Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tuumorisuppressorin homeodomain-vuorovaikutuksessa proteiinikinaasi-2 (HIPK2) fosforyloimalla seriini 46 (Ser46) on tärkeä säätelijä p53 apoptoottisen funktion. HIPK2 on myös transkription yhteistyössä repressori hypoksian-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) lähestymiskiellon kasvaimen angiogeneesiä ja chemoresistance. HIPK2 voidaan vapautettiin kasvaimia useilla mekanismeilla, mukaan lukien hypoksia. Täällä pyrimme kohdistaa hypoksia palauttamalla HIPK2 toiminta ja tukahduttaa HIF-1α, jotta näyttöä osallistumista sekä HIPK2 ja p53 torjuttaessa hypoksian aiheuttaman chemoresistance.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kun altistuminen paksusuolen ja keuhkosyövän solujen hypoksia, joko alhainen happipitoisuus tai kobolttia, HIPK2 toiminta oli heikentynyt, jolla lisätään HIF-1α ilmaisun ja estämällä p53-apoptoottista vastetta lääkkeen. Koboltin tukahdutti HIPK2 rekrytointi päälle HIF-1α promoottori. Hypoksian indusoima p53 tavoite MDM2 että downregulates HIPK2 näin MDM2 esto siRNA palautti HIPK2 /p53Ser46 vastaus huume. Sinkkilisän hypoksia käsiteltyjä soluja kasvoi HIPK2 proteiinia vakautta ja tumakertymään, mikä palauttaminen HIPK2 sitoutumisen HIF-1α promoottori, tukahduttaminen MDR1, Bcl2, ja VEGF-geenien ja aktivointi p53 apoptoottista vastetta lääkkeen. Yhdistelmä sinkki ja ADR voimakkaasti tukahdutti kasvaimen kasvua

in vivo

estämällä HIF-1-reitin ja säätelemällä p53 apoptoottisten kohdegeeneissä.

Johtopäätökset /merkitys

Osoitamme täällä ensimmäistä kertaa, että hypoksian indusoima HIPK2 sääntelyn purkamista torjua sinkki että palautettu HIPK2 tukahduttaminen HIF-1-reitin ja uudelleen p53 apoptoottista vastauksena huumeiden, mikä korostaa mahdollinen käyttö sinkkilisän yhdessä kemoterapian puuttua hypoksia ja parantaa kasvaimen hoitoa.

Citation: Nardinocchi L, Puca R, Sacchi A, Rechavi G, Givol D, D’Orazi G (2009) kohdistaminen Hypoksia syöpäsoluissa palauttamalla homeodomain Vuorovaikutus Protein-Kinase 2 ja p53 Activity ja estäminen HIF-1α. PLoS ONE 4 (8): e6819. doi: 10,1371 /journal.pone.0006819

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2009; Hyväksytty: 03 elokuu 2009; Julkaistu: 28 elokuu 2009

Copyright: © 2009 Nardinocchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Grant Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (GDO) ja Lentoemäntä- Medical Research Institute (FAMRI) (GR); RP on tukenut Fellowship Italian Foundation for Cancer Research (Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro -FIRC. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kiinteä kasvaimia voi selvitä hypoksinen ehto (korkea solutiheys kasvaimen rajoittaa hapen saatavuudesta soluihin) käyttämällä suojaavia mekanismeja, mukaan lukien aktivoituminen hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) transkriptiotekijä, joka indusoi muun muassa antiapoptoottisten Bcl2, monilääkeresistenssiin (MDR), VEGF: n geeniekspressiota, ja uudelleenohjelmointi glukoosiaineenvaihdunnan että huomioon solujen lisääntymisen, angiogeneesin, ja chemoresistance [1]. Lisäksi, hypoksia vaimentaa vaste oncosuppressor p53 soluvaurioita [2]. p53-proteiini on merkittäviä rooleja in kasvun pysähtymisen, solujen korjaus, ja solukuoleman, jotka minimoivat eteneminen pahanlaatuisten solujen [3]. Toiminta p53 tuumorisuppressorina liittyy sen toimintaan transkriptiotekijän posttranslational muutoksia, jotka mahdollistavat proteiinin paeta MDM2-ohjaus, kerääntyä, ja tulla aktiivisiksi [4]. P53-geeni on mutatoitunut -50% ihmisen syövistä katsoo, syövät kätkeminen villityypin (wtp53), sen toiminta voi vaarantua muilla mekanismeilla sääntelyn purkamisesta säätelijäproteiineja [5], [6].

homeodomain-vuorovaikutuksessa proteiinikinaasin-2 (HIPK2) on tärkeä säätelijä p53 apoptoottisen funktion, siten olemme aiemmin osoittaneet, että HIPK2 fosforyloi p53 seriinin 46 (Ser46) jälkeen vakavia DNA-vaurioita, joka indusoi p53 erityisiä apoptoottista transkriptionaalista aktiivisuutta [7] – [9]. Fosforylaatio tällä sivustolla on myöhässä tapahtuma jälkeen vakavia DNA-vaurioita ja säännellään erityisesti p53-aiheuttaman apoptoosin avulla esimerkiksi säätelyä p53AIP1 geenin sijasta solusyklin pidätetty liittyvä geeni ja MDM2-geenin ilmentymisen [10], [11]. Merkittävä auto-sääntelyyn, negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka p53 liittyy p53-riippuvaista MDM2 induktio, joka puolestaan ​​sitoo ja inaktivoi p53 ajamalla se proteasomaalisten hajoaminen [12] – [14]. Tässä suhteessa olemme osoittaneet, että HIPK2 neutraloi MDM2 esto pelastamiseen p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja apoptoottisen funktion [15]. Näin ollen aineet, kuten HIPK2, jotka voivat lisätä aktiivisen p53: n kasvainsoluissa estää MDM2-p53-vuorovaikutusta voisi olla terapeuttista käyttöä herkistävät kasvainsoluja kemo- tai radio-hoitoa.

HIPK2 on myös transkription yhteistyötä repressori usein moniproteiinikompleksin muiden yhteistyössä repressors kuten Groucho ja hystone deasetylaasi- 1 (HDAC1) [16]. Olemme äskettäin havainneet, että HIPK2 co-tukahduttaa hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) transkriptiotekijä elävänä HIF-1-indusoitua kasvaimen angiogeneesiä ja chemoresistance [17]. Siten esto HIF-1α aktiivisuutta HIPK2 vähentää VEGF, MDR1, ja Bcl2 ilmaisun ja stimuloi lääkkeiden aiheuttaman apoptoosin p53-riippuvaisten ja riippumattomien tavalla [18]. Koska sen keskeinen asema kohdentamisessa solujen kohti apoptoosin upon genotoksinen stressi, sääntely HIPK2 on tehty intensiivistä tutkimuksen viime vuosina. HIPK2 havaittiin downmodulated kilpirauhas-, rinta- [19] ja paksusuolen syövissä [20] verrattuna vastaavaan normaaleissa kudoksissa; mutatoitunut sisällä pilkku retentiosignaalilla ihmisen akuutin myeloblastinen leukemiat ja myelodysplastista oireyhtymää [21]; ja delocalized sytoplasmassa korkean liikkuvuuden ryhmä A1 (HMGA1) yliekspressio [22]. HIPK2 on epävakaa proteiini, joka hajoaa kautta proteasomireitillä reitin erityisesti viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että HIPK2 voidaan downmodulated p53 aiheuttama MDM2 [23] ja hypoksia aiheuttama Siah2 proteiinit [24]. Olemme äskettäin osoittaneet, että HIPK2 Knockdown indusoi p53 väärinlaskostumista joka voidaan palautunut sinkkilisän [25], [26]. Siksi kaikki edellytykset, jotka johtavat HIPK2 vapauttamisen loppuisi monitekijäinen vastauksena johtaa kasvaimen chemoresistance voimakkaasti vaikuttavat p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja apoptoosin toisaalta ja HIF-1 aktiivisuutta toisaalta. Siksi ymmärrystä siitä, miten vaimentua HIPK2 voitaisiin aktivoida saattaa johtaa uusien strategioiden sekä hillitä HIF-1-reitin ja palauttaa p53 aktiivisuuden voittamiseksi lääkeresistenssin. Tämä on linjassa myös uusien teosten, jotka ovat osoittaneet, että syövän hoidossa anti-angiogeeninen aineet voivat aiheuttaa hypoksiaa, joka valitsee radio- ja lääkeresistenssin, mikä korostaa tarvetta käsitellä kasvain hypoksia syöpä [27].

sinkki on tärkeä kofaktori DNA sitova aktiivisuus p53, kuten jotkut p53 mutaatioita, jotka hämmentää sinkkiä sitovan sivusto p53 johtaa menetys DNA sitova [28]. Sinkki on hivenaine, joka on välttämätön normaalia solujen toimintaa ja on kofaktori rakennetta ja toimintaa on monenlaisia ​​solun proteiinien, mukaan lukien entsyymit, transkriptiotekijät, ja rakenteelliset proteiinit [29]. Niinpä sinkki on olennainen edellytys etenemisen monien signaaliprosesseja eukaryooteissa ja vapauttaminen sen aineenvaihdunta voi aiheuttaa DNA-vaurioita ja syövän riskiä [30]. Hoito sinkki osoitettiin todellista klinikalle potentiaalia, vähentää kasvaimen kasvua ja aggressiivisuus rajoitettu biotoksisuuden, esimerkiksi eturauhassyövän [31].

Tarkoituksena meidän tutkimuksessa oli arvioida, onko hypoksia saattaa purkamaan HIPK2- aiheuttama p53 riippuvainen apoptoottisen transkriptioaktiviteettia vastauksena huumeiden ja edistää siten chemoresistance ja onko sinkki voisi torjua tätä HIPK2 /p53Ser46 esto. Olemme havainneet, että altistuminen kasvainsolujen hypoksia, joko alhaisen happi- tai kobolttia, esti p53Ser46 fosforylaatio ja p53 apoptoottista transkriptionaalista aktiivisuutta vasteena lääkkeen. Tämä inhibitio oli seurausta HIPK2 downregulation johtuu ainakin osittain hypoksian aiheuttamaa MDM2 säätelyä. Toisaalta, koboltti esti HIPK2 rekrytointi päälle HIF-1α promoottori. Erityisesti sinkkilisän hypoksia käsiteltyjä soluja torjua estyminen HIPK2 mahdollistaa sen tumakertymään joka korreloi HIF-1α downmodulation ja tukahduttaminen HIF-1-reitin ja palauttaminen p53Ser46 apoptoottisen transkriptioaktiviteettia vastauksena huumeiden. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että hypoksia-tila voi vaikuttaa HIPK2 /p53Ser46 reitin, erityisesti osoitamme tässä ensimmäistä kertaa, että sinkki voidaan neutraloida hypoksian indusoiman HIPK2 inhibition. Koska kasvaimet sisältävät alueita, joilla on hypoksinen olosuhteet, joissa wtp53 on aktiivinen, nämä tulokset tukevat mahdollista käyttöä sinkkilisän kemoterapian hoidossa kasvainten toimimatonta wtp53 tai HIPK2.

Tulokset

Solun altistuminen koboltti kumoaa p53 apoptoottisten-geenin transkription ja vähentää HIPK2 rekrytointi päälle HIF-1α promoottori

kysyttiin kobolttikloridia (CoCl

2), joka stabiloi HIF-1α ja indusoi HIF-1 reagoiva geenien kanssa kinetiikka samanlainen kuin hypoksia [32], voivat vaikuttaa lääkkeen aiheuttama p53-apoptoottisen geenin transkription. Kuten kuviossa 1A on esitetty, koboltti vahvasti poisti ADR-indusoidun PARP lohkominen ja Ser46 fosforylaatio. Kobolttia yksinään indusoi p53 tasoa, vaikka se ei ole indusoi Ser46 fosforylaation tai PARP pilkkominen (kuvio 1A). P53 apoptoottinen transkriptioaktiviteettia arvioitiin lusiferaasianalyysissä. Kuten kuviossa 1B on esitetty, ADR-indusoidun p53AIP1-luc-aktiivisuus on merkittävästi heikentynyt koboltti, kun taas koboltti yksinään ei vaikuta siihen, ja

in vivo

analyysi mRNA-tasojen osoitti, että lääkkeen aiheuttama säätelyä p53 apoptoottisten kohdegeenien

Bax

ja

Puma

voimakkaasti heikentynyt koboltti (kuvio 1 C), kuten on esitetty myös ilmaisulla suhde GAPDH. Toisaalta olimme aikaisemmin osoittaneet, että koboltti voi aiheuttaa

MDR1

, ja

Bcl2

geenin ilmentymistä [18].

(A) RKO-soluja käsiteltiin CoCl

2 ja ADR 16 h, yksin tai yhdessä. Sama määrä koko solu-uutteita analysoitiin Western immunoblottaus spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi Ser46 fosforylaation ja PARP pilkkominen (nuolet: katkaisematon ja katkaistun muodot); yhteensä p53 on myös esitetty. Anti-tubuliinia käytettiin proteiinin loading ohjaus. (B) RKO-solujen, jotka on stabiilisti transfektoitu p53AIP1-luc-reportterin, käsiteltiin CoCl

2 ja ADR: ssa 16 tuntia ennen lusiferaasi-aktiivisuus määritettiin. RLU: suhteellinen lusiferaasiyksikkönä.

Sarakkeet

, keskiarvo kolmen erillisen kokeen suoritettiin kahtena kappaleena;

baareja

, S.D. *

P

0,01. (C) Yhteensä mRNA: t käänteistranskriptio alkaen RKO soluista käsiteltiin CoCl

2 ja ADR yksin tai yhdessä, 16 h PCR analyysejä p53 kohdegeenien

Bax

ja

Puma

. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. Expression suhde GAPDH arvioitiin densitometrisellä analyysi geenien ilmentymistä. *

P

0,01.

Koska hypoksia kunnossa edistää ainakin osittain HIPK2 proteiinien hajoaminen [24] kysyimme koboltti pystyi samalla vaikuttamaan HIPK2 ilmaisun ja toimintaa. Tätä varten HIPK2 proteiinin tasot tutkittiin RKO ja A549-soluja käsiteltiin CoCl

2: n läsnä tai poissa ollessa proteasomin inhibiittoria MG132. Kuten kuviossa 2A on esitetty, koboltti vaimentua HIPK2 proteiinin tasoja, jotka voidaan pelastaa MG132 hoitoon. Analyysi mRNA: n ekspression osoitti, että HIPK2 geenin transkriptio ei vaikuttanut koboltti (kuvio 2B). Me perusteltu, että pitämällä HIPK2 proteiini alhaisena, koboltti voisi vaikuttaa HIPK2 rekrytointi päälle tavoite promoottorit, mikä vaikuttaa HIPK2 co-repressorin aktiivisuutta. Tämän tueksi hypoteesin, suoritimme ChlP määritys taas chromatin immunokompleksit immunosaostettiin anti-HIPK2 ja anti-histonideasetylaasi 1 (HDAC1) vasta-aineet ja PCR-analyysi suoritetaan käyttämällä spesifisiä alukkeita, jotka reunustavat HIF-1α promoottori [17]. Kuten kuviossa 2C (vasen paneeli), The HIPK2 ja HDAC1 rekrytointi päälle

HIF-1α

promoottori voimakkaasti heikentynyt kobolttia. Kontrollina HIPK2 sitovan spesifisyyden

HIF-1α

promoottorin, käytimme spesifisiä alukkeita ulottuu ihmisen

GAPDH

promoottorialueen. Kuten odotettua (kuvio 2C, oikea paneeli), ei

GAPDH

monistaminen jälkeen havaittiin kromatiinin immunosaostus anti-HIPK2 ja anti-HDAC1 vasta, kun selvä PCR detektoitiin käyttämällä genomi-DNA: ta templaattina. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että koboltti voivat vaikuttaa sekä p53 ja HIPK2 toimintaa.

(A) RKO ja A549-soluja käsiteltiin koboltin 16 tuntia, kun läsnä tai poissa proteasomin inhibiittoria MG132 (40 umol /l 6 h) ja ajoneuvon DMSO. Sama määrä koko solu-uutteita analysoitiin Western immunoblottaus spesifisen vasta-aineen havaitsemiseksi endogeenisen HIPK2 proteiinin tasot; anti-Hsp70 käytettiin proteiini latauskontrollina. (B) Yhteensä mRNA: t käänteistranskriptio päässä RKO ja A549 hoidettiin koboltti 16 h PCR-analyysit HIPK2 geenin ilmentymisen. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) Kromatiini immunosaostuksella (chip) analyysi suoritettiin anti-HIPK2 ja anti-HDAC1 vasta-aineiden RKO käsiteltyjä soluja koboltin 8 ja 16 tuntia. PCR-analyysit suoritettiin immunosaostettiin DNA-näytteille käyttämällä spesifisiä alukkeita ihmisen

HIF-1α

promoottori. Monistaminen

GAPDH

promoottori (oikea paneeli) käytettiin kontrollina HIPK2 sitovan spesifisyyden

HIF-1α

promoottori. Näyte edustaa lineaarisen vahvistuksen koko panos kromatiinin (Input) on sisällytetty kontrollina. Lisätarkastuksia mukana immunosaostus suoritettiin epäspesifinen immunoglobuliini (nro Ab).

Hypoksia inhiboivan p53 transkription aktiivisuutta voidaan palautunut MDM2 ehtyminen

HIPK2 välittämän p53Ser46 fosforylaatio aiheuttama vakava DNA vaurioita [7] – [9], että palaute sääntelyn silmukka, vahvistaa HIPK2 toiminnan kautta p53-välitteisen kaspaasi aiheuttama mekanismin [33] ja indusoi apoptoottista geenien ja estää solusyklin pidätys liittyvät ja MDM2 geenit [10], [11]. Toisaalta, on vain lievää stressi voi downregulate HIPK2 kautta p53 aiheuttamaa MDM2 säätelyä [23]. Siksi kysyimme hypoksia voi toimia vain lievää stressiä pystyy aktivoimaan p53-kohde MDM2 ja siten estävät HIPK2 ja altistaa lääkeresistenssin. Semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysit osoittivat, että kobolttia sekä alhainen hapen aiheuttama MDM2 säätelyä (kuvio 3A). Seuraavaksi, tutkimme MDM2 oli vastuussa eston p53 apoptoottisen aktiivisuuden. Analyysi p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden seuraavat koboltti käsittely suoritettiin 293-soluissa yhdessä transfektoitu p53AIP1-luc-reportterin ja joko HIPK2-lippu tai HIPK2-K1182R-Flag pisteen mutantin, joka ei voi hajottaa MDM2 [23]. Kuten on esitetty kuviossa 3B HIPK2 aiheuttama AIP1-luc-aktiivisuus vähentää huomattavasti kobolttia, kun K1182R aiheuttama AIP1-luc aktiivisuus ei muuttunut. Western immunoblottaus osoitti, että HIPK2 ilmentyminen väheni koboltti, kun ilmentymisen heikkenemistä vastustavasta K1182-mutantti ei ollut vaikutusta (kuvio 3C). Yhteisymmärryksessä, myös HIPK2 aiheuttama Ser46 fosforylaatio väheni koboltti, vaikka se ei muuttunut K1182 yliekspressio (kuvio 3C). Molemmat tulokset ehdotti osallistumista MDM2 vuonna HIPK2 asetuksessa, joka puolestaan ​​vaikutti p53Ser46 aktiivisuutta. Tämän hypoteesin testaamiseksi, RKO solut köyhdytetty n MDM2 toiminnon siRNA (kuva 3D) ja tämä MDM2 ehtyminen riitti pelastamaan ADR aiheuttama Ser46 fosforylaation ja PARP pilkkominen estävät koboltti (kuvio 3E ja verrata 1A). Lisäksi MDM2 ehtyminen torjua koboltti inhiboivan vaikutuksen p53AIP1-luc toimintaa vastauksena ADR (kuvio 3F ja verrata 1B). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että hypoksian aiheuttaman lääkeresistenssi riippui ainakin osittain, voimistumista MDM2 ilmaus, joka vuorostaan ​​esti HIPK2 /p53Ser46 apoptoottisen aktiivisuuden vastauksena huumeiden.

(A) Yhteensä mRNA: t oli käänteistranskriptio päässä RKO ja A549 hoidettiin kobolttia tai 2% O

2 16 h PCR-analyysit MDM2-geenin ilmentymisen. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) 293-solut ko-transfektoitiin p53AIP1-luc-reportterin ja HIPK2-Flag tai K1182R-Flag (MDM2 heikkenemistä vastustavasta mutantti) ekspressiovektorit, ja 24 tuntia myöhemmin käsiteltiin CoCl

2: ssa 16 tuntia, ennen kuin lusiferaasiaktiivisuus oli analysoitiin. RLU: suhteellinen lusiferaasiyksikkönä.

Sarakkeet

, keskiarvo kolmen erillisen kokeen suoritettiin kahtena kappaleena;

baareja

, S.D. *

P

0,01. (C) Soluja käsiteltiin kuten (B) ja käsittelyn jälkeen yhtä suuret määrät kokosolu-uutteet alistettiin Western-immunoblottaus käyttäen mainituilla vasta-aineilla: anti-Flag (havaitsemiseksi ectopic HIPK2-Flag ilmentymisen), anti-Ser46 ja anti-p53 vasta-aineita. (D) RKO-solut transfektoitiin siMDM2 ja 36 h myöhemmin sama määrä koko solu-uutteita analysoitiin Western immunoblottaus erityisiä anti-MDM2-vasta-ainetta. (E) RKO-solut transfektoitiin siMDM2 ja 24 tuntia myöhemmin käsiteltiin CoCl

2 ja ADR 16 tuntia. Sama määrä koko solu-uutteita analysoitiin Western immunoblottaus spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi p53Ser46 fosforylaation ja PARP pilkkominen (nuolet osoittavat pilkottu ja katkaisemattomat muodot); yhteensä p53 on myös esitetty. Anti-tubuliinia käytettiin proteiinin loading ohjaus. (F) RKO soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu p53AIP1-luc-reportterin, transfektoitiin siMDM2 ja 24 tuntia myöhemmin käsitelty CoCl

2 ja ADR 16 h ennen lusiferaasin aktiivisuus tutkittiin. RLU: suhteellinen lusiferaasiyksikkönä.

Sarakkeet

, keskiarvo kolmen erillisen kokeen suoritettiin kahtena kappaleena;

baareja

, SD

Sinkki palauttaa ADR aiheuttaman p53 apoptoottiset-geenin transkriptio in koboltti-käsitellyissä soluissa

Olemme äskettäin osoittaneet, että HIPK2 ehtyminen vastaa p53 proteiini väärinlaskostumista voidaan palautunut sinkkilisän [25], [26]. Siksi me arveltu täällä, että hypoksian indusoima HIPK2 sääntelyn purkaminen voisi peilata HIPK2 pudotus kunnossa ja näin vaikuttaa p53 DNA: ta sitovan ja transkription toimintaa. Olemme havainneet, että koboltti lisääntynyt p53-reaktiivisuutta PAb240-vasta-ainetta (mutantti, taittamista p53-muoto), ja vähensi p53 reaktiivisuus Pab1620 vasta-ainetta (villityypin, taitettu muoto) (kuvio 4A), joka osoittaa p53-proteiinin väärinlaskostumisen, ja testattiin tämän vuoksi siitä, sinkki lisäravinteen pystyi palauttamaan wtp53 toimintaa vastauksena huumeiden. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi meidän on ensin arvioitava

in vivo

wtp53 DNA-sitoutumisaktiivisuutta käyttämällä ChIP analyysiä. RKO-soluja käsiteltiin koboltin ja ADR: n läsnä tai poissa ollessa sinkin ja endogeenisen p53 immunorecipitated kanssa polyklonaalista anti-p53-vasta-ainetta (FL393). Määrä kerasaostuvat p53-sitovia elementtejä tavoite promoottorit määritettiin PCR: llä. Tulokset osoittivat, että koboltti lyhensi p53 sitoutuminen promoottorit apoptoottisten geenien kuten

Puma

ja

DR5

vastauksena ADR ja että tämä inhibitio voimakkaasti palautunut sinkkilisän (kuva 4B). P53-spesifinen sitoutuminen

Puma

ja

DR5

promoottorit vahvistettiin

GAPDH

promoottorin monistuksen jälkeen kromatiinin immunosaostus anti-p53-vasta-ainetta (kuvio 4B). Siten p53 apoptoottinen transkriptionaalista aktiivisuutta indusoi spesifisesti ADR (Noxa-luc versus p21-luc), estyi kobolttia ja palauttaa sinkkilisän (kuvio 4C). Erityisesti sinkin yksinään ei aiheuttanut p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden. Lisäksi arvioimme onko HIPK2 indusoimaa p53 transkriptionaalista aktiivisuutta inhiboi koboltti (kuvio 3B) voidaan palauttaa sinkkiä. Tätä varten 293-soluja kotransfektoitiin p53AIP1-luc-reportterin ja HIPK2 ekspressiovektoriin. Kuten on esitetty kuviossa 4D, sinkkilisän täysin palautettu HIPK2 aiheuttama p53AIP1-luc aktiivisuus vähentää koboltti, kun taas käsittelyjen koboltin tai sinkin yksinään ei indusoinut p53AIP1 lusiferaasiaktiivisuus. Yhteisymmärryksessä, ADR aiheuttama p53 apoptoottisen geenin transkriptio estyi koboltti (kuvio 4E, vertaa kaista 2, kaista 3) ja palauttaa sinkkilisän (kuvio 4E, vertaa kaista 3 ja 4) ja saman määrän ADR hoidon (kuva 4E vertaa kaista 4 kaista 2). Erityisesti sinkkilisän koboltin ei aiheuttanut apoptoottinen geenin transkriptio (kuvio 4E, kaista 5). Lopuksi apoptoottista solukuolemaa arvioitiin Western immunoblottauksella osoittaa, että estämällä PARP pilkkominen ja Ser46 fosforylaatio kobolttia altistuminen ADR-käsiteltyjen solujen (kuvio 4F, vertaa kaista 2 kaista 4) voimakkaasti palautettiin sinkkiä (kuvio 4F, vertaa kaista 4 jossa kaista 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että sinkki pystyi aktivoimaan hypoksia-esti endogeenisen wtp53 DNA: ta sitovan ja apoptoottisten transkription toimintaa vastauksena huumeiden, vastustamalla, ainakin osittain HIPK2 vapauttaminen.

(A) RKO soluja käsiteltiin koboltin 16 tuntia ja sama määrä koko solu- uutteet immunosaostettiin konformaatiosta erityisiä Pab1620 (villityypin, taitettu p53 muoto) ja Pab240 (mutantin, taittamista p53 muoto) vasta-aineet ja analysoitiin Western immunoblottauksella anti- p53 polyklonaalista vasta-ainetta (FL393). Edustaja bändejä vähintään kahdesta itsenäisestä kokeesta esitetään, osoittavat kasvua PAb240 reaktiivisuus ja vähentämisestä Pab1620 reaktiivisuus jälkeen koboltti hoidon. Ei erityisiä (ei riittävä) signaali näytetään proteiinia latauskontrollina. (B) Kromatiini immunosaostuksella (chip) analyysi suoritettiin anti-p53-vasta-aineella RKO solut altistetaan ZnCl

2 ja CoCl

2 24 tuntia ja adriamysiinin 16 tuntia. PCR-analyysit suoritettiin immunosaostettiin DNA-näytteitä käyttämällä alukkeina p53 kohde

Puma

ja

DR5

promoottorit. Monistaminen

GAPDH

promoottori (oikea paneeli) käytettiin kontrollina p53 sitovan spesifisyyden

Puma

ja

DR5

promoottorit. Näyte edustaa lineaarisen vahvistuksen koko panos kromatiinin (Input) on sisällytetty kontrollina. Lisätarkastuksia mukana immunosaostus suoritettiin epäspesifinen immunoglobuliini (nro Ab). (C) RKO-solut transfektoitiin p21-luc ja Noxa-luc toimittajat ja 24 tuntia myöhemmin käsitelty ZnCI

2 ja CoCl

2: ssa 24 tuntia ja adriamysiinin 16 tuntia vastaavasti, ennen lusiferaasin aktiivisuus määritettiin. Tulokset, normalisoitu p-galaktosidaasin aktiivisuus on esitetty kertainen induktio yli käsittelemättömien solujen;

baareja

, S.D. (D) 293-solut ko-transfektoitiin p53AIP1-luc-reportterin ja HIPK2-Flag-ekspressiovektoriin ja 24 tuntia myöhemmin käsitelty ZnCI

2 ja CoCl

2: ssa 16 tuntia, ennen lusiferaasin aktiivisuus määritettiin. RLU: suhteellinen lusiferaasiyksikkönä.

Sarakkeet

, keskiarvo kolmen erillisen kokeen suoritettiin kahtena kappaleena;

baareja

, S.D. *

P

0,01. (E) Yhteensä mRNA: t käänteistranskriptio alkaen RKO soluista käsiteltiin kuten (C) PCR analyysejä p53 kohdegeenien

Noxa

ja

Puma

. GAPDH: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. (F) RKO-soluja käsiteltiin ZnCl

2 ja CoCl

2 24 tuntia ja ADR 16 tuntia ja sama määrä koko solu- uutteiden analysoitiin Western immunoblottaus anti-PARP (nuolet osoittavat lohkaisemattoman ja pilkotaan PARP ), anti-Ser46 ja anti-p53-vasta-aineita. Anti-Hsp70 käytettiin proteiini latauskontrollina.

Sinkki palaa huonosti HIPK2 hypoksia käsiteltyjä soluja

Seuraavaksi pyrimme arvioimaan, sinkki voisi torjua hypoksian aiheuttaman HIPK2 downregulation ja vaikuttaa HIPK2 sitoutuminen kromatiinin. Kuten kuviossa 5A (vasen paneeli) koboltti-indusoidun HIPK2 proteiinin vaimennussäätely pelastettiin sinkkilisän kun sinkki yksinään ei muuta HIPK2 tasoilla. Kääntäen, koboltti hoito upregulated HIF-1α ilmaisun ja tämä vaikutus oli vahvasti palautunut sinkkilisän (kuvio 5A, oikea paneeli). Subsellulaariset osoitti, että koboltti hoito vähensi sekä soluliman ja ydinvoiman HIPK2 ydinaseiden tasolla, vaikka HIPK2 ydin- tasot voimakkaammat kobolttia ja että tämä vaikutus oli palautunut sinkkilisän (kuvio 5B). Sinkki yksinään ei vaikuta HIPK2 tasoja (kuvio 5B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin alhainen happipitoisuus hoitoon (kuvio 5C). Me seuraavaksi analysoitu HIPK2 katalyyttitoiminnan jälkeen koboltti hoidon. Tätä varten 293-soluja transfektoitiin Flag tyhjällä vektorilla tai HIPK2-Flag ekspressiovektorilla läsnä ollessa tai ilman kobolttia tai sinkkiä, minkä jälkeen immunosaostuksella ektooppisen HIPK2 anti-Flag-vasta-aineen ja

in vitro

kinaasianalyysiä tunnettujen HIPK2 fosforylaatiota substraatin myeliinin emäksisen proteiinin (MBP) [7]. Kuten kuviossa 5D, kohdunulkoinen HIPK2 saattoi silti fosforyloimaan MBP käsittelyjen jälkeen, mikä viittaa siihen, että hypoksia todennäköisesti ei vaikuta HIPK2 katalyyttistä aktiivisuutta, ainakin meidän koeolosuhteissa.

(A, vasen paneeli) aliyhtyvät RKO soluja altistettiin CoCl

2 ja ZnCl

2 yksinään tai yhdessä 16 tuntia, ja sama määrä koko solu- uutteiden analysoitiin immunoblottaus erityisiä vasta-aineella, joka esittää endogeenistä HIPK2 tasolla. Anti-tubuliinia käytettiin proteiini latauskontrollina (oikea paneeli). Sama määrä tumauutteita ja RKO-solujen käsiteltiin kuten edellä, analysoitiin Western immunoblottaus spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi HIF-1α tasoilla. Anti-Hsp70 käytettiin proteiini latauskontrollina. (B) RKO-solujen käsiteltiin kuten (A) hajotettiin ydin- ja sytoplasman fraktiointi ja analysoitiin Western-immunoblottaus käyttäen anti-HIPK2 vasta-aine. Anti-tubuliinia ja anti-NFYB vasta-aineita käytettiin Proteiinilisäyksen valvonta soluliman ja ydinvoiman jakeet, vastaavasti. (C) RKO ja A549-soluja käsiteltiin 2% O

2: n läsnä tai poissa ollessa sinkkiä 16 h, ja vastaava määrä ydin- solu-uutteiden analysoitiin Western-immunoblottauksella spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi HIF-1α ja HIPK2 ydin- tasot . Anti-Hsp70 käytettiin proteiini latauskontrollina. (D) kinaasimääritys ektooppisen HIPK2 293-soluissa, jotka on transfektoitu Flag tyhjä tai HIPK2-Flag ekspressiovektoriin jätetään hoitamatta tai hoidettiin koboltin tai sinkin 16 tuntia. Sama määrä koko solu-uutteet immunosaostettiin käyttäen anti-Flag-vasta-aineen ja määritettiin kinaasiaktiivisuuden käyttäen MBP substraattina. Equal ilmentyminen MBP-proteiinin varmistettiin comassie-värjäys kinaasianalyysiä. (E) Kromatiini immunosaostuksella (chip) analyysi suoritettiin anti-HIPK2 vasta-aineella RKO soluja käsiteltiin kuten (A). PCR-analyysit suoritettiin immunosaostettiin DNA-näytteille käyttämällä spesifisiä alukkeita ihmisen

HIF-1α

promoottori. Monistaminen

GAPDH

promoottori (oikea paneeli) käytettiin valvonta HIPK2 sitovan spesifisyyden

HIF-1α

promoottori Näyte edustaa lineaarisen vahvistuksen koko panos chromatin (Input) otettiin mukaan ohjaus. Lisätarkastuksia mukana immunosaostus suoritettiin epäspesifinen immunoglobuliini (nro Ab). (F, ylempi paneeli), Total mRNA: t olivat käänteistranskriptio alkaen RKO soluista käsiteltiin ZnCl

2 ja CoCl

2 24 tuntia ja ADR 16 h vastaavasti PCR analyysejä HIF-1 kohdegeenien

Bcl2

,

MDR1

, ja

VEGF

. Ratio: ilmaus suhde GAPDH. (F, alempi taso) densitometrisen analyysin geenin ilmentymisen piirrettiin ilmaisun suhteessa GAPDH, käytetään sisäisenä kontrollina. Opiskelijan

t

testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin vertailun arvojen koboltti ja koboltti plus sinkkiä, ja CoCI

2 /ADR ja CoCl

2 /ADR /ZnCl

2 as esitetty. *

P

0,01. (G) RKO solut köyhdytetty HIPK2 toiminnon siHIPK2 hoidettiin ZnCl

2 ja CoCl

2 24 tuntia ja ADR 16 h, vastaavasti ja koko mRNA: t käänteistranskriboitiin PCR analyysejä kuten (F).

vastakohta vaikutukset hypoksia HIPK2 ja HIF-1α tasot ovat yhteydessä toisiinsa repressorin vaikutuksen HIPK2 on

HIF-1α

promoottori. Siten koboltti aiheuttama poistaminen HIPK2 rekrytoinnin päälle

HIF-1α

promoottori voimakkaasti palautunut sinkkiä (kuvio 5E). HIPK2 spesifistä sitoutumista

HIF-1α

promoottori vahvistettiin

GAPDH

promoottori vahvistusta jälkeen kromatiinin immunosaostus anti-p53-vasta-ainetta. Näin ollen RT-PCR-analyysi osoitti, että koboltti-indusoidun

Bcl-2

,

MDR1

ja

VEGF

geenin ilmentyminen merkitsevästi tukahdutettiin sinkki (kuvio 5F, vertaa CoCl

2 kaistaa CoCl

2 /ZnCl

2 kaistaa), kuten myös osoittaa ilmaus suhde GAPDH (kuvio 5F, alempi paneeli). Lisäksi ADR hoito yhdistettynä koboltti ei kyennyt estämään koboltti aiheuttamaa HIF-1-reitin (kuvio 5E, vertaa CoCl

2 kaistaa CoCl

2 /ADR kaistaa) ellei yhdistettynä sinkin (Kuva 5F vertailla CoCl

2 /ADR kaistaa CoCl

2 /ADR /ZnCl

2 kaistaa). Rooli HIPK2 koboltin aiheuttama HIF-1 tavoitteet arvioitiin edelleen seuraavien HIPK2 ehtyminen. Kuten kuvassa 5G, pohjapinta taso

MDR1

ja

Bcl2

geenien ilmentyminen oli jo korkea siHIPK2 soluissa, kanssa edellisessä tuloksia HIPK2 repressorin aktiivisuutta HIF-1α [17 ], [18], eikä sitä voitu tukahdutettu sinkki käsittely (kuvio 5G ja verrata 5F). Sinkki torjua hypoksian tulos oli spesifinen, koska toinen antioksidantti, eli C-vitamiinia, ei ole downmodulate HIF-1 kohdegeenien eikä vaikuta lääkkeen vastetta (tietoja ei esitetä). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että sinkki torjua hypoksian aiheuttamaa HIPK2 downmodulation, talteen HIPK2 rekrytoinnin päälle kromatiinin ja johti tukahduttamisen HIF-1-reitin.

Sinkki parantaa kemoterapeuttisen vaste in vivo

arvioida terapeuttista tehoa yhdistelmän sinkin ja kemoterapia

in vivo

muodostimme tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Sitten hiiriä esikäsitelty ZnCl

2: ssa 8 tuntia, ennen kuin ADR injektiota ja sitten käsiteltiin päivittäin sinkkiä. Hiiret käsiteltiin ADR yksin aikana 2 viikon näkyvissä hidastanut kasvaimen tilavuuden vertailukelpoisella tavalla saaneilla sinkki yksinään (kuvio 6A). Mielenkiintoista, sinkki- merkittävästi parannettu vaikutus ADR johtaa merkittävästi kasvaimen kasvun estämiseen (adriamysiini + sinkki

versus

adriamysiinin:

P

0,01) (kuvio 6A ja 6B). Kasvaimet kerättiin päivänä 18 ja geenin ilmentyminen määritettiin RT-PCR: llä ja densitometrinen analyysit.