Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) edistää kasvaimen kasvua erilaistumaan karsinooma liittyvien fibroblasteja (valuuttalisiin) ja säveltäminen kasvain microenvironment. Kuitenkin mekanismit vastaa siirtymistä MSC: valuuttalisiin ei ymmärretä hyvin. Eksosomit säätelevät solujen toimintaa välittämällä solu-solu viestintä. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, onko syöpäsolu johdettu eksosomeiksi oli mukana säätelyssä erilaistumista ihmisen napanuoran johdettuja MSC: (hucMSCs) valuuttalisiin.

Menetelmät /Principal Havainnot

ensimmäinen osoitti, että mahasyövän soluperäisissä eksosomeiksi indusoi ilmentymistä CAF merkkiaineiden hucMSCs. Sitten osoitettiin, että mahasyövän soluperäisissä eksosomeiksi stimuloi fosforylaation Smad-2 in hucMSCs. Olemme edelleen vahvisti, että TGF-β-reseptorin 1 estäjä heikennettyjä Smad-2 fosforylaation ja CAF merkki ilmaisun hucMSCs altistuksen jälkeen mahasyövän soluista peräisin eksosomeiksi.

Päätelmä /merkitys

tulokset viittaavat että mahalaukun syöpäsolut laukaisi erilaistumista hucMSCs valuuttalisiin by eksosomeiksi välittämä TGF-β siirto ja TGF-β /Smad reitin aktivaatio, joka voi edustaa uutta mekanismia MSC: valuuttalisiin siirtyminen syövässä.

Citation: Gu J, Qian H, Shen L, Zhang X, Zhu W, Huang L, et al. (2012) mahasyövän Eksosomit Trigger erilaistuminen napanuoran johdettujen mesenkymaalisten kantasolujen ja karsinooma-Associated Sidekudosmuodostussolujen avulla TGF-β /Smad Pathway. PLoS ONE 7 (12): e52465. doi: 10,1371 /journal.pone.0052465

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 kesäkuu 2012; Hyväksytty 13 marraskuuta 2012 Julkaistu: 20 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Gu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Major Tutkimussuunnitelma National Natural Science Foundation of China (Grant no. 91129718), National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81071421, 31140063), Jiangsun maakunnan tieteellistä ja teknologista tukeminen Program (Grant no. BE2010703 ), 333 projekti Jiangsun maakunnassa (Grant no. 2009055) ja Sci-Tech Innovation Team ja Talents Jiangsu University (Grant no. 2008-018-02). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kasvaimen solut alkavat muovata niiden mikroympäristölle varhaisessa vaiheessa pahanlaatuisten etenemisen [1]. Laajat raportit ovat osoittaneet laajaa vuorovaikutukset kasvain microenvironment ja syöpäsolujen, jotka ovat kriittisiä kasvaimien synnyn ja syövän etenemistä [2], [3]. Kasvain microenvironment voisi saada palautuvia muutoksia fenotyypin syöpäsolujen ja helpottaa sen metastaaseja [4], ja muutokset kasvaimen microenvironment jopa dramaattisesti vaikuttaa tehoon syövän hoidossa. Kasvaimen mikroympäris- muodostuu monentyyppisiä soluja, mukaan lukien syöpä, liittyy fibroblastien (valuuttalisiin), infiltroituvat immuunisolut, veri- ja imusuonten verisuonten verkkoja, ja mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) [4], [5].

valuuttalisiin ovat keskeisiä vaikuttavista tekijöistä pahanlaatuinen eteneminen syövän kasvua, verisuonten muodostumista, ja etäpesäkkeitä. Valuuttalisiin ilmentävien fibroblastien aktivoiva proteiini (FAP) ja α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) voisi luoda markkinarako syöpäsoluja ja edistää niiden liikkuvuutta [6], [7]. Todellakin, valuuttalisiin läpikäyvät erilaistumista prosessi indusoitu kasvainsolujen ja kehittää invasiivinen ja vaeltavia kyvyt [8], [9].

Mesenkymaaliset kantasolut ovat multipotentteja soluja, jotka voidaan eristää erilaisia ​​kudoksia, mukaan lukien luun luuydin, rasvakudoksessa, nivelkalvon, luurankolihas, maksa, napanuoraverestä, istukka, ja napanuoran [10] – [13]. MSC: t voidaan indusoida erilaistumaan osteosyyteiksi, rasvasolut, kondrosyyttien ja lihassolujen, koska niiden regeneratiivista kyky ja multipotenteista kapasiteetti [14]. MSC: koti ja hengissä sivustoja tulehduksen ja vahinkoa sekä kasvaimia, edistää muodostumista kasvaimeen liittyvien strooman [15]. Tutkimukset ovat vahvistaneet, että MSC: t voivat erilaistua myofibroblasteja, karsinooma liittyvä fibroblasteja, fibrosyyttien tai perisyyteissä alla kasvaimen microenvironment olosuhteet [6], [16], [17]. Aiemmissa tutkimuksissa olemme osoittaneet, että luuytimen MSC: ja niistä eksosomeiksi voisi edistää kasvaimen kasvua [18], [19]. Kuitenkin mekanismi vastuussa tästä vaikutus jää suurelta osin tuntemattomia.

Tuumorisolut vuorovaikutuksessa kasvaimen mikroympäris- solu-solu-vuorovaikutuksen ja parakriinisten mekanismien, kuten tuottaa erilaisia ​​kasvutekijöitä, kemokiinit, ja matriisi hajottavia entsyymejä, jotka parantavat leviämisen ja invaasion kasvain [20]. Lisäksi tunnetaan järjestelmiä, uudella mekanismilla, että kasvaimen solut voivat aktiivisesti vapauttaa eksosomeiksi on syntymässä. Eksosomit on erityinen koostumus re fl ecting niiden alkuperä ja voi siirtää paitsi kalvokomponentit vaan myös nukleiinihappo eri solujen välillä [21], [22], korostamalla niiden roolia solujen väliseen viestintään [23]. Kertyvät näyttö on osoittanut osuutta eksosomeiksi matkapuhelinverkkoon tila viestinnän, mikä johtaa solujen väliseen siirtoon molekyylien [24]. Vaikka sääntelyn roolia eksosomeiksi immuunijärjestelmän ja niiden soveltamista rokote syövän immunoterapiassa on lupaava [25] – [28], lopputulos seuraavat vuorovaikutusta syövän eksosomeiksi ja stroomasolujen ei ole oikein ymmärretty.

Pahanlaatuinen solut siirtyvät MSC: t valuuttalisiin että myötävaikuttaa kasvaimen etenemistä on kannustanut tutkimaan mahdollisia mekanismeja sen siirtyminen. Tutkimukset ovat osoittaneet, että vähintään 20%: valuuttalisiin peräisin luuytimestä ja ovat peräisin mesenkymaaliset kantasolut hiirimalleissa in fl tulehdus aiheuttaman mahalaukun syöpä [16]. Oletimme, että syöpäsolut kommunikoivat MSC: t läpi julkaisun eksosomeiksi ja siirto proteiinien, siis indusoimaan erilaistumista MSC: valuuttalisiin. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että MSC: hankki CAF fenotyyppi altistuneella syöpään johdettuja eksosomeiksi ja erilaistumista MSC: valuuttalisiin liittyi TGF-β /Smad signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen napanuoran MSC: saatiin aikaisemmin kuvatulla [12], [29]. Tuore napanuorasta kerättiin ilmoitettiin, hyväksyin äitien ja käsiteltyinä 6 tuntia. Johdot huuhdottiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), penisilliinin ja streptomysiiniä, ja sitten ne poistettiin johto aluksia. Pestyt johdot leikattiin paloiksi 1-3 mm

2 kokoinen ja kellui DMEM, joka sisälsi 10% FBS (Invitrogen, USA), 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä. Palaset johto viljeltiin sen jälkeen 37 ° C: ssa kosteassa ilmassa 5% CO

2 ja väliaine vaihdettiin joka 3. päivän kuluttua alkuperäisestä pinnoitus. Kun hyvin kehittynyt pesäkkeitä fibroblastien kaltaisten solujen saavutti 80% konfluenssiin, viljelmiä käsiteltiin trypsiinillä ja ne siirrettiin uusiin pulloihin lisäkasvulle. Ominaisuudet eristetty hucMSCs, kuten morfologisia ulkonäkö, pinta-antigeenejä, erilaistumisen potentiaalin ja geenien ilmentymistä tutkittiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Kaikki koe protokollat ​​hyväksyttiin eettisen komitean Jiangsu University. HucMSCs kanavasta 2 valittiin kokeisiin. Ihmisen mahalaukun syöpäsolujen (SGC7901 ja HGC27) ostettiin Cell Bank, Type Culture Collection komitea (Chinese Academy of Sciences). Mahalaukun epiteelisolut (GES-1) hankittiin Cwbiotech Company ja pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää.

eksosomi eristäminen ja puhdistaminen

SGC7901, HGC27 ja mahalaukun epiteelisolujen (GES-1 ) johdettu eksosomeiksi eristettiin ja puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [30], [31]. Lyhyesti, soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10%: eksosomi-köyhdytettyä naudan sikiön seerumia. Fetaalinaudan eksosomeiksi poistettiin yön yli ultrasentrifugoimalla 100000 g 16 tuntia käyttäen tyypin 90 Ti kiinteän Angel roottori (Optima L-90K, Beckman Coulter). Supernatantit konfluentteja viljelmiä (3-5 päivää), sentrifugoitiin 2000 g: ssä 20 min solujen ja jätteiden poistamiseksi. Ja selkeytetty supernatantti konsentroitiin ultrasuodatuksella läpi 100 kDa: n MWCO ontelokuitukalvoja (Millipore) 1000 g: ssa 30 minuutin ajan. Konsentroitu supernatantti ladattiin sentrifugiputkiin (Beckman) ja underlayed 30% sakkaroosi /D

2O tiheys tyyny (5 ml), joka muodostaa näkyvän välifaasi ja ultrasentrifugoitiin 100,000 g ja 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan SW-32Ti svengaava-roottorilla (Optima L-90K, Beckman Coulter). Sitten molemmat eksosomeiksi sakkaroosia tiheys tyynyt (fraktio 3) kerättiin -ultrasentrifugissa putkien pohjaan ja nonbanded fraktiot (fraktio 6 ja 7), jotka sisältävät nonmembrane proteiini-kompleksit kerättiin käytettäviksi eksosomeiksi ohjaus (E-kontrolli) yhdistettiin ja pestiin kolme kertaa läpi 100-kDa: n pienoiskoossa onttoja kuituja kasetin (Millipore) 1000 g: ssa 30 minuutin ajan, kuten edellä on kuvattu. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen BCA-määritystä (Pierce). Eksosomeiksi steriloitiin 0,22 um: n kapseli suodattimen (Millipore) ja säilytetään -70 ° C: ssa käyttöön asti [30].

Elektronimikroskopian

pisara eksosomeiksi (noin 20 ui) saatua sen jälkeen, kun ero ultrasentrifugoinnin pipetoitiin formvar hiilellä päällystetty runkoverkkojen ja annetaan seistä 1 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Poistamisen jälkeen ylimääräinen neste pala suodattimen näyte värjättiin 2% (w /v) fosfovolframihappoa (pH 6,8) 5 minuutin ajan ja kuivattiin ilmassa mukaisesti sähköinen hehkulamppu, ja analysoitiin transmissioelektronimikroskoopilla (FEI Tecnai 12, Philips).

Eksosomit nimeäminen ja sisäistäminen

SGC7901 solut peräisin eksosomeiksi ja eksosomeiksi määräysvalta leimattiin CM-Dil (punainen) mukaan valmistajan protokollan (Invitrogen). Eksosomeiksi alkaen GES-1-soluja käytettiin solu-ohjaus. Leimattu eksosomi suspensio suodatetaan 100-kDa: n MWCO ontelokuitukalvoja (Millipore) ja läpivirtaus käytettiin sitoutumattoman väriaineen ohjaus. HucMSCs (1 x 10

4 /kuoppa) siirrostettiin 12-kuoppaisille maljoille, jotka sisältävät lamellien ja inkuboitiin 37 ° C: ssa leimatun eksosomeiksi (800 ug /ml) 4 tunnin ajan ennen sadonkorjuuta.

immunofluoresenssivärjäyksellä

HucMSCs fiksoitiin 4% paraformaldehydillä 10 min. Leimattuja soluja valmistettiin fluoresenssimikroskopian mukaan per-liikkeelle 3 minuutin ajan 0,1% Triton-X100, blokattiin 5% BSA: ta ja inkuboitiin kanin monoklonaalista anti-β-aktiini-vasta-ainetta yli yön, jonka jälkeen inkuboitiin Cy 2-leimatun anti-kanin IgG: tä sekundaarinen vasta-aine 37 ° C: ssa 45 min (Jackson Immuno-). Tumat vastavärjättiin DAPI. Konfokaaliset kuvat oli peräkkäin hankittu TCS SP5 II -järjestelmän (Leica) [32].

CAF eriyttäminen

HucMSCs ympättiin 6-kuoppaisille levyille (5 x 10

3 /kuoppa) . Kaksitoista tuntia ymppäyksen jälkeen, hucMSCs käsiteltiin eksosomeiksi (800 ug /ml) käynnistää CAF erilaistumista läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF-β-reseptorin 1-inhibiittori SD208 (Sigma) tai ihmisen rekombinantti-TGF-β (5 ng /ml; Sigma). Elatusaine vaihdettiin 3 päivän välein 14 päivää. Sitten solut kerättiin ja valmistettiin Western blot ja kvantitatiivisella PCR-analyysillä.

Western-blottaus

solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurilla (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 0,1% SDS: ää, 1 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM PMSF, 1 mg /ml aprotiniinia, 1 mg /ml leupeptiiniä). Alikvootit, jotka sisältävät identtisiä määriä proteiinia fraktioitiin ja siirretään sitten metanoli ennalta aktivoitu PVDF-kalvoille (Millipore, USA). Sen jälkeen kun peräkkäiset inkubaation ensisijaisen ja toissijaisen vasta-signaali visualisoitiin käyttäen HRP-substraattia (Millipore, USA) ja analysoitiin MD Image Quant Software. Lähteet ja laimennuskertoimet ensisijaisen vasta-aineet olivat: kaniinin polyklonaalinen anti-CD9 (1:1000, Bioworld), anti-CD81 (1:1000, Epitomics), anti-TGF-β (1:1000, Bioworld), anti-FAP ( 1:1000, Abcam), hiiren monoklonaalinen anti-α-SMA (1:1000, Santa Cruz), anti-VEGF (1:1000; Santa Cruz) ja anti-vimentiinista (1:2000, Santa Cruz), anti-N -cadherin (1:1,000, Bioworld), anti-E-kadheriini (1:500, SAB), ja hiiren monoklonaalinen anti-GAPDH (1:5000; Kangcheng).

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen), ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä käänteisen transkription kit (Toyobo, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet tuotettu Invitrogen Company (Shanghai, Kiina). Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin havaita muutoksen FAP, a-SMA, N-kadheriinin ja IL-6-geenin ilmentymistä (Rotor-Gene 6000, Australia). Kompensoimiseksi vaihtelut input RNA ja tehokkuutta Käänteistransskription endogeeninen ”taloudenpito” geeni (β-aktiini) oli myös määrälliset normalisoida tuloksia. Kaikki näytteet ajettiin kolmena kappaleena, ja kaikki reaktiot toistettiin 3 kertaa itsenäisesti varmistamiseksi toistettavuutta.

Migration Pitoisuus

HucMSCs (8 x 10

4 200 ui) suspendoitiin seerumin vapaa väliaine ladattiin ylempään osastoon ja 500 ui seerumitonta alustaa (SFM), joka sisälsi 800 ug /ml eksosomeiksi läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF-β-reseptorin 1-inhibiittori SD208 (2 uM) lisättiin pohjaan transwell (Corning). Viljelyn jälkeen 37 ° C: ssa 6 tuntia, solut ylempi kalvo pyyhittiin pumpulipuikolla. Solut, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin kristallivioletilla. Solut tarkkailtiin mikroskoopilla ja vähintään 10 kenttää soluja määritettiin kullekin ryhmälle.

TGF-β neutralointi

HucMSCs käsiteltiin kasvaimen eksosomeiksi (800 ug /ml) laukaisemaan CAF erilaistumista läsnä ollessa tai ilman TGF-β-vasta-ainetta (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Eksosomit karakterisointi ja sisäistäminen

eristetty ja tunnistettu eksosomeiksi perustuu niiden ainutlaatuinen koko ja tiheys. Kuten on esitetty kuviossa. 1A-a esitetään eksosomeiksi oli tunnusomainen lautanen kaltainen muoto rajoittaa lipidikaksoiskerros, joiden halkaisija vaihteli 40-100 nm. Varmistimme runsas ilmentyminen exosomal merkkiaineiden CD9 ja CD81 meidän eristetty eksosomeiksi Western-blottauksella (kuvio. 1A-b). Sen jälkeen meidän aiemmat tutkimukset, ihmisen napanuoran peräisin MSC: valmistettiin ja karakterisoitiin (tietoja ei ole esitetty). Tutkitaan sisäistämisen eksosomeiksi mukaan hucMSCs, leimasimme eksosomeiksi CM-Dil. Kuten kuviossa 1B on esitetty, SGC7901 saatujen solujen eksosomeiksi hoidettaviksi ja kertynyt hucMSCs inkuboinnin jälkeen 4 tuntia samalla eksosomeiksi ohjaus osoitti vähäinen vaikutus. Verrattuna SGC7901 ryhmä, vähemmän GES-1 peräisin eksosomeiksi otettiin ylös hucMSCs.

. Morfologia eksosomeiksi ja exosomal merkki ilme. (A) morfologinen analyysi mahasyövän johdettujen eksosomeiksi. Asteikko bar = 100 nm. (B) CD9 ja CD81 ilmaisun eksosomeiksi. B. Eksosomit olivat imeytymiskertoimeksi mukaan hucMSCs. Eksosomeiksi merkitty CM-Dil (punainen) 37 ° C: ssa 1 h, lisättiin osaksi hucMSCs ja inkuboitiin 4 tuntia. Jäteveden suodatetusta suspensioon CM-Dil-leimattuja eksosomeiksi (kontrolli) ja CM-Dil-leimattuja poistetaan eksosomeiksi osa (e-exos) käytettiin kontrolleina. Solut kiinnitettiin ja värjättiin solulimassa (CY2-aktiini, vihreä) ja ytimet (DAPI, sininen). Asteikko bar = 20 pm.

Kasvainperäinen Eksosomit edistää hucMSCs eriyttäminen valuuttalisiin

Oletimme, että kasvain- eksosomeiksi saattaisi aiheuttaa erilaistumista hucMSCs valuuttalisiin

in vitro

. Valuuttalisiin määriteltiin lisääntyneen ilmentymisen FAP ja α-SMA-proteiineja. HucMSCs yksikerroksista viljeltiin alustassa, joka sisälsi 800 ug /ml SGC7901 eksosomeiksi ja GES-1 eksosomeiksi. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit osoittivat, että SGC7901 eksosomeiksi muttei GES-1-eksosomeiksi edisti ilmentymistä CAF merkkiaineiden MSC-36 h (Fig. 2A) ja 14 d (Fig. 2B) induktion jälkeen, tässä järjestyksessä. Verrattuna käsittelemättömän ryhmän, kasvaimen eksosomeiksi hoito johti kasvaa FAP, α-SMA, N-kadheriinin, ja vimentiinin proteiinin tasot (Fig. 2C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että hucMSCs läpikäyvät CAF erilaistumista vasteena kasvaimen eksosomeiksi altistumista.

A.Quantitative analyysit FAP, IL-6 ja α-SMA-mRNA: n ekspression hucMSCs. HucMSCs käsiteltiin eri pitoisuuksilla SGC7901 eksosomeiksi tai GES-1 eksosomeiksi 36 tuntia. B. kvantitatiivinen analyysit FAP, IL-6 ja N-kadheriiniekspressiota in hucMSCs. HucMSCs käsiteltiin eri pitoisuuksilla SGC7901 eksosomeiksi tai GES-1 eksosomeiksi varten 14 päivää. C. Western blotting-analyysit FAP, α-SMA, N-kadheriini ja vimentiinin proteiinin ilmentyminen hucMSCs käsiteltiin SGC7901 eksosomeiksi (800 ug /ml) eri aikoina. (A-d) tiheys analyysi Western blotting bändejä. * P 0,05 ja # P 0,01, verrattuna suhteellisen kontrolliryhmään (n = 3).

Kasvainperäinen Eksosomit edistää hucMSCs Migration

Sen analysoimiseksi, onko leviämiskyky of hucMSCs vaikuttivat kasvain eksosomeiksi, hucMSCs viljeltiin Transvvell- ja indusoitu siirtymään kasvain eksosomeiksi. Kuten on esitetty kuvioissa 3A ja 3B, 6 tunnin inkubaation jälkeen, kasvaimen eksosomeiksi edistänyt migraatio hucMSCs tehokkaammin kuin normaalien solujen peräisin eksosomeiksi. Osoitimme myös, että lisääntynyt maahanmuutto hucMSCs kasvaimen eksosomeiksi esti samanaikainen hoito TGF-β R1 estäjä, SD208. Lisäksi tutkimme vaikutus SGC7901 eksosomeiksi siirtyvien hucMSCs käyttämällä scratch määritystä. Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​kuin siirtokuoppaan migraatiokokeessa, osoittaa alentuneen aukon etäisyyttä kasvain eksosomi saaneessa ryhmässä (kuvio. S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kasvain eksosomeiksi voi edistää muuttoa hucMSCs

in vitro

.

. HucMSCs hoidettiin mahalaukun syövän solujen tai normaalin mahalaukun epiteelisolujen peräisin eksosomeiksi (800 ug /ml) läsnä ollessa tai puuttuessa SD208 (2 uM) 6 tuntia. TranswellTM migraatiokokeessa suoritettiin analysoida leviämiskyky solujen. B. lukumäärä siirtynyt solujen edellä arvioitiin. Nämä kokeet toistettiin kolme kertaa. * P 0,05 ja # P 0,01, n = 3. Mittakaava = 50 pm.

Kasvainperäinen Eksosomit Aktivoi Smad2 /3 ja p38 vuonna hucMSCs

TGF-β on osoitettu olevan läsnä pinnalla eksosomeiksi [33] ja kriittinen CAF erilaistumista. Sitten tutkittiin, onko TGF-β-reitin oli vastuussa induktion MSC: siirtymisen valuuttalisiin kasvaimen eksosomeiksi. Ensin osoitti läsnä TGF-β kasvaimen eksosomeiksi (Fig. 4A). Verrattuna kasvain eksosomeiksi, normaali solu peräisin eksosomeiksi osoitti alempaa TGF-β ilme. Sen arvioimiseksi, onko erilaistumista hucMSCs valuuttalisiin liittyy TGF-β-reitin aktivaatio, tutkimme tilan fosforyloidun Smad 2/3 kuluttua kasvaimen eksosomeiksi hoidon. Tulokset osoittivat, että Smad 2/3 fosforylaatio korotettiin kasvain eksosomeiksi 15 min jälkikäsittely ja saavutti korkeimman tason 60 min jälkikäsittelyä, kun koko Smad 2/3 proteiinin tasot eivät vaikuttaneet. Olemme myös päättäneet tason fosforyloidun p38 ja totesi, että p38 fosforylaatio kasvattivat myös kasvaimen eksosomeiksi (Fig. 4B). Sen sijaan, GES-1 johdettu eksosomeiksi voinut aktivoida Smad2 /3 ja p38 (Fig. 4C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kasvain eksosomeiksi nimenomaan aktivoida Smad2 /3 ja p38 vuonna hucMSCs.

. Western blotting-analyysit TGF-β ilmentyminen mahalaukun syöpäsolun (SGC7901) ja normaalin mahalaukun epiteelisolujen (GES-1) peräisin eksosomeiksi. B. HucMSCs käsiteltiin SGC7901 johdettu eksosomeiksi (800 ug /ml) eri aikoina, kuten on ilmoitettu. Tasot p-Smad2 /3, t-Smad2 /3, p-p38and t-p38 analysoitiin Western-blottauksella. TGF-β toimi positiivisena kontrollina. C. HucMSCs käsiteltiin GES-1 peräisin eksosomeiksi (800 ug /ml) eri aikoina, kuten on ilmoitettu. Tasot p-Smad2 /3, t-Smad2 /3, s-p38 ja t-p38 analysoitiin Western-blottauksella.

TGF-β Pathway inhibitio Blocks Kasvaimen Eksosomit aiheuttama Smad2 /3 ja p38 aktivointi

Osoittaakseen, onko aktivointi Smad2 /3 ja p38 on spesifinen TGF-β signalointi laukaisee kasvain eksosomeiksi, me tukossa TGF-β signalointireitistä TGF-β R1inhibitor ja havaita tasot fosforyloitua Smad2 /3 ja p38. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, lisääntynyt fosforylaatiota Smad2 /3: n ja p38 kasvaimen eksosomeiksi hoidon purettiin TGF-β R1 estäjä, SD208, annoksesta riippuvalla tavalla. Edelleen osoittaa TGF-β kasvaimen eksosomeiksi joka aktivoi hucMSCs, me neutraloida TGF-β kasvaimen eksosomeiksi käyttäen anti-TGF-β-aine. Vastaa tuloksia, TGF-β R1 estäjä, lisääntynyt fosforylaatiota Smad2 /3 ja p38 hucMSCs myös kääntyi TGF-β-vasta-ainetta (kuvio. 5B). Yhteenvetona, nämä tiedot viittaavat siihen, että TGF-β kasvaimen eksosomeiksi vuorovaikutuksessa TGF-β-reseptorin hucMSCs, mikä peräkkäisen aktivoinnin Smad2 /3: n ja p38 on hucMSCs.

. HucMSCs käsiteltiin SGC7901 johdettu eksosomeiksi (800 ug /ml) läsnä ollessa tai puuttuessa SD208 (2 uM) 1 tunti. Tasot fosforyloitu Smad2 ja p38 tutkittiin Western-blottauksella. B. Mahalaukun syöpäsolun (SGC7901) johdettu eksosomeiksi esi-inkuboitiin anti-TGF-β-vasta-ainetta (20 ug /ml) 2 h, ja lisättiin sitten hucMSCs. Kuusi tuntia myöhemmin solut otettiin talteen ja tasot fosforyloitua Smad2 ja p38-proteiinit tutkittiin Western-blottauksella.

TGF-β Pathway inhibitio Kääntää Kasvaimen Eksosomit aiheuttama hucMSCs Differentiation valuuttalisiin

osoittaa TGF-β /TGF-β R1 vuorovaikutus on vastuussa erilaistumisen hucMSCs valuuttalisiin aiheuttama kasvain eksosomeiksi, me estetty TGF-β signalointia SD208 ja TGF-β neutralointi vasta-aineella, jota seuraa kasvaimen eksosomeiksi hoitoon. Kuten on esitetty kuvassa 6A-a-hoito SD208 (2 uM) ja 14 päivää voimakkaasti päinvastaiseksi kasvaimen eksosomeiksi indusoima CAF markkereita, mukaan lukien FAP, α-SMA, N-kadheriinin ja vimentiinin in hucMSCs. Meillä on myös vahvistanut tämän vaikutuksen käyttämällä eksosomeiksi peräisin HGC-27 mahasyövän soluja (Fig. 6A-b). Lisäksi, hoito anti-TGF-β-vasta-aine johti samanlaisia ​​vaikutuksia on havaittu TGF-β R1 estäjä (Fig. 6B). Yhteenvetona, nämä tiedot osoittavat, että kasvaimen eksosomeiksi välittävät erilaistumista hucMSCs valuuttalisiin kautta TGF-β /Smad-signalointireitin.

. HucMSCs hoidettiin mahalaukun syövän soluista peräisin eksosomeiksi läsnä ollessa tai poissa ollessa SD208 (2 uM) ja 2 viikkoa. Ilmaisu FAP, α-SMA, vimentiinistä ja N-kadheriinin proteiineja määritettiin Western blotting. (A) SGC7901; (B) HGC27. B. HucMSCs hoidettiin mahalaukun syövän solujen (SGC7901) johdettu eksosomeiksi läsnä ollessa tai poissa ollessa TGF-β-vasta-ainetta (20 ug /ml) 2 viikon ajan. Kaniinin lgG: tä käytettiin kontrollina. Ilmaisu FAP ja α-SMA proteiineja määritettiin Western blottauksella.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet uuden mekanismin, jolla tuumorisolut indusoivat erilaistumista MSC: valuuttalisiin. Tuloksemme osoittavat, että: (1) mahasyöpä soluista saatu eksosomeiksi sisäistetään mukaan hucMSCs; (2) mahasyöpä soluista saatu eksosomeiksi laukaista hucMSCs erilaistumista valuuttalisiin ja (3) TGF-β /Smad reitin välittää siirtymistä hucMSCs valuuttalisiin. Tuloksemme viittaavat siihen, että TGF-β kasvaimen eksosomeiksi voivat olla vuorovaikutuksessa TGF-β R1 on hucMSCs, jolloin aktivointi Smad väylän hucMSCs ja myöhemmin erilaistumista hucMSCs valuuttalisiin.

Vaikka on raportoitu että kasvain eksosomeiksi voi parantaa metastaattisen aktiivisuuden kasvainsoluihin [34], rooli kasvaimen eksosomeiksi MSC-ei ole vielä paljastettu. Meidän havainnot osoittavat, että kasvaimen solut voivat säädellä liikkuvuutta MSC viittaa siihen, että kasvainsolut voivat rekrytoida MSC: t luuytimestä tai muiden kudosten kasvain mikroympäristöä by eksosomi välittyvä mekanismi.

Altistuminen kasvain eksosomeiksi kasvattaa ilmaus CAF markkereita MSC-, mikä viittaa siihen, että kasvaimen eksosomeiksi indusoi kytkin fenotyypin välillä MSC: valuuttalisiin. Vaikka tämä paperi oli valmisteilla, Cho et al. kertoi, että eksosomeiksi rinta- ja munasarjasyövän solujen voisi aiheuttaa rasvakudoksesta peräisin MSC: hankkia fysiologisten ja toiminnalliset ominaisuudet kasvaimeen tukevien myofibroblasteja [35], [36]. Työmme on sopusoinnussa niiden havaintoja ja lisäksi osoittaa, että tämä prosessi on Smad-riippuvainen.

Nykyisessä tutkimuksessa, esitämme näyttöä siitä, että kasvaimen eksosomeiksi tarjoavat tehokkaan alustan siirto erityisviestien MSC, edistämällä MSC-CAF siirtyminen. Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TGF-β ilmaistaan ​​syövän soluista peräisin eksosomeiksi ja tässä muodossa TGF-β on biologisesti aktiivinen ajo Smad-riippuvaisen signaloinnin [33], [37]. TGF-β on keskeinen säätelijä kantasolujen uudistamista ja erilaistuminen [38]. Varmistimme läsnäolo TGF-β mahasyövän soluista peräisin eksosomeiksi ja vahvisti TGF-β /TGF-β R1 vuorovaikutus välitti Smad2 /3 aktivointi ja CAF erilaistumista hucMSCs.

On osoitettu, että MSC: voisi edistää syövän etäpesäkkeiden [4], [39]. Olemme myös raportoitu, että ihmisen MSC johdetut väliaine ja eksosomeiksi parantaa verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ilmentymistä tuumorisoluissa ja edistää kasvaimen kasvua

in vivo

[18], [19]. Olipa eksosomeiksi välillä MSC: voisi olla rooli syövän etäpesäkkeitä ei ole käsitelty. Olemme havainneet, että MSC: eksosomeiksi edistävät epiteelin-to-mesenchyme siirtyminen (EMT) mahalaukun syöpäsoluja, mutta taustalla olevien mekanismien vielä tutkittava tulevaisuudessa tutkimuksissa.

Yhteenvetona osoitamme tässä tutkimuksessa että mahasyövän soluista saatu eksosomeiksi on kyky indusoida erilaistumista MSC: valuuttalisiin ja TGF-β /Smad reitin kasvaimen eksosomeiksi edistää siirtymistä MSC: valuuttalisiin. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy uusi mekanismi, jolla kasvainsolujen aiheuttaa MSC: t erilaistua kasvainten stroomasoluissa ja osallistua muodostumiseen kasvaimen mikroympäristön.

tukeminen Information

Kuva S1.

Mahalaukun syöpäsolun peräisin eksosomeiksi edistää hucMSCs muuttoliikettä. HucMSCs hoidettiin mahalaukun syövän solujen (SGC7901) johdettu eksosomeiksi (800 ug /ml). Scratch array suoritettiin analysoida muuttoliikkeen kyky solujen. (A-c) Käsittelemätöntä hucMSCs; (D-f) SGC7901-eksosomeiksi käsitelty hucMSCs. Asteikko bar = 50 pm.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0052465.s001

(TIF) B