuria lisättiin ja sisältö ajettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä (nimetty ”2 tuntia”). Identtiset kuoppiin oli täydellistä alustaa lisätään heti pesuvaiheen ja inkuboitiin vielä 24 tuntia, ja hyvin sisällöt ajettiin sitten geeleillä (nimetty ”24 tuntia”). Filmi kehitettiin yön yli altistuksen osoittaa näennäinen pysyvä sisällyttäminen

32P osaksi solun proteiinien 24 tuntia (merkitty * on MA11-paneelissa). Peptidi MA11 sidottu 215 kertaa enemmän herkästi Caco2-soluissa kuin HeLa-solut kaksi tuntia, ja 150 kertaa enemmän innokkaasti 24 tuntia. Peptidi MA20 sidottu hyvin sekä Caco2 ja HeLa-solujen kahden tunnin, mutta vain Caco2 solut näyttivät omaavan solun koneiston tarvitaan sisällyttää

32P osaksi solun proteiinien. Ohut Nuoli osoittaa paikan

32P-leimattua peptidiä, kun taas rohkea Nuoli osoittaa aseman suhteellisen pieni molekyylipaino leimattu väli, jota ei nähty HeLa-soluissa.

Samankaltaisia tulokset havaittiin peptidien MA15 ja MA22, jotka molemmat sisälsivät 17-tähteen insertit kokonaispituus on 34 aminohappoa, ja jotka molemmat on sisällytetty 23 kertaa enemmän

32P osaksi Caco2 soluja kuin HeLa-soluissa sen jälkeen, kun oli inkuboitu yön yli (kuvio 3). Jälleen kerran, sekä MA15 ja MA22 osoittivat voimakkaasti radioaktiivisista LMW band (

lihavoitu nuoli

) 2 tuntia, joka oli lähes kokonaan hävinnyt 24 tuntia, lisäten jäljellä

32P osaksi solun proteiinien. Alunperin oletimme, että tämä LMW bändi nähtävissä 2 tuntia (

lihavoitu nuoli

) edustaa ehjä sitoutuneen

32P-leimattua peptidiä. Kuitenkin 34 aminohappopeptidejä MA15 ja MA22 tunnistaa nämä ehjä 34-aa peptidin esiasteita erotuksena intensiivistä pienempien KA (

lihavoitu nuolet

). Niinpä pääteltiin, että pienemmän bändi oli nopeasti käsitelty pieni väli molekyyli, joka vähentynyt huomattavasti yli varmistetaan 24 tuntia, jonka aikana

32P oltiin sisällytetty solun proteiineista.

peptidi MA20 sisälsi myös 17-tähteen insertti. Tämä peptidi oli erityisen huomionarvoista, koska se oli ainoa testattu, joka pystyi sitoutumaan solulinja ole peräisin paksusuolen adenokarsinooman ja edellyttäen avaimen näyttöä siitä mahdollisesta solujen käsittely mekanismi. Kuten kuviossa 3 on esitetty, MA20 sidottu korkealla tasolla sekä Caco2 ja HeLa-solut kaksi tuntia. Kuitenkin LMW bändi (

lihavoitu nuoli

) havaittu kolme muuta peptidien kuvassa 3 oli ainoa näkyvillä Caco2 soluja, mutta ei HeLa-solujen kanssa. Pesun ja inkuboitu yön yli, Caco2 solut näyttivät ovat käsitelleet LMW välitaajuuskaistasuodin (

lihavoitu nuoli

) osaksi solun proteiinien, kun taas HeLa-solut ilmeisesti puuttui kyky suorittaa seuraava vaihe (

eli

, ei radioaktiiviset solun proteiinien näitä MW: tehtiin näkyviksi, ja kaikki HeLa sitoutunut radioaktiivisuus oli yhä sama molekyylipaino kuin alun perin sitoutunut

32P-leimattua peptidiä (

ohut nuoli

)). Kahdesta kaistasta (

ohut nuolet

, ensimmäinen kaista MA20 ja MA22 geelit) olivat seurausta inkubaation

32P-leimatun peptidin väliaineessa, joka sisältää seerumissa kahden tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja osoitti ilmeisen osittaisen proteolyysi peptidin tuona aikana.

Vain koolonadenokarsinooma soluja voi käsitellä sitoutunut radioaktiivisuus osaksi solun proteiinien

Kuva 4 näyttää tulokset inkuboimalla peptidejä MA11, MA20 ja MA22 seitsemän erilaista karsinooma solulinjoissa 2 tuntia ja sen jälkeen yön yli inkuboinnin jälkeen. Peptidit MA11 ja MA22 osoitti vahvaa sitoutumista ja siirtäminen

32P vain kolmea paksusuolen adenokarsinooma riviä (Caco2, HCT116, ja HCT15) eikä kohdunkaulan (HeLa), fibrosarcoma (1080), haiman tai keuhkon adenokarsinooma soluissa. MA20 sen sijaan sidottu ahnaasti kaikkiin seitsemään solulinjoissa, mutta sen radioaktiivisuus jalostettu LMW bändi (

lihavoitu nuoli

) ja myöhemmin osaksi solun proteiinien vain kolme koolonadenokarsinooma riviä (Caco2, HCT116, ja HCT15). HCT116-solut jatkuvasti sidottu sekä jalostetaan suuremman MW bändejä, radioaktiivisuus kaikista kolmesta

32P-leimattua peptidit (MA11, MA20 ja MA22) paljon pienemmällä nopeudella kuin Caco2 ja HCT15 soluja, mutta sisällyttäminen HCT116 cellular proteiinit oli lopulta näkyvissä enää annokset (tuloksia ei ole esitetty).

32P-leimattua peptidit MA11, MA20 ja MA22 inkuboitiin seitsemän eri solulinjojen, kuten on kuvattu kuviossa 3. MA11 ja MA22 sidottu ja oli

32P radioisotooppi pysyvästi sisällytetty kolmen koolonadenokarsinooma solulinjat. MA20 sitoudu merkittävästi kaikki seitsemän solulinjoja, mukaan lukien yksi, joka on peräisin haiman adenokarsinooma ja joka on peräisin keuhkojen adenokarsinooma, mutta oli huomattavia määriä

32P sisällytetään pysyvästi solun proteiinien vain kolme paksusuolen adenokarsinoomien.

ohut nuoli

osoittaa asennon

32P-leimattua peptidiä, kun taas

lihavoitu nuoli

osoittaa aseman suhteellisen pieni molekyylipaino leimattu keskitason, joka oli nähnyt vain paksusuolen adenokarsinooma soluja.

Non-fosforyloitu peptidi kilpailee

32P-leimatun peptidin sitoutumisesta Caco2 soluihin

12-aa peptidin MA11 syntetisoitiin kemiallisesti, merkitty

32P, ja käyttää kilpailevan sitoutumisen määritystä Caco2-soluissa vastaan ​​vaihtelevia määriä kylmää, ei-fosforyloitua MA11 peptidi. Kuvio 5 esittää, että fosforylaatio tämän peptidin ei tarvitse onnistuneesti kilpailla sitoutumisesta Caco2 soluihin, ja että lisäämällä määriä kylmää kilpailijan nopeasti esti määrä

32P-leimattu peptidi, joka sitoutuu soluihin.

kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi Caco2 soluja lisättiin 0,005 ug

32P-leimattua MA11 peptidin ja ilmoitetusta määrästä kylmää, ei-fosforyloitua MA11. Tunnin inkuboinnin, kiinnittyneet solut pestiin ja sitoutunut radioaktiivinen määrä määritetään.

Keskustelu

Yhdeksäntoista erilaisia ​​pieniä peptidejä jopa 34 aminohapon pituisia on rekombinanttisesti tuotettu, kukin insertin sisältävän jopa 17 tähdettä pitkiä, joka voidaan leimata konservoitunut yhdeksän aminohapon substraattiin käyttämällä

32P ja proteiinikinaasi A Nämä

32P-leimattua peptidit sitoutuvat ainutlaatuisella sukua solulinjoja perustetaan eri paksusuolen adenokarsinoomien ja pysyvästi siirtää radioisotooppien solun proteiinien kahden tunnin inkubaation. Tehokkaimmin sitovaa peptidiä tuloksia pysyvästi oton

32P, jonka koolonkarsinoomasoluissa yli 150 kertaa suurempi kuin solulinjat, jotka ovat peräisin muiden syöpien tai normaaleissa kudoksissa. Lisäksi yksi

32P-leimatun peptidin sitoutunut kaikkiin testattuihin solulinjoihin, mutta

32P käsiteltiin ja pysyvästi sisällytetty vain johdetut solulinjat paksusuolen adenokarsinooman, mikä tarkoittaa, että vain tämäntyyppinen syöpäsolun hallussaan koneet, joita tarvitaan tämän käsittelyn vaihe. Yhdeksäntoista eri peptidiä kuviossa 2 on esitetty, valittiin alustava seulonta-paneeli, jossa on vain 25 peptidejä. Tämä yllättävän korkea saamiseksi onnistunut peptidien lisää todennäköisyyttä, että tämä strategia yksilöllisten hoitojen kehittäminen on mahdollista. Lopuksi, kilpailevan sitoutumisen määrityksessä, jossa käytettiin kylmää ja

32P-leimatun synteettisen MA11 peptidin osoitettiin, että ei-fosforyloitu peptidi kilpailee hyvin tehokkaasti sitoutumisesta Caco2-soluissa.

Useimmat tällä hetkellä hyväksytty syövän immunoterapeuttinen hoito käyttää vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu tunnettu solu molekyyliä, ja se voi olla kytketty myös kasvain-ablaatiota ainetta, kuten radioisotoopilla tai toksiini [14] – [18]. Vain kaksi radioimmunotherapeutic (RIT) hoidot ovat parhaillaan FDA-hyväksyttyjä; molemmat on suunnattu non-Hodgkin-lymfooman käyttämällä

131I (Bexxar) tai

90Y (Zevalinin) kautta solun tappaminen aktiivisuus lähteneet elektronit.

32P radioisotooppi on puhdas beta aiheuttaja, ja kuten taulukosta 1, sillä on monia ominaisuuksia, jotka ovat verrattavissa suotuisin

131I ja

90Y, sen lisäksi, että helposti saatavilla ja suhteellisen edullisia. Yksi etu käyttää beetahiukkasten tappamaan kasvainsoluja on, että niiden tiellä kantama on jopa 5 mm johtaa suuri määrä soluja läpäisemään kukin elektroni, joka johtaa kumulatiivinen ”sivullinen vaikutus” johtuu crossfire viereisistä leimattuja soluja.

erittäin aktiivinen alue biolääketieteellisen tutkimuksen keskittyy kytkimen radioisotooppeja peptideihin, sekä sen käyttöä diagnostisissa ja terapeuttisissa sovelluksissa [19] – [22]. Meidän ehdotettu soveltaminen

32P-leimattua pieniä peptidejä peptidin sitovaa terapiassa esitetään useita etuja perinteisiin RIT perustuu monoklonaalisia vasta-aineita. Esimerkiksi pienempien terapeuttisten molekyylien arvellaan olevan parempi kasvaimen levinneisyys ja keskimäärin pieni peptidi molekyylipaino on pienempi kuin 4000 Da on pienempi kuin 3%: n koko vasta-ainemolekyylin [23]. Radioaktiiviset halogeenit kuten

131I voidaan käsitellä ja vapautetaan ennenaikaisesti soluja, kun taas

32P toimitetaan näitä pieniä peptidejä on liitetty kiinteästi syöpäsolujen proteiinit [24]. Pieni peptidi on vähemmän todennäköisesti yllyttää tyypin isännän anti-proteiini vaste, joka voi kehittyä käytettäessä paljon suurempi vasta-aineet ja puuttuminen Fc immunoglobuliinifragmentin pitäisi johtaa vähemmän epäspesifisen sitoutumisen maksassa. Radioisotooppi

32P on pitkä historia kliinisessä käytössä dating 1930-luvun alussa, mutta nyt sitä käytetään yhä hoitoon polysytemia ja olennainen trombosytemiassa [25]. On olemassa selvä tarve kehittää tehokkaita uusia hoitoja ja peräsuolen syövän [26]. Työmme osoittaa, että erittäin suuri kirjaston erilaisia ​​pieniä peptidejä, joista jokaisella on omat sitovat ja

32P siirtää kykyjä, voidaan helposti valmistaa joko kemiallisesti tai biologisesti, mikä lisää mahdollisuuksia yksilöllisten hoito-ohjelmien eri potilaille. Syöpä on osoitettu olevan hyvin heterogeeninen sairaus, jolloin kehitys näiden ainutlaatuisten peptidin sitovaa hoitoja voitaisiin merkittävästi helpottaa yksilöllisten potilaiden hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

tuottaminen yhdistelmä-DNA

32P leimattua peptidit

Kuten on kuvattu kuviossa 1, PCR: tuotteet, jotka koostuvat 17 satunnaista kodonien reunustavat BamHI kloonattiin BamHI pGEX-2TK (GE Healthcare). Transformaation jälkeen DH5a bakteerit, eristetty klooneja kasvatettiin yön yli LB-amp-liemessä, laimennettiin 1/10 samassa, kasvatettiin kaksi tuntia, IPTG: tä lisättiin 1 mM, ja kasvatettiin 37 ° C: ssa viisi tuntia. Kymmenen ml viljelmää sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan 1 x TBS, joka sisälsi 100 ug /ml lysotsyymiä. Kahden jäädytys-sulatus-syklit, lysaatti sentrifugoitiin ja sekoitettiin 100 ul: Sepharose-Glutathione yksi tunti, pestiin kolme kertaa 1 x TBS, ja sitoutunut rekombinanttifuusioproteiinien leimattiin käyttäen

32P-γ-ATP: tä ja proteiinikinaasin mukaista A valmistajan ohjeiden (Sigma, St. Louis, MO). Pelletti pestiin kolme kertaa 1 x PBS: llä, ja leimattu peptidi pilkottiin ja supernatanttiin vapautuneen käyttäen trombiini (GE Healthcare). Kunkin rekombinantti tuotettu peptidi ja määritettiin DNA-insertin sekvenssi ekspressioplasmidin määritettiin.

määritys sitoutumisen

32P-leimattua peptidien solulinjojen

Solulinjat kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia. Kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä, 10000 soluja eri solulinjoja kasvatettiin yön yli. Kymmenen ui

32P-leimattua peptidiä 1 x PBS: ssä ja 90 ui täydellistä alustaa lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kahden tunnin ajan. Peptidi-väliaine poistettiin ja yksi ui lisättiin 100 ui geelilatauspuskuria tuikenestelaskentaan koettimen kvantitoimiseksi tai ajetaan 10% -20% polyakryyliamidi-SDS-geeliä (Biorad). Kiinnittyneet solut olivat lyhyesti ja kevyesti pestiin täydellistä elatusainetta kolme kertaa ja joissakin kuopat määritettiin välittömästi lisäämällä 100 ui geelilatauspuskuria kuhunkin kuoppaan ja ajettiin geelillä tai lasketaan tuikelaskimessa. Muut samalla käsiteltiin kuoppiin oli 200 ui täydellistä alustaa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 24 tuntia. Väliaine poistettiin ja 100 ui geelilatauspuskuria lisättiin ja näytteet ajettiin geelin tai lasketaan kuten edellä on kuvattu.

Synteettisten

32P-leimatun peptidin

12 aminohapon peptidi MA11 syntetisoitiin kemiallisesti ja 0,2 ug leimattiin, kuten on kuvattu edellä käyttäen 300 uCi

32P-γ-ATP: tä ja 30 yksikköä proteiinikinaasi A viiden tunnin leimausreaktion, seos mikrofugoimalla vaikka Microcon-10 yksikkö entsyymin poistamiseksi myöhemmistä sitoutumismäärityksissä. Sillä kompetitiivinen sitoutumismääritys, 0,005 ug

32P-leimattua peptidiä MA11 lisättiin kuoppaan, joka sisältää 10000 Caco2-solut ja nimetty määrä kylmää, ei-fosforyloitua MA11. Kun oli inkuboitu yksi tunti, kiinnittyneet solut pestiin varovasti ja hyvin sisältö laskettiin.