Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää biologisia vaikutuksia uusien meren alkaloidi analoginen 7- (4-fluoribentsyyliamino) -1,3,4,8-tetrahydropyrrolo [4,3,2-de] kinolin-8 (1 H) -onia (FBA-TPQ) ihmisen munasarjan syöpäsolujen sen anti-kasvain potentiaalia ja taustalla olevien mekanismien uutena kemoterapeuttinen aine. Ihmisen munasarjasyöpä soluja (A2780 ja OVCAR-3), ja Immortalisoidut ei-tuumorigeeniset ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolut (menettää tavallisesti-144), altistettiin FBA-TPQ alustavia sytotoksisuuden arviointi kautta (MTS-määritys kit, Promega). Yksityiskohtaiset

in vitro

(solutasolla) ja

in vivo

(eläinmallissa) tutkimuksia antituumorivaikutuksia ja mahdolliset taustalla toimintamekanismit yhdisteiden jälkeen suoritettiin. FBA-TPQ kohdistama voimakas sytotoksisuus ihmisen munasarjasyöpä A2780 ja OVCAR-3 solujen tehokkaana estäjänä solujen kasvua ja lisääntymistä, kun taas kohdistaa vähemmän vaikutuksia kuin tuumorigeeniset menettää tavallisesti-144 soluja. Lisätutkimuksia herkempi OVCAR-3 solulinja osoitti, että se voi voimakkaasti aiheuttaa solujen apoptoosin (anneksiini V-FITC-analyysi), G2 /M solusyklin pysähtymiseen (PI värjäys analyysi) ja myös annosriippuvaisesti estävät OVCAR-3 ksenograftikasvaimissa ’ kasvu naisten atyymisissä karvattomia hiiriä (BALB /c, nu /nu). Mekaaniset tutkimukset (molemmat

in vitro

ja

in vivo

) paljasti, että FBA-TPQ voisi käyttää sen toiminnan kautta reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) -associated aktivoitumista kuoleman reseptorin, p53-MDM2, ja PI3K-Akt väyliä OVCAR-3 soluja, mikä on sopusoinnussa

in vitro

microarray (ihmisen genomi mikrosiruja, Agilent) data-analyysi (GEO hakunumero: GSE25317). Lopuksi FBA-TPQ osoittaa merkittävää syövän vastaista aktiivisuutta vastaan ​​munasarjasyöpäsoluja, minimaalisella myrkyllisyys ei-tuumorigeeniset ihmisen menettää tavallisesti-144 soluja, mikä osoittaa, että se voi olla potentiaalinen terapeuttinen aine munasarjasyöpä.

Citation: Chen T, Xu Y, Guo H, Liu Y, Hu P, Yang X, et al. (2011) Kokeellinen hoito Munasarjojen Cancer kanssa Synteettinen Makaluvamine Analoginen:

In vitro

ja

In vivo

syövän vastaista aktiivisuutta ja Molecular vaikutusmekanismeja. PLoS ONE 6 (6): e20729. doi: 10,1371 /journal.pone.0020729

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 marraskuu 2010; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2011; Julkaistu: 06 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Sata Talents ohjelma Kiinan tiedeakatemia, National Nature Science Foundation (30870513, 31070680 ja 91029715), Ministry of Science and Technology of China (2007CB947100), tiede- ja teknologia-komissio Shanghai kunta ( 08391910800, 10391902100), National Science and Technology Major Project ”Key New Drug Creation ja Manufacturing Program” (2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011), tiede- ja teknologia-komissio Xuhui District of Shanghai kunta (RCT201001, CRC2010002), johtaja säätiön INS (20090101), Food Safety Research Center ja Key Laboratory of Nutrition and Metabolism INS, SIBS, CAS. R.Z. tuettiin osittain National Institutes of Health /National Cancer Institute myöntää R01 CA112029 ja R01 CA121211. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä, noin 5 prosenttia naisten syövistä kuolema, on nyt viides yleisin syöpä Yhdysvalloissa naiset [1]. Noin 70% kaikista munasarjasyövän potilailla diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa taudin, mikä johtaa huonoon ennusteeseen [2], [3]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, vaikka 5 vuoden pysyvyys munasarjasyöpä potilaille on merkittävästi parannettu soveltamisen vuoksi onnistuneen leikkauksen ja kehittäminen tai optimointiin tuumorisidistä huumeita, selviytyminen edelleen alhainen, noin 30% [2] – [4]. Näin ollen on kiireellinen tarve kehittää uusia terapeuttisia aineita, joita voidaan käyttää sairauden hoidossa.

Marine organismit ovat runsaasti potentiaalia lyijy-yhdisteet ainutlaatuisia farmakologisia ominaisuuksia [5], [6]. Lukuisat meren luonnon tuotteita uusia molekyylirakenteet ja erilaiset biologiset toiminnot on raportoitu viime vuosikymmeninä [7]. Makaluvamines, luokka meren pyrroloiminoquinone alkaloideja eristetty sienet suvuista

Zyzzya

, on esitetty vaikuttavan

in vitro

ja

in vivo

sytotoksisuutta useita ihmisen syövän solulinjat, ja tämä aktiivisuus johtuu niiden aktiivisuutta topoisomeraasi II: n estäjät [8] – [14]. Useat muut makaluvamines on osoitettu aiheuttavan suoran DNA-vaurion, joka johtaa kasvaimen vastaisen vaikutuksia [6], [15].

Olemme syntetisoitu yli 40 romaani makaluvamine analogit ja arvioitu systemaattisesti niiden syövänvastainen toiminta rintasyöpäsolulinjoissa linjat. Meidän tuloksemme osoittavat, että voimakas makaluvamine analoginen, FBA-TPQ, voi estää kasvaimen kasvua aktivaation kautta tuumorisuppressorien, esto onkogeenien, ja aktivointi DNA-vaurio vaste [6], [16]. Esillä olevassa raportissa laajensimme tutkimuksessa arvioitiin kasvaimen vastaisen toiminnan FBA-TPQ vastaan ​​munasarjasyöpäsoluja ja yrittivät edelleen valaista mahdollisia vaikutusmekanismeja.

Tulokset

in vitro

sytotoksisuutta FBA-TPQ kohteeseen A2780 ja OVCAR-3 soluja ensin arvioitiin käyttämällä MTS määritystä (Promega). A2780 ja OVCAR-3, ja ihmisen munasarja- IOSE144 (Immortalisoidut ei-tuumorigeenisiä Munasarjojen Surface epiteelisolut) solut altistettiin FBA-TPQ (ks. 1A) eri pitoisuuksilla 48 tunnin ajan. Elinkelpoisuuden A2780 ja OVCAR-3-solut merkittävästi vähentynyt, IC

50 1780 nM (A2780) ja 980 nM (OVCAR-3) (Fig. 1 B). Altistuminen FBA-TPQ johti annosriippuvaisia ​​vaikutuksia solujen eloonjäämistä, estämällä A2780 elinkelpoisuus 25,2%, 45,7%, ja 65,8%, samalla kun estetään OVCAR-3 solujen elinkelpoisuuden 33,9%, 56,7%, ja 73,7%, tässä järjestyksessä, että 0,5, 1,0 ja 2,5 uM pitoisuuksina, vastaavasti (kuvio. 1, p 0,05). Sen sijaan IOSE144 solut olivat vähemmän herkkiä FBA-TPQ hoito, jossa IC

50 yli 10 uM (Fig. 1 B, p 0,01). Altistuminen FBA-TPQ laski elinkelpoisuutta menettää tavallisesti-144 solut 2,7%, 7,7%, ja 25,6%, vastaavasti, että 0,5, 1,0 ja 2,5 uM pitoisuuksina (Fig. 1 B), mikä osoittaa, että FBA-TPQ on selektiivinen aktiivisuus munasarjasyöpä soluja. Lisäksi, FBA-TPQ inhiboi A2780 ja OVCAR-3 solujen lisääntymistä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1C ja 1D), kun taas sen anti-proliferatiiviset vaikutukset olivat paljon vähemmän ilmeistä IOSE144 solut käsiteltiin samalla pitoisuudet FBA- TPQ (Fig. 1 E). Itse asiassa, FBA-TPQ esti merkittävästi A2780 ja OVCAR-3 solujen lisääntymistä, jotka alkavat 0,5 uM (Fig. 1 C ja 1 D, p 0,05), kun taas ei ollut merkittävää inhibitiota menettää tavallisesti-144-solujen tahansa pitoisuudet ( enintään 1 uM, Fig. 1 E, p 0,05). Nämä tiedot viittaavat siihen, että FBA-TPQ voi selektiivisesti estävät A2780 ja OVCAR-3 munasarjasyövän solujen kasvua ja lisääntymistä samalla kohdistamalla tehottomampia vaikutukset ei-tuumorigeenisiä IOSE144 soluissa.

, Kemiallinen rakenne ja molekyylikaava FBA-TPQ ; B, Solujen elävyys (MTS) määritys Ihmisen munasarjakarsinoomasolut (A2780 ja OVCAR-3) ja joka ei aiheuttanut kasvaimia OSE soluja (IOSE144) jälkeen 48 tunnin inkubaatio FBA-TPQ; C 0,05 ). Pro-apoptoottiset vaikutukset olivat syvällisempää pitoisuudella 2,5 uM (apoptoottista indeksi nousi noin 600% kontrolliin verrattuna) (Fig. 2B, p 0,01). Lopuksi tuloksemme osoittivat, että FBA-TPQ voi aiheuttaa merkittävää apoptoosin OVCAR-3 solujen annosriippuvaisesti.

, apoptoosi OVCAR-3 soluja käsiteltiin sarja pitoisuuksia FBA-TPQ varten 24 h; B, Tietojen yhteenveto ja analyysi apoptoottisten indeksin (Q1 heijastaa nekroosi, Q2 heijastaa myöhään apoptoosin, Q3 heijastaa terveitä solupopulaation ei vaikuta apoptoosin tai nekroosin kun Q4 heijastaa varhaisen apoptoosin). C, Cell cycle arviointi OVCAR-3 soluja käsiteltiin sarja pitoisuuksia FBA-TPQ 12 h; D, Tietojen analysointi Solujen esitetty prosentuaalinen jakautuminen tietyn vaiheen (*,

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään, **,

p

0,01 verrattuna kontrolliryhmään, vastaavasti ). Tiedot edustavat arvoja vähintään kolmen itsenäisen kokeen samanlaisin tuloksin.

tutki myös FBA-TPQ on vaikutusta solusyklin etenemisen OVCAR-3-soluissa. Tässä määrityksessä me laski FBA-TPQ inkubaatioajan 12 h, jotta vältetään korkean apoptoosin. Kuten kuviossa. 2C ja 2D, kun 12 tunnin hoidon FBA-TPQ indusoi merkittäviä lisäyksiä solujen lukumäärä G

2 /M-vaihe 1500 nM (21,6% lisäys ohjaus, p 0,05) ja 2,5 uM (30,0% lisäys ohjaus, p 0,05) pitoisuuksia. Lisäksi, FBA-TPQ hoito johti myös merkittävään kasvuun solujen määrä S-vaihe on 2,5 uM (Fig. 2D, p 0,05). Kuten koottu kuvioon. 2D, FBA-TPQ aiheutti samanaikaisesti, annoksesta riippuvainen, väheneminen solujen G0 /G1-vaiheeseen (p 0,01). Yhdessä meidän tietojen mukaan estäviä vaikutuksia FBA-TPQ solujen elinkelpoisuus ja kasvu voi liittyä sen apoptoosin induktio ja solusyklin pysähtymisen.

Meidän edellinen työ raportoimme että FBA-TPQ voi käyttää DNA-vaurioita rintasyöpäsoluissa [6]; täällä, me tutkimme, FBA-TPQ voi aiheuttaa solujen ROS stressiä ja aiheuttaa oksidatiivisen vahinkoa DNA munasarjasyöpäsoluja. Tässä kokeessa me laski inkubaatioaika uudelleen 4 h (välttämiseksi ROS vaimennus), kun taas lisäsi sarja pitoisuuksia 0, 1,0, 2,0 ja 3,0 uM (tuottamaan nopeasti ROS induktion tarttumalla kuva). Kuten on esitetty kuviossa. 3A ja 3B, kun 4 tunnin inkubaation, FBA-TPQ indusoi merkittävän (p 0,05) annosriippuvaista lisäystä solujen ROS tuotannon OVCAR-3-solut (Fig. 3B). Perustuen havaintoon, että FBA-TPQ voisi indusoida apoptoosia, arvioimme mitokondriot transmembraaninen potentiaali (

ΔΨm

) hajoamista indikaattorina mitokondrion kalvon häiriöitä ja solujen apoptoosin. Käyttämällä JC-1 väriaine, havaitsimme, että FBA-TPQ hoito johti merkittävään (p 0,05) annoksesta riippuvainen

ΔΨm

hajoamista (annoksesta riippuvaa väheneminen JC-1 aggregaattien on osoitettu alentunut suhdeluvut punainen /vihreä fluoresenssin intensiteetti) sen jälkeen, kun 24 tunnin altistus (Fig. 4A ja 4B). Yhdessä nämä tulokset antavat näyttöä siitä, että FBA-TPQ indusoi kohonnut solujen ROS tuotanto ja menetys mitokondrioita kalvon potentiaalin aloittamista endogeeninen ROS stressin laukaisema varhaisen solujen apoptoosireitin.

A B, FBA-TPQ indusoi annoksesta -riippuvaista ROS stressi OVCAR-3-solut (A, annosriippuvainen kasvu ROS kuten CM-H

2DCFDA, B, Data tiivistää prosenttiosuus kontrolliin verrattuna). C, Western blot-analyysi solun proteiinin ilmentymisen tasot liittyvät reitin, osoittaa FBA-TPQ voi ottaa vaikutuksia kautta ROS-mukana, ja PI3K-Akt-välitteisen /p53-MDM2 liittyvät soluproliferaation apoptoosin ja solusyklin etenemisen liittyvän reitin on OVCAR-3 munasarjasyövän solulinjoissa kuluttua 24 h altistuksen (at 250750 ja 1000 nM).

A ja B, fluoresenssin intensiteetti (JC-1 tuottaa punaisen fluoresenssin sisällä mitokondriot kuin JC-1 -aggregates taas emittoi vihreää fluoresenssia, kun vuotaa sytoplasmaan JC-1-monomeerit; fluoresenssin intensiteetti siirtyminen vihreän ja punaisen välillä on verrannollinen

ΔΨm

muutos) arvot JC-1 väriaine tiettyinä viritysaallonpituuksia ja vastaava suhde punainen /vihreä muutos (%: n ohjaus) altistumisen jälkeen FBA-TPQ 24 h (*,

p

0,05 verrattuna kontrolliryhmään). C 0,05 verrattuna kontrolliryhmään, **,

p

0,01 verrattuna kontrolliryhmään) ja vastaavat painon muutokset aikana hoitoja (

p

0,05); E, Western-blot-analyysi proteiinien (hiirien ksenograftikasvaimissa jälkeen FBA-TPQ hoitoon 0, 1 tai 10 mg /kg annos) mukana FBA-TPQ laukaisema, ja PI3K-Akt välittämä /p53-MDM2-liittyvä polku.

määritellään tarkemmin vaikutusten FBA-TPQ solujen apoptoosin, solusyklin etenemistä, ja leviämisen, tutkimme ekspressiotason paneelin proteiinien mukana näissä väyliä OVCAR-3 solut (kts. 3C). Sen jälkeen, kun 24-h hoito FBA-TPQ (jossa pitoisuudet 0, 0,25, 0,75 ja 1,0 uM), havaitsimme annoksesta riippuva nousu ekspression cleaved- Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja Caspase- 3, samoin kuin Bax, jossa on samanaikaisesti annoksesta riippuva väheneminen Bcl-2. Tutkimme lisäksi mahdollisia mekanismeja vastuussa antiproliferatiivisia ja solusyklin sääntelyn vaikutuksia FBA-TPQ. Kuten edellä, arvioimme ekspressiotaso eri proteiinien liittyy lisääntymistä ja solusyklin etenemisen, ja havaittiin alas-säätely Cdc25c, CyclinB1 ja sykliiniriippuvaisten Kinase (CDK) 1, jotka ovat vastuussa G2 /M faasimuutoksen, ja havaittu kasvu ekspression Rb, p21 ja p27-proteiineja, samoin kuin lasku E2F1 proteiinia, jotka kaikki ovat mukana solujen lisääntymisen (Fig. 3C). Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että FBA-TPQ voi vähentää ilmentymistä ja aktivointi (merkitty fosforylaatio) Akt, sekä sen ylävirran kinaasia PI3K: n katalyyttisen alayksikön PI3K-110α. Arvioimme lisäksi sääntelyn vaikutuksia FBA-TPQ on p53, ja totesi, että FBA-TPQ aktivoitu p53, ja mukana alas-asetuksen MDM2 ilmaisun (kts. 3C), ja lisääntynyt lohkaisu PARP ja Kaspaasit-3. Nämä havainnot ovat osoitus apoptoosin ja /tai antiproliferatiivinen ja solukierron estäviä vaikutuksia. Kuten osoitettu kuvassa. 3C, myös havaittu annoksesta riippuvaa säätely ylöspäin Fas, mikä osoittaa, että kuolema reseptorin reitin yhdessä p53, voi olla tärkeä rooli vastauksena FBA-TPQ ja sen stimulaation ROS stressiä. Yhdessä voimme päätellä, että FBA-TPQ voi aiheuttaa sen

in vitro

vaikutuksia kautta ROS-liittyvä, ja PI3K-Akt-välitteisen /p53-MDM2 liittyviä solujen lisääntymistä, apoptoosin ja solusyklin etenemisen liittyviä reittejä (Fig. 5).

Olemme perustettu OVCAR-3 -tuumoriksenografti malli arvioimaan

in vivo

antituumorivaikutuksen of FBA-TPQ. Yhdistettä annettiin 5 päivää viikossa i.p. annoksena 1 mg /kg tai 10 mg /kg. Terapeuttisia vaikutuksia arvioitiin tutkimalla tuumorin kasvua. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, FBA-TPQ osoittaa merkitsevä (p 0,01) kasvaimen inhibitiota annoksesta riippuvalla tavalla. Merkittävä kasvaimen kasvua estäviä vaikutuksia alkoi olla selvää yhdeksäntenä hoitopäivänä (p 0,05). Sen jälkeen, kun 18 päivää hoidon, FBA-TPQ johti 20,5% kasvaimen kasvun inhibitio (verrattuna kontrolliryhmään) alempaan 1 mg /kg: n annos, ja 69,4% kasvaimen kasvun inhibitio on suurempi 10 mg /kg: n annoksena (Fig. 4C , p 0,01). Lisäksi vaikka hiiret, jotka saivat 10 mg /kg annoksella lievään menetys painon, ei ollut merkittäviä eroja kehon painon (p 0,05) välillä kolmeen ryhmään, mikä osoittaa, että FBA-TPQ voi olla hyväksyttävä turvallisuusprofiili (Fig. 4D).

validoimiseksi

in vitro

löydöksiä vaikutusmekanismi FBA-TPQ, me arvioitu,

in vivo

ilmentymistason proteiinit tutkittiin viljeltyjen solujen (Fig. 4E). Yhdenmukainen

in vitro

tietoja, proteiinin ilmentymisen kuviot käsiteltiin-ksenograftissa kasvainkudoksen olivat olennaisesti samat kuin solujen havainnot (ks. 3C ja kuvio. 4E), vahvistaa, että kasvaimen vastainen vaikutus FBA-TPQ ovat ainakin osittain välittyvät induktion ROS stressiä ja myöhemmät mitokondrion romahtaa, mikä johtaa muutoksiin solujen cascades, jotka osallistuvat apoptoosiin, solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen.

keskustelu

Tämä tutkimus on ensimmäinen, joka systemaattisesti tutkia uusi synteettinen makaluvamine analogi FBA-TPQ n

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutuksia in munasarjasyöpäsoluja. Olemme osoittaneet, että FBA-TPQ kykenee sen syöpälääkkeen toimintaa A2780 ja OVCAR-3 soluja estämällä solujen kasvua ja lisääntymistä. Edelleen tutkimus käyttö herkempi OVCAR-3 solulinja osoitti, että se voi aiheuttaa apoptoosia ja solusyklin pysähtymiseen. Tällaisia ​​funktionaalisia tuloksia saavutetaan kaskadin reaktioita näissä reittejä, mukaan lukien induktio solun ROS stressi, kuolema-reseptorin aktivoitumisen ja mitokondrioiden romahtaa, ja seuraavassa asetuksessa p53-MDM2 ja PI3K-Akt liittyviä reittejä.

meidän aikaisemmat tutkimukset, osoitimme, että FBA-TPQ on voimakkain makaluvamine analoginen osalta induktion DNA-vaurioita, apoptoosin, solusyklin pysähtymiseen ja lisääntymistä esto rintasyöpäsoluissa [6]. Kuitenkin mahdolliset taustalla olevat mekanismit nämä anti-kasvain toimintaa ja yhdisteen mahdollisen soveltamisen muita syöpätyyppejä ei ole selvitetty. Painopiste nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää FBA-TPQ voisi olla lupaava ehdokas tulevaisuuden syöpälääkettä kehitystä, sekä edelleen selvittämiseksi sen mekanismi (t),.

Alussa havaittu, että FBA- TPQ kykenee merkittävää sytotoksisuutta ja soluproliferaation eston vaikutuksia kohti A2780 ja OVCAR-3-soluissa. Myöhempi arviointi paljasti annoksesta riippuvan vaikutuksen FBA-TPQ on OVCAR-3-solujen apoptoosin, ja solusyklin etenemisen (G2 /M vaiheessa solusyklin pysähtymiseen). Nämä havainnot tukevat myös ilmentymisen profilointiin liittyvien proteiinien OVCAR-3-soluihin käyttäen Western blotting. Yrittäessään tutkia mekanismi (t), taustalla havaitut biologiset toiminnan FBA-TPQ, huomasimme, että FBA-TPQ voi aiheuttaa solujen ROS stressiä ja myöhemmin mitokondrioiden romahdus, joka tarjoaa potentiaalia selitys Cascade käynnistävät

in vitro

syöpää ehkäisevistä vaikutuksista, kuten apoptoosin. Seuraavaksi arvioimme

in vivo

aktiivisuus FBA-TPQ on OVCAR-3 munasarjasyöpä ksenograftimalli, ja osoitti, että FBA-TPQ voidaan jälleen käyttää voimakas kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta, jopa 69,4% kasvaimen kasvun esto at 10 mg /kg: n annos. Olemme systemaattisesti (molemmat

in vitro

ja

in vivo

) arvioinut oleva mekanismi (t) toimien, ja meidän

in vivo

tutkimukset vahvistivat, että FBA-TPQ kykenee sen voimakas anti-kasvain vaikutuksia pääasiassa vaikuttamalla solujen lisääntymisen, joka indusoi apoptoosia ja solusyklin pysähtymiseen.

lohkaisu PARP ja prokaspaasi-3 ovat hyvin dokumentoituja indikaattorit apoptoosin [18], [19]. Jäsenten Bcl-2-perheen, kuten Bcl-2: n ja Bax, tunnetaan kriittinen säätävät vastuussa solujen selviytymistä /apoptoosin [20] – [22]. Olemme osoittaneet annoksesta riippuvan lohkaisu PARP ja prokaspaasi-3, sekä annoksesta riippuva väheneminen Bcl-2 /Bax suhde FBA-TPQ-käsitellyistä soluista ja kasvaimet, jotka osoittavat, että FBA-TPQ indusoi apoptoosia. Perustuu aiemmat tiedot osoittavat, että FBA-TPQ voi toimia DNA vaurioittavan aineen, arvioimme ROS tasolla OVCAR-3 solujen jälkeen FBA-TPQ inkuboinnin kuten hapettumisen (yhdessä metylaatio, depurinaatio ja deamination) aiheuttamaa ROS stressi voi edistävät DNA-vaurioiden [23]. Itse asiassa havaitsimme annoksesta riippuva nousu solujen ROS tasolla, sekä annoksesta riippuvan hajoamista mitokondrion kalvon potentiaalia. Koska mitokondrion kalvon potentiaalin pidetään varhainen tapahtuma apoptoosin [18], [24], voidaan päätellä, että FBA-TPQ laukaisee havaittu apoptoosin OVCAR-3-solujen aiheuttamalla kohonnut solujen ROS, joka johtaa myöhemmin mitokondrion kalvon romahtaa [23], [24].

solut hyödyntävät solusyklin tarkastuspisteiden asianmukaiseksi solusyklin suorittamisen Herkkä jakautuvien solujen mahdollisesti hengenvaarallisten DNA-vaurioita [25], [26]. Solut voidaan pidätettiin G2 /M vaiheessa, jotta tehdään DNA korjaukseen tai apoptoottista solukuolemaa [26], [27]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutuksia FBA-TPQ on solusyklin pysähtymisen seurauksena sen induktio DNA-vaurioita, arvioimme sen ekspression modulaatiolle keskeisten osallistuvien proteiinien G2 /M-signalointia, ja havaitaan annoksesta riippuvainen väheneminen ilmaisun of CDC25C ja CDK1 /sykliini B1, jonka aktivointi ovat avainasemassa G2 /M etenemistä [26], [28], [29]. Tämä vahvistaa, että FBA-TPQ edistää G2 /M pidätys OVCAR-3-soluissa ROS aiheuttamaa vahinkoa.

aktivointi p53 on tärkeä vaikutusmekanismi monien DNA: ta vaurioittavat aineet [6]. Havaitsimme annosriippuvainen lisääntyminen mutantti-p53 ilmentymistä OVCAR-3-solujen, joka on yhdenmukainen edellisessä raportissa, että solut reagoivat FBA-TPQ vahinko riippumatta p53: [6]. Havaitsimme myös down-regulation of MDM2 ja samanaikainen lasku E2F1, ja lisääntynyt ilmentyminen Rb, p21 ja p27 [30], [31], mikä osoittaa, että aktivointi p53-MDM2 takaisinkytkentäsilmukka on todennäköisesti vastuussa FBA- TPQ hoito aiheuttama kasvu apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen ja vähentää solujen kasvun ja lisääntymisen A2780 ja OVCAR-3-soluissa. Akt signalointireitin näyttelee kriittistä roolia säätelyssä solujen eloonjäämistä [32], [33]. Aktivoituminen Akt mukaan PI3K (fosfoinositidi-3-OH-kinaasi) kinaasi voi säädellä transkription tekijöitä, jotka ovat vastuussa pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit, sekä kasvutekijöitä hengissä vasteena solunulkoisten ärsykkeisiin tai vahinkoa [32]. Fosforyloidun Akt (p-Akt) on raportoitu pystyvän estämään p53-riippuvaista apoptoosia ja kasvun hidastuminen fosforyloimalla MDM2 [34]. Tuloksemme osoittivat annoksesta riippuvaa vähenemistä p-Akt (ja t-Akt) ja sen alkupään aktivaattori PI3K (katalyyttinen alayksikkö) ja kasvu Fas (kuoleman reseptori), mikä viittaa siihen, että FBA-TPQ ärsyke -suppresses PI3K-Akt (p-Akt) reitti ja fosforyloi MDM2 säätelemään kasvutekijöiden (E2F1, Rb, p21 ja p27, jne.) tai apoptoottisia (PARP, Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3, jne.) ja solusyklin liittyviä (CDC25C, CDK1 ja sykliini-B1 jne) proteiineja, jolloin yhdisteen jatkuva syöpälääkkeen vaikutuksia.

Kun otetaan huomioon korkea kuolleisuus munasarjasyöpään [1] – [4], on välttämätöntä tutkia uusia aineita, jotka voivat toimia kautta uusia vaikutusmekanismeja parantamiseksi munasarjasyöpä terapiassa. Esillä oleva tutkimus osoittaa, että tehokkain makaluvamine analogi, FBA-TPQ, voi olla uusi ja lupaava anti-munasarjasyövän ainetta, että se voi edullisesti ja estävän tehokkaasti munasarjasyöpä OVCAR-3 solujen (mutta ei ei-tuumorigeenisiä OSE solu) kasvu. Mukaan meidän

in vitro

ja

in vivo

data, uskomme, että FBA-TPQ voi estää munasarjasyöpäpotilailla kasvua laukaisemalla Fas liittyvä /ROS-liittyvä, ja PI3K-Akt välittämä /p53-MDM2 liittyviä kasvu solujen apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen ja vähentää solujen lisääntymistä (Fig. 5). Nämä havainnot vahvistettiin proteiinitasolla in

in vitro

ja

in vivo

, ja olivat yhdenmukaisia ​​meidän microarray data-analyysi (katso teksti S1, Fig. S1, taulukot S1, S2, S3 ), että FBA-TPQ kykenee sen toimintaa pääasiassa sen induktion ROS ja DNA vaurioita, sääntely ”polku syövän”, ”p53 signalointireitin” ja ”fosfatidyyli merkinantojärjestelmän” (esim PI3K-Akt), sekä sen negatiivisesti sääntely CDK (esim CDK1 ja niihin liittyvät CDC25C ja CyclinB1).

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti, että FBA-TPQ voi käyttää voimakas sytotoksisuus ja soluproliferaation eston vaikutuksia kohti A2780 ja OVCAR-3-soluissa. Paitsi apoptoosin, se voi myös aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen ja estää OVCAR-3 ksenograftikasvaimissa kasvun kautta ROS /kuolema reseptori-aloitettu, ja PI3K-Akt välittämä /p53-MDM2 liittyviä solujen lisääntymistä ja apoptoosia ja solusyklin etenemiseen liittyvät reitit (esitetty kuviossa. 5). Kuitenkin tarkka mekanismi (t), yhdisteen, ja onko se kohdistaa samat vaikutukset muiden kasvainten tyyppiä ei ole vielä hyvin selvitetty. Jatkossa tässä tutkimuksessa yhdessä aiempien raportoitu havaintoja [6], varmasti parantaa ymmärrystä toimintamekanismit makaluvamine analogisten ja antaa myös perustan niiden tulevan kliinisiä kehitystä FBA-TPQ uutena anti -cancer agentti.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet ja reagenssit

kaikki kemikaalit olivat kaikki analyyttistä laatua. FBA-TPQ oli ystävällinen lahja professori Sadanandan VELU (UAB, Birmingham, AL, USA). Propidiumjodidia (P4170) ostettiin Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA). JC-1 väriaine (5,5 ’, 6,6′-tetra- 1,1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi) (T-3186), TRIZOL reagenssia ja CM-H

2DCFDA [5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’- dichlorodihydrofluorescein diasetaatti asetyyli esteri] (C6827) ostettiin Invitrogen-Molecular Probes Co. (City, State, USA). CellTiter 96® AQ

ueous One Solution (G3580) proliferaatiomääritystä (MTS-määritys) pakki hankittiin Promega Co., Ltd. (Madison, WI). DC-proteiini iinianalyysikitissä (500-0113) saatiin Bio-Rad (Hercules, CA, USA), ja ECL-plus-järjestelmä hankittiin Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Kaikki soluviljelmässä toimitukset saatiin Invitrogen-Gibco Co. (City, State, USA). Anti-ihmis-MDM2-vasta-aine saatiin Calbiochem® EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Saksa), kaspaasi-3 (8G10) vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA), ja anti- -ihmisen β-aktiini (AC-74) vasta-aine saatiin Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). Anti-humaani-p53 (SC-98), Fas (SC-8009), PI3K110a (SC-7189), PI3K85a (SC-423), AKT (SC-8312), p-AKT (SC-7985-R), PARP (H-250, SC-7150), Bax (SC-493), Bcl-2 (SC-509), Rb (SC-50), p21 (SC-817), p27 (SC-528), E2F1 (SC -193), CDK1 (SC-8395), sykliini B1 (SC-595), ja CDC25C (SC-13138) vasta-aineet sekä kaikki johdetun vasta-aineita (anti-hiiri, anti-vuohen ja anti-kani immunoglobuliini G) hankittiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

Solulinjat ja Cell Culture

Human munasarjakarsinoomaprote- A2780 ja OVCAR-3-solujen ja ihmisen munasarja- IOSE144 (Immortalized ei- tuumorigeenistä Munasarjojen pintaepiteelisolujen), jotka oli alun perin saatu American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) olivat lahja tri Jing Fang (Institute for Nutritional Sciences, Shanghai, Kiina). Kaikki solut viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä mukaisesti ATCC: n ohjeita. FBA-TPQ liuotettiin DMSO: hon ja laimennettiin sitten soluviljelmässä media ( 0,1%, lopullinen inkubaatio-pitoisuudesta).

solunelinkykyisyysmääritys

Solun kasvua ja elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä käyttäen CellTiter 96® AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (G3580, Promega). Lyhyesti, 4 x 10

3-soluja (per kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille ja niitä joko käsiteltiin 48 h FBA-TPQ (liuotettu DMSO: hon 0,1%, lopullinen konsentraatio) on sarja-pitoisuuksia (0 , 100, 500, 750, 1000, 1500 ja 2500 nM), tai käsiteltiin eri aikoja (0, 24, 48 ja 72 h) ja FBA-TPQ pitoisuuksina 0, 500, 750 ja 1000 nM. Jälkeen 24~72 tunnin käsittelyn 20 ui MTS-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin vielä 2~4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen absorbanssi 490 nm: ssä kirjattiin käyttäen SpectraMax

190 mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, USA) laskea solujen eloonjäämistä prosenttiosuudet.

Detection of apoptosis

Solun apoptoosia havaittiin kautta anneksiini V-FITC kit ostettu BioVision, Inc [6], [17]. Lyhyesti, 1 x 10

6-soluja siirrostettiin 6 cm: n annoksia ja käsiteltiin testiyhdisteellä (FBA-TPQ) 0,5, 1,5 ja 2,5 uM: ssa 24 tuntia ennen analysointia. Kelluva ja trypsiinillä tarttuvat solut kerättiin ja valmistettiin tunnistus mukaan valmistajan ohjeiden. Näytteet analysoitiin FACSAria ™ virtaussytometrillä (Becton Dickinson, USA) inkuboinnin jälkeen pimeässä huoneenlämpötilassa 5 min. Solut positiivinen varhaisen apoptoosin (anneksiini V-FITC värjätä ainoastaan, katso Q

4 kuviossa 2A) ja myöhään apoptoosin (anneksiini V-FITC ja PI värjätään, katso Q

2 kuviossa 2A) yhdistettiin.

Cell Cycle Analysis

propidiumjodidilla (PI) värjäys suoritettiin vaikutusten määrittämiseksi FBA-TPQ solun syklin [6]. Lyhyesti, 6 x 10

5-solut, jotka ympättiin 6 cm: n maljoissa altistettiin FBA-TPQ (0, 0,5, 1,5 ja 2,5 uM), ja inkuboidaan 12 tuntia ennen analysointia. Solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 1 ml: ssa 70%: ista etanolia (700 ui 100% etanolia lisättiin 300 ui PBS: ää) 4 ° C: ssa yön yli, mitä seurasi sentrifugointi (3000 rpm, 5 min), inkubointi RNaasi (100 ug /ml) ja propidiumjodidilla (50 ug /ml) 15 minuutin ajan pimeässä. DNA pitoisuus analysoitiin Cell Lab Quanta ™ SC -virtaussytometrillä (Beckman Coulter, USA).

mittaus reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) B

tuotanto ROS mitattiin käyttäen 5- (ja-6) -chloromethyl-2 ’, 7’- dichlorodihydrofluorescein diasetaatti asetyyli esteri (CM-H2DCFDA). Lyhyesti, solut (noin 7 x 10

5) ympättiin 6-cm: n maljoille ja altistettiin FBA-TPQ 4 tuntia serial pitoisuuksilla (0, 1,0, 2,0 ja 3,0 uM), jonka jälkeen solut kerättiin ja pestiin kerran PBS-liuoksella, sitten inkuboitiin 5 uM CM-H2DCFDA (DMSO) 30 minuuttia 37 ° C: ssa fenoli-puna-RPMI 1640-alustassa.